CN105925597A - 一种pedv s基因主要抗原表位串联的重组基因及其制备方法和应用 - Google Patents

一种pedv s基因主要抗原表位串联的重组基因及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种PEDV S基因主要抗原表位串联的重组基因及其制备方法和应用，属于PEDV S蛋白主要中和表位区高效表达方法领域。本发明的PEDV S基因主要抗原表位串联的重组基因，将PEDV S基因3个主要抗原表位串联获得，且各主要抗原表位之间以柔性氨基酸的碱基序列连接，名称为S123，碱基序列如序列如SEQ ID NO：1所示。本发明的重组基因包含大部分PEDV抗原表位，且所选的片段避开了高变异区，表达量高效稳定且免疫原性强；应用PEDV S基因主要抗原表位串联的重组蛋白在PEDV的间接ELISA检测试剂盒中的应用，既能快速诊断PEDV，又能很好地监测和评估猪群中和保护。

Description

一种PEDV S基因主要抗原表位串联的重组基因及其制备方法 和应用
技术领域
本发明属于PEDV S蛋白主要中和表位区高效表达方法领域，特别涉及一种PEDV S基因主要抗原表位串联的重组基因及其制备方法和应用。
背景技术
猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒引起的高度接触性肠道传染病，临床上以腹泻，脱水，呕吐和对哺乳仔猪高死亡率为特征。自2010年12月以来，猪流行性腹泻病毒(PEDV)在我国一直大面积爆发，2013年继续席卷美国养殖业，给我国乃至世界的养殖业造成了严重的经济损失。及早发现确诊该病毒，整体评估畜群的中和抗体水平显得异常重要，因此找到一种PEDV主要抗原表位的高效表达技术，建立一套高效、敏感、简便的PEDV ELISA检测方法，监测和评估血清中中和保护抗体具有重大意义。
目前ELISA是实验室最广泛的PEDV检测方法之一，它具有快速，简便，准确的特点。现国内外已有的商品化的PEDV抗体ELISA检测试剂盒中，大多数以全病毒作为抗原，但是由于PEDV分离培养的难度大，大量制备抗原显得相当困难，且表达片段较长，一定程度上降低了表达效率。也有许多国内外学者试图开发关于PEDV的S、M、N蛋白的ELISA试剂盒，RenXiaofeng将PEDV M蛋白免疫兔子获得的单克隆抗体来制备间接ELISA方法来检测PEDV病毒，Hou等利用大肠杆菌重组表达的N蛋白作为抗原建立了ELISA检测方法，具有较高特异性和敏感性。郑逢梅等以纯化的PEDV N蛋白作为包被抗原建立检测PEDV抗体的间接ELISA方法具有良好的特异性、灵敏性、可重复性。Kuchel和Oh从PEDV感染的Vero细胞的胞浆中提取S蛋白和N蛋白，建立了检测PEDV抗体的ELISA检测方法。M蛋白和N蛋白相对保守，但是由于这两个基因中和表位较少，不能很好地检测和评估畜群的中和保护抗体；S基因现阶段变异较大(特别在S1区)，不利于表达的高效准确，都存在一定的缺陷。所以一种高效、特异、准确且包含大部分中和表位的表达方法急需出现。
而S基因是PEDV的重要抗原基因，编码病毒的纤突蛋白，在感染宿主体内介导中和抗体的过程中发挥重要作用。S.H.Chang等曾实验确证PEDV S基因上499-638aa为中和抗原表位，D.J.Cruz等证实1368-1374aa片段能够诱导中和抗体产生，后孙东波等利用fd丝状噬菌体展示系统及生物信息学方法鉴定出PEDV S蛋白5个线性抗原表位即S1P1(第248-280aa)、S1P2(第442-499aa)、S1P3(第693-742aa)、S1S5(第748-755aa)、S1S6(第764-771aa)。
所以本发明针对PEDV S基因以上主要抗原表位进行串联表达，不仅可以用于开发PEDV ELISA试剂盒，以快速准确诊断疾病，监测和评估畜群中和保护抗体水平，而且可以用于制备基因工程疫苗。
目前，串联表达技术主要避开需要表达基因的高变异区并剔除多余的片段，选取目的基因的高效中和表位区进行串联得到新的重组基因，再利用原核系统将重组蛋白进行表达，发展至今已是一套成熟的技术。卢清峡等根据猪口蹄疫O型合成肽疫苗中主要抗原位点的氨基酸序列使用大肠杆菌偏好性密码子人工合成该抗原多肽的双拷贝基因序列,运用原核表达载体pET32a对该抗原多肽进行串联表达，结果得到高效表达，重组蛋白具有良好的反应性；陈如敬等选取(PRRSV)GP5蛋白已鉴定的抗原表位(aa31-37和aa192-198)进行串联后克隆到原核表达载体PGEX-6P-1上，转化E.coli BL21后进行条件优化诱导表达,结果显示该重组蛋白具有的免疫学活性；李明等将猪链球菌2型MRP与GPF基因串联表达，实验结果显示串联的融合蛋白能产生更高的针对MRP和EPF的效价。目前关于PEDV的串联表达技术在国内外还未见报道。经SOOPAT检索，现在并没有针对PEDV S基因主要中和表位进行串联表达的申报和授权。
综上，为了克服M蛋白和N蛋白表达不能很好地监测和评估畜群中和保护抗体，S蛋白变异性较大，不稳定等缺陷，本实验研究发明了一种PEDV S基因主要抗原位点表达技术，该方法表达量高，敏感性和特异性比其他单一原核表达更强，用此串联表达系统建立的间接ELISA既能快速诊断PEDV，又能很好地监测和评估猪群中和保护抗体水平。同时表达的蛋白具有较好的免疫原性，也为基因工程疫苗的研究提供参考，极大地丰富了实验室对PEDV的研究内容。
发明内容
为克服现阶段大部分中和表位的PEDV S蛋白S1区变异较多，表达不稳定，其他PEDV蛋白的表达所建立的ELISA不能很好地监测和评估猪群中和抗体水平的缺点与不足，本发明提供一种PEDV S基因主要抗原表位串联的重组基因。本发明的重组基因，敏感性和特异性强，用此串联表达系统建立的间接ELISA既能快速诊断PEDV，又能很好地监测和评估猪群中和保护抗体水平，也为基因工程亚单位疫苗的研究提供参考。
本发明的另一目的在于提供上述PEDV S基因主要抗原表位串联的重组基因的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述PEDV S基因主要抗原表位串联的重组基因的应用。应用于猪场血清中和保护抗体的监测和评估，PEDV ELISA诊断试剂盒的开发和PEDV基因工程疫苗的制备等方面。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种PEDV S基因主要抗原表位串联的重组基因，将PEDV S基因3个主要抗原表位的碱基序列串联获得，且各主要抗原表位的碱基序列之间以柔性氨基酸的碱基序列连接，名称为S123，碱基序列如下所示：
GGATCCTGTAGGGGTCCTAGACTTCAAGGTGGTGGTGGTAGCACTTCTTTTGTTACTTTGCCATCATTTAATGATCATTCTTTTGTTAATATTACTGTCTCTGCTGCTTTTGGTGGTCATAGTGGTGCCAACCTTATTGCATCTGACACTACTATCAATGGGTTTAGTTCTTTCTGTGTTGACACTAGACAATTTACCATTTCACTGTTTTATAACGTTACAAACAGTTATGGTTACGTGTCTAAATCACAGGACAGTAATTGCCCTTTTACCTTGCAATCTGTTAATGATTACCTGTCTTTTAGCAAATTTTGTGTTTCTACCAGCCTTTTGGCTAGTGCCTGTACCATAGATCTTTTTGGTTACCCTGAGTTTGGTAGTGGTGTTAAGTTCACGTCCCTTTACTTTCAATTCACAAAGGGTGAGTTGATTACTGGCACGCCTAAACCACTTGAAGGTGTTGGTGGTGGTGGTAGCGTTACGCCATGTTCTTTTTCAGAGCCGGCTGCATATGTTGATGATGATATAGTGGGTGTTATTTCTAGTTTGTCTAACTCCACTTTTAACAGTACTAGGGAGTTGCCTGGTTTCTTCTACCATTCTAATGATGGCTCTAATTGTACAGAGCCTGTGTTGGTGTATAGTAACATAGGTGTTTGTAAATCTGGCAGTATTGGCTATGTCCCATCTCAGTCTGGCCAACTCGAG。
所述的柔性氨基酸的碱基序列为GGTGGTGGTGGTAGC。
上述的重组基因制备PEDV S基因主要抗原表位串联的重组蛋白的方法，包括以下的步骤：
(1)目的片段的合成：以PEDV S基因为模板，选择三段抗原表位S1(1368-1374aa)、S2(499-638aa)、S3(697-771aa)，各抗原表位的基因片段之间以柔性氨基酸碱基序列GGTGGTGGTGGTAGC链接，在目的片段两端分别带有XhoI和BamHI，将串联的S基因命名为S123，总大小为708bp，碱基序列如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列组成；
(2)将S123连接至PET‐28a载体上，得到重组表达载体PET‐28a‐S123：对原核表达载体pET‐28a进行双酶切，在37℃水浴中进行酶切反应，酶切时间为4h～5h或者过夜酶切；双酶切之后，进行琼脂糖凝胶回收酶切产物；回收后，分别将纯化回收的目的基因S123与表达载体pET‐28a进行连接，然后转化至DH5a感受态细胞，挑取单菌落摇菌后提取质粒进行双酶切鉴定，测序鉴定结果为阳性的重组质粒命名为PET‐28a‐S123；
(3)目的基因在大肠杆菌中的表达：在已鉴定为阳性菌BL21(DE3)的kan平板上挑取单个菌落，接种于3ml含kan的LB培养基中，同时设立空载体对照组，在37℃的摇床中过夜培养12h～16h，第二天早上将过夜培养的菌液按1:100比例接种于3mL含有kan的LB培养基中，置于37℃摇床中150‐200r/min培养至OD600约为0.6‐0.8时加入IPTG至终浓度为1.0mmol/mL，诱导表达4‐6小时；进行SDS‐PAGE电泳鉴定，获得PEDV S基因主要抗原表位串联的重组蛋白。
步骤(1)中所述的抗原表位S1的氨基酸序列如下：
CRGPRLQ。
步骤(1)中所述的抗原表位S2的氨基酸序列如下：
TSFVTLPSFNDHSFVNITVSAAFGGHSGANLIASDTTINGFSSFCVDTRQFTISLFYNVTNSYGYVSKSQDSNCPFTLQSVNDYLSFSKFCVSTSLLASACTIDLFGYPEFGSGVKFTSLYFQFTKGELITGTPKPLEGV。
步骤(1)中所述的抗原表位S3的氨基酸序列如下：
VTPCSFSEPAAYVDD。
上述的PEDV S基因主要抗原表位串联的重组基因在PEDV的间接ELISA检测试剂盒中的应用。
本发明的重组基因包含大部分PEDV抗原表位，且所选的片段避开了高变异区，表达量高效稳定且免疫原性强；应用PEDV S基因主要抗原表位串联的重组蛋白在PEDV的间接ELISA检测试剂盒中的应用，既能快速诊断PEDV，又能很好地监测和评估猪群中和保护。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明选取了本实验室分离的GD12毒株细胞适应毒株的S基因为模板，截取3段S基因上中和表位的区域S1(1368aa-1374aa)、S2(499aa-638aa)、S3(697aa-771aa)，各基因片段之间以柔性氨基酸(GGTGGTGGTGGTAGC)碱基序列链接，表位片段都是很短的多肽，其保守性也比较高，从而避开S基因中几处高变区，更有利于表达的高效稳定。
2、本发明将构建的重组表达质粒转化至感受态BL21(DE3)中挑取阳性菌，在含kan的LB中过夜。小量提取转化细菌的质粒,通过质粒大小鉴定,经hindⅢ和Xhol双酶切分析鉴定,分别得到了约5369bp和708bp的pET-28a-的线性片段和与目的基因大小一致的插入片段，表明已经成功地构建出了S基因的原核表达重组质粒Pet-28aS123。
3、本发明将表达菌培养至OD600约为0.6-0.8时，选取4个ITPG浓度分别为，0.5mmol/ml、0.8mmol/ml、1.0mmol/ml、1.2mmol/ml将这4个浓度分别在37℃下做3h、4h、5h、6h的诱导表达，然后进行SDS-PAGE电泳分析，结果证明，37℃IPTG浓度为1.2mmol/ml下诱导4小时，表达量最高，为最佳的表达条件。
4、本发明将含有pET-28a-S123重组质粒的菌体表达量较高，将菌体诱导、裂解后，经过蛋白的变性，复性，对其纯化产物进行SDS-PAGE分析，表明纯化后的蛋白条带与原重组菌位置一致，在29kDa处有单一条带，说明重组蛋白得到了良好的纯化。
附图说明
图1是重组克隆质粒PCR鉴定结果；其中，1：重组质粒pMD-18T-S123双酶切结果；2：重组质粒pMD-18T-S123PCR结果；3：DNA Maker 2000；4：重组质粒pMD-18T-S123；
图2是重组表达质粒双酶切鉴定结果；其中，1：DNA Maker 5000；2：重组质粒Pet-28a-S123双酶切结果；3：重组质粒Pet-28a-S123；
图3是重组质粒在BL21(DE3)中表达的结果图；其中，1：含空质粒阳性菌在ITPG诱导下4小时结果；2：阳性菌在ITPG诱导下4小时结果；3：阳性菌在ITPG诱导下5小时结果；4：阳性菌在下诱导6小时结果；5：阳性菌在ITPG 1.0mmol/mL下诱导0小时结果；
图4是蛋白可溶性检测结果图；其中，1、2：阳性菌经超声波破碎后离心取重悬菌泥的电泳结果；3：阳性菌经超声波破碎后离心取菌液的电泳结果；
图5是蛋白表达条件优化结果图；其中，1、2、3、4分别为37℃ITPG浓度1.0mmol/mL下诱导3、4、5、6小时的表达结果；5为Maker对比；6、7、8、9分别为37℃ITPG浓度1.2mmol/mL下诱诱导3、4、5、小时的表达结果；
图6是western blot分析结果图；其中，1：蛋白Maker对比图；2、3：蛋白转膜后western blot鉴定结果；4：空载体表达western blot鉴定结果；
图7是蛋白纯化结果图；其中，1：蛋白Maker对比；2：空质粒表达对比结果；3：蛋白纯化结果。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1 目的片段的合成
以本实验室分离所得的细胞适应变异株GDGZ12株S基因为模板，选择三段抗原表位S1(1368-1374aa)、S2(499-638aa)、S3(697-771aa),各基因片段之间以柔性氨基酸的(GGTGGTGGTGGTAGC)碱基序列链接，在目的片段两端分别带有XhoI和BamHI，此部分由金唯智公司生物有限公司合成，将串联的S基因命名为S123，总大小为708bp。重组克隆质粒PCR鉴定结果如图1所示。
实施例2 表达载体pET-28a–S123构建与鉴定
1载体pet-28a与目的片段S123连接
对原核表达载体pET-28a进行双酶切，在37℃水浴中进行酶切反应，酶切时间为4h～5h或者过夜酶切。双酶切之后，进行琼脂糖凝胶回收酶切产物。回收后，分别将纯化回收的目的基因S123与表达载体pET-28a进行连接，连接体系如表1所示：
表1表达载体连接体系
2.pET-28a-S123双酶切鉴定
重组质粒Pet-28a-S123分别采用BamHI、XhoI双酶切鉴定体系如下表2，在37℃水浴中进行酶切反应，酶切时间为4h～5h或者过夜酶切，双酶切之后，进行琼脂糖凝胶电泳查看结果。重组表达质粒双酶切鉴定结果如图2所示。
表2表达载体双酶切
实施例3 目的基因在大肠杆菌中的表达
在已鉴定为阳性菌BL21(DE3)的kan平板上挑取单个菌落，接种于3ml含kan的LB培养基中，同时设立空载体对照组，在37℃的摇床中过夜培养(12-16h)。第二天早上将过夜培养的菌液按1:100比例接种于3mL含有kan的LB培养基中，置于37℃摇床中150-200r/min培养至OD600约为0.6-0.8时加入IPTG至终浓度为1.0mmol/mL，诱导表达4-6小时。进行SDS-PAGE电泳鉴定。同时设立空载体对照和零诱导对照。重组质粒在BL21(DE3)中表达的结果图如图3所示。
1表达产物的样品的制备
取诱导前和诱导后菌体样品同时还要设立空质粒对照，12000g离心1min，弃上清，然后加入ddH2O体积为(每毫升菌液加100μL)及等体积的5×SDS凝胶加样缓冲液(含DTT)，充分混匀，煮沸10min，14000g离心5min，取重悬菌，准备电泳。
2SDS-PAGE电泳分析
(1)12％分离胶制备
如表3所示，加入各成分后迅速混合均匀，灌入制胶板中，最后补加入约1.5ml去离子水充满。室温30min后凝结，弃去上层水份，用吸水纸吸干后准备灌注积层胶。
表3 12％的分离胶制作
(2)5％浓缩胶制作
如表4所示，加入各成分后迅速混合均匀，灌入制胶板中，灌满后插入加样梳。室温约20min待积层胶凝固后，取下梳子；
表4 5％浓缩胶制作
(3)上样电泳
将凝胶板固定于电泳装置上，加入足够量的Tris-甘氨酸电泳缓冲液，在加样孔中分别加入各样品；80V恒压电泳0.5h，然后转至130V继续电泳，至溴酚蓝泳移出凝胶底部，关闭电源，终止电泳。
3聚丙烯酰胺凝胶染色与脱色
卸下凝胶，用考马斯亮蓝R250染色液(45％甲醇，45％纯水，10％冰乙酸，0.25％的考马斯亮蓝R250)与摇床上染色1h，用脱色液(30％甲醇，45％纯水，20％冰乙酸)进行脱色3小时后(中途换3次染色液)，观察结果。
4蛋白可溶性检测
加入一级种子液于3mL含有kan的LB培养基中，置于37℃摇床中150-200r/min培养至OD600约为0.6-0.8时加入ITPG诱导5小时左右，用超声波破碎30min，5000rmp/s离心15分钟,取菌泥和菌液分别上样进行SDS-PAGE电泳分析。然后进行染色，脱色后查看结果，方法同上。蛋白可溶性检测结果图如图4所示。
5诱导表达的条件优化
菌液培养至OD600约为0.6-0.8时，选取4个ITPG浓度分别为，0.5mmol/mL、0.8mmol/mL、1.0mmol/mL、1.2mmol/mL将这4个浓度分别在37℃下做3h、4h、5h、6h的诱导表达，然后进行SDS-PAGE电泳，确定最佳诱导条件。蛋白表达条件优化结果图如图5所示。
实施例4 重组目的蛋白纯化
1包涵体制备
将含有重组质粒pET-28a-S123的基因工程菌BL21(DE3)种子液以1:100的比例，接种至500mlLB液体培养基中，220rpm，37℃扩大培养3～4h，至OD600值达0.5～0.6时按照已确定的最佳诱导条件浓度加入IPTG进行诱导，此时将转速提高至240rpm，温度保持不变继续培养；诱导4～5h后，离心收获菌体.然后将收集的菌体用预冷的菌体裂解缓冲液重悬，充分混匀后冰浴30min，超声裂解3～4次，10秒/次裂解时间为30min，中间间隔摇匀，最后4℃，6 000g离心10min，弃除上清。
2包涵体蛋白纯化
采用康为世纪公司的Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒。收集菌体后，每100mg菌体加入1-5ml细菌裂解液，然后超声裂解菌体；10000rmp，4℃离心30min后，分离上清和沉淀，并收集沉淀。将沉淀重悬于Binding Buffer中，尽量混匀，冰浴1h,使包涵体溶解；10000rmp离心20分钟，将上清用0.22μm滤膜过滤；将蛋白溶液负载上柱，流速为10倍体积每小时,收集流穿液；使用15倍柱体积的Binding Buffer冲洗柱子，洗去杂蛋白；使用ElutionBuffer洗脱，收集洗脱峰；洗脱后，依次使用10倍柱体积的去离子水洗涤柱子，再使用3倍柱体积的20％乙醇平衡，4℃保存。蛋白纯化结果图如图7所示。
实施例5重组蛋白质浓度和免疫原性的测定
对表达出的蛋白进行纯化后，得到纯度达90％以上的重组蛋白。然后用紫外分光光度计测定样品在260nm和280nm波长的光吸收值,按下式计算样品中的蛋白质含量:蛋白质浓度(mg/ml)＝(1.45×A280-0.74×A260)×稀释倍数通过计算得出纯化的蛋白的量为0.713mg/mL，Westernblot检测表明，表达的重组蛋白够被PEDV阳性血清所识别，且Western-blot初步分析S123重组蛋白可与PEDV兔抗多克隆血清发生反应，表明串联的3个主要PEDV S蛋白抗原表位具有免疫学反应。进一步摸索最佳表达条件，结果证明,37℃IPTG浓度为1.2mmol/ml下诱导4小时，S123重组蛋白表达量最高。western blot分析结果图所图6所示
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种PEDV S基因主要抗原表位串联的重组基因，其特征在于：将PEDV S基因3个主要抗原表位的碱基序列串联获得，且各主要抗原表位的碱基序列之间以柔性氨基酸的碱基序列连接，名称为S123，碱基序列如序列如SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的PEDV S基因主要抗原表位串联的重组基因，其特征在于：所述的柔性氨基酸的碱基序列如SEQ ID NO：2所示。
3.权利要求1或2所述的重组基因制备PEDV S基因主要抗原表位串联的重组蛋白的方法，其特征在于：包括以下的步骤：
(1)目的片段的合成：以PEDV S基因为模板，选择三段抗原表位S1、S2、S3，各抗原表位的基因片段之间以如SEQ ID NO：2所示的柔性氨基酸碱基序列链接，在目的片段两端分别带有XhoI和BamHI，将串联的S基因命名为S123，总大小为708bp，碱基序列如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列组成；
(2)将S123连接至PET‐28a载体上，得到重组表达载体PET‐28a‐S123：对原核表达载体pET‐28a进行双酶切，在37℃水浴中进行酶切反应，酶切时间为4h～5h或者过夜酶切；双酶切之后，进行琼脂糖凝胶回收酶切产物；回收后，分别将纯化回收的目的基因S123与表达载体pET‐28a进行连接，然后转化至DH5a感受态细胞，挑取单菌落摇菌后提取质粒进行双酶切鉴定，测序鉴定结果为阳性的重组质粒命名为PET‐28a‐S123；
(3)目的基因在大肠杆菌中的表达：在已鉴定为阳性菌BL21(DE3)的kan平板上挑取单个菌落，接种于3ml含kan的LB培养基中，同时设立空载体对照组，在37℃的摇床中过夜培养12h～16h，第二天早上将过夜培养的菌液按1:100比例接种于3mL含有kan的LB培养基中，置于37℃摇床中150‐200r/min培养至OD600约为0.6‐0.8时加入IPTG至终浓度为1.0mmol/mL，诱导表达4‐6小时；进行SDS‐PAGE电泳鉴定，获得PEDV S基因主要抗原表位串联的重组蛋白。
4.根据权利要求3所述的重组基因制备PEDV S基因主要抗原表位串联的重组蛋白的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的抗原表位S1的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
5.根据权利要求3所述的重组基因制备PEDV S基因主要抗原表位串联的重组蛋白的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的抗原表位S2的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
6.根据权利要求3所述的重组基因制备PEDV S基因主要抗原表位串联的重组蛋白的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的抗原表位S3的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。
7.权利要求1或2所述的PEDV S基因主要抗原表位串联的重组基因在PEDV的间接ELISA检测试剂盒中的应用。
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