CN111705066A - 一种经基因修饰的tigit蛋白及其单克隆抗体和应用 - Google Patents

一种经基因修饰的tigit蛋白及其单克隆抗体和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种经基因修饰的TIGIT蛋白及其单克隆抗体和应用本发明对TIGIT进行糖基化修饰，得到优化后的糖基化TIGIT蛋白，并利用此蛋白免疫制备了鼠源性单克隆抗体，本发明得到的抗TIGIT单克隆抗体具有特异性高，可大量生产的特点，所得抗体的效价达到1×105以上。本发明所得到的抗TIGIT单克隆抗体能够特异性的结合TIGIT蛋白，可用于细胞的免疫学检测，具有广阔的市场前景，对进一步开发以TIGIT为靶点的生物治疗药物具有重要的临床意义。

Description

一种经基因修饰的TIGIT蛋白及其单克隆抗体和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种经基因修饰的TIGIT蛋白及其单克隆抗体和应用。
背景技术
肿瘤免疫治疗是近年来肿瘤治疗领域的研究热点，固有免疫和适应性免疫系统都可对肿瘤进行应答，在肿瘤免疫监视阶段，多种细胞参与了该过程，如NK细胞、T细胞和巨噬细胞等通过细胞免疫进行应答，并通过分泌细胞因子调节抗肿瘤作用。T 细胞免疫球蛋白域和免疫受体酪氨酸抑制基序（TIGIT）是一种免疫调节分子，主要表达于 T 细胞、NK细胞和调节性 T 细胞等细胞表面，是NK细胞和T细胞上共有的抑制性受体。在癌细胞中，TIGIT的表达量显著上调，抑制了NK细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞和调节性T细胞的活化，从而对癌症免疫周期产生抑制作用，保护癌细胞不被消除。研究表明，肺癌患者的肿瘤浸润T细胞表面高表达TIGIT分子；结肠癌患者的肿瘤浸润NK细胞表面TIGIT表达显著高于外周血NK细胞；在多种小鼠肿瘤模型中，利用抗体阻断TIGIT能够有效的抑制肿瘤生长和转移，阻断TIGIT表达能够有效治疗肿瘤，因此，开发一种高效的高特异性的抗TIGIT 抗体显得尤为必要。目前用于检测或诊断的TIGIT抗体存在特异性差，产量低等的缺点，限制了TIGIT抗体的应用。
蛋白质翻译后修饰是蛋白质结构及功能成熟过程中的重要组成部分，其中的一种重要的翻译后修饰为蛋白质糖基化，对生命体起着非常重要的作用。目前还未见有糖基化修饰的TIGI重组蛋白，如能开发出一种糖基化修饰的抗TIGIT单克隆抗体对以TIGIT为靶点的生物学诊断，以及免疫治疗药物研发等方面均具有重要的意义。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的不足，提供一种经糖基化修饰的TIGIT蛋白，利用该糖基化TIGIT蛋白构建重组质粒载体，进行表达以及单克隆抗体的制备，获得的抗TIGIT单克隆抗体效价高、特异性好，可直接应用于分子免疫学研究，或制成多种体外诊断试剂盒用于检测TIGIT抗原的免疫检测工具中。可用于制备抗TIGIT的生物诊断试剂的研究与开发。
本发明的方案通过如下技术手段得以实现：
一种经糖基化修饰的TIGIT蛋白基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。
一种经糖基化修饰的TIGIT蛋白，由上述经糖基化修饰的TIGIT蛋白基因表达得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2 所示。
一种表达载体，该载体含有上述经糖基化修饰的TIGIT蛋白基因。
在某一具体实施方案中，本发明还共了一种抗TIGIT单克隆抗体，所述的抗TIGIT单克隆抗体采用上述经糖基化修饰TIGIT蛋白基因的表达载体为免疫原；其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在某一具体实施方案中，本发明还提供所述抗TIGIT单克隆抗体的一种制备方法，首先用糖基化TIGIT蛋白免疫BALB/c小鼠，再用免疫成功小鼠的脾脏淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，通过筛选阳性克隆得到特异性分泌抗TIGIT单克隆抗体的杂交瘤细胞株，将该细胞接种于提前用液体石蜡致敏的BALB/c小鼠腹腔，大量生产抗TIGIT单克隆抗体，并通过蛋白纯化的方式制备得到高纯度的抗TIGIT单克隆抗体。具体制备工艺步骤如下：
（1）重组蛋白的表达与纯化；
（2）BALB/c小鼠的免疫与效价检测；
（3）杂交瘤细胞的融合、筛选；
（4）抗TIGIT单克隆抗体的生产及纯化。
在某一具体实施方式中，本发明还提供了一种能产生上述抗TIGIT单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
本发明还提供了所述的抗TIGIT单克隆抗体在制备免疫学检测工具中的应用。
进一步地，所述的抗TIGIT单克隆抗体在制备检测TIGIT蛋白的生物检测试剂中的用途。进一步的所述的用途为制备检测TIGIT抗原的试剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明对TIGIT进行糖基化修饰，得到优化后的糖基化TIGIT蛋白，并利用此蛋白免疫制备了鼠源性单克隆抗体，本发明得到的抗TIGIT单克隆抗体具有特异性高，可大量生产的特点，所得抗体的效价达到1×105以上。本发明所得到的抗TIGIT单克隆抗体能够特异性的结合TIGIT蛋白，可用于细胞的免疫学检测，具有广阔的市场前景，对进一步开发以TIGIT为靶点的生物治疗药物具有重要的临床意义。
附图说明
图1是TIGIT及糖化TIGIT蛋白的 SDS-PAGE电泳图；
图2是纯化后的抗TIGIT单克隆抗体组分收集的SDS-PAGE电泳图；
图3是不同稀释度的抗TIGIT单克隆抗体的免疫效价检测结果图；
图4是抗TIGIT单克隆抗体的特异性及交叉反应鉴定结果；
图5是抗TIGIT单克隆抗体CD8+T与CD4+T细胞的Western blot实验结果图。
具体实施方式
本发明公开了一种经基因修饰的TIGIT蛋白及其单克隆抗体和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。以下实施案例中的方法、设备、材料，如果未进行特别说明，均为本领域常规方法、设备和材料，均可由市场购得。
实施例1：抗TIGIT单克隆抗体制备
（1）重组TIGIT蛋白的表达与纯化
a. 转化大肠杆菌BL21表达目标重组蛋白
TIGIT基因的Genbank登陆号为201633，对TIGIT基因进行糖基化修饰，修饰后的TIGIT基因核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，其序列经南京金斯瑞生物技术有限公司合成并插入原核表达载体pET-30a，构成重组表达质粒pET-30a-TIGIT（糖化），采用42℃热激90 s的方法将pET-30a-TIGIT（糖化）转化进大肠杆菌BL21，挑取卡那霉素抗性的菌斑，在500 mL LB培养基中培养至当菌液的OD为0.6~0.8时，加入0.5 mM IPTG诱导目标蛋白的表达，25℃恒温培养12 h后，收集菌体，超声破菌，离心收集上清。
b. 重组蛋白纯化
将菌体裂解液上清加入镍柱层析柱中（购自Qiagen），4℃结合过夜，弃去上清，用WashBuffer缓冲液洗去层析柱中未结合的蛋白，然后用10倍柱体积的500 mM咪唑缓冲液洗脱重组蛋白，收集合并洗脱后的重组糖化TIGIT蛋白，冻干后进行后续动物免疫。采用相同的方法收集正常的TIGIT蛋白（未经糖基化修饰）作为对比例。SDS-PAGE电泳分别检测重组蛋白的表情况达，图1是重组糖化TIGIT蛋白与TIGIT蛋白洗脱组分收集的SDS-PAGE电泳图，如图1所示，经洗脱后分别获得较高纯度的糖化TIGIT蛋白与TIGIT蛋白。
（2）BALB/c小鼠的免疫与效价检测
本实施例所用BALB/c小鼠购自南京大学动物模式研究所。按常规方法进行小鼠免疫（参考北京大学出版社出版的《现代抗体技术及其应用》和科学出版社的《抗体制备与使用实验指南》）。用间接ELISA法检测免疫后小鼠血清效价。各取步骤（1）中的重组糖化TIGIT蛋白、TIGIT蛋白，分别用pH9.6，0.05 mol/L的碳酸盐缓冲液将蛋白稀释为1 μg/mL后加入96孔酶标板，每孔100 μL，4℃包被过夜，取出包被过夜的酶标板，TBS-T缓冲液洗涤3次后，拍干酶标板，4℃贮存待用。第二次免疫后1周，从小鼠尾静脉适量采血，5000 g离心15 min分离血清，用样本稀释液（含有0.5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液）将血清按1:100、1:1000、1:10000、1:100000、1:1000000梯度进行稀释，每孔100 μL加入待检测酶标板，37℃，孵育1h后，经TBS-T缓冲液洗涤3次，拍干酶标板，每孔加入100 μL 1:5000稀释后的HRP标记的山羊抗小鼠二抗（购自Jackson Immuno Research公司），37℃孵育30 min。取出酶标板，经TBS-T缓冲液洗涤5次后，每孔加入100 μL TMB底物显示液，37℃避光显色10~15 min，随后加入50 μL终止液，于酶标仪450 nm波长下读取吸光值。选取血清效价达到1：105以上小鼠，进行第三次免疫。
（3）杂交瘤细胞的融合、筛选
制备饲养层细胞，准备SP2/0骨髓瘤细胞，免疫结束后3~4天后取小鼠脾脏细胞进行细胞融合。融合后的细胞铺板（4块96孔板），利用间接ELISA法筛选生产单克隆抗体的杂交瘤细胞，经过两轮亚克隆筛选得到抗体分泌性最好的杂交瘤细胞株编号命名为：TIGIT mAb与糖化TIGIT mAb。
（4）抗TIGIT单克隆抗体的生产及纯化。
按常规方法制备小鼠单克隆抗体腹水，利用正辛酸-蛋白G法对腹水抗体进行纯化，分别得到糖化TIGIT单克隆抗体（糖化TIGIT mAb）及TIGIT单克隆抗体（TIGIT mAb），对纯化后的抗体纯度经SDS-PAGE电泳验证，如图2所示，TIGIT mAb 与糖化TIGIT mAb抗体经洗脱后能均能获得较高的纯度，制备的抗抗体IgG(H+L)分子量均约为160 KD，其中IgG重链约为55 KD，IgG轻链约为25 KD。
实施例2：TIGIT单克隆抗体效价测定及特异性
（1）单克隆抗体的效价测定：
用pH9.6，0.05 mol/L的碳酸盐缓冲液将TIGIT蛋白稀释为1 μg/mL，包被酶标板，100 μL/孔，4℃过夜；用样本稀释液（含有0.5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液）分别将实施例1所得到的糖化TIGIT单克隆抗体及TIGIT单克隆抗体按1:103、1:104、1：105、1：106稀释，100 μL/孔，37℃孵育1 h；取出酶标板，经TBS-T洗涤3次，拍干酶标板，每孔加入100 μL 1:5000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠二抗，37℃孵育30 min；经TBS-T洗涤5次后，每孔加入100 μL加入TMB底物显示液，37℃避光显色10~15 min，随后加入50 μL终止液终止反应，于酶标仪450nm波长下分别读取吸光值，结果如图3所示，本发明提供的纯化后的TIGIT mAb 与糖化TIGIT mAb单克隆抗体的效价均能达到1×105，且由糖基化修饰的TIGIT单克隆抗体的效价达到1×106，高于TIGIT单克隆抗体。
（2）单克隆抗体特异性识别及交叉反应鉴定：
用将碳酸盐缓冲液将TIGIT、HSP90、HB-EGF、EGFR、HGF蛋白稀释为1 μg/mL，包被酶标板，并设置空白对照，空白对照组为1 μg/mL BSA蛋白，用间接法ELISA检测糖化TIGIT mAb单克隆抗体的特异性，图4是特异性及交叉反应鉴定结果图；如图4所示，糖化TIGIT单克隆抗体与HSP90、HB-EGF、EGFR、HGF蛋白之间均无交叉反应，表明该抗体具有较好的特异性。
实施例3：TIGIT单克隆抗体的Western blot实验
收集人CD8+T （购自美国ATCC细胞库）与人CD4+T细胞（购自美国ATCC细胞库），用RIPA裂解液将细胞裂解，5000 g 4℃离心20 min，收集上清，BCA试剂盒（购于碧云天生物技有限公司）检测蛋白浓度；细胞裂解液经12％SDS-PAGE电泳分离，随后将PAGE胶（购于碧云天生物技有限公司）置于PVDF膜上，120 mA转膜240 min；将PVDF膜放入5％的脱脂牛奶中室温封闭1 h，然后分别用1:5000本发明中提供的糖化TIGIT单克隆抗体作为一抗4℃孵育过夜；取出PVDF膜，PBS-T漂洗3次，每次5 min，置于1:5000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠二抗中室温孵育1 h后，弃二抗，PBS-T洗涤5次，每次5 min；将膜加入显色液中避光显影，拍照记录实验结果，如图5所示，本发明的糖化TIGIT单克隆抗体能够特异性识别TIGIT蛋白，并且能够用于检测细胞中的TIGIT蛋白，说明本发明中的生产的抗TIGIT抗体具有较高的特异性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏莱森生物科技研究院有限公司
<120> 一种经基因修饰的TIGIT蛋白及其单克隆抗体和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 669
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgactaagt ttggattttt gcgattgtcc tatgagaagc aggacacact tttgaagctt 60
ctcatatgcg ctggtgtctc ctcctggtct gggcccaggg gctggggcag gctcccctcg 120
cctcaggaac gaggacaggc acaaaagaaa caacggggaa catttctgca gagaaaggtg 180
gctctatcat cttacaatgt cacctctcct ccaccacggc acaagcgacc caggtcaact 240
gggagcagca ggaccagctt ctggccattt gtaatgctga cttggggtgg cacatctccc 300
catccttcaa ggatcgagtg gccccaggtc ccggcctggg cctcaccctc cagtcgccga 360
ccgcgaacga tacaggggag tacttctgca tctatcacac ctaccctgat gggacgtaca 420
ctgggagaat cttcctggag gtcccagaaa gctcagtggc tgagcacggt gccaggttcc 480
agattccatt gcttggagcc atggccgcga cgctggtggt catctgcaca gcagtcatcg 540
tggtggtcgc gtcgactaga aagaagaaag ccctcagaat ccattctgtg gaaggtgacc 600
tcaggagaaa atcagctgga caggaggaat ggagccccag tgctccctca cccccaggaa 660
gctgtgtaa 669
<210> 2
<211> 222
<212> PRT
<213> 人源(Homo sapiens)
<400> 2
Met Thr Lys Phe Gly Phe Leu Arg Leu Ser Tyr Glu Lys Gln Asp Thr
1 5 10 15
Leu Leu Lys Leu Leu Ile Cys Ala Gly Val Ser Ser Trp Ser Gly Pro
20 25 30
Arg Gly Trp Gly Arg Leu Pro Ser Pro Gln Glu Arg Gly Gln Ala Gln
35 40 45
Lys Lys Gln Arg Gly Thr Phe Leu Gln Arg Lys Val Ala Leu Ser Ser
50 55 60
Tyr Asn Val Thr Ser Pro Pro Pro Arg His Lys Arg Pro Arg Ser Thr
65 70 75 80
Gly Ser Ser Arg Thr Ser Phe Trp Pro Phe Val Met Leu Thr Trp Gly
85 90 95
Gly Thr Ser Pro His Pro Ser Arg Ile Glu Trp Pro Gln Val Pro Ala
100 105 110
Trp Ala Ser Pro Ser Ser Arg Arg Pro Arg Thr Ile Gln Gly Ser Thr
115 120 125
Ser Ala Ser Ile Thr Pro Thr Leu Met Gly Arg Thr Leu Gly Glu Ser
130 135 140
Ser Trp Arg Ser Gln Lys Ala Gln Trp Leu Ser Thr Val Pro Gly Ser
145 150 155 160
Arg Phe His Cys Leu Glu Pro Trp Pro Arg Arg Trp Trp Ser Ser Ala
165 170 175
Gln Gln Ser Ser Trp Trp Ser Arg Arg Leu Glu Arg Arg Lys Pro Ser
180 185 190
Glu Ser Ile Leu Trp Lys Val Thr Ser Gly Glu Asn Gln Leu Asp Arg
195 200 205
Arg Asn Gly Ala Pro Val Leu Pro His Pro Gln Glu Ala Val
210 215 220
<210> 3
<211> 113
<212> PRT
<213> 人源(Homo sapiens)
<400> 3
Asp Ile Val Val Thr Gln Asp Glu Leu Ser Asn Pro Val Thr Ser Gly
1 5 10 15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Lys
20 25 30
Asp Gly Gln Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Met Ser Thr Arg Ala Ser Gly Val Ser
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Glu Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Lys Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu
85 90 95
Val Asp Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 4
<211> 120
<212> PRT
<213> 人源(Homo sapiens)
<400> 4
Gln Ile Gln Ala Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
His Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Asn Thr Phe Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Ser Val Thr Arg Asp Thr Ser Arg Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Ile Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Glu Gly Tyr Asp Gly Val Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120

Claims (9)

1.一种经糖基化修饰的TIGIT蛋白基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.一种经糖基化修饰的TIGIT蛋白，其特征在于，由权利要求1所述的经糖基化修饰的TIGIT蛋白基因表达得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2 所示。
3.一种表达载体，其特征在于，该载体含有权利要求1所述的经糖基化修饰的TIGIT蛋白基因。
4.一种抗TIGIT单克隆抗体，其特征在于，以权利要求2所述经糖基化修饰TIGIT蛋白为免疫原；所述抗体包括重链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
5.根据权利要求4所述的抗TIGIT单克隆抗体，其特征在于，所述抗体还包括轻链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
6.一种能产生权利要求4所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
7.根据权利要求4所述的抗TIGIT单克隆抗体在制备免疫学检测工具中的应用。
8.根据权利要求7所述的抗TIGIT单克隆抗体的应用，其特征在于，在制备检测TIGIT蛋白的生物检测试剂中的用途。
9.根据权利要求7所述的抗TIGIT单克隆抗体的应用，其特征在于，应用于制备检测TIGIT抗原的试剂。
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