CN110903359B - 一种空肠弯曲菌重组蛋白及其单克隆抗体的制备 - Google Patents

一种空肠弯曲菌重组蛋白及其单克隆抗体的制备 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种空肠弯曲菌重组蛋白及其单克隆抗体的制备。该重组蛋白是以空肠弯曲菌膜蛋白(LoIA)的A优势表位与B优势表位用一段柔性片段作为连接短肽串联后重复三次形成的，其氨基酸序列为SEQ ID No:1所示。将该重组蛋白通过免疫Balb/c小鼠，细胞融合和多轮细胞筛选后得到单克隆细胞株。制备并纯化单克隆抗体后分别标记荧光微球，正交实验确定最佳单抗配对组合。可用于空肠弯曲菌感染的早期诊断。

Description

一种空肠弯曲菌重组蛋白及其单克隆抗体的制备
技术领域：本发明属于生物技术领域，涉及一种空肠弯曲菌重组蛋白，编码该重组蛋白的核苷酸序列，含有上述核苷酸序列的质粒载体，转化含有上述质粒载体的菌株，还涉及使用上述空肠弯曲菌重组蛋白制备单克隆抗体，并应用于空肠弯曲菌感染的快速诊断。
背景技术：空肠弯曲菌(Campylobacter)，属螺旋菌科、革兰氏阴性，空肠弯曲菌有内毒素能侵袭小肠和大肠粘膜引起急性肠炎，亦可引起腹泻的暴发流行或集体食物中毒。潜伏期一般为3～5天，对人的致病部位是空肠、回肠及结肠。主要症状为痉挛性腹痛、腹泻、血便或果酱样便，量多；头痛、不适、发热。细菌有时可通过肠粘膜入血流引起败血症和其他脏器感染，如脑膜炎、关节炎、肾盂肾炎等。孕妇感染本菌可导致流产，早产，而且可使新生儿受染。空肠弯曲菌是一种人畜共患病病原菌，可以引起人和动物发生多种疾病，并且是一种食物源性病原菌，被认为是引起全世界人类细菌性腹泻的主要原因，对空肠弯曲菌的致病机理研究越来越多。其致病因素包括粘附、侵袭、产生毒素和分子模拟机制等四个方面，通过分子模拟机制可以引起最严重的并发症—格林-巴利综合征。空肠弯曲菌可以通过产生细胞紧张性肠毒素、细胞毒素和细胞致死性膨胀毒素而致病。因此早期快速诊断对于防治该病至关重要。
目前，用于空肠弯曲菌检测的经典方法为生化鉴定方法，该方法检测时间长、试剂成本高、尤其空肠弯曲菌的微需氧特性，使其分离培养更为困难，需要额外的维持微需氧条件的设施和试剂。近年来，随着分子生物学的发展，DNA测序技术在空肠弯曲菌的检测中得到了广泛的应用，此类方法敏感性较高、特异性较强，但其成本较高，操作步骤相对繁琐、耗时较长导致此类方法的产业化应用始终受到限制。因此，研发一种快速、灵敏、特异、准确的空肠弯曲菌可视化实时检测方法显得尤为重要。
免疫学检测方法因其操作简便，结果易于判定，适用于大量样本现场快速筛查等特点而得到非常广泛的应用。该方法主要是通过制备空肠弯曲菌膜蛋白的单克隆抗体来实现对空肠弯曲菌的特异性检测。常规用于空肠弯曲菌蛋白单克隆抗体制备的免疫原是完整蛋白，由于抗原表位氨基酸序列同源性缘故，所制得的单克隆抗体特异性差，可能识别其它蛋白，导致检测结果失真。
发明内容:
为了克服现有技术中存在的问题，本发明目的在于优化设计一种空肠弯曲菌重组蛋白并制备其单克隆抗体，从而实现对空肠弯曲菌的特异性识别及快速检测。
为了实现上述发明目的及其他相关目的，本发明提供如下技术方案：(1)以空肠弯曲菌膜蛋白(LoIA)为靶抗原，分析并选择该抗原两个特异性优势表位A和B，序列比较显示所选择的两个抗原表位与其它蛋白序列无明显同源性。(2)为增强所选择优势抗原表位对Balb/c小鼠免疫系统的刺激，运用一段柔性片段(四个甘氨酸)作为连接短肽，将空肠弯曲菌膜蛋白(LoIA)的A优势表位和B优势表位序列串联后三次重复，组成一个重组蛋白。(3)采用大肠杆菌偏爱密码子，将重组蛋白氨基酸序列转换为对应的核苷酸序列，以利于重组蛋白在大肠杆菌中的表达，从而提高表达量。(4)化学合成上一步骤得到的核苷酸序列，并通过酶切连接，将合成得到的核苷酸片段插入表达载体pET-28a(+)，构建重组蛋白表达载体。(5)重组蛋白表达载体转化大肠杆菌ER2566感受态细胞，IPTG诱导筛选得到重组蛋白表达菌株。(6)重组蛋白表达菌株大规模培养后，超声破菌并低温离心，收集上清用镍琼脂糖亲和层析柱纯化，透析得空肠弯曲菌重组蛋白。(7)纯化后的重组蛋白多次免疫Balb/c小鼠后，取其脾脏细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合，经多轮筛选最终得到杂交瘤细胞株。(8)将杂交瘤细胞株分别制备Balb/c小鼠腹水，使用正辛酸-硫酸铵沉淀法及Protein A亲和层析分两步纯化单克隆抗体，并分别标记荧光微球。(9)正交实验筛选显示4D8单抗包被与6E7荧光微球标记配对检测空肠弯曲菌为最佳组合。
本发明与背景技术相比，一是通过分子生物学技术，实现了空肠弯曲菌膜蛋白(LoIA)两个优势抗原表位的重复及串联表达，增强了目的抗原表位对小鼠免疫系统的刺激，排除了无关序列可能带来的干扰；二是采用大肠杆菌偏爱密码子优化重组蛋白对应的核苷酸序列，大大提高重组蛋白在大肠杆菌中的表达水平；三是作为免疫原的重组蛋白仅含有空肠弯曲菌膜蛋白特有的优势抗原表位，保证了空肠弯曲菌膜蛋白单克隆抗体的高特异性，并筛选得到最佳单抗配对组合，提高检测灵敏度。
具体实施方案:
以下实施例虽然对本发明的设计思路作了比较详细的文字描述，但是这些文字描述，只是对本发明设计思路的简单文字描述，而不是对本发明设计思路的限制，任何不超出本发明设计思路的组合、增加或修改，均落入本发明的保护范围内。
实施例1：空肠弯曲菌膜蛋白(LoIA)优势抗原表位选择
以空肠弯曲菌膜蛋白(LoIA)为靶抗原，利用生物软件DNAssist2.0分析其抗原表位序列的亲水性及抗原性，兼顾其特异性，选择A优势抗原表位(SEQ ID No:2)和B优势抗原表位(SEQ ID No:3)。序列比较显示所选择的A、B两个优势抗原表位与其它蛋白序列无明显同源性。
实施例2：空肠弯曲菌膜蛋白(LoIA)优势抗原表位串联与序列优化
为加强A、B优势抗原表位对Balb/c小鼠免疫的效果，运用一段柔性片段(四个甘氨酸)作为连接短肽，将空肠弯曲菌膜蛋白(LoIA)的A和B优势抗原表位序列串联后三次重复，组成重组蛋白氨基酸序列，其氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。为提高重组蛋白在大肠杆菌中的表达量，采用大肠杆菌偏爱密码子，将重组蛋白氨基酸序列转换为对应的核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID No:4所示，在该核苷酸序列上下游分别添加BamHI和EcoRI酶切位点序列，交由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，合成后的目的基因克隆于pMD19-T载体(购自于宝生物工程大连有限公司)中。
实施例3：重组蛋白表达载体构建
用限制性内切酶BamHI和EcoRI(宝生物工程大连有限公司)于37℃分别双酶切含目的基因的pMD19-T载体和pET-28a(+)载体(德国Novagen公司)12小时，酶切产物分别行1％琼脂糖凝胶电泳，并分别切胶回收目的基因和pET-28a(+)载体(本发明所使用的胶回收试剂盒均来自宁波中鼎生物技术有限公司)。使用T4连接酶(宝生物工程大连有限公司)将回收的目的基因和pET-28a(+)载体按一定比例于4℃连接12小时后，连接产物转化DH5α感受态细胞(杭州贤至生物科技有限公司)，并涂布于含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB平板，37℃恒温培养12小时后，于平板上挑取单克隆菌株至含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB液体培养基，37℃恒温摇床培养12小时后，采用质粒纯化试剂盒(本发明所使用的质粒纯化试剂盒均来自于Axygen公司)提取质粒，经BamHI和EcoRI双酶切鉴定后得到正确的重组表达载体。
实施例4：重组蛋白表达菌株构建
将构建好的重组蛋白表达载体转化E.coli ER2566感受态细胞，并涂布于含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB平板，37℃过夜倒置培养，挑取平板上单克隆菌株至含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB液体培养基，37℃恒温摇床培养5h后，加异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)(终浓度为1.0mmol/L)诱导表达4h后制备蛋白电泳样品。14％聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明重组蛋白成功表达，得到重组蛋白表达菌株。
实施例5：重组蛋白诱导表达、纯化与透析
将重组蛋白表达菌株接种至含卡那青霉素(终浓度为50μg/mL)的LB液体培养基中，37℃恒温摇床培养至OD600＝0.6，用含终浓度50μg/mL卡那青霉素的LB液体培养基将该菌按1：100稀释后，分装至细菌培养瓶中，置37℃摇床恒温过夜培养，次日加诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1.0mmol/L，继续培养5h。4℃离心收集菌体，用50mM、pH8.0的Tris-HCl悬浮菌体，超声破碎，低温离心收集上清。上清用0.45μm滤膜过滤后用Ni柱纯化，经洗涤、洗脱得到空肠弯曲菌重组蛋白，用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测确定为目的蛋白。将纯化后的空肠弯曲菌重组蛋白装入截留分子量为5kDa的透析袋中，pH 7.4PBS缓冲液透析过夜，次日取出分装，于-20℃保存。
实施例6：杂交瘤细胞株的获得
取4-6周龄雌性Balb/c健康小鼠，用100μg重组蛋白与弗氏完全佐剂完全乳化后，采取小鼠脊柱两侧皮下多点注射。20天后进行第二次加强免疫，方法为取80μg重组蛋白与弗氏不完全佐剂乳化，皮下多点注射。第三次加强免疫在15天以后，方法与第二次加强免疫相同。15天后，取120μg重组蛋白腹腔加强注射，于72小时至96小时间眼眶取血，拉颈处死小鼠，取其脾脏制备细胞悬液，细胞计数，按1/5于脾细胞的数量取生长状态良好的sp2/0(小鼠骨髓瘤细胞)，混和离心后，加入聚乙二醇(Sigma公司)使二者融合。另外，再加入等体积的饲养细胞，混匀后分置于96孔细胞板(200μL/孔)，于37℃、5％二氧化碳培养箱培养。5天后，半保留换液，10天后采用间接酶联免疫吸附法检测96孔细胞培养板中培养杂交瘤细胞的上清。
具体方法如下：
包被：用包被液稀释空肠弯曲菌重组蛋白至终浓度为1μg/mL，100μL/孔加入酶标板(无锡国胜生物工程有限公司)，4℃过夜后弃去孔内液体，通过DEM-3型洗板机(中山大学达安基因股份有限公司)用洗涤液洗板1次。
封闭：以150μL/孔加入封闭液，37℃封闭1h，洗板机洗板1次；
加样：加待检细胞培养上清及对照血清，100μL/孔，37℃孵育40分钟后，洗板机洗板3次；
加酶标抗体：以100μL/孔加入新鲜稀释的HRP(辣根过氧化物酶)标记的羊抗鼠IgG，37℃孵育40分钟后，洗板机洗板5次；
加显色液：每孔加显色液A和显色液B各50μL，37℃避光显色10分钟；
终止反应：以50μL/孔加入2M H2SO4；
结果判定：在酶标仪上，于450nm处，空白孔校零后读取OD值。以免疫小鼠血清作为阳性对照。相关溶液配方如下：
包被液：Na2CO3 1.5g，NaHCO3 2.9g，加ddH2O定容至1000mL(pH9.6)。
封闭液：Na2HPO4.12H2O 2.68g，NaH2PO4.2H2O 0.39g，NaCl 8.5g，20g牛血清白蛋白，加ddH2O定容至1000mL(pH7.4)。
洗涤液：Na2HPO4.12H2O 2.68g，NaH2PO4.2H2O 0.39g，NaCl 8.5g，Tween-20 0.5mL，加ddH2O定容至1000mL(pH7.4)。
显色液A：200mg TMB溶于100mL无水乙醇，加ddH2O定容至1000mL。
显色液B：柠檬酸2.1g，Na2HPO4.12H2O 71g，加ddH2O定容至1000mL。
使用时：1mL显色液A+1mL显色液B+0.4μL 30％H2O2
终止液：2M H2SO4，21.7mL浓H2SO4加ddH2O定容至1000mL。
对于检测阳性的杂交瘤细胞克隆，通过有限稀释法进行亚克隆。经过三次亚克隆，筛选得到7株杂交瘤细胞株(1B9，3E4，4D8，4F11，6E7，7C3，7H5)。
实施例7：单克隆抗体的大量制备及纯化
取6-8周龄的健康Balb/c雄鼠，腹腔注射液体石蜡，每只500μL，4天后腹腔注射单克隆细胞(约1×106个/只)，6-8天后，小鼠腹部鼓起，收集腹水。用磁珠法抗体纯化试剂盒(苏州海狸生物医学工程有限公司)，通过样品处理，磁珠预处理，抗体吸附，磁珠洗涤，抗体洗脱，抗体中和一系列步骤，得到的即为纯化的单克隆抗体。
实施例8：标记空肠弯曲菌单克隆抗体荧光微球垫的制备
用50mM pH4.5 MES缓冲液将直径210nm的荧光微球(购自南京微测生物科技有限公司)浓度调节至1％，采用碳二亚胺(EDC)和琥珀酰亚胺(NHS)共价偶联的方式将前期筛选得到的7株单克隆抗体(1B9，3E4，4D8，4F11，6E7，7C3，7H5)标记到荧光微球上，抗体浓度为0.2mg/ml。将制备好的荧光微球使用定量喷膜仪以4μL/cm的量喷涂于荧光微球垫上，25℃真空干燥1～2h，置于干燥环境备用。
实施例9：硝酸纤维素膜(NC膜)的制备
用10mM pH7.4的PBS(磷酸盐缓冲液，其中包含5％蔗糖)分别调节前期筛选得到的7株单克隆抗体(1B9，3E4，4D8，4F11，6E7，7C3，7H5)至其浓度为0.4mg/mL，将所得溶液分别喷涂在NC膜上形成检测区(T线)；用10mM pH7.4的PBS(磷酸盐缓冲液，其中包含5％蔗糖)调节羊抗鼠IgG浓度为0.5mg/mL，将所得溶液喷涂在NC膜上形成质控区(C线)。两区喷膜量均为1μL/cm，两区相隔5mm，质控区距离NC膜一端2mm，37℃烘干过夜，置于室温干燥环境备用。
实施例10：荧光微球免疫层析检测卡的制备
组装试纸条：在PVC底板上依次搭接粘贴：(1)喷涂空肠弯曲菌单克隆抗体(1B9，3E4，4D8，4F11，6E7，7C3，7H5)作为检测区和羊抗鼠IgG作为质控区的NC膜；(2)喷涂有荧光微球标记空肠弯曲菌单克隆抗体(1B9，3E4，4D8，4F11，6E7，7C3，7H5)的荧光微球垫；(3)滤纸和样本垫，样本垫为一种经过2％Tween-20处理的玻璃纤维膜；(4)吸水纸，组装完成后剪切成4mm的宽度，装上试剂卡条壳并压紧，即得荧光微球免疫层析检测卡。
实施例11：配对单抗筛选
空肠弯曲菌患者临床血清样本，100μL/孔上样，室温放置15min后，通过荧光分析仪(购自和迈生物科技股份有限公司)分别读取NC膜上T、C线信号并计算测量值T/(T+C)，详见表1。
表1配对单抗测量值T/(T+C)统计
Figure BDA0002330674350000091
通过上表可知，4D8单抗包被与6E7荧光微球标记配对检测空肠弯曲菌为最佳组合。
实施例12：单克隆抗体特异性鉴定
将单增李斯特菌、猪霍乱沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、福氏志贺菌、宋内氏志贺菌、鲍氏志贺菌、出血性大肠杆菌等9种细菌培养物用10mM pH7.4的无菌PBS缓冲液稀释至107CFU/mL，用4D8单抗包被与6E7荧光微球标记制得的荧光微球免疫层析检测卡来检测其特异性。各取100μL稀释后的菌液加至检测卡加样孔中，15min后读取T线信号值，对照组为10mM pH7.4的无菌PBS缓冲液。重复三次。结果(表2)表明，仅空肠弯曲菌检测为阳性，其他均为阴性。
表2特异性实验结果
Figure BDA0002330674350000101
注：“++”表示强阳性，“－”表示阴性。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州贤至生物科技有限公司
<120> 一种空肠弯曲菌重组蛋白及其单克隆抗体的制备
<130> 20191219
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 101
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial）
<400> 1
Thr Lys Gln Asp Thr Phe Ala Gln Val Asn Gln Ile Ser Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Lys Phe Thr Ile Arg Thr Lys Gln Asp Val Gln Gly Phe Asp Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Thr Lys Gln Asp Thr Phe Ala Gln Val Asn Gln Ile Ser
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Lys Phe Thr Ile Arg Thr Lys Gln Asp Val Gln Gly
50 55 60
Phe Asp Gly Gly Gly Gly Thr Lys Gln Asp Thr Phe Ala Gln Val Asn
65 70 75 80
Gln Ile Ser Gly Gly Gly Gly Lys Phe Thr Ile Arg Thr Lys Gln Asp
85 90 95
Val Gln Gly Phe Asp
100
<210> 2
<211> 13
<212> PRT
<213> 空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni ）
<400> 2
Thr Lys Gln Asp Thr Phe Ala Gln Val Asn Gln Ile Ser
1 5 10
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213> 空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni ）
<400> 3
Lys Phe Thr Ile Arg Thr Lys Gln Asp Val Gln Gly Phe Asp
1 5 10
<210> 4
<211> 303
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial）
<400> 4
accaaacagg atacctttgc ccaggtgaac cagattagcg gcggcggcgg caaatttacc 60
attcgcacca aacaggatgt gcagggcttt gatggcggcg gcggcaccaa acaggatacc 120
tttgcccagg tgaaccagat tagcggcggc ggcggcaaat ttaccattcg caccaaacag 180
gatgtgcagg gctttgatgg cggcggcggc accaaacagg atacctttgc ccaggtgaac 240
cagattagcg gcggcggcgg caaatttacc attcgcacca aacaggatgt gcagggcttt 300
gat 303

Claims (5)

1.一种空肠弯曲菌重组蛋白，其特征在于，所述空肠弯曲菌重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。
2.一种空肠弯曲菌重组蛋白，其特征在于，所述空肠弯曲菌重组蛋白的编码核苷酸序列如 SEQ ID No:4所示，可编码权利要求1所述的重组蛋白。
3.一种质粒载体，其特征在于，该质粒载体含有权利要求2所述的编码核苷酸。
4.一种菌株，其特征在于，该菌株含有权利要求3所述的质粒载体。
5.一种空肠弯曲菌重组蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，该方法包含以下步骤：
(a)第三方合成权利要求2所述的空肠弯曲菌重组蛋白编码核苷酸，连接至pET-28a(+)载体中，得重组表达质粒；
(b)将步骤(a)中的重组表达质粒转化至大肠杆菌中诱导表达，经纯化透析即得空肠弯曲菌重组蛋白；
(d)重组蛋白多次免疫Balb/c小鼠后，取其脾脏细胞与sp2/0骨髓瘤细胞融合，经多轮筛选得到杂交瘤细胞株；
(e)纯化单克隆抗体并分别标记荧光微球，正交实验确定最佳单抗配对组合。
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