CN102260322A

CN102260322A - 幽门螺杆菌抗原肽及其应用

Info

Publication number: CN102260322A
Application number: CN201110188650XA
Authority: CN
Inventors: 于浩洋
Original assignee: 苏静
Current assignee: SHENZHEN GENEBIOHEALTH Co Ltd
Priority date: 2011-07-06
Filing date: 2011-07-06
Publication date: 2011-11-30
Anticipated expiration: 2031-07-06
Also published as: CN102260322B

Abstract

本发明涉及包含幽门螺杆菌保护性抗原表位的抗原肽、包含所述抗原肽的多肽、其编码核酸、其抗体以及用于治疗、预防以及诊断幽门螺杆菌的相关疫苗、组合物和试剂盒。

Description

幽门螺杆菌抗原肽及其应用

技术领域

本发明涉及免疫学领域，具体而言涉及包含幽门螺杆菌保护性抗原表位的抗原肽、包含所述抗原肽的多肽、其编码核酸、其抗体以及用于治疗、预防以及诊断幽门螺杆菌的相关疫苗、组合物和试剂盒。

背景技术

幽门螺旋杆菌(Helicobacter prlori，HP)是世界卫生组织认定的第一类致癌因子，在溃疡患者中HP的感染率为80％，健康人群为60％，60岁以上人群为70％。目前在一些发达国家，HP的感染率虽然有所下降，但仍存在大量感染者；而在发展中国家，HP的感染状况则更为严重。目前临床上常采用抗生素治疗HP感染，虽可在一定程度上治愈感染，但存在患者的依从性差、耐药菌株产生和反复感染等问题。大量的实验证明，免疫接种可预防甚至治疗HP感染，所以HP疫苗的研究具有深远的发展前景。

免疫学研究表明，尽管病原体存在多种抗原，但是其中具有诱导动物机体产生免疫应答功能，使动物获得免疫力的抗原只是极少数，这类抗原被称作保护性抗原。重要的是在一个保护性抗原分子中存在多个抗原表位，其中也只有个别抗原表位具有作用，它们被称作保护性抗原表位。然而HP的抗原成分很多。业已表明HP的尿素酶、过氧化氢酶以及外膜蛋白hp0231和hp0410是能诱导动物机体产生免疫应答的保护性抗原。然而，尚不知晓这些保护性抗原中的免疫保护性抗原表位。

传统的疫苗是以减毒或灭活的病原微生物作为免疫原。近年来，随着生物安全和食品安全在现代社会日益重要，由于减毒疫苗存在因病毒返祖或变异而产生强毒株的潜在可能，而灭活菌苗则由于免疫原性差，通常仅仅能够产生体液免疫，并且免疫力较低，免疫持续时间较短，需大剂量反复接种和添加佐剂来达到所需的保护性抗体水平。由全菌制成的灭活疫苗因其组分复杂而副作用较大，而且特别是灭活疫苗诱导的只是针对对应于此菌种的单一亚种的特异性免疫应答，所以，此疫苗只能预防该单一亚种相应的病原，为了预防细菌感染，人或动物例如家畜、禽类等在短时间内必须接种多种疫苗。由于疫苗剂型和种类不同，必须多次接种。然而，尤其对于家畜和禽类而言由此会产生应激反应等，从而影响其生长速度或产蛋量等。

核酸疫苗(nucleic acid vaccine)，也称基因疫苗(genetic vaccine)，是指将含有蛋白基因编码序列的质粒载体，经肌肉注射或微弹轰击等方法导入宿主体内，通过宿主细胞表达抗源蛋白，诱导宿主细胞产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。与传统疫苗相比，核酸疫苗具有许多优越性：1.免疫保护力强，既可以产生体液免疫，也有细胞免疫，由于核酸疫苗接种后，系在机体细胞内表达免疫原，有利于MHC I类分子的抗原递呈，故可以诱生机体产生特异性细胞免疫反应(即特异性细胞毒性T淋巴细胞，CTL)，攻击已被感染且有相应抗原表达的宿主细胞，对寄生有病原微生物的宿主细胞乃至肿瘤细胞均具杀伤清除作用；2.核酸疫苗不存在传统减毒疫苗毒力回复的危险，理论上可兼具灭活疫苗与减毒疫苗之长；3.与传统的蛋白质疫苗相比，核酸疫苗的制备过程毋须涉及复杂的蛋白质纯化工艺，成本较低廉；4.同种异株交叉保护，即：在制备基因疫苗时，可通过对基因表达载体所携带的靶基因进行改造、嫁接与组合；5.应用较安全；6.产生持久免疫应答；7.核酸疫苗容易制备成多价疫苗，即可将编码不同抗原的基因构建在同一质粒中，或将不同抗原基因的多种重组质粒联合应用。8.核酸疫苗的质粒DNA稳定性好，便于贮存和运输，无须冷藏。正是由于上述特点，核酸免疫技术被誉为疫苗发展史上的第三次革命，成为生物技术领域研究的热点。

发明内容

本发明的目的是提供包含保护性抗原表位的幽门螺杆菌抗原肽、多肽、其编码核酸、其抗体、包含所述核酸的核酸疫苗、包含所述抗体的组合物等及其应用。

本发明涉及：

1)幽门螺杆菌抗原肽，其包含选自以下的一种氨基酸序列：分别对应于幽门螺杆菌尿素酶氨基酸序列SEQ ID NO：35中第545-551位(SEQ IDNO：39)和第555-561位(SEQ ID NO：40)氨基酸的氨基酸序列、分别对应于幽门螺杆菌过氧化氢酶氨基酸序列SEQ ID NO：36中第357-363位(SEQ IDNO：41)和第456-462位(SEQ ID NO：42)氨基酸的氨基酸序列、对应于幽门螺杆菌外膜蛋白hp0231氨基酸序列SEQ ID NO：37中第152-158位氨基酸(SEQ ID NO：43)的氨基酸序列、和分别对应于幽门螺杆菌外膜蛋白hp0410氨基酸序列SEQ ID NO：38中第170-176位(SEQ ID NO：44)和第219-225位(SEQ ID NO：45)氨基酸的氨基酸序列。

2)上述1)的抗原肽，其包含选自SEQ ID NO：39-45的一种氨基酸序列。

3)上述2)的抗原肽，其包含选自以下的一种氨基酸序列：分别对应于幽门螺杆菌尿素酶氨基酸序列SEQ ID NO：35中第541-555位(SEQ ID NO：1)和第552-565位(SEQ ID NO：2)氨基酸的氨基酸序列、分别对应于幽门螺杆菌过氧化氢酶氨基酸序列SEQ ID NO：36中第350-365位(SEQ ID NO：3)和第453-468位(SEQ ID NO：4)位氨基酸的氨基酸序列、对应于幽门螺杆菌外膜蛋白hp0231氨基酸序列SEQ ID NO：37中第148-163位氨基酸(SEQ IDNO：5)的氨基酸序列、和分别对应于幽门螺杆菌外膜蛋白hp0410氨基酸序列SEQ ID NO：38中第163-178位(SEQ ID NO：6)和第217-232位(SEQ IDNO：7)氨基酸的氨基酸序列。

4)上述3)的抗原肽，其由一种所述氨基酸序列组成。

5)上述4)的抗原肽，其为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示的肽。

6)一种多肽，其包含一种或多种上述1)-5)中任一项的抗原肽。

7)上述6)的多肽，其包含两种以上上述1)-5)中任一项的抗原肽，其中所述抗原肽可以来自相同或不同的亚种或菌株。

8)上述6)或7)的多肽，其还包含T表位抗原，优选包含T通用表位，例如SEQ ID NO：10所示的表位。

9)上述6)-8)中任一项的多肽，其由SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列组成。

10)一种核酸，其包含编码上述1)-5)中任一项的抗原肽或上述6)-9)中任一项的多肽的核苷酸序列。

11)上述10)的核酸，其编码上述1)-5)中任一项的抗原肽或上述6)-9)中任一项的多肽的核苷酸序列。

12)上述10)的核酸，其由SEQ ID NO：28组成。

13)一种载体，其包含上述10)-12)中任一项的核酸。

14)上述13)的载体，其还包含奇孔古尼亚病毒的复制单元NSPs。

15)上述13)或14)的载体，其还包含脑心肌病毒的内部核糖体进入位点。

16)核酸疫苗，其包含上述10)-12)中任一项的核酸或上述13)-15)中任一项的载体。

17)抗体，其特异性地针对上述1)-5)中任一项的抗原肽。

18)上述17)的抗体，其为IgY抗体。

19)幽门螺杆菌抗原肽，其包含上述17)的抗体所识别的抗原表位。

20)免疫原性组合物，其包含一种或多种上述1)-5)和19)中任一项的抗原肽，或包含上述6)-9)中任一项的多肽。

21)组合物，其包含一种或多种上述17)或18)的抗体。

22)上述21)的组合物，其包含通过用上述16)的核酸疫苗免疫禽类而获得的混合抗体。

23)上述21)或22)的组合物，其为用于检测幽门螺杆菌的组合物。

24)上述21)或22)的组合物，其为用于治疗幽门螺杆菌感染的组合物。

25)用于检测幽门螺杆菌的试剂盒，其包含一种或多种上述17)或18)的抗体、或上述21)或22)的组合物。

附图说明

图1为本发明所用的pNSPs-tPA-nEpitope-IRES-MyD88真核表达质粒以及其构建流程示意图。

图2为本发明所使用的幽门螺旋杆菌多个保护性抗原表位的氨基酸序列串联构造和核苷酸序列串联构造以及连接臂构造的示意图。

图3为本发明胶体金非侵入性卵黄抗体唾液抗原快速检测试纸条的构造图。

图4为本发明新型非侵入性卵黄抗体唾液抗原快速检测试剂盒的使用示意图。

图5显示了本发明中分别以幽门螺杆菌四种保护性抗原的单克隆抗体和新型非侵入性卵黄抗体(IgY)来检测唾液中HP抗原的检测结果。图中，P13：以尿素酶UreB单克隆抗体作为检测试剂条加样区填充物的胶体金试剂条唾液快速检测结果，为阳性(+)；P14：以尿素酶UreB单克隆抗体作为检测试剂条加样区填充物的胶体金试剂条唾液快速检测结果，为阳性(+)；P15：以hp0231外膜蛋白单克隆抗体作为检测试剂条加样区填充物的胶体金试剂条唾液快速检测结果，为阳性(+)；P16：以hp0410外膜蛋白单克隆抗体作为检测试剂条加样区填充物的胶体金试剂条唾液快速检测结果，为阳性(+)；L1、L2和L3：以抗幽门螺杆菌的多价特异性核酸疫苗免疫SPF母鸡(来航鸡)后分离提纯的卵黄抗体作为检测试剂条加样区填充物的胶体金试剂条唾液快速检测结果，为阳性(+)。

图6为显示本发明中在小鼠口服IgY抗体制剂8周之后，其胃组织免疫组化比较试验结果的相片。

图7为显示本发明中通过感染幽门螺旋杆菌的小鼠模型进行IgY的功能效率试验结果的图表。

图8为本发明中小鼠体内炎性细胞因子检测试验(实时PCT，Real-TimePCR)结果分析图。

具体实施方式

业已知晓，幽门螺旋杆菌的尿素酶、过氧化氢酶以及2种具有粘附功能的外膜蛋白是免疫保护性抗原。为了确定这些免疫保护性抗原中的免疫保护性抗原表位，本发明人构建了多个来自幽门螺旋杆菌尿素酶、过氧化氢酶以及具有粘附功能的外膜蛋白免疫保护性抗原蛋白的原核表达质粒，然后诱导其高效表达、分离和纯化，从而获得多个幽门螺旋杆菌免疫特异性蛋白抗原。通过利用杂交瘤细胞技术制备和克隆出相应表达各自特异性抗体的融合细胞株，经融合细胞株培养和培养细胞表达产物的检测，证实获得了其各自的保护性单克隆抗体。经噬菌体展示技术筛选并鉴定出尿素酶、过氧化氢酶、外膜蛋白hp0231和外膜蛋白hp0410中与所述单克隆抗体结合的7肽(SEQ ID NO：39-45)，它们分别对应于尿素酶氨基酸序列SEQID NO：35中的第545-551位和第555-561位、过氧化氢酶氨基酸序列SEQID NO：36中的第357-363位和第456-462位、外膜蛋白hp0231氨基酸序列SEQ ID NO：37中的第152-158位、以及外膜蛋白hp0410氨基酸序列SEQID NO：38中的第170-176位和第219-225位。

此外，本发明人对幽门螺旋杆菌尿素酶、过氧化氢酶以及外膜蛋白hp0231和hp0410进行了生物信息学分析：A)利用哈佛大学的在线生物信息学软件(http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/antigenic.html)进行对保护性抗原蛋白抗原表位预测；B)利用生物信息学软件DNAMAN，分析每个保护性抗原蛋白的DNA序列和对应编码的蛋白质的亲水性和疏水性并预测其二级结构；C)利用www.ncbi.nlm.nih.gov网站上的BLAST工具进行同源性搜索和分析。选取实测单克隆抗体所对应抗原基础表位序列的数据库集合与预测的保护性抗原表位序列数据库集合的交集，确定了保护性抗原幽门螺旋杆菌尿素酶、过氧化氢酶以及外膜蛋白hp0231和hp0410中的免疫保护性抗原表位，即SEQ ID NO：1-7所示的肽。SEQ ID NO：1-7分别对应于尿素酶氨基酸序列SEQ ID NO：35中第541-555位(SEQ ID NO：1)和第552-565位(SEQ ID NO：2)氨基酸的氨基酸序列、过氧化氢酶氨基酸序列SEQ ID NO：36中第350-365位(SEQ ID NO：3)和第453-468位(SEQ ID NO：4)位氨基酸的氨基酸序列、外膜蛋白hp0231氨基酸序列SEQ ID NO：37中第148-163位氨基酸(SEQ ID NO：5)的氨基酸序列、和外膜蛋白hp0410氨基酸序列SEQ IDNO：38中第163-178位(SEQ ID NO：6)和第217-232位(SEQ ID NO：7)氨基酸的氨基酸序列。

发明人还确定了ureB的T细胞表位(SEQ ID NO：8和9)。所述细胞表位通过IEDB提供的在线预测工具http://tools.immuneepittope.org/main/html/tcell_tools.html分析而获得。关于本发明中包含的T通用表位，例如SEQ ID NO：10所示的表位，请参见“间日疟原虫多表位疫苗基因的设计、合成与酵母表达”Journal of TropicalMedicine Vol.6 No.8 Aug.2006。

1.抗原肽和多肽

本发明涉及幽门螺旋杆菌保护性抗原尿素酶、过氧化氢酶以及外膜蛋白bp0231和hp0410中的免疫保护性抗原表位。所述抗原表位包含幽门螺杆菌中对应于本发明所鉴定7肽的氨基酸序列，例如对应于SEQ ID NO：1-7中任一序列的氨基酸序列，优选包含SEQ ID NO：1-7中任一序列。

本发明涉及包含这些免疫保护性抗原表位的抗原肽。本发明的抗原肽也包括含有来自幽门螺杆菌其他亚种或菌株(例如幽门螺杆菌SS1菌株、幽门螺杆菌NCTC11637菌株)的尿素酶、过氧化氢酶以及外膜蛋白hp0231和hp0410中所对应的抗原表位的抗原肽。优选所述抗原肽由SEQ ID NO：1-7所示的任一种肽组成。

本发明的抗原肽也可以含有针对SEQ ID NO：1-7中所示任一抗原表位的抗体所识别的抗原表位。这样的抗原表位例如由幽门螺杆菌尿素酶、过氧化氢酶、外膜蛋白hp0231或外膜蛋白hp0410中与对应于SEQ ID NO：1-7中任一序列的序列相比长度更短或更长的氨基酸序列组成。

本发明的抗原肽可以与载体蛋白融合形成融合蛋白，以作为例如用于诱导产生保护性免疫应答的抗原。所述载体可以是任何已知的任何载体，例如牛血清白蛋白(BSA)、钥匙孔血蓝蛋白(KLH)等。

本发明涉及包含一种或多种、优选两种以上、例如2、3、4、5、6或7种本发明抗原肽的多肽。当本发明的多肽含有两种以上抗原肽时，所述抗原肽可以来自相同或不同的幽门螺杆菌亚种或菌株。本发明的多肽可以含有接头肽，以将两种以上的抗原肽连接在一起。这样的接头肽是本领域已知的。本发明的多肽还可以包含T抗原表位，例如SEQ ID NO：8-9所示的幽门螺杆菌UreB的T细胞表位氨基酸序列，分别对应于尿素酶氨基酸序列中的第546-561位(16个氨基酸)FVDGKEVTSKPANKVS和第230-244位(15个氨基酸)AINHALDVADKYDVQ。优选本发明的多肽包含所有7种抗原肽。本发明的多肽还可以包含通用T抗原表位，例如SEQ ID NO：10所示的白喉毒素T细胞表位(通用表位)。本发明的多肽更优选由SEQ ID NO：1-10组成。

本发明的抗原肽或多肽可以通过合成制备，也可以利用基因重组技术来制备。

2.核酸

本发明涉及包含编码本发明抗原肽或多肽的核苷酸序列的核酸。

所述核酸可以包含myD88基因的cDNA的核苷酸序列。myD88为髓样分化因子，它是Toll样受体(Toll-Linker receptor，TLR)信号通路中的一个关键接头分子，是免疫应答中信号的进一步快速呈递的必要条件，可促进DC内的信号传导和DC的成熟，激活特异性免疫应答。。

本发明也包括包含所述核酸的载体。本发明的载体可以为任何载体，例如质粒载体、病毒载体等，可以为克隆载体或表达载体。

本发明的载体可以含有有利于本发明核酸复制和/或表达的各种元件，例如复制元件、启动子、增强子、终止子、内部核糖体进入位点(IRES)等。这些元件是本领域技术人员所熟知的。

在一个实施方案中，本发明的载体为真核表达载体。所述载体优选含有奇孔古尼亚病毒(Chikungunya virus)的复制单元NSPs(由NSP1、NSP2、NSP3和NSP4组成)。奇孔古尼亚病毒复制单元NSP1-NSP4基因的核苷酸序列如图1所示。

本发明的载体还可以含有IRES元件，即，源自脑心肌病毒(ECMV)的内部核糖体进入位点。该IRES是单启动子双表达哺乳动物表达载体的重要元件，IRES两侧存在着两个多克隆位点(MCS A和MCS B)，能够使来自于同一个顺反子mRNA转录的两个基因在哺乳动物细胞内以较高的水平表达。

本发明的载体还可以含有外源通用T细胞表位(例如SEQ ID NO：10所示的T细胞表位)，并在此序列前插入组织型纤溶酶原(tPA)的蛋白分泌信号肽基因。这些结构就使得该质粒能够在被转染的细胞内经转录和复制产生幽门螺杆菌多个保护性抗原肽和外源通用T细胞表位肽，并且在信号肽的先导之下，被逐步分泌到细胞外。

3.疫苗

本发明涉及针对幽门螺杆菌的疫苗。

在一个实施方案中，本发明的疫苗包含本发明的抗原肽或多肽。姜政等2003(“幽门螺旋杆菌疫苗的研究进展”，世界华人消化杂志2003；11(8)：1451-1456)成功克隆并融合表达了幽门螺杆菌Hsp和外膜蛋白，Western印迹法检测显示重组蛋白有良好的免疫原性，为幽门螺杆菌多价疫苗的开发奠定了基础。此外，朱森林等2003(“优化构建UreB/HpaA双价幽门螺杆菌减毒活菌疫苗的免疫保护作用”，，2003年第10期)研究发现，幽门螺杆菌单一抗原所提供的保护率几乎均低于80％，使用2种或多种抗原成分联合免疫，可使100％的小鼠避免HP感染，这说明多抗原组合的疫苗具有理想的保护效果。

因此，在一个优选实施方案中，本发明的疫苗包含两种以上、例如2种、3种、4种、5种、6种或7种本发明的抗原肽、或包含本发明的多肽。

本发明的疫苗还可以含有佐剂，以增强免疫应答。这种佐剂可包括但不限于无机凝胶，例如氢氧化铝；表面活性物质如溶血卵磷脂、聚醚多元醇(pluronic polyol)、聚阴离子；肽；油乳液；弗氏佐剂；及具有潜在用途的人佐剂如BCG和小棒杆菌(Corynebacterium parvum)。

在另一个实施方案中，本发明的疫苗为核酸疫苗。所述核酸疫苗包含上述的载体。

可以将本发明的疫苗给予人类或非人类动物，包括啮齿动物、鸟类、哺乳动物等，例如牛、马、绵羊、猪、禽(例如鸡)、山羊、猫、狗、仓鼠、小鼠和大鼠，以供免疫之用。

本发明的疫苗可以通过任何常规的途径施用，例如通过任何胃肠外途径，如静脉内、腹膜内、皮内、通过划痕、皮下、肌内、经粘膜途径或微弹轰击施用。

本发明的疫苗的给药量为例如20-50μg/kg核酸疫苗。

4.抗体

本发明涉及特异性针对本发明抗原肽的抗体或其抗原结合片段。所述抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，可以为IgG、IgA、IgE、IgM或IgY。所述抗原结合片段包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv片段等。

本发明的抗体可以得自人或非人类动物，诸如得自啮齿动物、鸟类、哺乳动物，例如得自牛、马、绵羊、猪、禽(例如鸡)、山羊、猫、狗、仓鼠、小鼠和大鼠。

本发明的抗体可以通过用本发明的抗原肽或多肽、或包含所述抗原肽或多肽的组合物、或核酸疫苗免疫合适的动物而获得。制备抗体的方法是本领域众所周知的，例如可以参见林学颜、张玲主编的《现代细胞与分子免疫学》，科学出版社，2000；也可参见本说明书的实施例1(1)。

在本发明的一个实施方案中，本发明的抗体为IgY。

王炯等研究组于1997年(“鸡卵黄抗体理化特性的研究”，中国生物制品学杂志，1997；10(3)：140-143)和Schade R等人于1996年(“Egg yolk antibodies，state of the art and future prospects”，ALTEX，1996；13(5)：5-9)指出了与产生于哺乳动物的IgG相比，IgY具有许多独特的优点：(1)无需采血，只需收集免疫母鸡产下的鸡蛋即可获得抗体；(2)Gottestein和Hemmeler 1985(“Eggyolk immunoglobulin Y as an attemative antibody in serology of echinococcosis”，Parasitology Research，Vol.71，No.2，p273-276)使用少量的抗原免疫禽类既可获得大量的质量均一的特异性IgY；(3)由于种系发生距离相差很大，禽类IgY与哺乳动物免疫球蛋白之间不会发生交叉血清学反应；(4)特异性最强，不激活哺乳动物的补体系统，不与类风湿因子或Fc受体相结合，避免在免疫检测过程中产生假阴性或价阳性结果；(5)耐热、耐酸，巴氏灭菌温度下也不会失活并且在pH值小于3时仍能保持稳定活性，(6)IgY易于保存，可常温保存和低温保存，在室温条件下其免疫效价可稳定保存11个月，在冰箱冷藏保存(4-8℃)有效期至少2年以上；(7)提取工艺最为简单，成本最为低廉。

IgY对检测方法的改进胶乳凝集试验是将可溶性抗原(或抗体)吸附于聚苯乙烯胶乳载体颗粒的间接凝集试验。根据此原理，将胶体金标记抗体固定于特制的载体，则为免疫金标记法。这种方法简便、快速、敏感、特异，因此广泛用于疾病的快速诊断。试验中常用的抗体是哺乳动物IgG。然而，聚苯乙烯胶乳吸附蛋白质存在结合不牢固的问题，影响了检测效果。由于IgY具有更高的特异性和敏感性，可用IgY代替哺乳动物抗体作胶乳凝集试验及制作胶体金。Davalos Pantoja L等(“A comparative studybetween the adsorption of IgY and IgG on latex particles”，J.Biomater.Sci.Polym Ed.，2000；11(6)：657-73)对此做了初步研究。他们对IgY胶乳复合物进行了蛋白质吸附和解离、等电点、电场迁移率和胶体金稳定性等研究，并与IgG进行比较，发现IgY是一种疏水性更强的蛋白质，它与乳胶的结合力更强，用它包被乳胶颗粒制作的胶体金比IgG稳定性更好。

5.组合物

本发明还包括含有一种或多种本发明抗体的组合物。本发明的组合物优选含有两种以上本发明抗体，所述抗体优选为IgY抗体。更优选本发明的组合物包含通过用本发明的核酸疫苗免疫禽类而获得的混合抗体。

在一个实施方案中，本发明的组合物为用于检测幽门螺杆菌的检测用组合物。

在另一实施方案中，本发明的组合物为用于治疗幽门螺杆菌的药物组合物。本发明的药物组合物还可包含可药用载体、赋形剂等。制备药物组合物的方法以及合适的载体和赋形剂是本领域技术人员所熟知的。

6.试剂盒

本发明还包括用于检测样品中幽门螺杆菌的试剂盒，其含有一种或多种本发明抗体，优选含有两种以上本发明抗体，所述抗体优选为IgY抗体。更优选本发明的试剂盒包含通过用本发明的核酸疫苗免疫禽类而获得的混合抗体。

在一个实施方案中，本发明试剂盒所测试的样品为唾液。在一个优选实施方案中，本发明涉及非侵入性卵黄抗体唾液抗原快速检测试剂盒。所述试剂盒可如下制备。

在将本发明的核酸疫苗与转染试剂混合，然后加入弗氏佐剂，经过充分的混合，分别对经过试验筛选、具有高免疫应答活性的免疫SPF级良种产蛋母鸡或者良种产蛋母鸭或者产蛋火鸡等禽类进行胸部皮下、翅膀下胸肌内注射，注射剂量为每只鸡或鸭20-40μg。注射免疫10天后，开始在卵黄中产生IgY，大约在免疫接种后20天，其卵中的卵黄抗体IgY可达到一个较高的峰值，于是分别捡取鸡或鸭或火鸡所产的蛋，并按照不同抗原所得的免疫蛋加以不同标记以作区别。

从免疫蛋中分离、提取和纯化卵黄抗体IgY，制备含有卵黄抗体IgY的试剂盒。

以下通过非限制性的实施例来进一步说明本发明，以便本领域技术人员更好地理解和实施本发明。

实施例

实施列1.分析确定幽门螺旋杆菌尿素酶、过氧化氢酶以及具有粘附功能的外膜蛋白免疫保护性抗原表位的氨基酸序列和核苷酸序列

1.制备针对幽门螺旋杆菌尿素酶、过氧化氢酶以及具有粘附功能的外膜蛋白hp0231和hp0410免疫保护性抗原的单克隆抗体。

(1)病毒的复制与纯化

根据GenBank提供的幽门螺杆菌HP26695株基因组序列，分别设计引物：

ureB基因：Pf：AGATCTCTAATACTTTTTCTAATCG，

Pr：AAATCGTAAAAGATCAATCGTCGAC；

katA基因：Pf：AGATCTCTAATACCAATTATTTCTA，

Pr：TTTTTCTTTTTCATTAATCGTCGAC；

hp0231基因：Pf：AGATCTCTAATACTATAATTCTCGC，

Pr：GTAATATTCCGTACTAATCGTCGAC；

hp0410基因：Pf：AGATCTCTAATACTTTTTTCCATCA，

Pr：TTTTTTGCTTTCATCAATCGTCGAC)，

以NCTC 11639菌株(源于ATCC，No.43629)基因组为模板，经PCR扩增ureB、katA、hp0231和hp0410基因，分别将其连接入经过使用EcoRV酶消化的pMD18-T载体(Takara Bio Inc.)，构建了含有单个抗原的四种重组克隆ureB/pMD18-T、katA/pMD18-T、hp0231/pMD18-T和hp0410/pMD18-T。在分别经双酶切(Sal I酶和Pst I酶)鉴定后测序证实获得了完全正确的ureB、katA、hp0231和hp0410基因克隆。将重组质粒ureB/pMD18-T、katA/pMD18-T、hp0231/pMD18-T和hp0410/pMD18-T与表达载体pGEX-4T-1(购自上海希匹吉生物技术有限公司)分别用EcoR I和Sal I双酶切后连接，然后用连接产物转化宿主菌Top10大肠杆菌(购自天津天有利科技有限公司)，构建了含有单个抗原基因的四种表达载体ureB/pGEX-4T-1、katA/pGEX-4T-1、hp0231/pGEX-4T-1和hp0410/pGEX-4T-1。双酶切(EcoRV酶和Sal I酶)后测序证实获得了正确的克隆。再利用IPTG诱导分别含有所述四种表达载体的Top10大肠杆菌表达目的蛋白，再经SDS-PAGE电泳及蛋白质印迹分析(Western Blotting)鉴定表达的蛋白。在确定目的蛋白表达后，通过GST亲和层析柱纯化了上述保护性抗原蛋白。

(2)免疫小鼠

取6-8周龄雌性Balb/C小鼠6只，初次免疫皮下注射抗原蛋白(尿素酶、过氧化氢酶、外膜蛋白hp0231或hp0410)约100-200μg/只(按体积比1∶1与弗氏完全佐剂混合)，15天后以同样剂量皮下注射(按体积比1∶1与弗氏不完全佐剂混合)，21天后以同样剂量(不加佐剂)尾静脉加强免疫。

(3)SP2/0骨髓瘤细胞的准备

使SP2/0细胞(上海研生生化试剂有限公司)处于对数生长期(在CO₂细胞培养箱37℃，16-20小时)，轻轻吹打使之悬浮，分散成单个细胞。经1000rpm离心5min，再用RPMI1640基础培养基(上海江莱生物科技有限公司)重悬洗涤3次，活细胞达95％以上，取约2×10⁷-5×10⁷个细胞用于细胞融合。

(4)免疫脾细胞的准备

于加强免疫后3天，取鼠经眼球放血致死，无菌取脾。将脾脏移入含RPMI1640基础培养基的平皿中，剪碎、研磨，经200目尼龙筛过滤。过滤液经小鼠淋巴细胞分离来分离出脾细胞，然后用RPMI1640基础培养基洗涤3次，制成单细胞悬液。经活细胞计数，取约1×10⁸-2×10⁸个细胞用于细胞融合。

(5)饲养细胞的制备

于融合前2天取小鼠一只，经眼球放血致死，将小鼠浸泡于75％乙醇5min，取出后置无菌操作台，用一次性注射器吸取10ml RPMI1640基础培养基，注入腹腔。将注射器置于肝上，轻轻按压腹腔3-5次，重新吸出注入的含有细胞的液体，用RPMI1640基础培养基洗涤3次。经活细胞计数，用含15％犊牛血清的HAT培养基稀释至1×10⁵-2×10⁵个细胞/ml，每孔0.1ml接种于96孔微量培养板。

(6)细胞融合与克隆

以3∶1的比例将脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞混合于50ml刻度离心管，用20-30ml RPMI1640基础培养基洗涤2次。轻击管底，使沉淀细胞松散。将基础培养基滴加到融合管中，先慢后快，5min内加完，边加边轻轻转动离心管，37℃静置10min，1000rpm离心5min。弃上清，加入50mlHAT培养基，每孔0.1ml接种于培养有饲养细胞的96孔微量培养板，置37℃、5％的CO₂培养箱中培养。5天后用新鲜的HAT培养基换出组织培养板孔中1/2培养基，10天后用HT培养基换出HAT培养基。观察杂交瘤细胞生长情况，待其分布至孔底面积1/10以上时，吸出上清液作抗体检测。

(7)阳性细胞株的筛选(间接ELISA)

取聚苯乙烯平底微孔版，用包被缓冲液(磷酸盐缓冲液，PBS)将经梯度离心纯化所得的各抗原稀释至150μg/ml，每孔100μl，振荡器振匀，4℃过夜。将板孔内液体甩掉，用洗涤液洗涤3次，甩干。每孔加相应待检杂交瘤上清100μl，37℃温箱孵育30min，同前洗涤。每孔加100μl 1∶1000稀释的羊抗鼠IgG-HRP(杭州隆基生物技术有限公司)，37℃温箱孵育30min，同前洗涤。每孔加OPD底物100μl，室温避光静置15min。每孔加终止液(0.5mol/L NaOH溶液)100μl，轻轻振摇。用酶标读数仪测OD₄₉₂值，S/N(样品/阴性对照)≥2.5者判为阳性。

2.用噬菌展示技术鉴定编码尿素酶、过氧化氢酶以及外膜蛋白hp0231或hp0410的免疫保护性抗原表位的氨基酸序列和核苷酸序列。

(1)扩增肽库：使用肽库试剂盒(New England Biolabs，噬菌体表面蛋白展示的幽门螺杆菌NCTC11639菌株7肽库，肽库的滴度2.8×10¹⁴pfu/ml，随机多样性2.7×10⁹)80μl该试剂(来自肽库试剂盒)预先接种200μl大肠杆菌ER2738(New England Biolabs)感染5min。加入40ml低盐LB培养基中，37℃200rpm振摇4.5小时。将培养物转入50ml离心管中，4℃6800rpm 15min离心。将上清吸入另一个大离心管中，加入3.4mlPEG/NaCl溶液，沉淀4℃过夜。4℃6800rpm 15min离心，弃上清。用1ml TBS溶沉淀，转到1.5ml离心管，4500rpm离心1分钟，吸取上清。上清中加入1/6体积PEG/NaCl(167μl)，-20℃沉淀5min，在冰上沉淀最多30min，4℃12000rpm离心12min。将沉淀溶于TBS(含0.02％NaN₃)。

(2)包被：用包被液(磷酸盐缓冲液，PBS)配制100μg/ml的抗体溶液。用75％酒精浸泡聚苯乙烯板后，再用包被液洗板，加入待包被的抗体溶液，每孔100μl。对照孔不包被。4℃湿盒包被过夜。

(3)封闭：吸尽包被液，加封闭液(Thermo Scientific，无蛋白封闭缓冲液)300μl/孔，室温放置1小时。吸尽封闭液，用0.1％TBS-T(TBS+0.1％(v/v)Tween-20)洗6次。

(4)生物淘筛：取扩增的噬菌体7肽库5μl加入包被板中，加95μl0.1％TBS-T，放置30min。倒出未结合的噬菌体，吸尽或排去残液，用0.1％TBS-T洗板6遍，吸尽残液。每孔加入洗脱液(0.2M甘氨酸-HCl，pH2.2，1mg/ml BSA)100μl，室温轻摇9min 30s，立即用移液枪吸出洗脱液，将其移至已经预先加入15μl 1M Tris-HCl pH 9.1的离心管中，混匀。

(5)扩增洗脱的噬菌体：取洗脱的噬菌体80μl加入20ml低盐LB培养基中，加入500μl大肠杆菌ER2738菌株。37℃200rpm振摇4.5小时。重复步骤(1)扩增库肽。

(6)噬菌体克隆和抗体的ELISA分析：以100μg/ml浓度的抗体包被ELISA板，4℃过夜，加入10％脱脂奶粉或5％BSA室温封闭1小时。加入滴度为1×10¹²pfu/L的噬菌体克隆，室温结合1小时。用PBS-T(含0.1％Tween-20)洗涤后，加入抗M13单克隆抗体(1∶2000)室温孵育60min。再用PBS-T洗涤后，加入HRP标记的羊抗鼠IgG(杭州隆基生物技术有限公司)室温孵育60min。PBS-T洗涤后，加入底物TMB，避光反应10min，加入终止液(1mol/L H₂SO₄)，于波长450nm测定吸光度。用针对所述四种幽门螺杆菌保护性蛋白的单克隆抗体，筛选出ureB的两个噬菌体克隆、katA的两个噬菌体克隆、hp0231的一个克噬菌体隆和hp0410的两个噬菌体克隆。

(7)抗体识别序列的鉴定：将大肠杆菌ER2738按1∶100接种于低盐LB培养基中，挑取所筛选的噬菌斑加入其中，于37℃振摇培养4.5小时。以10000rpm离心10min。取上清，加入200μl PEG/NaCl溶液，混匀，室温放置10min。再以10000rpm离心10min。弃上清，用PBS缓冲液充分重悬沉淀，加入无水乙醇室温放置10min。再以10000rpm离心10min。弃上清，用70％乙醇清洗，室温放置10min后，用30μl TE溶解沉淀。进行琼脂糖凝胶电泳分析并测序，分别鉴定出ureB的两个7肽(SEQ ID NO：39-40)、katA的两个7肽(SEQ ID NO：41-42)、hp0231的一个7肽(SEQ IDNO：43和hp0410的两个7肽(SEQ ID NO：44-45)。

(8)对测序结果进行生物信息学分析：利用BLAST T具进行同源性搜索；利用DNAMAN软件分析ureB、katA、hp0231和hp0410的DNA序列和编码蛋白的特性；利用哈佛大学的在线分析软件进行抗原表位预测；应用Signal P3.0 Sever分析氨基酸序列中是否存在信号肽，对上述四种幽门螺杆菌抗原进行保护性抗原表位多肽序列分析。

利用New England Biolabs公司噬菌体表面蛋白展示的幽门螺杆菌7肽库所对应的多肽序列和生物信息学，对上述四种幽门螺杆菌抗原进行保护性抗原表位多肽序列分析。取两者多肽序列集合的交集(即取在生物信息学分析预测的多肽序列中同时存在7肽库中所对应多肽序列的14-16氨基酸序列)，最终得到了本发明的幽门螺旋杆菌尿素酶、过氧化氢酶以及外膜蛋白hp0231和hp0410的免疫保护性抗原表位的氨基酸序列(SEQ ID NO：1-7)。

(9)抗原表位的验证：

i.按照表位序列SEQ ID NO：1-7人工合成其对应的多肽，然后将这些多肽分别与牛血清白蛋白(BSA)进行偶联(吉尔生化上海有限公司)。

ii.将这7种偶联后的多肽作为酶联免疫检测(ELISA)的包被用抗原，在96孔聚苯乙烯板上进行包被(抗原包被浓度10μg/孔)，用含4％脱脂奶粉的封闭液(溶解于PBS)200μl/孔进行封闭。分别加入100μl/孔的经稀释的所述四种抗HP保护性单克隆抗体(分别抗幽门螺旋杆菌尿素酶、过氧化氢酶以及外膜蛋白hp0231和hp0410)，37℃孵育1-2小时，洗涤。同时做空白(加H₂O)、阴性(只加PBS缓冲液)和阳性孔对照(四种HP保护性单抗等比例混合液)。

iii.每孔加入新鲜的酶标兔抗鼠二抗(深圳菲鹏生物)100μl，37℃孵育1-2小时，洗涤，最后一遍用双蒸馏水洗涤。

iv.每孔加入TMB底物溶液(深圳菲鹏生物)100μl，37℃孵育30分钟，之后在于各孔中加入2mol/L硫酸50μl终止反应液。

结果，在ELISA检测仪上，于405nm波长下，7种偶联多肽的OD值均大于阴性对照的2.1倍。所以，可确定此七种抗原表位(SEQ ID NO：1-7)都是具有抗HP保护性抗原功能的功能性表位。

实施例2.真核表达质粒载体pNSPs-IRES的构建及制备

1.PCR扩增NSPs基因

首先，根据真核生物表达质粒载体pIRES-neo(Invitrogen)找到其中的neo基因两侧的两个目标克隆位点，一个位于neo基因前fi ori序列之后开始点；另一个位于neo基因之后的BamHI酶切位点前开始点。然后以pNSPs质粒(源自GIBCO公司的pSFV1)中NSPs(NSP1、NSP2、NSP3和NSP4)基因作为模板设计PCR引物，在引物的5’端分别加上25bp来自于pIRES-neo质粒的与上述两个克隆位点同源的序列，于是得到PCR引物PA(SEQ ID NO：11)和PB(SEQ ID NO：12)。

PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃30s，60℃30s，72℃2min，30个循环，72℃延伸10min结束，预期的PCR片段长度为7425bp。

2.将质粒pIRES-neo与上述已经扩增好的NSPs的PCR产物1∶1混合充分后，利用同源重组克隆试剂盒Red/ET Recombination Kits(Genebridges)，将该核酸混合物2μl同先前准备好的大肠杆菌JM 109感受态菌50-100μl相混合，冰浴5-10min。

3.将核酸与细菌的混合物一同移入到冰浴后的1ml电击杯中，在1250V的瞬间电压下，进行电击转化。

4.立即将电击转化杯置于冰中，冰浴5min。

5.在电击转化后的电击杯中的混合液中加入900μl新鲜灭菌的LB并小心冲洗电击杯，然后将全部混合液转移至灭菌了的1.5mL离心管中，在37℃恒温振荡器上以200rpm的条件下让培养菌体恢复30min。

6.离心30s，弃掉上清，用新鲜的LB培养液重新混匀，取100μl的菌液涂在具有氨苄青霉素抗性的培养板上，37℃恒温箱培养过夜。

7.重组真核表达质粒载体pNSPs-IRES的制备

无菌挑取单个转化菌落，接种到5mL LB培养液中，37℃，200rpm振荡培养12-16h。将3.0ml培养液转入1.5ml离心管中，12,000rpm离心30s，弃上清，室温空干。以100μL溶液Ⅰ(来自Qiagen的质粒抽提试剂盒)重悬沉淀，加入200μL的溶液Ⅱ(来自Qiagen的质粒抽提试剂盒)，轻轻颠倒数次。加入150μL用冰预冷的溶液Ⅲ(来自Qiagen的质粒抽提试剂盒)，轻轻颠倒数次混匀，冰浴1-2min。12,000rpm离心10min。取上清，分别用等量饱和酚/氯仿(25∶24∶1)、氯仿/异戊醇(24∶1)各抽提一次。取上清，加2倍体乙醇和0.1倍体积的3mol/L NaAC，混合均匀，在-20℃，12,000rpm离心10min。弃上清，沉淀用70％冷乙醇洗涤。经酶切(BamH I酶)鉴定后，该重组真核表达质粒载体pNSPs-IRES在-20℃保存，备用(参见图1)。

实施例3.构建真核表达重组质粒pNSPs-tPA-nEpitope-IRES-MyD88

采用重叠PCR方法，构建含幽门螺杆菌尿素酶、过氧化氢酶以及2种具有粘附功能的外膜蛋白免疫保护性抗原表位串联核苷酸序列(nEpitope)的重组真核质粒，并用特定12个引物(P1-P12)经PCR获得连接它们的核苷酸序列，并将其插入上述的真核表达质粒pNSPs-IRES内。具体而言，将幽门螺杆菌尿素酶、过氧化氢酶以及2种具有粘附功能的外膜蛋白的免疫保护性抗原表位序列(B细胞表位，SEQ ID NO：1-7)、尿素酶的T细胞表位(SEQ ID NO：8-9)及一个外源通用T细胞表位(SEQ ID NO：10)的核苷酸序列组合成串联序列(nEpitope)，并在此串联序列前插入组织型纤溶酶原(tPA)的信号肽基因(SEQ ID NO：30)。将如此获得的片段与MyD88基因分别克隆入带有甲病毒复制元件的真核表达质粒载体pNSPs-IRES中的IRES两侧的两个多克隆位点(MCS A和MCS B)，得到了所要构建的新型的真核表达重组质粒pNSPs-tPA-nEpitope-IRES-MyD88(参见图1)。

(1)引物设计和目的基因合成

根据69bp的tPA的信号肽设计引物P1和P2(SEQ ID NO：13和14)，其中分别在5’端引入NheI和XhoI酶切位点及保护性碱基(共计15bp)。以含幽门螺旋杆菌尿素酶、过氧化氢酶以及2种具有粘附功能的外膜蛋白7个免疫保护性抗原表位(B细胞表位)、尿素酶的2个T细胞表位为基础，再加入白喉毒素通用T细胞表位。将这些表位串联起来，表位之间加入非极性的甘氨酸和丝氨酸连接臂(GGS)以保持其相对独立性，最终得到长度为180个氨基酸的多肽序列(SEQ ID NO：27)。采用大肠杆菌的优势密码子，将上述构建的氨基酸序列转换为DNA序列(540bp)。由此分别设计了核苷酸引物P3、P4、P5、P6、P6、P7、P8、P9、P10、P11和P12(SEQ ID NO：15-24)，其中在引物P3的5’端引入EcoRI酶切位点及保护性碱基(共计8bp)，在P12的5’端引入MluI酶切位点、终止密码子(TAA)及保护性碱基(共计12bp)。经过PCR和重叠PCR合成了tPA信号肽基因和目的多表位肽合成序列(参见图2)。

(2)PCR扩增MyD88基因

参考GenBank中登录的MyD88基因序列以及内切酶图谱分析结果，设计了引物P13和P14(SEQ ID NO：25和26)，其中分别在5’端引入XbaI和SmaI酶切位点和保护性碱基。以CMV4-hmyD88质粒(来自于日本Fumihiko Takeshita博士)为模板扩增MyD88基因。反应条件为：94℃预变性5min，94℃30s，60℃30s，72℃2min，30个循环，72℃延伸10min结束。经测序确认所扩增的PCR片段与预期的PCR片段长度(4545bp)相同。

(3)重组质粒pNSPs-tPA-nEpitope-IRES的构建

将含有tPA信号肽基因与幽门螺旋杆菌多表位合成序列(nEpitope)的连接核酸序列和pNSPs-ISRE真核表达质粒分别使用NheI和XhoI酶、EcoRI和MluI酶在37℃2h消化，回收酶切片段，经T4DNA连接酶在16℃反应过夜。然后将连接产物转化到大肠杆菌DH5α的感受态细胞中，经菌落PCR和酶切(EcoRI酶)鉴定挑选出阳性重组子，在经过测序确认后获得了重组质粒pNSPs-tPA-nEpitope-IRES(参见图1)。

(4)重组质粒pNSPs-tPA-nEpitope-IRES-MyD88的构建

MyD88基因的PCR产物经纯化回收后，与质粒pNSPs-tPA-nEpitope-IRES分别经XbaI和SmaI双酶切，回收酶切片段，经T4DNA连接酶在16℃反应过夜。将连接产物转化到大肠杆菌DH5α的感受态细胞中，经挑菌、纯化回收质粒并进行酶切鉴定以及测序后，获得了重组质粒pNSPs-tPA-nEpitope-IRES-MyD88(参见图1)。

(5)核酸疫苗质粒的扩增、抽提和纯化

试剂：

STE：0.01mol/L NaCl；10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)；1mmol/L EDTA

溶液A：50mol/L葡萄糖；25mmol/L Tris.Cl(pH8.0)；10mmol/L EDTA

该溶液配制成100ml，6.76×10⁴Pa消毒15分钟，4℃储存。

溶液B(新鲜配制)：0.2N NaOH；1％SDS

溶液C：5mol/L KAc(醋酸钾)60ml；冰醋酸11.5ml；水28.5ml。

操作步骤：

1.将收集的含有重组质粒pNSPs-tPA-nEpitope-IRES-MyD88的大肠杆菌菌体用10ml溶液A悬浮，再移至50ml离心管中。

2.加入1ml用10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)新鲜配制的溶菌酶溶液(10mg/ml)混匀。

3.加20ml新鲜配制的溶液B，盖紧离心管管盖，温和地将离心管上下颠倒混匀5-7次，室温放置5分钟。

4.加入15ml冰预冷的溶液C，上下颠倒混匀，此步绝对避免强烈震荡。冰浴放置10分钟，此时形成的白色沉淀为细菌染色体DNA、大分子量RNA、钾盐/蛋白质/细胞膜的混合物。

5.用离心机12,000g、4℃离心20分钟。

6.将上清液通过4层消毒纱布过滤，置于另1个50ml离心管中，加入0.6倍容积的异丙醇混匀，室温放置10分钟。

7.12,000g、室温离心15分钟。

8.小心弃上清液，用70％乙醇室温漂洗1次，1,200g离心5分钟后小心弃上清液，倒置离心管在滤纸上，流净乙醇，或用消毒滤纸条擦净管壁上乙醇，室温放置5分钟使乙醇蒸发。

9.加入3ml TE，pH 8.0，溶解DNA沉淀。进一步纯化通过23,000g超速离心25分钟来实现。所获DNA产物经检定后，按需要分装，即为核酸疫苗。

实施例4.抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体IgY及新型非侵入性卵黄抗体唾液抗原快速检测试剂盒的制备

(1)新型核酸疫苗对禽类的免疫

在将扩增后分离提纯的核酸质粒(20-40μg)与两种转染试剂混合物(来自Invitrogen公司的Lipofectamine LTX脂质体转染试剂和Clontech公司的Xfect蛋白质转染试剂，以1∶1质量比混合)按1∶1质量比充分混合，然后按照1∶1的体积比例加入弗氏佐剂，经过充分的混合，分别对经过试验筛选、具有高免疫应答活性的免疫SPF级良种产蛋母鸡(来航鸡)进行胸部皮下、翅膀下胸肌内注射，注射剂量为每只鸡40-100μg。注射免疫10天后，开始在卵黄中产生IgY，大约在免疫接种后20天，其卵中的卵黄抗体IgY可达到一个较高的峰值，于是捡取鸡所产的蛋。

(2)卵黄抗体IgY的分离、提取和纯化：

a)用蛋黄筛取出免疫蛋的蛋黄，并用蒸馏水清洗两遍，将其搅打均匀10分钟；

b)加入9倍体积的蒸馏水稀释混匀；

c)利用0.1％的盐酸调节用蒸馏水稀释后的蛋黄溶液pH值到5.0；

d)加入2％的海藻酸钠溶液到上述稀释的蛋黄溶液中至终浓度为0.1％，搅拌直至出现浑浊；

e)加入浓度为1％的氯化钙溶液至终浓度为0.1％，混匀搅拌15分钟；

f)溶液静置于4℃的冷库条件下过夜至第二天，去除沉淀；

g)获取上清液，并向上清液中加入40％硫酸铵至浓度5％；

h)在4℃条件下将混合液搅拌20分钟后，再以2,2000rpm离心25分钟；

i)在4℃条件下过滤除去脂蛋白沉淀，收集滤液得到澄清的水溶性蛋白组分；

j)以葡聚糖交联的弱碱性阴离子交换剂DEAE为载体，磷酸盐缓冲液为吸附、洗脱体系进行精细纯化。

k)通过冻干机对IgY卵黄免疫球蛋白水溶液进行冷冻干燥，最终获得粉末状制剂。

(3)非侵入性卵黄抗体唾液抗原检测试剂盒的加工制备

该检测试剂盒的加工流程主要分为：

●胶体金与IgY多抗在胶体金结合垫中的包被；

●IgY多抗在硝酸纤维素膜上的划膜点样固定；

●兔抗鸡的多克隆抗体在硝酸纤维素膜上的划膜点样固定；

●将样品垫、包被后的胶体金结合垫、划膜点样固定后的纤维素膜以及良好的吸水材料垫粘合固定在PVC胶板上制成检测试纸条。

检测试纸条是以硝酸纤维素膜为载体，可分为以下3区：加样区，其中在胶体金结合区(垫)中包被(填充)有可溶性金标记的抗幽门螺旋杆菌尿素酶、过氧化氢酶以及2种具有粘附功能的外膜蛋白的鸡卵黄免疫球蛋白IgY；检测T区，在免疫层析试纸硝酸纤维素膜表面包被有抗幽门螺旋杆菌尿素酶、过氧化氢酶以及2种具有粘附功能的外膜蛋白的鸡卵黄免疫球蛋白IgY；和质控C区，其中包被有兔抗鸡的IgG多克隆第二抗体(参见图4)。

实施例5.非侵入性卵黄抗体唾液抗原快速检测试剂盒的使用方法

最好是在一天中的清晨刚刚起床后，于早餐前和刷牙前，或饭后2小时取样检测。首先唾液收集采用专门的唾液采集器(Salivette，SARSTEDT公司)，使用时先把Salivette中的棉条倒入口中咀嚼45秒，然后再用舌头将咀嚼后的棉条放入Salivette试管中，经短暂的离心就可收集到0.5-1.5ml的唾液。然后用吸管再从试管中吸出混有唾液的液体并且滴加到试剂盒的加样孔中4-5滴。通过毛细管作用液体向检测线和质控线方向扩散，如果唾液中含有幽门螺旋杆菌的尿素酶、过氧化氢酶以及2种具粘附功能的外膜蛋白等，则它们将能够同胶体金结合区中的可溶性金标记的抗幽门螺旋杆菌尿素酶、过氧化氢酶以及2种具有粘附功能的外膜蛋白的鸡卵黄免疫球蛋白IgY相结合，并且一直水平运动到检测T区，在此处幽门螺旋杆菌的抗原、IgY抗体和T区包被的IgY抗体结合形成抗体-抗原-抗体的复合物，这些复合物在检测T区截留聚集，形成肉眼可见的紫红色条带(检测线)，同时液体还在继续向质控C区扩散，当扩散到C区时被其中包被的IgG兔抗鸡多克隆第二抗体截留聚集，形成肉眼可见的紫红色条带(对照线)。(参见图7)

如T、C区都出现紫红色条带则受试唾液为阳性；C区有紫红色条带而T区无则受试唾液为阴性；如C区无紫红色条带则需重复检测。

以幽门螺旋杆菌四种保护性抗原(尿素酶、过氧化氢酶以及外膜蛋白hp0231和hp0410)的单克隆抗体作为胶体金检测试剂条中加样区的填充物制成快速检测试剂条，然后对幽门螺旋杆菌感染患者和健康人群的唾液进行检测，结果检测的灵敏度和准确率大于99.5％(参见图5中的第I组实验)。此试验结果说明了本发明中使用的螺旋杆菌四种保护性抗原的单克隆抗体对各自表位具有极高的特异性和检测灵敏性。

另外，以实施例3中制备的多价特异性核酸疫苗免疫SPF母鸡(莱航鸡)，用按照实施例4制备的卵黄抗体作为胶体金检测试剂条中加样区的填充物制成快速检测试剂条，然后对幽门螺旋杆菌感染患者和健康人群的唾液进行检测。结果检测的灵敏度和准确率大于95％(参见图5中的第II组实验)。此试验结果说明了本发明的多价核酸疫苗具有较高的免疫激活性，所产生的卵黄抗体也具有较高的特异性和检测灵敏性，符合临床上快速检测的要求。

实施例6.以该抗HP的IgY为主要成分的混合口服生物制剂在抑制幽门螺旋杆菌方面的功用

在抗幽门螺旋杆菌卵黄抗体IgY中按体积百分比30％加入有机铝盐-硫糖铝C₁₂H₃₀Al₈O₅lS_8XAl(OH)_3yH₂O，该有机铝盐能够有效地阻止卵黄抗体IgY被胃蛋白酶裂解并提高它在低pH值的胃酸条件下的耐受力及保持活性。然后将该混合物作为饲料添加剂加入到普通的动物饲料中来喂养大鼠和小鼠，分别进行长期毒性试验、小鼠精子畸形试验、IgY与IgG活性效价检测、特异性抑制HP的粘附试验和对HP感染的动物模型的小鼠进行预防治疗试验以及对感染HP的动物模型的小鼠血液中的炎性细胞因子进行检测。

1.长期毒性试验：选用健康的SD大鼠(上海宝特生命科学发展有限公司)各30只(对照和试验组)，其中给试验组喂上述特异性抗幽门螺旋杆菌IgY免疫球蛋白生物制剂，按其体重比例每日喂80mg/kg，共喂30天后。结果，试验组大鼠均无任何临床症状；各项生理指标和血常规检查均为正常。(参见表1和2)

2.小鼠精子畸形试验：25～30g昆明种雄性小鼠(源自云南省中医中药研究所)50只，按体重随机分成5组，A组为无实验药物的阴性对照组，E组为环磷酰胺阳性对照组，B、C、D组为IgY试验组。以急性毒性实验结果(每公斤体重20g)1/2(即10g/kg)为高剂量组(D组)，依次1/4、1/8为中(C组)、低(B组)剂量组。动物经口连续灌胃5天后，再继续喂养30天，然后颈椎脱臼处死，取小鼠双侧副睾涂片，用伊红染色。每只动物高倍镜下观察1,000个精子，记录畸形精子数。参见表3，结果表明：各实验组与阴性对照组间差异无显著性，IgY精子畸形试验结果为阴性。

3.IgY与IgG活性效价检测：

用粘附抑制(AHAI)试验测定IgY的活性效价。在U型微量滴定板上，用25μl细菌液体培养液将上述纯化后IgY待检液作1∶100、1∶200、1∶400、1∶800和1∶1000倍稀释。各孔中加入100倍稀释的培养18小时的幽门螺旋杆菌菌株培养物25μl，平板在37℃孵育18小时，然后每孔用50μlPBS冲洗3次，弃去液体，并在各孔中加入25μl用PBS悬浮的0.2％鸡红细胞溶液。平板于37℃培养30分钟后，观察各孔的血凝或血凝抑制现象。测定出抗体IgY的间接血凝抑制试验效价达1∶600。

用核酸疫苗(重组质粒pNSPs-tPA-nEpitope-IRES-MyD88)，按照实施例4(1)中所述免疫SPF饲养条件下的来航鸡(来自广东省大华农动物保健品股份有限公司)后，按照实施例4(2)从卵黄以及从血清中分别提取特异性抗幽门螺旋杆菌尿素酶B、尿素酶、过氧化氢酶以及具有粘附功能的外膜蛋白混合保护性抗原的抗体IgY和IgG，然后用四种抗原蛋白混合物作为抗原进行抗体IgY和IgG的效价比较试验。用ELISA法测得该核酸疫苗初次免疫鸡4周后所得的经水稀释法提取的卵黄IgY的效价为1∶12,800，初免4周和8周的鸡血清IgG效价分别为1∶3200和1∶6400(ELISA诊断标准：≥对照OD均值+4×标准差)。这一结果表明：特异性抗幽门螺旋杆菌的卵黄IgY抗体的免疫效价明显高于鸡血清中IgG抗体的效价。

4.抑制粘附(ADI)试验：在U型微量滴定板上，用25μl细菌液体培养液将上述纯化后IgY待检液如表4所示进行1∶1、1∶2直至1∶20倍稀释。各孔中加入100倍稀释的培养18小时的幽门螺旋杆菌菌株培养物25μl，平板在37℃孵育18小时，然后每孔用50μl PBS冲洗3次，弃去液体，在各孔中加入25μl细菌液体培养液。平板于37℃培养3小时后，如上所述观察各孔的粘附或粘附抑制现象。在实验条件下，按P＞2.1N(P为阳性OD值，N表示阳性OD值)判为阳性，故A₅₇₀＞0.298时，判为阳性，A₅₇₀≤0.298判为阴性。水稀释法提取的HP特异性卵黄IgY抗体纯化后的浓度为230μg/ml。如表4所示，以1∶10的比例稀释后，仍有效抑制幽门螺旋杆菌的粘附作用。

5.动物防治试验：取上述的IgY免疫球蛋白生物制剂，以口服的方式对感染幽门螺旋杆菌的动物模型的小鼠(来自中国人民解放军第三军大BALB/C感染HP小鼠)进行功能检测试验，其中测试组和不治疗的对照组(不喂食IgY抗体制剂)各12只小鼠。测试组在连续口服IgY抗体制剂(剂量：8mg/只/天)2、4、6和8周之后，感染幽门螺旋杆菌的小鼠幽门螺旋杆菌培养阴转率依次达到83.3％、100％、100％和100％。经病理检查通过小鼠的胃解剖后外观比较试验和组织免疫组化试验进行比较。结果发现：小鼠胃壁粘膜受损的情况以及炎症的状况也在口服8周后发生明显的改善，乃至痊愈(参见图6)；小鼠胃壁充血和胃内壁出血的症状明显减轻或者消失(参见图7)。由此可得出结论，经本发明的核酸疫苗免疫后制得的幽门螺杆菌特异性卵黄抗体IgY制剂连续2-4周以上的喂养，感染大鼠的胃幽门螺旋杆菌(HP)能够被有效地预防和治疗(参见表5)。

6.炎性细胞因子检测：取IgY免疫球蛋白生物制剂，对感染HP的动物模型的小鼠进行口腔给药，其中测试组和对照组各5只大鼠。在连续口服IgY抗体制剂(剂量：18mg/只/天)8周之后，从小鼠尾部取血，并通过实时PCR检测比较其体内的各类炎性细胞因子。结果发现：小鼠体内的炎性细胞因子IL-1β、IL-6和IFN-γ的血液中的浓度(Y轴，ng/L)，在摄取IgY之后比没服用的小鼠有了极为显著的降低(参见图8)，进而也说明小鼠体内的炎症的状况也在口服8周后发生明显的改善。

序列表一览表

SEQ ID NO：1-2为幽门螺杆菌UreB的B细胞表位的氨基酸序列。

SEQ ID NO：3-4为幽门螺杆菌KatA的B细胞表位的氨基酸序列。

SEQ ID NO：5为幽门螺杆菌HP0231的B细胞表位的氨基酸序列。

SEQ ID NO：6-7为幽门螺杆菌HP0410的B细胞表位的氨基酸序列。

SEQ ID NO：8-9为幽门螺杆菌UreB的T细胞表位的氨基酸序列。

SEQ ID NO：10为白喉毒素的T细胞表位(通用表位)的氨基酸序列。

SEQ ID NO：11-26分别为引物PA、PB和P1-14的核苷酸序列。

SEQ ID NO：27为幽门螺杆菌保护性抗原表位的串联氨基酸序列。

SEQ ID NO：28为幽门螺杆菌保护性抗原表位的串联核苷酸序列。

SEQ ID NO：29为组织型纤溶酶原信号肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：30为组织型纤溶酶原信号肽的核苷酸序列。

SEQ ID NO：31-34为奇孔古尼亚病毒分离株IND-06-Guj的NSP1-NSP4蛋白基因的部分编码区。

SEQ ID NO：35为幽门螺杆菌NCTC 11639菌株UreB的氨基酸序列。

SEQ ID NO：36为幽门螺杆菌NCTC 11639菌株KatA的氨基酸序列。

SEQ ID NO：37为幽门螺杆菌NCTC 11639菌株HP0231的氨基酸序列。

SEQ ID NO：38为幽门螺杆菌NCTC 11639菌株HP0410的氨基酸序列。

SEQ ID NO：39-40为用噬菌展示技术鉴定的抗UreB单克隆抗体所识别的7肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：41-42为用噬菌展示技术鉴定的抗KatA单克隆抗体所识别的7肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：43为用噬菌展示技术鉴定的抗HP0231单克隆抗体所识别的7肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：44-45为用噬菌展示技术鉴定的抗HP0410单克隆抗体所识别的7肽的氨基酸序列。

SEQ ID NO：46-47为扩增ureB基因用的引物。

SEQ ID NO：48-49为扩增katA基因用的引物。

SEQ ID NO：50-51为扩增hp0231基因基因用的引物。

SEQ ID NO：52-53为扩增hp0410基因用的引物。

Claims

1.幽门螺杆菌抗原肽，其包含选自以下的一种氨基酸序列：分别对应于幽门螺杆菌尿素酶氨基酸序列SEQ ID NO：35中第545-551位(SEQ IDNO：39)和第555-561位(SEQ ID NO：40)氨基酸的氨基酸序列、分别对应于幽门螺杆菌过氧化氢酶氨基酸序列SEQ ID NO：36中第357-363位(SEQ IDNO：41)和第456-462位(SEQ ID NO：42)氨基酸的氨基酸序列、对应于幽门螺杆菌外膜蛋白hp0231氨基酸序列SEQ ID NO：37中第152-158位氨基酸(SEQ ID NO：43)的氨基酸序列、和分别对应于幽门螺杆菌外膜蛋白hp0410氨基酸序列SEQ ID NO：38中第170-176位(SEQ ID NO：44)和第219-225位(SEQ ID NO：45)氨基酸的氨基酸序列。

2.权利要求1的抗原肽，其包含选自SEQ ID NO：39-45的一种氨基酸序列。

3.权利要求2的抗原肽，其包含选自以下的一种氨基酸序列：分别对应于幽门螺杆菌尿素酶氨基酸序列SEQ ID NO：35中第541-555位(SEQ IDNO：1)和第552-565位(SEQ ID NO：2)氨基酸的氨基酸序列、分别对应于幽门螺杆菌过氧化氢酶氨基酸序列SEQ ID NO：36中第350-365位(SEQ ID NO：3)和第453-468位(SEQ ID NO：4)位氨基酸的氨基酸序列、对应于幽门螺杆菌外膜蛋白hp0231氨基酸序列SEQ ID NO：37中第148-163位氨基酸(SEQ IDNO：5)的氨基酸序列、和分别对应于幽门螺杆菌外膜蛋白hp0410氨基酸序列SEQ ID NO：38中第163-178位(SEQ ID NO：6)和第217-232位(SEQ IDNO：7)氨基酸的氨基酸序列。

4.权利要求3)的抗原肽，其由一种所述氨基酸序列组成。

5.权利要求4的抗原肽，其为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示的肽。

6.一种多肽，其包含一种或多种权利要求1-5中任一项的抗原肽。

7.权利要求6的多肽，其包含两种以上权利要求1-5中任一项的抗原肽，其中所述抗原肽可以来自相同或不同的亚种或菌株。

8.权利要求6或7的多肽，其还包含T表位抗原，优选包含T通用表位，例如SEQ ID NO：10所示的表位。

9.上述6-8中任一项的多肽，其由SEQ ID NO：27所示的氨基酸序列组成。

10.一种核酸，其包含编码权利要求1-5中任一项的抗原肽或权利要求6-9中任一项的多肽的核苷酸序列。