CN111733162A - 一种经基因修饰的cd47蛋白及其单克隆抗体和应用 - Google Patents

一种经基因修饰的cd47蛋白及其单克隆抗体和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及了一种经基因修饰的CD47蛋白及其单克隆抗体和应用。本发明利用NEDD8对CD47进行了修饰，得到优化后的NEDD8‑CD47蛋白，并利用此蛋白免疫制备了鼠源性单克隆抗体，本发明的抗CD47单克隆抗体具有特异性高、可大量生产的特点，所得抗体的效价达到1×105以上。能够特异性的结合CD47蛋白可用于细胞的免疫学检测，具有广阔的市场前景，对进一步开发以CD47为靶点的生物治疗药物具有重要的临床意义。

Description

一种经基因修饰的CD47蛋白及其单克隆抗体和应用
技术领域
本发明涉及单克隆抗体技术领域，具体涉及一种经基因修饰的CD47蛋白及其单克隆抗体和应用。
背景技术
分化簇47（CD47）是一种广泛表达的细胞膜表面的免疫球蛋白，又称整合素相关蛋白。CD47通过与巨噬细胞表面的胞外配体SIRPα结合，从而传导抑制性信号降低巨噬细胞的吞噬活性，进而对固有免疫系统产生抑制作用。CD47分子与多种恶性肿瘤密切相关，在大部分肿瘤细胞中呈现高表达。肿瘤细胞凭借这种信号逃避了机体对肿瘤细胞的杀伤作用，从而产生了免疫逃逸现象，促进肿瘤的发展。因此肿瘤组织中的CD47的蛋白表达及CD47抗体的靶向免疫治疗成为研究热点。目前多项研究表明， CD47单克隆抗体已在多种实体肿瘤治疗的相关研究中获得显著的效果，CD47单克隆抗体在肿瘤的靶向治疗中显示了强大的疗效。因此，开发一种高效的高特异性的抗CD47抗体显得尤为必要。目前还未见有对CD47蛋白进行修饰的相关研究报道。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的不足，提供一种经修饰的CD47蛋白及其单克隆抗体和应用。本发明利用分子生物学技术设计一种经NEDD8修饰的CD47融合表达蛋白，开发出一种高特异性、高亲和性、高产量的CD47抗体，对进一步以CD47为靶点的特异性免疫治疗药物等方面具有重要的意义。
本发明的上述目的通过如下技术方案得以实现：
一种经NEDD8修饰的CD47蛋白基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。
一种经NEDD8修饰的CD47蛋白，由上述经NEDD8修饰的CD47蛋白基因表达得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2 所示。
一种表达载体，该载体含有上述经NEDD8修饰的CD47蛋白基因。
在某一具体实施方案中，本发明还提供有一种抗CD47单克隆抗体，所述抗CD47单克隆抗体采用上述经NEDD8修饰CD47蛋白基因的表达载体为免疫原；所述的抗CD47单克隆抗体，其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示，其重链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。
在某一具体实施方式中，本发明还提供所述的抗CD47单克隆抗体的一种制备方法，首先用NEDD8-CD47重组蛋白免疫BALB/c小鼠，再用免疫成功小鼠的脾脏淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，通过筛选阳性克隆得到特异性分泌抗CD47单克隆抗体杂交瘤细胞株，将该细胞接种于提前用液体石蜡致敏的BALB/c小鼠腹腔，大量生产抗CD47单克隆抗体，并通过蛋白纯化的方式制备得到高纯度的抗CD47单克隆抗体。具体制备工艺步骤如下：
（1）重组蛋白的表达与纯化；
（2）BALB/c小鼠的免疫与效价检测；
（3）杂交瘤细胞的融合、筛选；
（4）抗CD47单克隆抗体的生产及纯化。
在某一具体实施方式中，本发明还提供了一种能产生上述抗CD47单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
本发明还提供了所述抗的CD47单克隆抗体在制备免疫学检测工具中的应用。
进一步地，所述的抗CD47单克隆抗体在制备检测CD47蛋白的生物检测试剂中的用途。进一步的所述的用途为制备检测CD47抗原的试剂，具体的为检测细胞中的CD47蛋白。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明采用与泛素蛋白结构类似的蛋白NEDD8（又称Rub 1）对CD47蛋白质进行翻译后修饰，其与靶蛋白共价结合，调节靶蛋白的生理功能，得到优化后的NEDD8-CD47蛋白，并利用此蛋白免疫制备了鼠源性单克隆抗体，本发明的抗CD47单克隆抗体具有特异性高，可大量生产的特点，所得抗体的效价达到1×105以上。能够特异性的结合CD47蛋白，可用于细胞的免疫学检测，具有广阔的市场前景，也可能对进一步开发以CD47为靶点的生物治疗药物具有重要的临床意义。
附图说明
图1是重组蛋白的 SDS-PAGE电泳图；
图2是纯化后的CD47单克隆抗体组分收集的SDS-PAGE电泳图；
图3是不同稀释度的抗CD47单克隆抗体的免疫效价检测结果图；
图4是抗CD47单克隆抗体的特异性及交叉反应鉴定结果图；
图5是CD47单克隆抗体对U87、MCF-7、SKOV3细胞进行Western blot实验的结果图。
具体实施方式
本发明公开了一种经修饰的CD47蛋白及其单克隆抗体和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。以下实施案例中的方法、设备、材料，如果未进行特别说明，均为本领域常规方法、设备和材料，均可由市场购得。
实施例1：抗CD47单克隆抗体制备
（1）NEDD8-CD47重组蛋白的表达与纯化
a. 转化大肠杆菌BL21表达目标重组蛋白
NEDD8、CD47基因的核苷酸序列均可以在公共数据库中获得，NEDD8的Genbank登陆号为4738，CD47 的Genbank登陆号为961；用NEDD8对CD47基因进行修饰，NEDD8修饰后的 CD47基因核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，其序列经南京金斯瑞生物技术有限公司合成并插入原核表达载体pET-30a，构成重组表达质粒pET-30a-NEDD8-CD47。采用42℃热激90 s的方法将重组质粒pET-30a-NEDD8-CD47转化进大肠杆菌BL21，挑取卡那霉素抗性的菌斑，在500 mLLB培养基中培养至当菌液的OD为0.6~0.8时，加入0.5 mM IPTG诱导目标蛋白的表达，25℃恒温培养12 h后，收集菌体，超声破菌，离心收集上清。
b. 重组蛋白纯化
将菌体裂解液上清加入镍柱层析柱中（购自Qiagen），4℃结合过夜，弃去上清，用WashBuffer缓冲液洗去层析柱中未结合的蛋白，然后用10倍柱体积的500 mM咪唑缓冲液洗脱重组蛋白，收集合并洗脱后的重组NEDD8-CD47蛋白，冻干后进行后续动物免疫。采用相同的方法收集正常的CD47蛋白（未经NEDD8修饰）作为对比例。SDS-PAGE电泳分别检测各蛋白的表达情况，图1是重组蛋NEDD8-CD47与CD47蛋白洗脱组分收集的SDS-PAGE电泳图，如图1所示洗脱后分别获得了较高纯度的NEDD8-CD47蛋白与CD47蛋白。
（2）BALB/c小鼠的免疫与效价检测
本实施例所用BALB/c小鼠购自南京大学动物模式研究所。按常规方法进行小鼠免疫（参考北京大学出版社出版的《现代抗体技术及其应用》和科学出版社的《抗体制备与使用实验指南》）。
用间接ELISA法检测免疫后小鼠血清效价。分别取步骤（1）中的NEDD8-CD47蛋白与CD47蛋白，用pH 9.6，0.05 mol/L的碳酸盐缓冲液将CD47蛋白稀释为1 μg/mL后加入96孔酶标板，每孔100 μL，4℃包被过夜，取出包被过夜的酶标板，TBS-T缓冲液洗涤3次后，拍干酶标板，4℃贮存待用。第二次免疫后1周，从小鼠尾静脉适量采血，5000 g离心15 min分离血清，用样本稀释液（含有0.5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液）将血清按1:100、1:1000、1:10000、1:100000、1:1000000梯度进行稀释，每孔100 μL加入待检测酶标板，37℃，孵育1h后，经TBS-T缓冲液洗涤3次，拍干酶标板，每孔加入100 μL 1:5000稀释后的HRP标记的山羊抗小鼠二抗（购自Jackson Immuno Research公司），37℃孵育30 min。取出酶标板，经TBS-T缓冲液洗涤5次后，每孔加入100 μL TMB底物显示液，37℃避光显色10~15 min，随后加入50μL终止液，于酶标仪450 nm波长下读取吸光值。选取血清效价达到1：105以上小鼠，进行第三次免疫。
（3）杂交瘤细胞的融合、筛选
制备饲养层细胞，准备SP2/0骨髓瘤细胞，免疫结束后3~4天后取小鼠脾脏细胞进行细胞融合。融合后的细胞铺板（4块96孔板），利用间接ELISA法筛选生产单克隆抗体的杂交瘤细胞，经过两轮亚克隆筛选分别得到抗体分泌性最好的杂交瘤细胞株，编号命名为：CD47mAb与NEDD8-CD47 mAb。
（4）抗CD47单克隆抗体的生产及纯化。
按常规方法制备小鼠单克隆抗体腹水，利用正辛酸-蛋白G法对腹水抗体进行纯化，分别得到抗NEDD8-CD47单克隆抗体（NEDD8-CD47 mAb）及CD47单克隆抗体（CD47 mAb），对纯化后的抗体纯度经SDS-PAGE电泳验证，如图2所示，抗NEDD8-CD47单克隆抗体、CD47单克隆抗体经洗脱后均能获得较高的纯度，制备的抗体IgG(H+L)分子量约为160 KD，其中IgG重链约为55 KD，IgG轻链约为25 KD。
实施例2：CD47单克隆抗体效价测定及特异性
（1）单克隆抗体的效价测定：
用pH9.6，0.05 mol/L的碳酸盐缓冲液将CD47蛋白稀释为1 μg/mL，包被酶标板，100 μL/孔，4℃过夜；用样本稀释液（含有0.5%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液）将以上单克隆抗体分别按1:103、1:104、1：105、1：106稀释，100 μL/孔，37℃孵育1 h；取出酶标板，经TBS-T洗涤3次，拍干酶标板，每孔加入100 μL 1:5000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠二抗，37℃孵育30min；经TBS-T洗涤5次后，每孔加入100 μL加入TMB底物显示液，37℃避光显色10~15 min，随后加入50 μL终止液终止反应，于酶标仪450 nm波长下读取吸光值，结果如图3所示，CD47单克隆抗体的效价为1×105，NEDD8化修饰的CD47单克隆抗体（抗NEDD8-CD47单克隆抗体）的效价约为1×106，高于CD47单克隆抗体约5-6倍。
（2）单克隆抗体特异性识别及交叉反应鉴定：
用将碳酸盐缓冲液分别将CD47、VEGFA、TIGIT、HB-EGF、HSP90蛋白稀释为1 μg/mL，包被酶标板，并设置空白对照，空白对照组为1 μg/mL BSA蛋白，对抗NEDD8-CD47单克隆抗体、进行间接法ELISA检测，图4是特异性及交叉反应鉴定结果，如图4所示，NEDD8-CD47单克隆抗体与VEGFA、TIGIT、HB-EGF、HSP90蛋白之间均无交叉反应，表明该抗体具有较好的特异性。
实施例3：CD47单克隆抗体的Western blot实验
分别收集人胶质母细胞瘤细胞系U87（购自中科院昆明细胞库）、人乳腺腺癌细胞系MCF-7（购自中科院昆明细胞库）、人卵巢腺癌细胞系SKOV3（购自中科院昆明细胞库），用RIPA裂解液将细胞裂解，5000 g 4℃离心20 min，收集上清，BCA试剂盒（购于碧云天生物技有限公司）检测蛋白浓度；细胞裂解液经12％ SDS-PAGE电泳分离，随后将PAGE胶（购于碧云天生物技有限公司）置于PVDF膜上，120 mA转膜240 min；将PVDF膜放入5％的脱脂牛奶中室温封闭1 h，然后分别用1:5000本发明中的抗NEDD8-CD47单克隆抗体作为一抗4℃孵育过夜；取出PVDF膜，PBS-T漂洗3次，每次5 min，置于1:5000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠二抗中室温孵育1 h后，弃二抗，PBS-T洗涤5次，每次5 min；将膜加入显色液中避光显影，拍照记录实验结果，如图5所示，本发明得到的抗NEDD8-CD47单克隆抗体能够特异性识别CD47蛋白，并且能够用于检测细胞中的CD47蛋白，本发明中的生产的抗NEDD8-CD47单克隆抗体具有较高的特异性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江苏莱森生物科技研究院有限公司
<120> 一种经基因修饰的CD47蛋白及其单克隆抗体和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 558
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgtggcccc tggtagcggc gctgttgctg ggctcggcgt gctgcggatc agctcagcta 60
ctatttaata aaacaaaatc tgtagaattc acgttttgta atgacactgt cgtcattcca 120
tgctttgtta ctaatatgga ggcacaaaac actactgaag tatacgtaaa gtggaaattt 180
aaaggaagag atatttacac ctttgatgga gctctaaaca agtccactgt ccccactgac 240
tttagtagtg caaaaattga agtctcacaa ttactaaaag gagatgcctc tttgaagatg 300
gataagagtg atgctgtctc acacacagga aactacactt gtgaagtaac agaattaacc 360
agagaaggtg aaacgatcat cgagctaaaa tatcgtgttg tttcatggtt ttctccaaat 420
gaaaatattc ttattgttat tttcccaatt tttgtatact cctgttctgg ggacagtttg 480
gtattaaaac acttaaatat agatccagtc cttcacctgg tgttggctct gagaggagga 540
ggtggtctta ggcagtga 558
<210> 5
<211> 185
<212> PRT
<213> 人源(Homo sapiens)
<400> 5
Met Trp Pro Leu Val Ala Ala Leu Leu Leu Gly Ser Ala Cys Cys Gly
1 5 10 15
Ser Ala Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe
20 25 30
Cys Asn Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala
35 40 45
Gln Asn Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp
50 55 60
Ile Tyr Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp
65 70 75 80
Phe Ser Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala
85 90 95
Ser Leu Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr
100 105 110
Thr Cys Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu
115 120 125
Leu Lys Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Asn Ile Leu
130 135 140
Ile Val Ile Phe Pro Ile Phe Val Tyr Ser Cys Ser Gly Asp Ser Leu
145 150 155 160
Val Leu Lys His Leu Asn Ile Asp Pro Val Leu His Leu Val Leu Ala
165 170 175
Leu Arg Gly Gly Gly Gly Leu Arg Gln
180 185
<210> 6
<211> 108
<212> PRT
<213> 人源(Homo sapiens)
<400> 6
Asp Ile Val Phe Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Ile Lys
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
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65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 7
<211> 122
<212> PRT
<213> 人源(Homo sapiens)
<400> 7
Glu Val Pro Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
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65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Phe Phe Cys
85 90 95
Gly Arg Arg Gly Asn Tyr Tyr Gly Ser Leu Tyr Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Ile Val Ser Ser
115 120

Claims (9)

1.一种经NEDD8修饰的CD47蛋白基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。
2.一种经NEDD8修饰的CD47蛋白，其特征在于，由权利要求1所述的经NEDD8修饰的CD47蛋白基因表达得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2 所示。
3.一种表达载体，其特征在于，该载体含有权利要求1所述的经NEDD8修饰的CD47蛋白基因。
4.一种抗CD47单克隆抗体，其特征在于，以权利要求2所述的经NEDD8修饰CD47蛋白为免疫原；所述抗体包括重链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
5.根据权利要求4所述的抗CD47单克隆抗体，其特征在于，所述抗体还包括轻链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
6.一种能产生权利要求4所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
7.根据权利要求4所述的抗CD47单克隆抗体在制备免疫学检测工具中的应用。
8.根据权利要求7所述的抗CD47单克隆抗体的应用，其特征在于，在制备检测CD47蛋白的生物检测试剂中的用途。
9.根据权利要求7所述的抗CD47单克隆抗体的应用，其特征在于，应用于制备检测CD47抗原的试剂。
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