CN111440230B - 一种空肠弯曲菌外膜蛋白的串联表位多肽、基因、重组质粒、重组菌的构建及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种空肠弯曲菌外膜蛋白的串联表位多肽、基因、重组质粒、重组菌的构建及其应用，属于基因工程疫苗技术领域。本发明的空肠弯曲菌外膜蛋白的串联表位多肽能够激活小鼠的免疫反应，具有高效预防空肠弯曲菌定植的作用。本发明的串联表位多肽能够用于预防空肠弯曲菌感染的疫苗制备。

Description

一种空肠弯曲菌外膜蛋白的串联表位多肽、基因、重组质粒、 重组菌的构建及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程疫苗技术领域，尤其涉及一种空肠弯曲菌外膜蛋白的串联表位多肽、基因、重组质粒、重组菌的构建及其应用。
背景技术
空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)是20世纪70年代发现的革兰阴性、微需氧的人兽共患病病原菌，主要通过污染食物而感染人类引起急性肠炎，还可导致吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barra syndrome，GBS)、反应性关节炎和Reiter’s综合征等并发症。
疫苗接种是对感染性疾病预防的有效途径，例如幽门螺旋杆菌疫苗已取得重大进展，而空肠弯曲菌疫苗却因不同血清型抗原分子结构差异，或潜在的周围神经免疫性损伤等原因未获更多进展。多抗原肽疫苗(multiple antigenic peptides，MAP)是以反向疫苗学(Reverse Vaccinology)技术鉴定的多个优势抗原表位与高分子核心载体人工交联而成的新一代基因工程疫苗，具有同时提呈多种多个抗原表位、抗原提呈作用强、各抗原肽分枝之间非共价结合后形成构成表位提高免疫效果、个别氨基酸突变不影响抗原提呈与后继免疫应答等优点。抗原表位长度通常在30个氨基酸以下，其中优势抗原表位通常可体现完成蛋白抗原分子50％以上的免疫原性。此外，抗原表位短肽可通过重复串联式表达显著提高其产量。然而，目前尚无空肠弯曲菌MAP基因工程疫苗的研究报道。而且随着空肠弯曲菌耐药菌株的不断增加，寻求一种新的、安全、高效的空肠弯曲菌亚单位疫苗具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种空肠弯曲菌外膜蛋白的串联表位多肽、基因、重组质粒、重组菌的构建及其应用，该空肠弯曲菌外膜蛋白的串联表位多肽能够诱导免疫反应，减少空肠弯曲菌定植的数量。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种空肠弯曲菌外膜蛋白的串联表位多肽，所述空肠弯曲菌外膜蛋白的串联表位多肽氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了一种编码上述方案所述空肠弯曲菌外膜蛋白的串联表位多肽基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种包含上述方案所述基因的重组质粒。
优选的，所述重组质粒以pET30a作为原始质粒。
优选的，所述基因插入在pET30a上的Nde I和Hind III酶切位点之间。
本发明还提供了一种包含上述方案所述重组质粒的重组菌。
本发明还提供了上述方案所述的空肠弯曲菌外膜蛋白的串联表位多肽、所述基因、所述重组质粒或者所述重组菌在制备预防空肠弯曲菌感染的疫苗中的应用。
本发明的有益效果：本发明提供了一种空肠弯曲菌外膜蛋白的串联表位多肽、基因、重组质粒、重组菌的构建及其应用。本发明的空肠弯曲菌外膜蛋白的串联表位多肽能够激活小鼠的免疫反应，具有高效率预防弯曲杆菌定植的作用。本发明的空肠弯曲菌外膜蛋白的串联表位多肽能够用于制备预防空肠弯曲菌感染的疫苗。
附图说明
图1为重组原核表达载体pET30a结构示意图；
图2为空肠弯曲菌Omp18基因与pET30a连接后Nde I和Hind III双酶切结果；
图3为空肠弯曲菌AhpC基因与pET30a连接后Nde I和Hind III双酶切结果；
图4为空肠弯曲菌FlgH基因与pET30a连接后Nde I和Hind III双酶切结果；
图5为rOmp18、rAhpC和rFlgH纯化效果及其与相应抗体结合情况；其中图5中的A为rOmp18、rAhpC和rFlgH亲和层析提纯后考马斯亮蓝染色结果；图5中的B为rOmp18、rAhpC和rFlgH与相应抗体结合后Western Blot检测情况；
图6为Omp18、AhpC和FlgH T-B联合抗原表位与相应抗体结合反应性结果；
图7为rAhpC-2/Omp18-1/FlgH-1串联表位肽核苷酸测序结果，其中红、蓝和黄色分别表示AhpC-2、Omp18-1和FlgH-1T-B联合表位核苷酸序列；
图8为rAhpC-2/Omp18-1/FlgH-1串联表位肽氨基酸序列，其中红、蓝和黄色分别表示AhpC-2、Omp18-1和FlgH-1T-B联合表位氨基酸序列；
图9为串联表位肽SDS-PAGE(图9中的A)和WesternBlot(图9中的B)检测结果；
图10为不同重组表位肽免疫小鼠后血清特异性IgGs水平变化情况，*表示与未免疫小鼠比较P<0.05；
图11为CD4+细胞数量变化情况；
图12为CD4+IFN-γ+细胞数量变化情况；
图13为CD4+IL-4+细胞数量变化情况；
图14为CD8+细胞数量变化情况；
图15为IFN-γ+CD8+细胞数量变化情况；
图16为CD8+IL-4+细胞数量变化情况；
图17为各组小鼠免疫后体重变化；
图18为免疫小鼠肠黏膜病理学检查结果。
具体实施方式
本发明提供了一种空肠弯曲菌外膜蛋白的串联表位多肽，所述空肠弯曲菌外膜蛋白的串联表位多肽(TKKAL或空肠弯曲菌OMP18-1/AhpC-2/FlgH-1串联表位多肽)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：MTKKALDFTAPAVLGGSKAVKEALIAKGVNADRIAVKSYGETNPVCTEKTKACDAQNRRGGSFGCSATVDPQISMKPPAYVEELAPKQSNNVESAPGSLFGGGSTKKALDFTAPAVLGGSKAVKEALIAKGVNADRIAVKSYGETNPVCTEKTKACDAQNRRGGSFGCSATVDPQISMKPPAYVEELAPKQSNNVESAPGSLFGGGSTKKALDFTAPAVLGGSKAVKEALIAKGVNADRIAVKSYGETNPVCTEKTKACDAQNRRGGSFGCSATVDPQISMKPPAYVEELAPKQSNNVESAPGSLFGHHHHHH；所述空肠弯曲菌外膜蛋白的串联表位多肽包括3个多肽表位，分别为FlgH-1、OMP18-1和AhpC-2；所述表位FlgH-1的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示，具体为：FGC SATVDPQISMKPPAYVEELAPKQSNNVESAPGSLFG；所述表位OMP18-1的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：KAVKEALIAKGVNADRIAVKSYGETNPVCTEKTKACDAQNRR；所述表位AhpC-2的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，具体为：TKKALDFTAPAVLGNNEIVQDFNLYKNIGPKGAVVF；所述FlgH-1、OMP18-1和AhpC-2以连接肽GGS串联，并重复2次。
本发明还提供了一种编码上述方案所述空肠弯曲菌外膜蛋白的串联表位多肽基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：catatgaccaaaaaagcgctggattttaccgcaccggcagttctgggcggtagtaaagccgttaaagaagcactgattgcgaaaggcgttaacgcagatcgtatcgcggttaaaagctacggcgaaaccaacccggtttgcaccgagaaaaccaaagcgtgcgacgcacaaaatcgccgcggcggtagttttggttgttctgcgaccgttgatccgcagatttccatgaaaccgccggcatacgttgaagaactggcaccgaaacagagcaacaacgttgaatctgcaccgggtagtctgtttggcggcggtagcactaagaaagcactagactttacagcgccagctgtacttggaggcagcaaggcggtcaaggaggcgctgattgcgaaaggtgttaacgcggatcgtattgcggtcaaaagctacggcgaaaccaatccggtttgtaccgaaaaaaccaaagcctgcgacgctcaaaatcgccgtggcggtagttttggttgttctgcaaccgtagatccgcagattagcatgaaaccgccggcatacgttgaagaactggcaccgaaacagagcaataacgttgaaagcgcaccgggtagtctgtttggcggcggtagtaccaaaaaagcgctggattttaccgcaccggcagttctgggcggtagcaaagccgttaaagaagcgctgatcgcaaaaggcgttaacgcagatcgtattgcggtcaaaagctacggcgaaaccaatccggtttgcaccgaaaaaaccaaagcctgcgacgcacaaaatcgtcgcggagggagcttcggctgctcagcgactgtcgacccacaaatcagcatgaagccacctgcgtatgtagaggaactcgcgccaaagcaaagtaataacgtagagagcgctccgggtagtctgtttggtcatcatcatcaccatcactaatgaaagctt；本发明所述编码上述方案所述空肠弯曲菌外膜蛋白的串联表位多肽基因经过密码子优化处理；所述密码子优化的软件优选为MaxCodon TM Optimization Program(V13)。
本发明还提供了一种包含上述方案所述基因的重组质粒；所述重组质粒优选的以pET30a作为原始质粒；所述基因优选的插入在pET30a上的Nde I和Hind III酶切位点之间；所述重组质粒的结构图如图1所示。本发明中，所述重组质粒由德泰生物科技(南京)有限公司构建获得。
本发明还提供了一种包含上述方案所述重组质粒的重组菌；所述重组菌优选为重组大肠杆菌；所述重组大肠杆菌优选的包括重组Top10克隆菌株和重组BL21(DE3)表达菌株。本发明中，所述重组菌的构建由德泰生物科技(南京)有限公司完成。
本发明还提供了上述方案所述的空肠弯曲菌外膜蛋白的串联表位多肽、所述基因、所述重组质粒或者所述重组菌在制备预防空肠弯曲菌感染的疫苗中的应用；所述空肠弯曲菌外膜蛋白的串联表位多肽为针对空肠弯曲菌MAP基因工程疫苗的有效表位。
本发明还提供了上述方案所述空肠弯曲菌外膜蛋白的串联表位多肽能够抑制空肠弯曲杆菌在肠道定植，能够预防空肠弯曲杆菌引起的感染。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1实验方法
1.1外膜蛋白Omp18、AhpC和FlgH中T-B联合抗原表位预测
空肠弯曲菌NCTC11168株全基因组序列从美国国家生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AL111168.1)获取。Omp18、AhpC、FlgH基因及其产物序列分别来自NC_002163.1、CAL34485.1、RNF61095.1。Omp18、AhpC、FlgH信号肽和序列采用SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测，跨膜区采用http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/预测，B细胞表位采用IEDB(http://tools.iedb.org/bcell/)在线软件预测，T表位采用http://www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm.预测。根据T和B细胞表位评分及其重合情况，预测出T-B联合表位。
1.2 T-B联合表位肽合成
委托公司采用固相多肽合成技术，以N-α-Fmoc保护氨基酸为原料，Fmoc-AA-Wang树脂为载体，HBTU方法偶联，经HPLC鉴定纯度在95％以上。
1.3外膜蛋白Omp18、AhpC和FlgH原核表达系统构建与抗体制备
1.3.1靶基因片段和表达载体酶切与电泳分离
(1)Omp18、AhpC、FlgH基因克隆和表达载体质粒pET30a用限制性核酸内切酶Nde I和Hind III 37℃水浴酶切2h。酶切反应体系：Nde I 1μL、Hind III 1μL、10×酶切缓冲液2μL、超纯水5.5μL，总体积20μL。
(2)酶切产物与等体积2×电泳上样缓冲液混合，加入到含1μg/mL溴乙锭的1.5％琼脂糖凝胶上样孔，直流100V电泳30min。
1.3.2目的基因片段及载体回收
(1)电泳结束后在紫外线灯上观察，切取目的条带置于1.5mL离心管中，加入4倍体积的Solution SN混匀。
(2)将3S柱放入收集管中，混合液转移至柱内，室温放置2min，盖上离心管盖，室温10000r/min离心1min。
(3)倾去收集管中废液，将3S柱放入同一收集管中，加入600μL Wash Solution，室温10000r/min离心1min。
(4)重复步骤(3)一次。
(5)倾去收集管中废液，将3S柱放入同一收集管中，室温10000r/min离心2min。
(6)将3S柱放入一只新的1.5mL离心管中，在3S柱膜中央加入30μLTE缓冲液，室温放置2min，室温10000r/min离心1min。
(7)收集的液体即为回收的DNA片段，立即使用或保存于-20℃备用。
1.3.3目的片段连接
微量试管中将回收的目的片段和线性化载体pET30a在连接反应体液中连接，PCR扩增仪中16℃过夜。连接反应液如表1：
表1连接体系
Figure GDA0003122895040000051
1.3.4连接产物转化
(1)提前将筛选培养基平板37℃预热。
(2)-80℃取100μL E.coli DH5α感受态细胞，迅速插入冰中，融化后加入2.0μL连接产物，轻轻混匀，冰浴30min。
(3)42℃水浴热激90s，冰浴2min。
(4)每管加700μL 37℃预热的LB液体培养液，37℃ 200r/min振荡培养60min。
(5)取250μL菌液均匀涂布于含100μg/mL卡那霉素的T-A克隆蓝白筛选平板(预先涂布20μL 0.1mM IPTG和40μL 20mg/ml X-gal的LB琼脂平板，37℃干燥)上，37℃正放至涂布液基本被吸收，倒置37℃培养过夜。
1.3.5质粒提取和纯化
(1)用接种环从平板上挑取单个分离良好的白色菌落接种于5mL含0.1μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，160r/min 37℃振荡培养过夜。
(2)取1.5mL菌液加入2mL Epperdorf管中，5000r/min 4℃离心2min。
(3)弃上清，加入100μL冰浴预冷的solution I，剧烈震荡混匀，冰浴5min。
(4)加入250μL Solution II，上下颠倒混匀3～6次，避免震荡，冰浴5min。
(5)加入150μL Solution III，轻轻上下颠倒混匀3～6次，冰浴5min。
(6)13000r/min 4℃离心10min，小心吸取上清液移至另一1.5mL Eppendorf管中，加入等体积苯酚-氯仿(1:1，pH7.8～8.0)，手摇混匀，室温放置2min。
(7)12000r/min 4℃离心10min，小心吸取上层水相移至另一1.5mL Eppendorf管中，加入等体积氯仿手摇混匀，室温放置2min。
(8)10000r/min 4℃离心5min，小心吸取上层水相移至另一1.5mL Eppendorf管中，加入2倍体积预冷无水乙醇，上下颠倒混匀，室温放置2min。
(9)10000r/min 4℃离心10min，弃上清，将1.5mL Eppendorf管倒置于吸水纸上吸干残余液体，用1mL 70％乙醇洗涤沉淀，10000r/min 4℃离心5min，弃上清，37℃挥干。
(10)沉淀溶于约30μLTE缓冲液中，-20℃保存。
1.3.5质粒酶切鉴定
酶切反应体系：限制性核酸内切酶Nde I 1μL和Hind III 1μL、10×酶切缓冲液2μL、质粒10μL(约1.0μg)、超纯水5.5μL，总体积20μL，37℃水浴2h。
10μL酶切产物与等体积2×电泳上样缓冲液混合，加入含1μg/mL溴乙锭的1.5％琼脂糖凝胶上样孔中，直流100V电泳30min，紫外检测仪观察结果。
1.3.6 DNA序列测定
将酶切结果正确的克隆，委托上海Introvigen公司测序。
1.4目的重组蛋白表达与纯化
1.4.1目的重组蛋白诱导表达
(1)将测序验证正确的重组表达质粒转化至E.coliBL21DE3感受态细胞中，方法同上。
(2)挑取阳性单个菌落接种于10mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，200r/min 37℃培养过夜。
(3)吸取培养液按1:100比例，接种于10mLLB培养液中，200r/min 37℃震荡培养至OD600为0.8左右。
(4)加入终浓度为0.5mM IPTG于37℃诱导目的重组蛋白表达4h。
(5)1mL菌液12000r/min离心1min，收集菌体。
(6)pH7.4、0.01mol/LPBS洗涤菌体两次，50μLPBS重悬细菌沉淀。
(7)冰浴超声破碎细菌(超声1min，工作时间3s，间隔3s)。
(8)12000r/min离心10min，上清液转移至另一试管中，取沉淀加入200μL PBS重悬。上清和沉淀各取200μL加入4μL的5×SDS上样缓冲液，混匀，沸水浴5min，SDS-PAGE检测。
1.4.2 SDS-PAGE鉴定表达的目的重组蛋白
(1)配制8％分离胶溶液：双蒸水6.9mL、30％丙烯酰胺-双丙烯酰胺4.0mL、Tris(pH8.8)3.8mL、10％SDS 0.15mL、10％过硫酸铵0.15mL、TEMED 0.009mL。灌注分离胶，留出灌注浓缩胶所需空间并用双蒸水封闭。
(2)室温放置30min后，用双蒸水洗涤凝胶顶部数次以除去未聚合的丙烯酰胺。尽可能排去凝胶上的液体，再用滤纸边缘吸净残留液体。
(3)配制5％浓缩胶8mL，在已聚合的分离胶上灌注浓缩胶液，立即在浓缩胶液中插入干净的Teflon梳子，室温放置30min。
(4)浓缩胶聚合完全后，小心拔出凝胶梳子，用Tris-甘氨酸电泳缓冲液洗涤加样槽。
(5)菌液离心沉淀，PBS重悬后加等量2×SDS凝胶加样缓冲液混匀，100℃水浴3min，每孔上样约20μL。
(6)接通电源，70V恒压电泳，当溴酚蓝指示剂前缘进入分离胶后，150V恒压电泳至溴酚蓝指示剂至分离胶下端，关闭电源。
(7)染色液染色2h，再用脱色液脱色3～5h。
(8)取下凝胶，用考马斯亮蓝染色30～60min。
(9)将胶块转移至脱色液中脱色，期间可更换脱色液，脱色至背景清晰，观察目的重组蛋白rOmp18、rAhpC和rFlgH表达情况。
1.4.3目的重组蛋白纯化
(1)挑取单个阳性菌落接种于10mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中200r/min 37℃培养过夜。
(2)吸取培养液按1:100比例接种于10mL含50μg/mL卡那霉素LB液体培养基，200r/min 37℃培养至OD600值为0.8左右。
(3)加入终浓度0.5mM IPTG于37℃诱导重组蛋白表达4h。
(4)菌液12000r/min离心1min收集细菌沉淀。
(5)PBS(pH7.4)缓冲液洗涤细菌2次，12000r/min离心10min弃上清。
(6)细菌沉淀悬于20mM PB(pH7.2)、300mM NaCl、1％Triton X-100、2mM DTT、0.5mM PMSF溶液中冰浴超声裂解(超声1min，工作3s，间隔3s)。
(7)冰浴中加入1/20体积的NTA-0Buffer和PMSF。PMSF用无水乙醇配制成200mM储存液，4℃保存，工作浓度为1mM。
(8)冰浴中加入终浓度0.2～0.4mg/mL溶菌酶混匀，冰浴30min，超声破碎细菌。
(9)加入终浓度为0.05％TritonX-100，充分混匀，冰浴15min，间或摇动试管混匀。冰浴中超声破碎细胞。
(10)加入终浓度为5mM MgCl2，混匀。加入终浓度10mg/mL DNase，混匀，室温放置10min。
(11)5000r/min 4℃离心15min，取上清，-20℃保存。
(12)NTA树脂装入合适的层析柱，用10倍NTA体积的NTA-0缓冲液过柱。将样品加到NTA层析柱中，流速控制在15mL/h左右，收集穿透液，用于SDS/PAGE分析蛋白结合情况。
(13)用5倍NTA体积的缓冲液过柱，流速控制在30mL/h左右。
(14)用5倍NTA体积的NTA-20、NTA-40、NTA-60、NTA-80、NTA-100、NTA-500缓冲液过柱洗脱，流速控制在15mL/h左右，收集洗脱液。
(15)SDS-PAGE电泳确定目的重组蛋白rOmp18、rAhpC和rFlgH表达情况。在洗脱液中的分布情况。
(16)将含目的重组蛋白洗脱液置于透析袋中，4℃透析，期间更换透析液。
(17)透析后目的重组蛋白用PEG20000浓缩，然后用BCA法测定目的重组蛋白rOmp18、rAhpC和rFlgH浓度，分装后-80℃保存。
1.5 rOmp18、rAhpC和rFlgH抗血清制备
1.5.1动物免疫
(1)挑选健康雄性新西兰家兔6只，每只体重3kg左右，免疫前耳静脉采血约2mL，分离血清与含60％甘油生理盐水1:1混合，-70℃保存。
(2)1mL含2mg rOmp18、rAhpC或rFlgH与卡介苗和1mL弗氏不完全佐剂于5mL注射器内充分乳化。
(3)初次免疫：将上述2mL乳化抗原背部皮下多点注射免疫新西兰家兔。
(4)初次免疫后间隔1周按上法免疫家兔3次。
(5)末次免疫10d后，用50mL无菌注射器采集心血约50mL，分置于两管50mL圆底离心管中，37℃放置1～2h，血液凝固后4℃放置1～2h，使血块充分收缩析出血清。吸取血清3000r/min4℃离心5min，分装血清-20℃保存。
1.5.2IgG提纯
(1)用0.45μm或0.2μm孔径的滤膜过滤所用的溶液。
(2)所有的溶液必须用超声等方法脱气。
(3)选择适当的纯化柱，用适当量的ProteinA Agarose装填纯化柱。
(4)用10～20倍柱体积的TBS洗涤并平衡纯化柱。
(5)将含有待纯化的抗体样本上样到纯化柱。
(6)待纯化的抗体过柱后，用10～20倍柱体积的TBS洗涤，去除未结合和非特异性结合蛋白。洗涤是否完全可以通过测定280nm的吸光度进行确定。
(7)用10mL 50mM glycine(pH2.7)为洗脱液，洗脱结合的IgG，分管收集洗脱抗体，根据蛋白浓度检测结果确定IgG洗脱峰所在收集管。
(8)收集抗体洗脱液PBS中4℃透析过夜。
1.5.3 IgG鉴定
1.5.3.1 IgG浓度测定
采用Bradford法测定IgG提取物蛋白浓度，检测步骤参照上海碧云天生物技术有限公司的Bradford蛋白浓度测定试剂盒说明书。
1.5.3.2 ELISA测定抗体效价
(1)包被：用包被缓冲液将rOmp18、rAhpC和rFlgH配制成5μg/mL溶液，加入板条中，每孔100μL，4℃过夜。
(2)封闭：弃去包被液，用TBST洗板3次，每孔加入200μL封闭液，37℃孵育1h，弃封闭液，TBST洗板2次。
(3)一抗反应：rOmp18-IgG、rAhpC-IgG或rFlgH-IgG按1:500稀释，每孔加100μL，37℃孵育1h。
(4)二抗反应：弃去一抗溶液，TBST洗板3次，每孔加入1:5000稀释的HRP标记羊抗兔二抗100μL，37℃孵育1h。
(5)显色：弃去二抗溶液，TBST洗板4次，每孔加入100μL TMB显色液，根据颜色的深浅决定显色时间，一般37℃显色15min。
(6)终止反应：每孔加入100μL 1M HCl溶液，终止反应，立即在酶标仪上检测450nm处OD值，将OD450值大于设定的阴性对照OD450值2.1倍的孔对应的稀释度，确定为该抗体的效价。
1.6 Dot Blot法和ELISA检测优势表位
1.6.1 Dot Blot法检测
(1)加样：取相同浓度的Omp18、AhpC或FlgH的T-B联合抗原表位肽各5μL滴加于PVDF膜上，自然风干。
(2)封闭：PVDF膜浸入含5％脱脂奶粉的封闭液中，摇床上缓慢摇动，室温封闭1h。
(3)洗膜：1×TBST洗涤7～8遍，摇床10min换液重复3次。
(4)一抗作用：加入1:500稀释的免抗rOmp18-IgG、rAhpC-IgG或rFlgH-IgG为一抗，PVDF膜在室温中摇床上孵育1h。
(5)洗膜：1×TBST洗涤7～8遍，摇床10min换液重复3次。
(6)二抗作用：加入1:4000稀释的HRP标记羊抗兔IgG二抗，PVDF膜在室温中摇床上孵育1h。
(7)洗膜：1×TBST洗涤7～8遍，摇床10min换液重复3次。
(8)ECL化学发光显影：PVDF膜置于保鲜膜上，取适量ECL试剂盒中等体积的A液和B液混合，混匀后加在膜的表面，移入凝胶成像分析仪中，化学光敏模式曝光显影。
1.6.2 ELISA检测T-B联合抗原表位肽与抗体免疫反应性
合成的Omp18、AhpC或FlgH不同T-B联合抗原表位肽分别用包被缓冲液配制成1μg/mL溶液，每个反应孔中加50μL，4℃过夜。次日弃去孔内溶液，TBST洗板1次，1％BSA37℃封闭1h，加1:200、1:1000、1:5000、1:10000、1:20000、1:60000或1:240000稀释的rOmp18-IgG、rAhpC-IgG或rFlgH-IgG为一抗，室温震荡孵育1h，TBST洗板3次，加1:10000稀释的HRP标记羊抗兔IgG二抗，37℃孵育45min，TBST洗板3次，加底物液显色、终止液终止反应后酶标仪读板。
1.7 Omp18、AhpC和FlgH优势T-B联合抗原表位串联多肽基因构建及鉴定
根据上述Dot Blot和ELISA检测结果，选取3个优势T-B联合抗原表位，分别命名为Omp18-1、AhpC-2、FlgH-1。
参照文献(Wei JC,et al.Biochem Biophy Res Commun,2010)，以GGS序列连接AhpC-2、Omp18-1、FlgH-1优势T-B联合抗原表位肽序列，构建3价优势T-B联合抗原表位肽3次重复串联体基因，根据密码子优化软件MaxCodonTM Optimization Program(V13)对重复串联体氨基酸密码子进行优化，采用全基因合成法合成3价优势T-B联合抗原表位肽3次重复串联体人工基因片段。通过限制性核酸酶切位点Nde I和Hind III将目的基因插入原核表达载体pET30a中，采用双酶切和测序确认重组表达载体序列的正确性，然后分别转化入大肠埃希菌Top10克隆菌株和BL21DE3表达菌株中，构建出3价优势T-B联合抗原表位肽3次重复串联原核表达系统。重组原核表达载体pET30a结构示意图如图1所示。
1.8 rAhpC-2/Omp18-1/FlgH-1表达与纯化
目的重组蛋白rAhpC-2/Omp18-1/FlgH-1表达与纯化方法同1.4.1和1.4.3。
1.9 rAhpC-2/Omp18-1/FlgH-1免疫原性检测
1.9.1 rAhpC-2/Omp18-1/FlgH-1免疫动物
4～6周龄SPF级雌性BALB/c小鼠90只，随机分为5组，分别为A组(25μg rAhpC-2/Omp18-1/FlgH-1+完全弗氏佐剂)、B组(25μg rAhpC+完全弗氏佐剂)、C组(25μg rOmp18+完全弗氏佐剂)、D组(25μg rFlgH+完全弗氏佐剂)、F组(等量NS+完全弗氏佐剂，对照组)。免疫方法同1.5.1。
1.9.2 ELISA检测血清特异性抗体IgG1和IgG2a
(1)各组免疫小鼠随机抽取5只，末次免疫2周后采血，ELISA法测定血清IgG。
(2)包被：用包被缓冲液配制5μg/mL提纯的rAhpC-2/Omp18-1/FlgH-1、rAhpC、rOmp18、rFlgH溶液，每孔100μL，4℃过夜。
(3)洗涤：1×PBST洗板3次。
(4)封闭：各孔加入100μL 5％BSA-PBST，37℃封闭1h。
(5)洗涤：1×PBST洗板3次。
(6)一抗：每孔加入1:100稀释的rAhpC-2/Omp18-1/FlgH-1、rAhpC、rOmp18、rFlgH兔抗血清，37℃孵育2h。
(7)洗涤：1×PBST洗板3次
(8)二抗：每孔加入100μL 1:10000稀释HRP标记羊抗兔IgG1或IgG2a，37℃孵育1h。
(9)显色：每孔加入100μLTMB底物显色溶液，避光37℃孵育15min。
(10)中止反应：每孔加入100μL 2M硫酸中止反应。
(11)结果测定：酶标仪450nm波长检测OD450值。
1.9.3 Western Blot法检测血清特异性抗体
(1)等量rAhpC-2/Omp18-1/FlgH-1、rAhpC、rOmp18、rFlgH SDS-PAGE后半干电转至PVDF膜上，电压为23V，时间为45min。
(2)立春红染液染PVDF膜1min，查看转膜效果，然后用双蒸水漂洗，5％FCS-TBST 4℃封闭过夜。
(3)用TBST 1:1000稀释的免抗血清为一抗，PVDF膜90r/min室温孵育2h，用TBST漂洗30min，每5min换液1次。
(4)用TBST 1:5000稀释的羊抗兔HRP标记IgG为二抗，PVDF膜90r/min室温孵育1h。
(5)用TBST漂洗10min，每5min换液1次。
(6)取出PVDF膜，吸水纸上小心沥干，将膜与ECL(A液与B液各5mL及双氧水20μL混匀)温育1min。
(7)PVDF膜沥干，平展在保鲜膜上，再覆盖一层保鲜膜，赶出气泡，放置于曝光夹中。关闭所有灯光，根据荧光强度估算曝光时间，曝光后将胶片放入显影液、定影液各7min，清水漂洗干净后晾干，观察结果。
1.10流式细胞术检测脾淋巴细胞亚群
1.10.1细胞分离
(1)取小鼠脾组织块称重后，用眼科剪刀无菌操作，将脾脏剪成小块。
(2)将脾组织块放在70μm细胞筛网上，反复研磨后，边研磨边加入匀浆冲洗液(以0.1g组织为例，约加5～8mL)，使细胞通过筛网滴入离心管中。
(3)弃去筛网，脾组织研磨液450r/min离心10min，弃上清。
(4)细胞沉淀用样本稀释液重悬并计数，将细胞悬液细胞浓度调整为2×108～1×109/mL，备用。
(5)取一支合适的离心管，加入与脾单细胞悬液等量分离液(注：分离液不得少于4mL)。
(6)小心吸取脾单细胞悬液加于分离液液面上，400～500r/min离心30min。
(7)离心后离心管中液体由上至下分为四层：第一层为稀释液层，第二层为环状乳白色淋巴细胞层(可含少量红细胞)，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层。
(8)小心吸取第二层环状乳白色淋巴细胞层到另一15mL离心管中，离心管中加入5～10mL洗涤液，混匀。
(9)上述细胞悬液400r/min离心10min。弃上清，细胞沉淀用5ml洗涤液重悬。
(10)上述细胞悬液250r/min离心10min。
(11)重复步骤(9)、(10)，获得后续实验所需的脾淋巴细胞。
1.10.2流式细胞仪检测脾淋巴细胞亚群
脾淋巴细胞悬液分装入流式管，每管加入100μL CD4-IgG、CD8-IgG、IL4-IgG、IFN-γ-IgG，避光室温孵育30min，用流式细胞仪检测脾淋巴细胞中不同T细胞亚群，了解不同实验组小鼠脾淋巴细胞CD4+细胞、IFN-γ+CD4+细胞、IL4+CD4+细胞以及CD8+细胞、IFN-γ+CD8+细胞、IL4+CD8+细胞比例。
1.11动物保护试验
1.11.1动物免疫
BALB/c小鼠随机分为5组：rAhpC-2/Omp18-1/FlgH-1组，rOmp18组、rAhpC组、rFlgH组和正常对照组，每组13只，前4组每只小鼠间隔1周用25μg相应重组蛋白与弗氏完全佐剂乳化后皮下注射免疫，共4次。
1.11.2空肠弯曲菌攻击
末次免疫后第1、3、7天用1mL空肠弯曲菌(5×109CFU)灌胃，然后每天观察8周内动物发病及死亡情况并计算每组疾病指数。评分标准：外表健康为0分，有症状和体征为1分，死亡为2分。小鼠出现活动明显减少、食欲下降、背部耸起、皮毛散乱和灰暗、神萎中一项或几项视为有症状和体征。各组疾病指数之和除以当日被观察动物数获得该组疾病指数，然后根据以下公式计算免疫保护率：保护率＝(对照组疾病指数–免疫组疾病指数)/对照组疾病指数×100％。
1.11.3小鼠空肠样本采集
空肠弯曲菌攻击后第2周，颈椎脱位法处死小鼠，打开腹部，取空肠2cm，轻轻挤压收集内容物悬于灭菌PBS中，另取空肠2cm用4％PFA固定。
1.11.4免疫保护作用评估
小鼠肠组织HE染色后用普通光学显微镜检查。肠黏膜无损伤但有轻度炎症细胞浸润归类为轻度炎症，肠黏膜有中度炎性渗出物和部分坏死归类为中度炎症，肠黏膜几乎完全剥离以及大量炎症细胞浸润、炎性渗出物和坏死归类为严重炎症。
2数据处理与统计学分析
实验数据用均值±标准差
Figure GDA0003122895040000131
表示，采用GraphPad Prism统计软件进行多组均数分析。先对数据进行方差齐性检验，若方差齐性，采用单因素方差分析进行总体比较，用各试验组与对照组均数间用LSD法进行统计分析，对非正态或方差不齐的数据用秩和检验进行统计分析。
3结果与分析
3.1空肠弯曲菌外膜蛋白T-B联合抗原表位预测
IEDB在线预测软件对空肠弯曲菌NCTC11168株Omp18、AhpC和FlgH线性B细胞表位进行了预测，采用Epitope Prediction在线预测软件进行了T细胞表位预测，根据T和B细胞表位评分及其重合情况(T-B联合抗原表位)，获得6个高分值T-B联合抗原表位(表2)。
表2空肠弯曲菌外膜蛋白T-B联合抗原表位预测结果
Figure GDA0003122895040000141
注：下划线为B细胞表位，方框内为人T细胞表位，加粗斜体为小鼠T表位。
3.2空肠弯曲菌外膜蛋白重组表达载体酶切鉴定
空肠弯曲菌Omp18、AhpC和FlgH基因与pET30a连接后Nde I和Hind III双酶切结果见图2～图4(注：泳道M为DNAmarker；泳道1为重组pET30a；泳道2为Nde I和Hind III酶切结果)。其中图2为空肠弯曲菌Omp18基因与pET30a连接后Nde I和Hind III双酶切结果；图3为空肠弯曲菌AhpC基因与pET30a连接后Nde I和Hind III双酶切结果；图4为空肠弯曲菌FlgH基因与pET30a连接后Nde I和Hind III双酶切结果。
3.3空肠弯曲菌目的重组蛋白表达、提纯与免疫原性检测
所构建的空肠弯曲菌Omp18、AhpC和FlgH基因原核表达系统在IPTG诱导下能有效表达目的重组蛋白rOmp18、rAhpC和rFlgH，SDS-PAGE检测结果显示，Ni-NTA亲和层析法提纯的rOmp18(～17kDa)、rAhpC(～22kDa)和rFlgH(～24kDa)均显示为单一蛋白条带(图5中的A)。Bradford法测定提纯的rOmp18、rAhpC和FlgH浓度分别为0.745、1.150和0.381mg/mL。Western Blot检测结果表明rOmp18、rAhpC和rFlgH能与相应抗体发生特异性免疫结合反应(图5中的B)。
3.4空肠弯曲菌Omp18、AhpC和FlgH优势T-B联合抗原表位筛选
Dot Blot检测结果显示，空肠弯曲菌Omp18、AhpC和FlgH各2个T-B联合抗原表位中，rOmp18-IgG能与Omp18-1和Omp18-2表位结合，但前者结合反应强于后者，rAhpC-IgGAhpC和rFlgH-IgG仅分别能与AhpC-2和FlgH-1呈强结合反应(图6)，提示Omp18-1、AhpC-2和FlgH-1为优势T-B联合抗原表位。
3.5空肠弯曲菌AhpC-2/Omp18-1/FlgH-2串联表位肽鉴定
rAhpC-2/Omp18-1/FlgH-1重组pET30a测序结果见图7(注：红、蓝和黄色分别表示AhpC-2、Omp18-1和FlgH-1T-B联合表位核苷酸序列)；氨基酸序列见图8(注：红、蓝和黄色分别表示AhpC-2、Omp18-1和FlgH-1T-B联合表位氨基酸序列)。SDS-PAGE检测结果显示，IPTG可诱导rAhpC-2/Omp18-1/FlgH-1串联重复原核表达系统表达3价重组T-B联合抗原表位肽rAhpC-2/Omp18-1/FlgH-1(图9中的A)。Western Blot检测结果显示，rAhpC-2/Omp18-1/FlgH-1能与空肠弯曲菌全菌抗体发生很强的特异性免疫结合反应(图9中的B)。
3.6串联T-B联合表位肽免疫动物后免疫指标变化
ELISA检测结果显示，rAhpC、rOmp18和rFlgH免疫小鼠血清IgG抗体水平均有升高(P<0.05)，但以T-B联合rAhpC-2/Omp18-1/FlgH-1串联表位肽免疫小鼠血清IgG升高更为显著(P<0.05)，其类型以IgG1和IgG2a为主(图10)。流式细胞仪检测结果显示，rOmp18、rAhpC和rFlgH免疫小鼠脾淋巴细胞中CD4+细胞数量无明显改变(P>0.05)，但rAhpC-2/Omp18-1/FlgH-1串联表位肽免疫小鼠脾淋巴细胞中CD4+细胞数量显著增加(P<0.05)，其中CD4+IL-4+细胞数量明显增加(P<0.05)，CD4+IFN-γ+细胞数量无显著变化(P>0.05)；rAhpC、rOmp18、rFlgH和rAhpC-2/Omp18-1/FlgH-1串联表位肽免疫小鼠脾淋巴细胞中CD8+细胞及其IFN-γ+CD8+细胞数量均无显著变化(P>0.05)，但rAhpC-2/Omp18-1/FlgH-1串联表位肽免疫小鼠CD8+IL-4+细胞数量显著减少(P<0.05)(图11～图16，*表示与未免疫小鼠比较P<0.05，其中图11为CD4+细胞数量变化情况；图12为CD4+IFN-γ+细胞数量变化情况；图13为CD4+IL-4+细胞数量变化情况；图14为CD8+细胞数量变化情况；图15为IFN-γ+CD8+细胞数量变化情况；图16为CD8+IL-4+细胞数量变化情况)。
3.7串联T-B联合抗原表位肽免疫保护效果
动物试验结果显示，未免疫对照组小鼠空肠弯曲菌经消化道感染后，空肠内容物中空肠弯曲菌阳性率为90％，菌落数可达104CFU/mL。rOmp18、rAhpC、rFlgH、rAhpC-2/Omp18-1/FlgH-1串联T-B联合抗原表位肽免疫小鼠空肠内容物中空肠弯曲菌阳性率均显著减少(P<0.05)，其中rAhpC-2/Omp18-1/FlgH-1免疫小鼠空肠弯曲菌阳性率可减少40％，明显低于rOmp18、rAhpC、rFlgH免疫小鼠(P<0.05)。疾病指数分析结果显示，rAhpC-2/Omp18-1/FlgH-1免疫小鼠疾病指数显著低于rOmp18、rAhpC、rFlgH-1免疫小鼠(P<0.05)，其保护率可达80％(表3)。免疫后各组小鼠体重均有增加且无显著差异(图17)。病理检查结果显示，rOmp18、rAhpC和rFlgH免疫小鼠肠黏膜内有较多炎症细胞浸润，rAhpC-2/Omp18-1/FlgH-1免疫小鼠肠黏膜完整、无明显的炎症细胞浸润(图18)。
表3免疫小鼠感染空肠弯曲菌后疾病指数和保护率
Figure GDA0003122895040000161
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 金华职业技术学院
杭州医学院
<120> 一种空肠弯曲菌外膜蛋白的串联表位多肽、基因、重组质粒、重组菌的构建及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 313
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Thr Lys Lys Ala Leu Asp Phe Thr Ala Pro Ala Val Leu Gly Gly
1 5 10 15
Ser Lys Ala Val Lys Glu Ala Leu Ile Ala Lys Gly Val Asn Ala Asp
20 25 30
Arg Ile Ala Val Lys Ser Tyr Gly Glu Thr Asn Pro Val Cys Thr Glu
35 40 45
Lys Thr Lys Ala Cys Asp Ala Gln Asn Arg Arg Gly Gly Ser Phe Gly
50 55 60
Cys Ser Ala Thr Val Asp Pro Gln Ile Ser Met Lys Pro Pro Ala Tyr
65 70 75 80
Val Glu Glu Leu Ala Pro Lys Gln Ser Asn Asn Val Glu Ser Ala Pro
85 90 95
Gly Ser Leu Phe Gly Gly Gly Ser Thr Lys Lys Ala Leu Asp Phe Thr
100 105 110
Ala Pro Ala Val Leu Gly Gly Ser Lys Ala Val Lys Glu Ala Leu Ile
115 120 125
Ala Lys Gly Val Asn Ala Asp Arg Ile Ala Val Lys Ser Tyr Gly Glu
130 135 140
Thr Asn Pro Val Cys Thr Glu Lys Thr Lys Ala Cys Asp Ala Gln Asn
145 150 155 160
Arg Arg Gly Gly Ser Phe Gly Cys Ser Ala Thr Val Asp Pro Gln Ile
165 170 175
Ser Met Lys Pro Pro Ala Tyr Val Glu Glu Leu Ala Pro Lys Gln Ser
180 185 190
Asn Asn Val Glu Ser Ala Pro Gly Ser Leu Phe Gly Gly Gly Ser Thr
195 200 205
Lys Lys Ala Leu Asp Phe Thr Ala Pro Ala Val Leu Gly Gly Ser Lys
210 215 220
Ala Val Lys Glu Ala Leu Ile Ala Lys Gly Val Asn Ala Asp Arg Ile
225 230 235 240
Ala Val Lys Ser Tyr Gly Glu Thr Asn Pro Val Cys Thr Glu Lys Thr
245 250 255
Lys Ala Cys Asp Ala Gln Asn Arg Arg Gly Gly Ser Phe Gly Cys Ser
260 265 270
Ala Thr Val Asp Pro Gln Ile Ser Met Lys Pro Pro Ala Tyr Val Glu
275 280 285
Glu Leu Ala Pro Lys Gln Ser Asn Asn Val Glu Ser Ala Pro Gly Ser
290 295 300
Leu Phe Gly His His His His His His
305 310
<210> 2
<211> 954
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
catatgacca aaaaagcgct ggattttacc gcaccggcag ttctgggcgg tagtaaagcc 60
gttaaagaag cactgattgc gaaaggcgtt aacgcagatc gtatcgcggt taaaagctac 120
ggcgaaacca acccggtttg caccgagaaa accaaagcgt gcgacgcaca aaatcgccgc 180
ggcggtagtt ttggttgttc tgcgaccgtt gatccgcaga tttccatgaa accgccggca 240
tacgttgaag aactggcacc gaaacagagc aacaacgttg aatctgcacc gggtagtctg 300
tttggcggcg gtagcactaa gaaagcacta gactttacag cgccagctgt acttggaggc 360
agcaaggcgg tcaaggaggc gctgattgcg aaaggtgtta acgcggatcg tattgcggtc 420
aaaagctacg gcgaaaccaa tccggtttgt accgaaaaaa ccaaagcctg cgacgctcaa 480
aatcgccgtg gcggtagttt tggttgttct gcaaccgtag atccgcagat tagcatgaaa 540
ccgccggcat acgttgaaga actggcaccg aaacagagca ataacgttga aagcgcaccg 600
ggtagtctgt ttggcggcgg tagtaccaaa aaagcgctgg attttaccgc accggcagtt 660
ctgggcggta gcaaagccgt taaagaagcg ctgatcgcaa aaggcgttaa cgcagatcgt 720
attgcggtca aaagctacgg cgaaaccaat ccggtttgca ccgaaaaaac caaagcctgc 780
gacgcacaaa atcgtcgcgg agggagcttc ggctgctcag cgactgtcga cccacaaatc 840
agcatgaagc cacctgcgta tgtagaggaa ctcgcgccaa agcaaagtaa taacgtagag 900
agcgctccgg gtagtctgtt tggtcatcat catcaccatc actaatgaaa gctt 954
<210> 3
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Phe Gly Cys Ser Ala Thr Val Asp Pro Gln Ile Ser Met Lys Pro Pro
1 5 10 15
Ala Tyr Val Glu Glu Leu Ala Pro Lys Gln Ser Asn Asn Val Glu Ser
20 25 30
Ala Pro Gly Ser Leu Phe Gly
35
<210> 4
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Lys Ala Val Lys Glu Ala Leu Ile Ala Lys Gly Val Asn Ala Asp Arg
1 5 10 15
Ile Ala Val Lys Ser Tyr Gly Glu Thr Asn Pro Val Cys Thr Glu Lys
20 25 30
Thr Lys Ala Cys Asp Ala Gln Asn Arg Arg
35 40
<210> 5
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Thr Lys Lys Ala Leu Asp Phe Thr Ala Pro Ala Val Leu Gly Asn Asn
1 5 10 15
Glu Ile Val Gln Asp Phe Asn Leu Tyr Lys Asn Ile Gly Pro Lys Gly
20 25 30
Ala Val Val Phe
35
<210> 6
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Ala Arg Asn Phe Asp Val Leu Val Ala Glu Ala Val Ala Leu Arg Gly
1 5 10 15
Ser Phe Leu Leu Asp Ala Asp
20
<210> 7
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Lys Ile Leu Phe Thr Ser Ile Ala Ala Leu Ala Val Val Ile Ser Gly
1 5 10 15
Cys Ser Thr Lys Ser Thr Ser Val Ser Gly Asp Ser Ser Val Asp Ser
20 25 30
Asn Arg Gly Ser Gly Gly Ser Asp Gly Trp Asp Ile Asp
35 40 45
<210> 8
<211> 34
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Ala Met Asn Val Asn Asp Leu Val Thr Val Val Ile Gln Glu Ser Thr
1 5 10 15
Thr Gln Ser Thr Gln Ala Asn Lys Ala Thr Ser Arg Thr Asn Thr Asp
20 25 30
Ser Leu

Claims (7)

1.一种空肠弯曲菌外膜蛋白的串联表位多肽，所述空肠弯曲菌外膜蛋白的串联表位多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种编码权利要求1所述空肠弯曲菌外膜蛋白的串联表位多肽基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种包含权利要求2所述基因的重组质粒。
4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒以pET30a作为原始质粒。
5.根据权利要求4所述的重组质粒，其特征在于，所述基因插入在pET30a上的Nde I和Hind III酶切位点之间。
6.一种包含权利要求3～5任意一项所述重组质粒的重组菌。
7.权利要求1所述的空肠弯曲菌外膜蛋白的串联表位多肽、权利要求2所述基因、权利要求3～5任意一项所述重组质粒或者权利要求6所述重组菌在制备预防空肠弯曲菌感染的疫苗中的应用。
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