CN107033224B - 一种口蹄疫病毒灭活抗原纯化浓缩方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种口蹄疫病毒灭活抗原纯化浓缩方法，涉及生物技术领域。一种口蹄疫病毒灭活抗原纯化浓缩方法，包括以下步骤：（1）将氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的接头蛋白加入口蹄疫病毒灭活抗原中，混匀，孵育；（2）加入纯化载体，混匀，孵育；所述纯化载体为乳酸乳球菌骨架；（3）离心，取沉淀。本发明纯化浓缩方法能够高效纯化口蹄疫病毒灭活抗原、高效除去杂质，抗原回收效率高、浓缩倍数高，对设备要求低，操作简单，成本低。

Description

一种口蹄疫病毒灭活抗原纯化浓缩方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体的说，涉及到一种口蹄疫病毒灭活抗原纯化浓缩方法。
背景技术
口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdisease virus,FMDV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，主要感染猪、牛、羊、骆驼等偶蹄类动物。目前已经发现O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia17个血清型，各血清型之间没有交叉保护，这就增加了口蹄疫防控的难度，一旦爆发就会给养殖业带来严重的经济损失，被世界动物卫生组织(OIE)列为通报性疫病，也是国内首先防控的A类头号疫病。在我国，主要采用接种灭活疫苗的方式来控制该病。我国口蹄疫疫苗已形成规模化生产，但大部分口蹄疫疫苗均为粗制疫苗，抗原含量低，异源蛋白(细胞蛋白、牛血清蛋白、非结构蛋白、内毒素)含量在95％以上，大面积接种存在较严重的副反应，口蹄疫防制受到了影响。
针对FMDV灭活抗原制苗过程中抗原含量不足、纯度不高的问题，当前生产中使用的大规模浓缩纯化方法是膜过滤澄清技术配合中空纤维浓缩技术等物理学纯化工艺。这种工艺能够在一定程度上将抗原进行浓缩、去除部分杂蛋白，提高制苗抗原的纯度和含量，但却存在操作复杂、对技术设备要求高，纯化浓缩成本较高且抗原回收率和浓缩倍数较低、抗原中杂蛋白去除量较小等缺陷。
发明内容
本发明的目的是提供一种口蹄疫病毒灭活抗原纯化浓缩方法，该方法能够高效纯化口蹄疫病毒灭活抗原、高效除去杂质，抗原回收效率高、浓缩倍数高，对设备要求低，操作简单，成本低。
本发明的目的采用如下技术方案实现：
一种口蹄疫病毒灭活抗原纯化浓缩方法，包括以下步骤：
(1)将氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的接头蛋白加入口蹄疫病毒灭活抗原中，混匀，孵育；
(2)加入纯化载体，混匀，孵育；所述纯化载体为乳酸乳球菌骨架；
(3)离心，取沉淀。
在本发明中，步骤(1)中孵育条件如下：孵育过程中震荡，孵育温度为20-25℃，孵育时间为45min-60min。
在本发明中，步骤(2)中孵育条件如下：孵育过程中震荡，孵育温度为20-25℃，孵育时间为25min-35min。
优选的技术方案中，接头蛋白加入的比例如下：108.7TCID50-109.2TCID50的口蹄疫病毒灭活抗原中加入40～60μg的接头蛋白。
优选的技术方案中，纯化载体加入的比例如下：108.7TCID50-109.2TCID50的口蹄疫病毒灭活抗原中加入2.4×109-2.6×109个纯化载体。
在本发明中，所述接头蛋白是通过诱导表达携带所述接头蛋白编码基因的重组菌获得的。
在本发明中，所述重组菌是将接头蛋白编码基因插入表达载体pET32中NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点之间，然后导入大肠杆菌后获得的。
在本发明中，所述重组菌在35-37℃培养1-2h，在24-26℃培养2-4h，在15-17℃静置10-20min，然后加入终浓度为0.1-0.3mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷在15-17℃诱导培养18-22h，获得接头蛋白。
在本发明中，所述乳酸乳球菌骨架是将乳酸乳球菌采用盐酸煮沸、洗涤后得到。
本发明还提供口蹄疫病毒灭活疫苗，上述方法获得的沉淀。
本发明相对于现有技术的有益效果：本发明口蹄疫病毒灭活抗原纯化浓缩方法中，由于接头蛋白可以特异性地与口蹄疫病毒灭活抗原和乳酸乳球菌骨架结合，从而可以通过简单的离心步骤收获以沉淀方式富集的口蹄疫病毒灭活抗原，因此本发明方法能够高效纯化口蹄疫病毒灭活抗原、高效除去杂质，抗原回收效率高、浓缩倍数高，对设备要求低，操作简单，成本低。本发明方法对口蹄疫病毒灭活抗原的回收效率高于99％，杂蛋白去除效率高于90％，所得抗原易于保存和制备口蹄疫多价疫苗。
附图说明
图1是重组表达质粒pET-PFL酶切鉴定结果，其中M为DNA标准分子量，泳道1、2、3为重组质粒pET-PFL的NdeⅠ和XhoⅠ双酶切产物。
图2是诱导表达接头蛋白的SDS-PAGE电泳及Western-blot鉴定结果，其中图2(A)为SDS-PAGE电泳鉴定，M为预染标准蛋白分子量，泳道1为诱导后pET/BL21全菌，泳道2为诱导后PFL/BL21全菌，泳道3为诱导后PFL/BL21裂解液沉淀，泳道4为诱导后PFL/BL21裂解液上清；图2(B)为Western-blot鉴定结果，其中M为预染标准蛋白分子量，泳道1为诱导后pET/BL21全菌，泳道2为诱导后PFL/BL21全菌，泳道3为诱导后PFL/BL21裂解液上清，泳道4为诱导后PFL/BL21裂解液沉淀。
图3为接头蛋白与纯化载体结合及解离SDS-PAGE鉴定结果，其中M为预染标准蛋白分子量，泳道1为上清1，泳道2为沉淀1，泳道3为沉淀2，泳道4为上清2。
图4为FMDV O型病毒灭活抗原纯化浓缩鉴定结果，其中图4(A)为SDS-PAGE电泳鉴定结果，泳道1为上清3，M为预染标准蛋白分子量，泳道2为未纯化FMDV O型病毒灭活抗原对照，泳道3为沉淀3；图4(B)为Western-blot鉴定结果，泳道1为沉淀3，M为预染标准蛋白分子量，泳道2为上清3，泳道3为未纯化FMDV O型病毒灭活抗原对照。
图5为FMDV A型病毒灭活抗原纯化浓缩鉴定结果，其中图5(A)为SDS-PAGE电泳鉴定结果，泳道1为沉淀4，M为预染标准蛋白分子量，泳道2为4上清，泳道3为未纯化FMDV A型病毒灭活抗原对照；图5(B)为Western-blot鉴定结果，泳道1为4沉淀，M为预染标准蛋白分子量，泳道2为上清4，泳道3为未纯化FMDV A型病毒灭活抗原对照。
图6为FMDV Asia1型病毒灭活抗原纯化浓缩鉴定结果，其中图6(A)为SDS-PAGE电泳鉴定结果，泳道1为未纯化FMDV Asia1型病毒灭活抗原对照，M为预染标准蛋白分子量，泳道2为沉淀5，泳道3为上清5；图6(B)为Western-blot鉴定结果，M为预染标准蛋白分子量，泳道1为沉淀5，泳道2为上清5，泳道3为未纯化FMDV Asia1型病毒灭活抗原对照。
图7为FMDV Asia1型灭活疫苗免疫动物28d抗体水平阻断ELISA检测结果。
图8为FMDV A型灭活疫苗抗原免疫动物28d抗体水平阻断ELISA检测结果。
图9为FMDVO型灭活疫苗免疫动物28d抗体水平阻断ELISA检测结果。
具体实施方式
实施例1重组表达质粒pET-PFL的构建与鉴定
设计接头蛋白，接头蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。该接头蛋白为一个融合蛋白，含有两个功能识别区，能够分别特异性地识别口蹄疫病毒灭活抗原和乳酸乳球菌骨架，该接头蛋白的编码基因如SEQ ID NO:1所示。为了便于鉴定接头蛋白，在SEQ ID NO:2所示序列的羧基端添加His标签蛋白(HHHHHH)，在SEQ ID NO:1所示序列的3’-末端终止密码子之前添加His标签蛋白编码序列，添加后序列如SEQ ID NO:3所示。另外，在SEQ ID NO:3所示的5’-末端设计NdeI酶切位点、3’-末端分别设计XhoⅠ酶切位点，送金斯瑞公司合成。将合成的基因片段插入pUC载体，得到重组质粒pUC-PFL。
采用内切酶NdeⅠ和XhoⅠ对重组质粒pUC-PFL和原核表达载体pET32a进行双酶切，将接头蛋白目的基因片段(缩写为PFL片段)和表达载体片段回收，通过T4连接酶连接，得到重组表达载体。
pUC-PFL和pET32a质粒双酶切体系(30μL)：
其中10×Q.cut Buffer、Q.cutNdeⅠ和Q.cutXhoⅠ购自大连宝生物有限公司。
将双酶切体系混匀后置于37℃条件下作用30min，经琼脂糖凝胶电泳分离条带，切胶，按照AXYGEN胶回收试剂盒说明，分别回收目的片段PFL和载体片段pET32a，通过T4连接酶连接。
T4连接酶连接体系如下(25μL)：
将上述连接体系置于16℃条件下，连接12-16h，得到连接产物。
将上述连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞，涂布含有50mg/mL氨苄青霉素的LB平板，置于37℃条件下静置过夜培养，挑取单克隆接种含有50mg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基培养过夜，按照AXYGEN质粒提取试剂盒说明操作，提取质粒，用Q.cutNdeⅠ和Q.cutXhoⅠ双酶切鉴定，酶切产物电泳得到图1。由图1可以看出，阳性重组质粒双酶切后，获得大小为5389bp和981bp两条目的条带，鉴定成功的阳性重组质粒命名为pET-PFL。
实施例2重组表达菌PFL/BL21的构建与接头蛋白表达
1.重组表达菌株PFL/BL21的构建将实施例1获得的阳性重组质粒pET-PFL转化原核表达菌株BL21(DE3)，得到重组表达菌株PFL/BL21。同时设空pET32a质粒转化BL21(DE3)的对照，得到对照菌株pET/BL21。
2.重组表达菌株PFL/BL21诱导表达与鉴定
(1)挑取菌株PFL/BL21和对照菌株pET/BL21的单克隆，分别接种含有50mg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃、200rmp条件下过夜培养，获得母液；
(2)将上述各菌株的母液以1:200的比例接种至新鲜LB液体培养基(含50mg/mL氨苄青霉素)，37℃、180rmp条件下培养1.5h，25℃、180rmp条件下培养3h，然后在16℃静置15min；
(3)向步骤(2)所得培养物中加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)进行蛋白诱导，诱导温度为16℃，诱导培养时间为18h；
(4)收集上述诱导后菌液，在8000g、4℃条件下离心10min，获得菌体，菌体用PBS(pH 7.0-7.4，0.1mol/L)洗涤两遍，进行重悬；
(5)将菌体悬浮液在4℃条件下进行高压裂解，裂解条件：压力800MPa，裂解3-5个循环；
(6)将菌体裂解液在4℃、12000rpm条件下离心15min，分别收集裂解液上清和沉淀，沉淀用与上清等量的PBS缓冲液重悬。
以上所有操作均在洁净环境下进行，所用试剂、容器均经过高压无菌处理，处理条件为：温度121℃，压力103.4KPa，时间20min；高压破碎采用无菌进料、收样泵。
(7)为分析鉴定重组表达菌株PFL/BL21表达情况，取上述诱导后PFL/BL21全菌及其裂解液上清和沉淀各80μL进行SDS-PAGE鉴定，其中对照为诱导后pET/BL21全菌，得到图2(A)。由图2(A)可知与对照菌相比，诱导后PFL/BL21全菌及其裂解液上清和沉淀泳道在36KD处均出现明显目的条带，其中裂解液上清中可溶目的蛋白量约为总目的蛋白的50％-60％。
(8)为了鉴定接头蛋白，借助其羧基端His标签蛋白，取上述诱导后PFL/BL21全菌及其裂解液上清和沉淀进行Western-blot鉴定，其中对照为诱导后pET/BL21全菌，具体方法如下：将各样品SDS-PAGE电泳结果转印至硝酸纤维素膜上，然后用含有5％BSA的TBST封闭缓冲液液室温封闭转印膜1h，TBST缓冲液洗涤3次，37℃条件下与1:5000稀释的鼠源His单抗(购自KPL公司，)孵育1h；接着再用TBST缓冲液洗涤3次，37℃条件下与1:10000稀释的羊抗鼠HRP-IgG二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体，购自KPL)孵育45min；抗体孵育结束后，TBST缓冲液洗涤3次，采用DAB显色试剂盒进行显色，拍照保存。结果如图2(B)所示，诱导后PFL/BL21裂解液上清泳道在36KD位置出现一条明显条带，证实该条带为接头蛋白条带。
按照本实施例中方法采用重组表达菌株PFL/BL21诱导表达接头蛋白。将诱导表达后的重组菌进行高压裂解，取裂解液上清，即得接头蛋白溶液。
His(组氨酸)标签蛋白只是为了方便表达蛋白的鉴定，不影响蛋白表达及其功能发挥。实际生产过程中，只要将接头蛋白编码基因插入pET32a，然后导入BL21(DE3)内，筛选阳性重组菌，就可以用于生产接头蛋白。
实施例3接头蛋白定量分析
1.纯化载体的制备
用新鲜GM17培养基，30℃条件下静置培养乳酸乳球菌IL1403(The CompleteGenome Sequence ofthe Lactic AcidBacterium Lactococcus lactis ssp.lactisIL1403，Genome Res.,10.1101/gr.169701.)，培养时间为16-18h，将培养液在8000rpm条件下离心5min，收集菌体，用PBS缓冲液洗涤沉淀一次，加入0.1M盐酸，煮沸30min，在8000rpm条件下离心5min，然后用PBS缓冲液洗涤沉淀3次，最后用PBS缓冲液重悬，得到乳酸乳球菌骨架，即为纯化载体。对纯化载体进行血球板计数，将2.5×109个纯化载体记为1单位。
2.蛋白解离
按照实施例2中方法制备接头蛋白溶液。在2mL接头蛋白溶液(总蛋白含量为4.2mg)中，加入过量的纯化载体(10×109个)，孵育30min，使接头蛋白完全与纯化载体结合，9000rpm离心3min，获得上清1和沉淀1，沉淀1中含有纯化载体及其与接头蛋白的复合物。沉淀1以400μL PBS缓冲液重悬。
在沉淀1重悬液中加入终浓度为1％的SDS(十二烷基硫酸钠)，在100℃煮沸10min，使接头蛋白与纯化载体解离，然后在12000rpm离心10min，收获上清液2和沉淀2，沉淀2用与上清2等量的PBS缓冲液重悬。
3.蛋白解离鉴定
为了分析接头蛋白是否与纯化载体完全解离，对上清1、沉淀1、上清2和沉淀2进行SDS-PAGE电泳分析，结果如图3所示，解离后接头蛋白全部在上清2中(泳道4)。
4.有效接头蛋白含量测定
用BCA蛋白定量试剂盒测定上清2中总蛋白含量，结果即为2mL接头蛋白溶液(实施例2中方法制备)中接头蛋白总量。根据计算结果，可知每毫升LB培养基最终可得到90μg接头蛋白。
用PBS缓冲液调整接头蛋白溶液中接头蛋白浓度为50μg/mL。
实施例4 FMDV O型病毒灭活抗原纯化浓缩
1.抗原制备
FMDV O型病毒采用BHK细胞增殖，然后将培养物反复冻融，离心取上清液，灭活后，得到FMDV O型病毒灭活抗原。抗原滴度为108.5TCID50/mL，146S含量为5.6μg/mL。
2.FMDV O型病毒灭活抗原纯化浓缩
(1)无菌条件下，调整接头蛋白溶液(实施例2中方法制备)中接头蛋白浓度至50μg/mL，然后加入待纯化的FMDV O型病毒灭活抗原中，加入比例为：109.2TCID50的FMDV O型病毒灭活抗原中加入1mL浓度为50μg/mL的接头蛋白溶液，充分混匀；
(2)将上述混合物置于25℃、转速为150rpm的摇床中，震荡孵育50min，使FMDV O型病毒灭活抗原完全与接头蛋白结合；
(3)无菌条件下，加入纯化载体，加入比例为：109.2TCID50的FMDV O型病毒灭活抗原中加入2.5×109个纯化载体，充分搅拌混匀；
(4)将上述混合物置于25℃、转速为150rpm的摇床中，震荡孵育30min，使结合了FMDV O型病毒灭活抗原的接头蛋白完全与纯化载体结合；
(5)无菌条件下，9000rpm离心5min，得到上清3和沉淀3。
沉淀3为FMDV O型病毒灭活抗原复合物。FMDV O型病毒灭活抗原复合物是FMDV O型病毒灭活抗原、接头蛋白及乳酸乳球菌骨架的复合物，形成FMDV O型病毒灭活抗原复合物的原理在于接头蛋白可以同时与FMDV O型病毒灭活抗原及乳酸乳球菌骨架进行特异性的结合。因此，本实施例FMDV O型病毒灭活抗原纯化浓缩方法的最终产物为FMDV O型病毒灭活抗原复合物，即沉淀3。
以0.1倍原病毒体积的TE缓冲液(含有10mmol/L Tris，50mmol/L NaCl的水溶液，pH8.0)重悬沉淀3。
在纯化过程中，为了保证FMDV O型病毒灭活抗原完全回收，乳酸乳球菌骨架及接头蛋白都是过量加入的，因此，采用本实施例中纯化浓缩方法得到的FMDV O型病毒灭活抗原复合物(沉淀3)中还含有少量乳酸乳球菌骨架及其与接头蛋白的复合物。
以下“FMDV O型病毒灭活抗原复合物”均指沉淀3。
3.FMDV O型病毒灭活抗原纯化浓缩鉴定
为了验证FMDV O型病毒灭活抗原通过本实施例中方法达到纯化浓缩目的，对本实施例获得的上清3和沉淀3进行SDS-PAGE电泳和Western-blot鉴定分析，得到图4(A)和图4(B)。
对纯化前FMDV O型病毒灭活抗原、沉淀3、上清3进行SDS-PAGE电泳鉴定，得到图4(A)。并对上述SDS-PAGE电泳结果进行FMDV O型病毒特异性Western-blot鉴定，得到图4(B)。Western-blot具体操作步骤如下：
(1)转印：SDS-PAGE电泳结束后，采用湿转法将蛋白印迹转至PVDF膜(聚偏二氟乙烯膜)，转膜条件为恒压100V，时间45min；
(2)封闭：将PVDF膜用含5％脱脂乳的TBST缓冲液(pH8.0)，4℃条件下封闭过夜；
(3)孵育一抗：洗涤上述PVDF膜，浸入含2％BSA的TBST溶液1:40稀释的牛FMDV O型病毒高免血清(高免血清为FMDV O型病毒免疫牛所得)，37℃孵育1h；
(4)洗涤：取出PVDF膜，用TBST缓冲液漂洗4次，每次8min；
(5)孵育二抗：将PVDF膜浸入含2％BSA的TBST溶液稀释的HPR-山羊抗牛二抗(辣根过氧化酶标记的山羊抗牛IgG抗体，购自KPL公司，稀释度为1:4000)，37℃孵育45min；
(6)同(4)洗涤，DAB显色试剂盒显色。
图4(A)和图4(B)结果显示，纯化后SDS-PAGE和Western-blot在上清3中未检测到大小约为25KDa的抗原条带，抗原主要富集在沉淀3即FMDVO型病毒灭活抗原复合物中，且由图可见，纯化后大部分的杂蛋白被去除，抗原纯度显著提高。
4.FMDV O型病毒灭活抗原纯化浓缩效率测定
(1)为了检测本实施例中方法纯化病毒灭活抗原的效率，用FMDV O型抗体阻断ELISA检测试剂盒(兰州兽医研究所)提供的抗体包被板检测FMDV O型病毒灭活抗原(本实施例标题1)及上清3中抗原含量。数据检测结果显示，上清3中抗原残余量低于FMDV O型病毒灭活抗原稀释28(256)倍后的抗原含量，说明纯化后上清3中残余病毒量不足原病毒抗原含量的百分之一，即本实施例中纯化方法对抗原的回收效率高于99％。
(2)为了分析FMDV O型病毒灭活抗原复合物中抗原纯度，采用实施例3标题2中方法将沉淀3进行解离，并用BCA蛋白定量试剂盒对沉淀3的解离上清和未纯化的FMDV O型病毒灭活抗原(本实施例标题1)进行总蛋白含量测定，测得FMDV O型病毒灭活抗原中总蛋白含量为3582μg/mL，沉淀3的解离上清中蛋白总含量为490μg/mL，由于沉淀3的解离上清与FMDV O型病毒灭活抗原的体积比为0.1:1，因此杂蛋白去除率＝[1-(0.1*490/3582)]*100％，高于90％；根据抗原回收效率高于99％计算，FMDV O型病毒灭活抗原复合物(沉淀3)中146S含量约为56μg/mL，FMDV O型病毒灭活抗原复合物中抗原纯度＝(56/490)*100％，抗原纯度高于10％。
实施例5 FMDV A型病毒灭活抗原纯化浓缩
纯化浓缩FMDV A型病毒灭活抗原的方法包括如下步骤：
1.抗原制备将FMDV A型病毒采用BHK细胞增殖，然后将培养物反复冻融，离心取上清液，灭活后，得到FMDV A型病毒灭活抗原。抗原滴度为108.3TCID50/mL，146S含量为5.2μg/mL。
2.FMDV A型病毒灭活抗原纯化浓缩
(1)无菌条件下，调整接头蛋白溶液(实施例2中方法制备)中接头蛋白浓度至50μg/mL，然后加入待纯化的FMDV A型病毒灭活抗原中，加入比例为：109.0TCID50的FMDV A型病毒灭活抗原中加入1mL浓度为50μg/mL的接头蛋白溶液，充分混匀；
(2)将上述混合物置于25℃、转速为150rpm的摇床中，震荡孵育55min使FMDV A型病毒灭活抗原完全与接头蛋白结合；
(3)无菌条件下，加入纯化载体，加入比例为：109.0TCID50的FMDV A型病毒灭活抗原中加入2.5×109个纯化载体，充分搅拌混匀；
(4)将上述混合物置于25℃、转速为150rpm的摇床中，震荡孵育30min，使结合了FMDV A型病毒灭活抗原的接头蛋白完全与纯化载体结合；
(5)无菌条件下，9000rpm离心5min，得到上清4和沉淀4。
沉淀4即为FMDV A型病毒灭活抗原复合物。以0.1倍原病毒体积的TE缓冲液(含有10mmol/L Tris，50mmol/LNaCl的水溶液，pH8.0)重悬。FMDV A型病毒灭活抗原复合物是FMDV A型病毒灭活抗原、接头蛋白及乳酸乳球菌骨架的复合物，形成FMDV A型病毒灭活抗原复合物的原理在于接头蛋白可以同时与FMDV A型病毒灭活抗原及乳酸乳球菌骨架进行特异性的结合。因此，本实施例FMDV A型病毒灭活抗原纯化浓缩方法的最终产物为FMDV A型病毒灭活抗原复合物，即沉淀4。
在纯化过程中，为了保证FMDV A型病毒灭活抗原完全回收，乳酸乳球菌骨架及接头蛋白都是过量加入的，因此，FMDV A型病毒灭活抗原复合物(沉淀4)中还含有少量乳酸乳球菌骨架及其与接头蛋白的复合物。
3.FMDV A型病毒灭活抗原纯化浓缩鉴定
为了验证FMDV A型病毒灭活抗原通过本实施例中方法达到纯化浓缩目的，对纯化前FMDV A型病毒灭活抗原、本实施例标题2获得的上清4和沉淀4进行SDS-PAGE电泳和Western-blot鉴定分析，得到图5(A)和图5(B)。
Western-blot操作步骤同实施例4，不同之处在于一抗换成FMDV A型病毒高免血清。FMDV A型病毒高免血清制备方法：FMDV A型病毒免疫牛，取抗体效价合格的牛采集血液，分离后得到高免血清。
图5(A)和图5(B)结果显示，上清4在SDS-PAGE电泳和western-blot中未检测到大小约为25KDa的抗原条带，抗原主要富集在沉淀4即FMDV A型病毒灭活抗原复合物中，且由图可见，纯化后大部分的杂蛋白被去除，抗原纯度显著提高。
4.FMDV A型病毒灭活抗原纯化浓缩效率测定
(1)为了检测本实施例中方法纯化浓缩病毒灭活抗原效率，用FMDV A型抗体阻断ELISA检测试剂盒(兰州兽医研究所)提供的抗体包被板检测FMDV A型病毒灭活抗原及上清4中抗原含量。数据检测结果显示，上清4中抗原残余量低于FMDV A型病毒灭活抗原稀释28(256)倍后的抗原含量，说明纯化后上清4中残余病毒量不足原病毒抗原含量的百分之一，即本实施例中纯化浓缩方法对抗原的回收效率高于99％。
(2)为了分析FMDV A型病毒灭活抗原复合物中抗原纯度，采用实施例3标题2中方法将沉淀4进行解离，并用BCA蛋白定量试剂盒对沉淀4的解离上清和未纯化的FMDV A型病毒灭活抗原进行总蛋白含量测定，测得未纯化抗原总蛋白含量为3400μg/mL，沉淀4的蛋白总含量为456μg/mL，由于沉淀4的解离上清与FMDV A型病毒灭活抗原的体积比为0.1:1，因此杂蛋白去除率＝[1-(0.1*456/3400)]*100％，高于90％；以抗原回收效率高于99％计算，FMDV A型病毒灭活抗原复合物(沉淀4)中146S含量约为52μg/mL，FMDV A型病毒灭活抗原复合物(沉淀4)中抗原纯度＝(52/456)*100％，高于10％。
实施例6 FMDV Asia1型病毒灭活抗原纯化浓缩
1.抗原制备将FMDV Asia1型病毒采用BHK细胞增殖，然后将培养物反复冻融，离心取上清液，灭活后，得到FMDV Asia1型病毒灭活抗原。抗原滴度为108.2TCID50/mL，146S含量为5.3μg/mL。
2.FMDV Asia1型病毒灭活抗原纯化浓缩
(1)无菌条件下，调整接头蛋白溶液(实施例2中方法制备)中接头蛋白浓度至50μg/mL，然后加入待纯化的FMDV Asia型病毒灭活抗原中，加入比例为：108.9TCID50的FMDV O型病毒灭活抗原中加入1mL浓度为50μg/mL的接头蛋白溶液，充分混匀；
(2)将上述混合物置于25℃、转速为150rpm的摇床中，震荡孵育45min，使FMDV型病毒灭活抗原与接头蛋白结合；
(3)无菌条件下，加入纯化载体，加入比例为：108.9TCID50的FMDV Asia1型病毒灭活抗原中加入2.5×109个纯化载体，充分搅拌混匀；
(4)将上述混合物置于25℃、转速为150rpm的摇床中，震荡孵育30min，使结合了FMDV Asia1型病毒灭活抗原的接头蛋白完全与纯化载体结合；
(5)无菌条件下，9000rpm离心5min，得到上清5和沉淀5。
沉淀5即为FMDV Asia1型病毒灭活抗原复合物。以0.1倍原病毒体积的TE缓冲液重悬重悬。FMDV Asia1型病毒灭活抗原复合物是FMDV Asia1型病毒灭活抗原、接头蛋白及乳酸乳球菌骨架的复合物，形成FMDV Asia1型病毒灭活抗原复合物的原理在于接头蛋白可以同时与FMDV Asia1型病毒灭活抗原及乳酸乳球菌骨架进行特异性的结合。因此，本实施例FMDV Asia1型病毒灭活抗原纯化浓缩方法的最终产物为FMDV Asia1型病毒灭活抗原复合物，即沉淀5。
在纯化过程中，为了保证FMDV Asia1型病毒灭活抗原完全回收，乳酸乳球菌骨架及接头蛋白都是过量加入的，因此，FMDV Asia1型病毒灭活抗原复合物(沉淀5)中还含有少量乳酸乳球菌骨架及其与接头蛋白的复合物。
3.FMDV Asia1型病毒灭活抗原纯化浓缩鉴定
为了验证FMDV Asia1型病毒灭活抗原通过本实施例中方法达到纯化浓缩目的，对上清5和沉淀5进行SDS-PAGE电泳和Western-blot鉴定分析，得到图6(A)和图6(B)。
Western-blot操作步骤同实施例4，不同之处在于一抗换成牛FMDV Asia1型病毒高免血清。牛FMDV Asia1型病毒高免血清制备方法：FMDV Asia1型病毒免疫牛，取抗体效价合格的牛采集血液，分离后得到高免血清。
图6(A)和图6(B)结果显示，上清5在SDS-PAGE电泳和western-blot中未检测到大小约为25KDa的抗原条带，抗原主要富集在沉淀5即FMDV Asia1型病毒灭活抗原复合物(沉淀5)中，且由图可见，纯化后大部分的杂蛋白被去除，抗原纯度显著提高。
4.FMDV Asia1型病毒灭活抗原纯化浓缩效率测定
(1)为了检测本实施例中方法纯化病毒灭活抗原效率，用FMDV Asia1型抗体阻断ELISA检测试剂盒(兰州兽医研究所)提供的抗体包被板检测FMDV Asia1型病毒灭活抗原及上清5中抗原含量。数据检测结果显示，上清5中抗原残余量低于FMDV Asia1型病毒灭活抗原稀释27(128)倍后的抗原含量，说明纯化后残余病毒量不足原病毒抗原含量的百分之一，因此，抗原回收效率高于99％。
(2)为了分析FMDV Asia1型病毒灭活抗原复合物中抗原纯度，采用实施例3标题2中方法将沉淀5进行解离，并用BCA蛋白定量试剂盒对沉淀5的解离上清和未纯化FMDVAsia1型病毒灭活抗原进行总蛋白含量测定，测的未纯化抗原总蛋白含量为3290μg/mL，沉淀5蛋白总含量为416μg/mL，由于沉淀5解离上清与FMDV Asia1型病毒灭活抗原的体积比为0.1:1，因此杂蛋白去除率＝[1-(0.1*416/3290)]*100％，高于90％；以抗原回收效率高于99％计算，FMDV Asia1型病毒灭活抗原复合物(沉淀5)中146S含量约为53μg/mL，FMDVAsia1型病毒灭活抗原复合物(沉淀5)中抗原纯度＝(53/416)*100％，高于10％。
实施例7 FMDV病毒灭活抗原纯化浓缩免疫效力鉴定
将FMDV Asia1型病毒灭活抗原(实施例6中标题1)、FMDV Asia1型病毒灭活抗原复合物(实施例6标题2中沉淀5)分别采用TE缓冲液(含有10mmol/L Tris，50mmol/L NaCl，pH8.0)稀释至146S浓度为5.3μg/mL，纯化载体含量约为5×108个，然后与206佐剂(购自法国Seepic)按照体积比为46:54混合，乳化，分别制得Asia1型灭活疫苗及其对照苗。
将FMDV A型病毒灭活抗原(实施例5标题1)、FMDV A型病毒灭活抗原复合物(实施例5标题2中沉淀4)分别采用TE缓冲液(含有10mmol/L Tris，50mmol/L NaCl，pH8.0)稀释至146S浓度为5.2μg/mL，纯化载体含量约为5×108个，然后与206佐剂(购自法国Seepic)按照体积比为46:54混合，乳化，分别制得A型灭活疫苗及其对照苗。
将FMDV O型病毒灭活抗原(实施例4标题1)、FMDV O型病毒灭活抗原复合物(实施例4标题2中沉淀3)分别采用TE缓冲液(含有10mmol/L Tris，50mmol/L NaCl的水溶液，pH8.0)稀释至146S浓度为5.6μg/mL，纯化载体含量为约5×108个，然后与206佐剂(购自法国Seepic)按照体积比为46:54混合，乳化，分别制得O型灭活疫苗及其对照苗。
按照实施例4标题2中方法将接头蛋白溶液与纯化载体混合，孵育，除了不加入FMDV病毒灭活抗原外，其他条件不变，取沉淀采用TE缓冲液(含有10mmol/L Tris、50mmol/LNaCl的水溶液，pH8.0)稀释至含有5×108个纯化载体，然后与206佐剂(购自法国Seepic)按照体积比为46:54混合，乳化，制得对照疫苗1。
对照疫苗2：含有10mmol/L Tris，50mmol/L NaCl的水溶液，pH8.0。
各疫苗的编号及所含抗原见表1。
表1疫苗的编号及所含抗原
疫苗名称 抗原
Asia1型灭活疫苗 FMDV Asia1型病毒灭活抗原复合物
Asia1型对照灭活疫苗 FMDV Asia1型病毒灭活抗原
A型灭活疫苗 FMDV A型病毒灭活抗原复合物
A型对照灭活疫苗 FMDV A型病毒灭活抗原
O型灭活疫苗 FMDV O型病毒灭活抗原复合物
O型对照灭活疫苗 FMDV O型病毒灭活抗原
对照疫苗1 纯化载体与接头蛋白复合物
对照疫苗2 TE缓冲液
(1)免疫效果试验
取40-45日龄的口蹄疫抗体阴性的健康仔猪80头，按照按照表2中方法随机分为8组，颈部肌肉注射方式免疫40-45日龄的口蹄疫抗体阴性的健康仔猪，免疫剂量为2mL/头，每组免疫的疫苗见表2。
免疫后28d采血，分离血清，检测液相阻断抗体水平，评价抗原复合物的免疫原性。从图7、8、9可见，对照疫苗1(G7组)与对照疫苗2(G8组)免疫组抗体水平为阴性，说明纯化过程中引入的纯化载体、接头蛋白与TE缓冲液不会影响疫苗抗体水平；三种FMDV亚型病毒纯化后抗原复合物免疫后的抗体水平显著高于未纯化抗原制成的疫苗，其中FMDV Asia1型病毒灭活抗原复合物免疫组(G1)比其对照组(G2)平均抗体水平约高1个滴度，FMDV A型病毒灭活抗原复合物免疫组(G3)比其对照组(G4)平均抗体水平约高0.7个滴度，FMDV O型病毒灭活抗原复合物免疫组(G5)比其对照组(G6)平均抗体水平约高2个滴度。三种FMDV亚型病毒灭活抗原复合物免疫后的抗体滴度升高水平不一致，可能与抗原或是机体免疫环境有关，不影响其整体抗体提高的趋势。说明本发明纯化浓缩方法制备的FMDV病毒灭活抗原复合物可用于制备抗原纯度高、免疫效果较好的单价或多价口蹄疫疫苗。
表2免疫分组
分组 疫苗名称
G1 Asia1型灭活疫苗
G2 Asia1型对照灭活疫苗
G3 A型灭活疫苗
G4 A型对照灭活疫苗
G5 O型灭活疫苗
G6 O型对照灭活疫苗
G7 对照疫苗1
G8 对照疫苗2
(2)副反应试验
G1-G8组免疫后立即观察记录仔猪免疫应激反应，包括体温、采食、精神状态等，并对免疫后28d内仔猪生长状况(采食、体重、被毛等)进行观察记录。结果显示，G1、G3、G5、G7组与G8对照组免疫后体温、采食均正常，无明显异常反应，生长状况良好。G2、G4组各有一头仔猪免疫后0.5h出现亢奋应激，G2组有1头、G4、G6各有两头出现体温升高，采食量下降等应激反应。结果表明G1、G3、G5组免疫的疫苗由于其FMDV抗原复合物的纯度显著提高，疫苗的免疫应激反应明显减轻。G7对照组免疫后至检测结束并未出现明显异常反应，说明在纯化过程中引入的纯化载体和接头蛋白并不会给机体带来毒副作用，不会影响机体正常生长。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省农业科学院
<120> 一种口蹄疫病毒灭活抗原纯化浓缩方法
<130> 201701261
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 957
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 接头蛋白编码基因
<400> 1
atgactactt ataccgtcaa atctggtgat actctttggg gaatctcaca aagaacaggt 60
tcagcttctt ctacaaattc aggtggttca aacaattccg caagcactac tccaaccact 120
tctgtgacac ctgcaaaacc aacttcacaa acaactgtta aggttaaatc cggagatacc 180
ctttgggcgc tatcagtaaa atataaaact agtattgctc aattgaaaag ttggaatcat 240
ttaagttcag ataccattta tattggtcaa aatcttattg tttcacaatc tgctgctgct 300
tcaaatcctt cgacaggttc aggctcaact gctaccaata actcaaactc gacttcttct 360
aactcaaatg cctcaattca taaggtcgtt aaaggagata ctctctgggg actttcgcaa 420
aaatctggca gcccaattgc ttcaatcaag gcttggaatc atctacgaat aaaaatgcct 480
caattcataa ggtcgttaaa ggagatactc tctggggact ttcaattgct tcaatcaagg 540
cttggaatca tttatctagc gatggaatta gtgtcgctca aattcaaagt gcgaataatc 600
ttaaaagtac cattatctac attgtactgc atactatttt atattcaaag tgcgaataat 660
cttaaaagta ccattatcta cattggtcaa aaacttgtac tggatacctg taacgaaagt 720
accatctatc tgcgtaaata ccagtccaaa gttaaacgcc aataccagtc cgaagtcgac 780
atcattcgcg atgaaatcac cagcgacacc agctacgaaa gcgttggtcg tttcattcgt 840
gacgatgcga aaaacatggt gctgatgaac cgtaagccgg aggatgcggt ttactatggt 900
ctgcgtgcga gcaccgcggg ttgggaaccg cgttgtagct ggggtacccc cgtttaa 957
<210> 2
<211> 318
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> 接头蛋白
<400> 2
Met Thr Thr Tyr Thr Val Lys Ser Gly Asp Thr Leu Trp Gly Ile Ser
1 5 10 15
Gln Arg Thr Gly Ser Ala Ser Ser Thr Asn Ser Gly Gly Ser Asn Asn
20 25 30
Ser Ala Ser Thr Thr Pro Thr Thr Ser Val Thr Pro Ala Lys Pro Thr
35 40 45
Ser Gln Thr Thr Val Lys Val Lys Ser Gly Asp Thr Leu Trp Ala Leu
50 55 60
Ser Val Lys Tyr Lys Thr Ser Ile Ala Gln Leu Lys Ser Trp Asn His
65 70 75 80
Leu Ser Ser Asp Thr Ile Tyr Ile Gly Gln Asn Leu Ile Val Ser Gln
85 90 95
Ser Ala Ala Ala Ser Asn Pro Ser Thr Gly Ser Gly Ser Thr Ala Thr
100 105 110
Asn Asn Ser Asn Ser Thr Ser Ser Asn Ser Asn Ala Ser Ile His Lys
115 120 125
Val Val Lys Gly Asp Thr Leu Trp Gly Leu Ser Gln Lys Ser Gly Ser
130 135 140
Pro Ile Ala Ser Ile Lys Ala Trp Asn His Leu Arg Ile Lys Met Pro
145 150 155 160
Gln Phe Ile Arg Ser Leu Lys Glu Ile Leu Ser Gly Asp Phe Gln Leu
165 170 175
Leu Gln Ser Arg Leu Gly Ile Ile Tyr Leu Ala Met Glu Leu Val Ser
180 185 190
Leu Lys Phe Lys Val Arg Ile Ile Leu Lys Val Pro Leu Ser Thr Leu
195 200 205
Tyr Cys Ile Leu Phe Tyr Ile Gln Ser Ala Asn Asn Leu Lys Ser Thr
210 215 220
Ile Ile Tyr Ile Gly Gln Lys Leu Val Leu Asp Thr Cys Asn Glu Ser
225 230 235 240
Thr Ile Tyr Leu Arg Lys Tyr Gln Ser Lys Val Lys Arg Gln Tyr Gln
245 250 255
Ser Glu Val Asp Ile Ile Arg Asp Glu Ile Thr Ser Asp Thr Ser Tyr
260 265 270
Glu Ser Val Gly Arg Phe Ile Arg Asp Asp Ala Lys Asn Met Val Leu
275 280 285
Met Asn Arg Lys Pro Glu Asp Ala Val Tyr Tyr Gly Leu Arg Ala Ser
290 295 300
Thr Ala Gly Trp Glu Pro Arg Cys Ser Trp Gly Thr Pro Val
305 310 315
<210> 3
<211> 975
<212> DNA
<213> artificial
<220>
<223> 带有His标签的接头蛋白
<400> 3
atgactactt ataccgtcaa atctggtgat actctttggg gaatctcaca aagaacaggt 60
tcagcttctt ctacaaattc aggtggttca aacaattccg caagcactac tccaaccact 120
tctgtgacac ctgcaaaacc aacttcacaa acaactgtta aggttaaatc cggagatacc 180
ctttgggcgc tatcagtaaa atataaaact agtattgctc aattgaaaag ttggaatcat 240
ttaagttcag ataccattta tattggtcaa aatcttattg tttcacaatc tgctgctgct 300
tcaaatcctt cgacaggttc aggctcaact gctaccaata actcaaactc gacttcttct 360
aactcaaatg cctcaattca taaggtcgtt aaaggagata ctctctgggg actttcgcaa 420
aaatctggca gcccaattgc ttcaatcaag gcttggaatc atctacgaat aaaaatgcct 480
caattcataa ggtcgttaaa ggagatactc tctggggact ttcaattgct tcaatcaagg 540
cttggaatca tttatctagc gatggaatta gtgtcgctca aattcaaagt gcgaataatc 600
ttaaaagtac cattatctac attgtactgc atactatttt atattcaaag tgcgaataat 660
cttaaaagta ccattatcta cattggtcaa aaacttgtac tggatacctg taacgaaagt 720
accatctatc tgcgtaaata ccagtccaaa gttaaacgcc aataccagtc cgaagtcgac 780
atcattcgcg atgaaatcac cagcgacacc agctacgaaa gcgttggtcg tttcattcgt 840
gacgatgcga aaaacatggt gctgatgaac cgtaagccgg aggatgcggt ttactatggt 900
ctgcgtgcga gcaccgcggg ttgggaaccg cgttgtagct ggggtacccc cgttcaccac 960
caccaccacc actaa 975

Claims (10)

1.一种口蹄疫病毒灭活抗原纯化浓缩方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的接头蛋白加入口蹄疫病毒灭活抗原中，混匀，孵育；
(2)加入纯化载体，混匀，孵育；所述纯化载体为乳酸乳球菌骨架；
(3)离心，取沉淀。
2.根据权利要求1所述口蹄疫病毒灭活抗原纯化浓缩方法，其特征在于步骤(1)中孵育条件如下：孵育过程中震荡，孵育温度为20-25℃，孵育时间为45min-60min。
3.根据权利要求1或2所述口蹄疫病毒灭活抗原纯化浓缩方法，其特征在于步骤(2)中孵育条件如下：孵育过程中震荡，孵育温度为20-25℃，孵育时间为25min-35min。
4.根据权利要求3所述口蹄疫病毒灭活抗原纯化浓缩方法，其特征在于接头蛋白加入的比例如下：108.7TCID50-109.2TCID50的口蹄疫病毒灭活抗原中加入40～60μg的接头蛋白。
5.根据权利要求4所述口蹄疫病毒灭活抗原纯化浓缩方法，其特征在于纯化载体加入的比例如下：108.7TCID50-109.2TCID50的口蹄疫病毒灭活抗原中加入2.4×109-2.6×109个纯化载体。
6.根据权利要求5所述口蹄疫病毒灭活抗原纯化浓缩方法，其特征在于所述接头蛋白是通过诱导表达携带所述接头蛋白编码基因的重组菌获得的。
7.根据权利要求6所述口蹄疫病毒灭活抗原纯化浓缩方法，其特征在于所述重组菌是将接头蛋白编码基因插入表达载体pET32中NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点之间，然后导入大肠杆菌后获得的。
8.根据权利要求7所述口蹄疫病毒灭活抗原纯化浓缩方法，其特征在于所述重组菌在35-37℃培养1-2h，在24-26℃培养2-4h，在15-17℃静置10-20min，然后加入终浓度为0.1-0.3mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷在15-17℃诱导培养18-22h，获得接头蛋白。
9.根据权利要求8所述口蹄疫病毒灭活抗原纯化浓缩方法，其特征在于所述乳酸乳球菌骨架是将乳酸乳球菌采用盐酸煮沸、洗涤后得到。
10.口蹄疫病毒灭活疫苗，其特征在于含有权利要求1所述方法获得的沉淀。
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