CN102416174A

CN102416174A - 猪o型口蹄疫重组噬菌体疫苗及其构建方法

Info

Publication number: CN102416174A
Application number: CN2011103738606A
Authority: CN
Inventors: 徐海; 王义伟; 侯继波
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2011-11-23
Filing date: 2011-11-23
Publication date: 2012-04-18

Abstract

本发明提供了一种猪O型口蹄疫重组噬菌体疫苗及其构建方法，所说的疫苗以重组噬T7菌体为抗原，所说的重组T7噬菌体表面表达有氨基酸序列如SEQIDNO：2所示的Mya98谱系FMDVVP1(129-169)位多肽，所说的VP1(129-169)多肽是由单拷贝VP1(129-169)基因插入T7噬菌体P10B基因下游进行融合表达获得。本发明具有如下技术效果：(1)用T7噬菌体载体制备的重组噬菌体疫苗能够克服FMDVVP1多肽自身免疫原性较弱的不足、缺乏T辅助性细胞表位的缺点，有效的提高免疫原性，刺激机体产生更高水平的抗体。(2)由于T7噬菌体易于培养、便于纯化，用于生产基因工程疫苗具有多种优势，本发明制备的猪O型口蹄疫重组噬菌体疫苗便于大规模生产、成本低廉。

Description

猪O型口蹄疫重组噬菌体疫苗及其构建方法

技术领域

本发明涉及T7噬菌体展示猪O型口蹄疫病毒VP1蛋白主要抗原表位的重组噬菌体构建及应用，属于分子生物技术领域。

背景技术

口蹄疫(FMD)是偶蹄动物的一种急性、烈性传染病，严重威胁动物及其产品的国内外贸易乃至于人类的健康。FMD一旦暴发，随之而来所采取的封锁、隔离、扑杀牲畜等强制措施将给发病国家或地区带来重大的经济损失。因此，FMD一直被世界动物卫生组织(OIE)列在A 类传染病之首。口蹄疫的病原为口蹄疫病毒，是小RNA病毒科，口蹄疫病毒属成员。病毒粒子为二十面体，无囊膜，直径20～30nm，结构比较简单，完整的病毒颗粒包括衣壳和RNA两部分，病毒的RNA为单股正链RNA，全长8.5kb。

O型FMDV至少有5个中和性抗原位点。位点1由VP1的G-H环和C 端氨基酸残基的线性表位组成，从病毒中分离的VP1可以诱导动物产生相应中和性抗体，该位点是FMDV最重要的抗原位点，也是FMDV抗原变异关键所在。位点2位于病毒表面VP2的B-C环和E-F环上，在三重轴附近，由4个表位组成。位点3位于病毒表面五重轴周围VP1的B-C环。位点4位于五重轴周围VP3的B-B“结节”上。位点5位于VP1的G-H环内，与位点1是相互独立的。它们在功能上都是独立的，但是在单拓扑结构上很可能有重叠。抗体竞争试验表明，位点1、2和3在拓扑结构上是独立的，位点2和4在拓扑结构上是关联的。

研究表明，结构蛋白VP1～VP4均参与抗原位点的形成，但发挥主要作用的是VP1，该基因位于FMDV基因组的2977～3615位核苷酸，编码213个氨基酸。结构蛋白VP1功能区内包含FMDV的主要抗原位点，能诱导感染动物产生中和性抗体，其中第140～160位氨基酸处的G-H环是主要的保护性抗原位点,有连续的B细胞表位，具有较大的运动性,在其顶部形成了一个高度保守的Arg-Gly-Asp (RGD)序列，是FMDV的细胞受体位点。其次，在C端200～213位氨基酸残基有T细胞抗原表位。

T7噬菌体是感染大肠杆菌的小型烈性噬菌体，基因组为线状双链DNA，长39 936bp。其衣壳蛋白包括主要头蛋白(P10A)、次要头蛋白(P10B)、颈圈蛋白(P8)、尾蛋白(P11、P12)和尾丝蛋白(P17)，其中P10A和P10B是由p10编码的是一对重叠蛋白，P10A有344个氨基酸残基，P10B有397个氨基酸残基，是在P10A的phe341处翻译移码产生的，在野生型T7噬菌体中，P10B约占衣壳蛋白总量(415拷贝)的10%。对T7噬菌体的生物学特性，己经做过全面深入地研究，基因组全部序列己经测定。与入噬菌体和丝状噬菌体相比，T7噬菌体更易培养且繁殖更快，37℃下3h形成噬菌斑，感染后1-2h完全裂解。

T7噬菌体展示系统是一种新型的展示系统，对p10进行了改造，自然状态下的翻译移码位点被去除，并在348位氨基酸之后重组入了一个多克隆位点，使得基因组中仅表达改造后的P10B (415拷贝)，因而可以将外源肽段以融合蛋白的形式展示在P10B上。T7噬菌体展示系统具有操作简便、复制周期短、容易培养、生长迅速、系统稳定、勿需分泌到周质或膜外而是直接展示，

重组噬菌体疫苗具有以下优势：噬菌体作为表达产物的载体展示的是生物体自身翻译机制产生的天然构象产物，能很好的诱发机体的抗原-抗体免疫反应；噬菌体有较强的免疫原性，在噬菌体表面表达的多肽易于接近抗体，容易被免疫系统识别；噬菌体可以募集T辅助细胞，而且噬菌体颗粒的不对称性有利于引发T细胞依赖的免疫反应；由于噬菌体颗粒是由感染的细菌分泌，噬菌体颗粒可以方便的大规模生产疫苗用抗原表位，还可以在同一噬菌体上展示多个具有保护性作用的抗原决定簇，构建多价疫苗；噬菌体生长迅速，纯化简单、花费少；噬菌体颗粒稳定，对理化因素的抵抗力强。

发明内容

本发明的目的是克服现有多肽疫苗技术的不足之处，提供一种高效的猪O型口蹄疫重组噬菌体疫苗。

本发明的猪O型口蹄疫重组噬菌体疫苗，以重组T7噬菌体为抗原，所说的重组T7噬菌体表面表达有氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的Mya98谱系FMDV VP1(129-169)位多肽，所说的多肽由VP1(129-169)基因插入T7噬菌体P10B基因下游融合表达获得。

所述的Mya98谱系FMDV VP1(129-169)位多肽基因选自以下序列的核苷酸：

1)具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列；

2)具有SEQ ID NO：1所示序列经改变、缺失或增加一个或几个核苷酸但仍表达具有猪O型口蹄疫VP1主要抗原活性多肽的核苷酸序列。

所说的疫苗中还包含用于乳化重组T7噬菌体的白油佐剂。

本发明的猪O型口蹄疫重组噬菌体疫苗的构建方法，包括下列步骤：

A、构建重组噬菌体

(1)合成一段DNA序列，该DNA序列克隆至pUC-19载体多克隆位点中，DNA序列的5’端有酶切位点EcoRⅠ，3’端含有酶切位点HindⅢ，其DNA序列如SEQ ID NO：3所示；

(2)用限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ将上述DNA序列从pUC-19载体上切下后插入T7噬菌体多克隆位点的EcoRⅠ和HindⅢ之间，构建重组噬菌体；

(3)用T7噬菌体包装蛋白组装重组噬菌体，包装产物通过琼脂糖夹心法扩增，用PCR方法筛选阳性重组噬菌体，重组噬菌体展示Mya98谱系FMDVVP1(129-169)位多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；

B、重组噬菌体的制备

甘油冻存的E.coli BL21菌株在LB体培养基平面上划线接种，37℃过夜培养；

从平皿上挑取单菌落，接种5mL LB培养液，37℃、200转/分震荡培养过夜，取3mL过夜培养物接种300mL LB培养液，培养至OD₆₀₀=0.8左右，挑取平皿上的单个噬菌斑，接种到培养好的BL21宿主菌中，37℃、100转/分震荡培养2-3小时，直至菌液由浑浊变为澄清，用PEG沉淀的方法回收噬菌体，并按常规的方法测定噬菌体滴度，将回收的噬菌体调整浓度为2×10¹³pfu/mL，并按照4‰的比例加入甲醛溶液，37℃、100转/分震荡灭活过夜；

C、制备重组噬菌体油乳剂疫苗

1）疫苗油相的制备：4mL司本80，2mL司本85，94mL 10号矿物油，2g硬脂酸铝，充分混匀，121℃高压20分钟；疫苗水相的制备：94mL滴度为2×10¹³pfu/mL的灭活噬菌体，4mL高压灭菌吐温-80，3000转/分钟搅拌均匀；

2）按照水相：油相比1:3的比例在高速乳化器上乳化至稳定的油包水结构，即为制备的重组噬菌体油乳剂疫苗；

所述的猪O型重组噬菌体疫苗的构建方法中，重组T7噬菌体的载体为T7 Select 415-1b。

本发明具有如下技术效果：

(1)本发明利用噬菌体具有的病毒样颗粒的佐剂的特性，用T7噬菌体载体制备的重组噬菌体疫苗能够克服猪O型口蹄疫VP1自身免疫原性较弱的不足、缺乏T辅助性细胞表位的缺点，有效的提高免疫原性，刺激机体产生更高水平的抗体。

(2)由于T7噬菌体易于培养、便于纯化，用于生产基因工程疫苗具有多种优势，本发明制备的猪O型口蹄疫重组噬菌体疫苗便于大规模生产、成本低廉。

附图说明

图1为重组T7噬菌体的基因鉴定。泳道1为DL2000 DNA Marker；泳道2为T7噬菌体载体对照；泳道3为重组T7噬菌体。

图2为重组噬菌体SDS-PAGE鉴定。泳道1为Blue Plus Protein Marker；泳道2为T7 Select 415-1b；泳道3为T7-FMD-VP1。

图3为重组噬菌体Western-blot鉴定。泳道1为Blue Plus Protein Marker；泳道2为T7 Select 415-1b；泳道3为T7-FMD-VP1。

图4为猪O型口蹄疫重组噬菌体疫苗免疫后UBI^?VP1多肽ELISA抗体水平图。

图5为猪O型口蹄疫重组噬菌体疫苗免疫后口蹄疫O型抗体液相阻断ELISA抗体水平图。

具体实施方式

实施例中，

编码如SEQ ID NO：3所示基因，是Mya98谱系FMDV VP1主要抗原表位，为常规技术。

限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ购自大连宝生物生物工程公司。

T7噬菌体载体、T7包装蛋白、E.coli BL21购自Novagen公司。

T7噬菌体的提取为常规技术。

T7噬菌体滴度的测定为常规技术。

实施例1 构建重组噬菌体

由商业公司合成一段DNA序列，该DNA序列已克隆至pUC-19载体多克隆位点中，DNA序列的5’端有酶切位点EcoRⅠ，3’端含有酶切位点HindⅢ，其DNA序列如SEQ ID NO：3所示

用限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ将上述DNA序列从pUC-19载体上切下后插入T7噬菌体多克隆位点的EcoRⅠ和HindⅢ之间，构建重组噬菌体。

重组pUC-19载体双酶切体系：

ddH₂O	16.0 μL
		10×H Buffer	5.0 μL
pUC-19载体	25.0μL
		EcoRⅠ	2.0 μL
HindⅢ	2.0 μL

混匀上述反应体系，并置于37 ℃水浴作用4 小时，酶切产物同样经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，胶回收试剂盒进行切胶回收鉴定。

T7噬菌体载体双酶切体系：

ddH2O	11.0 μL
		10×T Buffer	2.0 μL
T7-Select 415b载体	5.0μL
		EcoRⅠ	1.0 μL
HindⅢ	1.0 μL

混匀上述反应体系，并置于37 ℃水浴作用4小时，酶切产物同样经0.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，胶回收试剂盒进行切胶回收鉴定。

连接反应体系：

DNA片段回收产物	2.0 μL
		T7-Select 415b载体回收产物	0.5 μL
ddH2O	1.75 μL
		T4 DNA Ligase	0.25 μL
10×T4 DNALigase Buffer	0.5 μL

16℃连接过夜。

重组噬菌体的包装：

连接产物	5.0 μL
		T7 Packing Extracts	25.0 μL

22℃包装2小时，在包装反应体系中加入270μL LB培养液终止反应。

包装产物的平板扩增：

100μL包装反应物与250μL新鲜过夜培养的BL21菌液(OD600=1.0)混匀后，迅速与3mL融化的45℃温浴的顶层琼脂混合均匀平铺LB平皿，待顶层琼脂凝固后，37℃倒置培养至形成噬菌斑。挑取噬菌斑，PCR方法筛选阳性重组噬菌体。重组噬菌体表面展示GnRH蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

实施例2 大量扩增重组噬菌体

甘油冻存的E.coli BL21菌株在LB体培养基平面上划线接种，37℃过夜培养；从平皿上挑取单菌落，接种5mL LB培养液，37℃、200转/分震荡培养过夜。取3mL过夜培养物接种300mL LB培养液，培养至OD₆₀₀=0.8左右。挑取平皿上的单个噬菌斑，接种到培养好的BL21宿主菌中，37℃、100转/分震荡培养2-3小时，直至菌液由浑浊变为澄清。用PEG-NaCl沉淀的方法回收噬菌体，并按常规的方法测定噬菌体滴度。将回收的噬菌体调整浓度为2×10¹³pfu/mL，并按照4‰的比例加入甲醛溶液，37℃、100转/分震荡灭活过夜。

实施例3 制备猪O型口蹄疫重组噬菌体油乳剂疫苗

猪O型口蹄疫重组噬菌体油乳剂疫苗的制备方法如下：

疫苗油相的制备：4mL司本80，2mL司本85，94mL 10号矿物油，2g硬脂酸铝，充分混匀，121℃高压20分钟。疫苗水相的制备：94mL滴度为2×10¹³pfu/mL的灭活噬菌体，4mL高压灭菌吐温-80，3000转/分钟搅拌均匀。按照水相：油相比1:3的比例，在组织捣碎机加入150mL油相，一边缓慢搅拌一边缓慢加入50mL水相，带充分混匀后，10000转/快速搅拌2分钟至形成稳定的油包水结构，即为制备的重组噬菌体油乳剂疫苗，4℃保存备用。

实施例4 猪O型口蹄疫重组噬菌体油乳剂疫苗免疫及其效果

将上述制成的猪O型口蹄疫重组噬菌体油乳剂疫苗在仔猪40日龄时进行一次免疫，期间定期采集血液样品检测抗体。重组T7噬菌体疫苗中抗原含量达到5×10¹²pfu/mL，每头猪每次免疫2mL。具体操作如下：

挑选出生日龄相近的健康公猪10头，同群饲养至40日龄，其中5头免疫猪O型口蹄疫重组噬菌体疫苗(T7-FMD-VP1)，5头免疫猪口蹄疫O型合成肽疫苗(多肽2570+7309)。分别在免疫后的0、2、4、6、8周采血分离血清，分别用UBI^?VP1多肽ELISA检测试剂盒和中国农业科学研兰州兽医研究所生产的口蹄疫O型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒检测抗体。

如图4所示，UBI^?VP1多肽ELISA检测试剂盒检测表明：猪O型口蹄疫重组噬菌体疫苗免疫后机体产生高水平的抗VP1抗体，免疫后两周抗体迅速升高，OD₄₅₀值到达2.5以上，免疫后2到8周抗体水平仍有小幅上升，并能维持在OD₄₅₀3.0左右；猪口蹄疫O型合成肽疫苗免疫后抗体上升缓慢，免疫后4周抗体到达高峰，但OD₄₅₀值仅有1.2。

如图5所示，口蹄疫O型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒检检测表明：在免疫后第4周，猪O型口蹄疫重组噬菌体疫苗免疫组检测到液相阻断抗体，其中4头猪阻断抗体达到1:64，符合免疫保护设定的阈值；猪口蹄疫O型合成肽疫苗仅有一头猪阻断抗体达到1:32，但仍未满足免疫保护的要求。

<110> OrganizationName : 江苏省农业科学院

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<120> Title : 猪O型口蹄疫重组噬菌体疫苗及其构建方法

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Claims

1.猪O型口蹄疫重组噬菌体疫苗，其特征在于，以重组T7噬菌体为抗原，所说的重组T7噬菌体表面表达有氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的Mya98谱系FMDV VP1(129-169)位多肽，所说的VP1(129-169)多肽是由单拷贝VP1(129-169)基因插入T7噬菌体P10B基因下游融合表达获得。

2.根据权利要求1所述的猪O型口蹄疫重组噬菌体疫苗，其特征在于，所述Mya98谱系FMDV VP1(129-169)位多肽基因选自以下序列的核苷酸：

1)具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列；

2)具有SEQ ID NO：1所示序列经改变、缺失或增加一个或几个核苷酸但仍表达具有VP1主要抗原活性多肽的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的猪O型口蹄疫重组噬菌体疫苗，其特征在于，所说的疫苗中还包含用于乳化重组T7噬菌体的白油佐剂。

4.权利要求1-3中任意一种猪O型口蹄疫重组噬菌体疫苗的构建方法，其特征在于，包括下列步骤：

A、构建重组噬菌体

(3)用T7噬菌体包装蛋白组装重组噬菌体，包装产物通过琼脂糖夹心法扩增，用PCR方法筛选阳性重组噬菌体，重组噬菌体展示FMDV VP1129-169位多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；

B、重组噬菌体的制备

甘油冻存的E.coli BL21菌株在LB体培养基平面上划线接种，37℃过夜培养；从平皿上挑取单菌落，接种5mL LB培养液，37℃、200转/分震荡培养过夜，取3mL过夜培养物接种300mL LB培养液，培养至OD₆₀₀=0.8左右，挑取平皿上的单个噬菌斑，接种到培养好的BL21宿主菌中，37℃、100转/分震荡培养2-3小时，直至菌液由浑浊变为澄清，用PEG沉淀的方法回收噬菌体，并按常规的方法测定噬菌体滴度，将回收的噬菌体调整浓度为2×10¹³pfu/mL，并按照4‰的比例加入甲醛溶液，37℃、100转/分震荡灭活过夜；

C、制备重组噬菌体油乳剂疫苗。

5.根据权利要求4所述的猪O型口蹄疫重组噬菌体疫苗的构建方法，其特征在于，所述的重组T7噬菌体的载体为T7 Select 415-1b。