CN110128509B

CN110128509B - 一种噬菌体展示口蹄疫颗粒、制备方法及疫苗

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Publication number: CN110128509B
Application number: CN201910414269.7A
Authority: CN
Inventors: 陈创夫; 吴鹏; 王勇; 吴文星
Original assignee: Shihezi University
Current assignee: Shihezi University
Priority date: 2019-05-17
Filing date: 2019-05-17
Publication date: 2023-09-12
Anticipated expiration: 2039-05-17
Also published as: CN110128509A

Abstract

本发明属于兽用生物制品领域，公开了一种噬菌体展示口蹄疫颗粒、制备方法及疫苗，噬菌体展示口蹄疫颗粒为噬菌体展示A型口蹄疫颗粒或噬菌体展示O型口蹄疫颗粒；其中噬菌体展示A型口蹄疫颗粒由A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1与噬菌体衣壳组合在一起，噬菌体展示O型口蹄疫颗粒由O型口蹄疫病毒结构蛋白VP1与噬菌体衣壳组合在一起。本发明的噬菌体口蹄疫颗粒是由口蹄疫病毒的结构蛋白VP1与噬菌体组成，结构稳定，不仅温度稳定性及酸碱环境稳定性增加，而且制备的口蹄疫噬菌体颗粒可以快速的诱导特异性抗体的产生，免疫持续期延长，而且降低了生产成本以及佐剂的使用量。

Description

一种噬菌体展示口蹄疫颗粒、制备方法及疫苗

技术领域

本发明属于兽用生物制品领域，尤其涉及一种噬菌体展示口蹄疫颗粒、制备方法及疫苗，具体涉及口蹄疫VP1衣壳蛋白与噬菌体展示系统组合产生的噬菌体展示口蹄疫颗粒疫苗以及组合应用。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：

口蹄疫(foot and mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(foot and mouthdisease virus,FMDV)引起的一种急性、热性、高摄氏度接触传染性的偶蹄动物烈性疫病。口蹄疫能够造成严重的经济和社会问题，被世界动物卫生组织(OIE)列为法定报告病种，我国定为一类动物疫病。根据动物交叉保护和血清学型试验可将FMDV分为O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asial等7个血清型。口蹄疫病毒各型间无交叉反应，各型又根据抗原亲缘关系分为不同的亚型，型之间无交叉免疫保护作用。其中，O型口蹄疫是全球最主要的流行亚型。在我国及周边国家多次爆发O型口蹄疫，造成了重大经济损失。

利用噬菌体展示技术制备的疫苗有安全性高、稳定性强、制作简单、易于贮存运输等优点，已日益引起人们的广泛重视。2009年，在欧洲举行的世界流感大会对噬菌体衍生的病毒样颗粒(Virus-like particles，VLPs)作为传输载体的疫苗高摄氏度关注。

噬菌体展示技术已广泛应用于预防性疫苗与治疗性疫苗的研制。噬菌体颗粒疫苗不仅能注射免疫，还可采用多种免疫途径。在规模化养殖条件下，良好的经口免疫效果对于疫苗特别是基因工程疫苗的推广使用意义重大。

基因工程疫苗包括重组蛋白疫苗、DNA疫苗和病毒载体疫苗。噬菌体疫苗属于病毒载体疫苗，其兼有重组蛋白疫苗和DNA疫苗的优点:比其他病毒载体疫苗更安全方便；比一般蛋白疫苗更易于制备纯化；比DNA疫苗更安全可靠。因此，噬菌体疫苗在新型疫苗的研制上具有广阔的应用前景。噬菌体展示技术作为一种新型技术，将成为简单、有效、具有广阔应用前景的新型疫苗研制工具。

FMDV是人类最早确认的一种动物病毒，具有群体庞大、复制突变率高、繁殖周期短等特征。FMDV以“准种(quasispecies)”状态生存和演变，在突变(mutation)、遗传漂移(genetic drift)、重组(recombination)和基因迁移(migration)等多种机制和环境压力作用下，不断进化，导致病毒适应性、种群大小和种群平衡、瓶颈事件等准种特性的变化，形成了具有明显区域特征的变异体(毒株)，其宿主嗜性、毒力、抗原性等表型呈现差异。因此，急需开发一种有效又实用的口蹄疫疫苗，用于预防口蹄疫。

综上所述，现有技术存在的问题是：

(1)现有技术中，口蹄疫灭活疫苗在我国控制该病的过程中扮演了极其重要的角色，但也存在诸多缺点，表现为有效抗原含量低、免疫效果较差、免疫期较短，不能有效刺激机体产生细胞免疫应答且只能维持较短的中和抗体水平。国内有生产厂家6家(威特、天康、中牧、金宇、保山、必威安泰)，生产的疫苗种类有14种主要为灭活疫苗。中农威特公司是经农业部批准的国内唯一家生产全部系列口蹄疫灭活疫苗的生产厂家，共生产8种，国内独家生产的有4种。

(2)现有的口蹄疫疫苗，疫苗制作过程中的种毒必须为强毒，存在严重的生物安全隐患和生产成本较高等问题。

(3)现有口蹄疫疫苗中，合成肽疫苗尽管能够刺激机体产生高水平的中和抗体，但它们在实际生产中对免疫动物的保护效果往往达不到预期水平。因为人工合成的小肽并不是所有病毒唯一的中和位点，而且由于分子较小，导致空间构象简单，并不一定能够被宿主机体所识别或者不能充分诱导机体产生特异性免疫应答。

(4)江苏农科院国家兽用生物制品工程技术研究中心的徐海，王义伟，侯继波等申请了《猪O型口蹄疫重组噬菌体疫苗及其构建方法》专利。发明提供了一种猪O型口蹄疫重组噬菌体疫苗及其构建方法，以重组噬T7菌体为抗原,重组T7噬菌体表面表达有氨基酸序列Mya98谱系。吴健敏，涂长春，任兆钧，美国马里兰州大学医学院，生物化学及分子生物研究中心《以T4SOC-HOC噬菌体双展示系统在SOC、HOC位点同时展示猪瘟病毒E2抗原和狂犬病病毒糖蛋白的研究工作》。龙良启，何玉龙进行了从噬菌体12肽库中筛选出了几个良好的噬菌体展示口蹄疫肽段的研究。以上提到的国际以及国内研究，目前仅限于实验室阶段，没有应用到实际生产当中。

解决上述技术问题的难度和意义：

口蹄疫是由具有抗原易变性、血清多样性为特征的口蹄疫病毒引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。口蹄疫的不同型之间没有交叉免疫保护性，并且不同亚型之间也只有部分交叉免疫保护性，所以口蹄疫的有效防控十分困难。口蹄疫对国家的影响有政治、经济影响，军事和公共卫生危害。口蹄疫的防控形势严峻。根据动物交叉保护和血清学型试验可将FMDV分为O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asial等7个血清型。口蹄疫病毒各型间无交叉反应，各型又根据抗原亲缘关系分为不同的亚型，型之间无交叉免疫保护作用。FMDV分子进化的“准种”特性决定其具有超强的变异能力和宽泛的宿主适应性。其中，O型口蹄疫是全球最主要的流行亚型。在我国及周边国家多次爆发O型口蹄疫，造成了重大经济损失。

噬菌体是感染细菌、真菌、藻类、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称，因部分能引起宿主菌的裂解故称为噬菌体。噬菌体展示技术(phage displaytechnology)是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时，外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。该技术将特定蛋白基因在其表面进行融合表达，实现了表型与基因型的统一。

通过将噬菌体展示技术与口蹄疫结合，期待可以获取一种安全性高、稳定性强、制作简单、易于贮存运输等优点的疫苗。为我国口蹄疫防治提供一种有力的技术支持。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种噬菌体展示口蹄疫颗粒、制备方法及疫苗。

本发明是这样实现的，一种噬菌体展示口蹄疫颗粒，所述噬菌体展示口蹄疫颗粒为噬菌体展示A型口蹄疫颗粒或噬菌体展示O型口蹄疫颗粒；其中噬菌体展示A型口蹄疫颗粒由A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1与噬菌体衣壳组合在一起，口蹄疫的衣壳蛋白VP1表达到了T7噬菌体的外壳上，显示噬菌体展示O型口蹄疫颗粒由O型口蹄疫病毒结构蛋白VP1与T7噬菌体衣壳组合在一起。

进一步，A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

AKT-III VP1氨基酸序列242个氨基酸为：

TTATGESADPVTTTVENYGGETQVQRRHHTDVSFIMDRFVQIKPVSPTHVIDLMQTHQHGLVGAMLRAATYYFSDLEIVVNHTGRLTWVPNGAPEAALDNTSNPTAYHKAPFTRLALPYTAPHRVLATVYNGTSRYSAPATRQGDLGSLAAGLAAQLPASFNYGAVRATEIQELLVRMKRAELYCPRPLLAVEVTSQDRHKQKIIAPAKQLL。

进一步，O型口蹄疫病毒结构蛋白VP1氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

OMH-02VP1氨基酸序列为：

TTSTGESADPVTATVENYGGETQVQRRQHTDVSFILDRFVKVTPKDQTNVLDLMQTPAHTLVGALLRTATYYFADLEVAVKHEGNLTWVPNGAPETALDNTTNPTAYHKAPLTRLALPYTAPHRVLATVYNGDCKYGGSPVTNVRGDLQVLAQKAARTLPTSFNYGAIKATRVTELLYRMKRAETYCPRPLLAIHPSEARHKQKIVAPVKQLL。

本发明的另一目的在于提供一种所述噬菌体展示口蹄疫颗的制备方法，所述噬菌体展示口蹄疫颗的制备方法包括：

步骤一，摇菌，提质粒；

步骤二，酶切，跑胶，切胶，胶回收；酶切条件3.5-4h，37摄氏度；

步骤三，连接体系10微升：目的片段2微升0.02-0.06pmol/μl，载体2微升0.04pmol/μg，45摄氏度5分钟，0摄氏度2分钟；加入1微升10×Buffer,加入1微升酶；16摄氏度，12小时；

步骤四，包装：将25微升提取物，分装为5管，每管5微升，加入2微升的连接产物；轻轻混合，22摄氏度，反应2小时，加入270微升M9TB，加入到800微升EP管摇起来的BLT5403中，菌液透明后，收集；保存；

步骤五，噬斑测试：在M9TB培养基中接种适当的宿主菌株，并在37℃下振荡孵育至OD600＝1.0。

进一步，步骤五中，融化足够量的顶部琼脂糖，用于提供每管5ml稀释液；将熔化的琼脂糖转移到45-50℃的水浴中；用无菌TB培养基作为稀释剂，制备稀释的样品；

从最高稀释度开始，向每个管中加入100μl噬菌体稀释液；加入3毫升顶部琼脂糖到管中，并将内容物倒入预热的37℃琼脂平板上；漩涡平板均匀分布琼脂糖；平板静置后，直到顶部琼脂糖硬化，然后倒置并在37℃孵育3-4小时或在室温下过夜；

计数斑块并计算噬菌体滴度，以每单位体积的噬菌斑形成单位描述的噬菌体滴度是平板上的噬菌斑数乘以稀释倍数10；

样品中的噬菌体总数通过将效价乘以总样品体积确定。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述噬菌体展示口蹄疫颗粒制备的抗口蹄疫新型疫苗。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述噬菌体展示口蹄疫颗粒制备的预防和/或治疗FMDV感染的疫苗组合物，所述预防和/或治疗FMDV感染的疫苗组合物包含氨基酸序列为SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2的变体。

进一步，变体为在天然蛋白中的一个或更多位点的一个或更多氨基酸的缺失或添加，和/或天然蛋白中的一个或更多位点的一个或更多氨基酸的取代而源于天然蛋白的蛋白。

进一步，变体包括等位基因变体，等位基因变体含有导致蛋白的氨基酸序列变化及在天然的群之内存在的多态性的核苷酸或多肽。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

噬菌体对理化因素的抵抗力较强，在宽的pH范围内具有高稳定性，展示在噬菌体表面的单链可变抗体(Single-chain variable fragment antibody，ScFv)比利用杂交瘤技术制备的抗体更稳定，适合大规模生产。利用噬菌体展示技术研制疫苗具有不需细胞培养与融合、生产周期短且易于扩增与纯化等优势，弥补了传统疫苗生产成本高、难于推广应用的缺点。利用噬菌体展示技术制备的疫苗有安全性高、稳定性强、制作简单、易于贮存运输等优点，已日益引起人们的广泛重视。以噬菌体颗粒作为高效的疫苗传递载体，能诱导机体产生较强的免疫应答。

本发明的噬菌体口蹄疫颗粒是由口蹄疫病毒的结构蛋白VP1与噬菌体组成，结构稳定，不仅温摄氏度稳定性及酸碱环境稳定性增加，而且制备的口蹄疫噬菌体颗粒可以快速的诱导特异性抗体的产生，免疫持续期延长，而且降低了生产成本以及佐剂的使用量。

附图说明

图1是本发明实施例提供的噬菌体展示口蹄疫颗粒的制备方法流程图。

图2是本发明实施例提供的重组A型口蹄疫噬菌体双酶切图。

图3是本发明实施例提供的重组O型口蹄疫噬菌体双酶切图。

图4是本发明实施例提供的原始文库图。

图5是本发明实施例提供的重组A型口蹄疫噬菌体噬斑鉴定图。

图6是本发明实施例提供的重组O型口蹄疫噬菌体噬斑鉴定图。

图7是本发明实施例提供的重组噬菌体PCR鉴定图。

图中，M为DL10 000分子量DNA Marker，1-5为重组A型口蹄疫噬菌体，6为阴性对照，7-11为重组O型口蹄疫噬菌体。

图8是本发明实施例提供的重组噬菌体SDS-PAGE图。

图中，M为彩虹Marker，1、2为阴性对照，3、4、7、8为重组O型口蹄疫噬菌体，5、6、9、10为重组A型口蹄疫噬菌体，11、12为BLT5403菌液对照。

图9是本发明实施例提供的重组O型口蹄疫噬菌体三次反向筛选图。

图10是本发明实施例提供的重组A型口蹄疫噬菌体三次反向筛选图。

图11是本发明实施例提供的重组O型口蹄疫噬菌体滴度确定图。

图12是本发明实施例提供的重组A型口蹄疫噬菌体滴度确定图。

图13是本发明实施例提供的小鼠抗体水平分布图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明涉及的“预防”指通过其与FMDV相关的感染或疾病的症状被阻断或延迟；术语“治疗”指通过与FMDV相关的感染或疾病的症状被缓和或完全消除的过程。

“保护性反应”为在动物中预防FMDV相关疾病或由FMDV导致的感染的发作或减轻存在的这样的疾病的严重性。

本发明涉及的FMDV蛋白，其有利地激发动物中的保护性反应。本发明实施方式的蛋白序列包含与其功能衍生物基本相同的氨基酸序列。

为解决上述技术问题，下面结合具体方案对本发明的应用原理作详细描述。

本发明实施例供一种抗口蹄疫新型疫苗，所述疫苗包括噬菌体展示A型口蹄疫颗粒和/或噬菌体展示O型口蹄疫颗粒。其中噬菌体展示口蹄疫颗粒由口蹄疫病毒VP1结构蛋白与噬菌体衣壳组合在一起。

作为本发明优选实施例，本发明提供的A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

AKT-III VP1氨基酸序列242个氨基酸为：

作为本发明优选实施例，本发明提供的O型口蹄疫病毒结构蛋白VP1氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

OMH-02VP1氨基酸序列为：

作为本发明的一种实施方式，本发明提供的预防和/或治疗FMDV感染的疫苗组合物包含氨基酸序列为SEQ ID N0.1,2的变体。

“变体”旨在表示基本上类似序列。“变体”蛋白旨在表示通过在天然蛋白中的一个或更多位点的一个或更多氨基酸的缺失或添加，和/或天然蛋白中的一个或更多位点的一个或更多氨基酸的取代而源于天然蛋白的蛋白。本发明包括的变体蛋白有生物学活性，即，它们有引发免疫应答的能力，能对FMDV攻击具有保护性反应的能力。变体包括等位基因变体。

“等位基因变体“指称含有导致蛋白的氨基酸序列变化及在天然的群(例如，病毒物种或变种)之内存在的多态性的多核普酸或多肽。该天然的等位基因变异可一般导致多核普酸或多肤的1％-5％变异。等位基因变体可通过在许多不同物种中测序目的核酸序列来鉴定，其可通过使用鉴定那些物种中的相同的遗传座位的杂交探针来容易进行。任何和全部该核酸变异及得到的氨基酸多态性或是天然的等位基因变异的结果且不改变目的基因的功能活性的变异旨在本发明的范围之内。

根据上述内容，下面结合制备方法对本发明的应用原理作进一步描述。

如图1所示，本发明实施例提供的噬菌体展示口蹄疫颗粒的制备方法包括：

S101:摇菌，提质粒。

S102:酶切，跑胶，切胶，胶回收。酶切条件3.5-4h，37摄氏度(阴性对照：将酶换成等体积的水)；

S103:连接体系10微升：目的片段2微升0.02-0.06pmol/μl，载体2微升0.04pmol/μg，45摄氏度5分钟，0摄氏度2分钟；加入1微升10×Buffer,加入1微升酶。16摄氏度，12小时。

S104:包装：将25微升提取物，分装为5管，每管5微升，加入2微升的连接产物。对照组，为0.1微克加入到5微升，提取物中。对照命名为：SC；A型命名为SA-3；O型命名为SO-1。轻轻混合，22摄氏度，反应2小时，加入270微升M9TB，加入到800微升EP管摇起来的BLT5403中，菌液透明后，收集。保存。扩繁，平板滴定，保存。吸取50％甘油240微升加入到760微升M9TB中。剩余100微升做文库滴定。保存扩繁的噬菌体，4摄氏度。

S105:噬斑测试：在M9TB培养基中接种适当的宿主菌株，并在37℃下振荡孵育至OD600＝1.0。融化足够量的顶部琼脂糖，用于提供每管5ml稀释液。将熔化的琼脂糖转移到45-50℃的水浴中。用无菌TB培养基作为稀释剂，制备一系列稀释的样品。通常，重组噬菌体的适当稀释度是10³-10⁶。连续稀释可以通过向900μl培养基(10³稀释)中添加100μl稀释液。准备一系列的4毫升无菌管，吸取250微升的宿主细胞到每管。从最高稀释度开始，向每个管中加入100μl噬菌体稀释液。更换枪头以避免交叉污染。加入3毫升顶部琼脂糖到管中，并将内容物倒入预热的(37℃)琼脂平板上。立即漩涡平板(轻轻)均匀分布琼脂糖。让平板静置几分钟，直到顶部琼脂糖硬化，然后倒置并在37℃孵育3-4小时或在室温下过夜。计数斑块并计算噬菌体滴度。以每单位体积的噬菌斑形成单位(pfu)描述的噬菌体滴度是平板上的噬菌斑数乘以稀释倍数10(以考虑0.1ml的稀释平皿)。如果从1/10⁶稀释度的平板上有200个噬菌斑，则样品的效价是200×10⁶×10＝2×10⁹pfu/ml。样品中的噬菌体总数是通过将效价乘以总样品体积来确定的。

下面结合实验方案及效果对本发明的应用原理作进一步描述。

免疫方案

1材料与方法

1.1材料

AKT-Ⅲ与OMH-02株VP1基因序列为上海生工生物工程有限责任公司合成；口蹄疫(AKT-Ⅲ与OMH-02株)二联苗疫苗由天康生物技术有限责任公司提供；EcoRⅠ、HindⅢ、1×MBuffer由Takara公司提供；DNA回收试剂盒由天根生化科技(北京)有限公司提供。

1.2方法

1.2.1VP1序列获取：

摇菌，提质粒。将上海生工生物工程有限责任公司提供的质粒进行双酶切。质粒双酶切体系：

对照组不加酶，37℃水浴4h。制备1％琼脂糖凝胶，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，拍照保存。阴性对照：将酶换成等体积的水。将目的条带使用刀片切下，使用DNA胶回收试剂盒回收目的条带，操作方法按照说明书进行。

1.2.2重组载体构建：

10微升体系：

轻轻地上下移液，然后在16℃孵育3-16小时。保存在4℃直到使用。

1.2.3噬菌体包装实验：

将包装提取物在冰上解冻。每25μl提取物加入5μl连接反应物以及T7Select Packaging Control DNA。用移液器尖端搅拌轻轻混合。在22℃孵育反应2小时。加入270μl无菌TB培养基以终止反应。将构建好的噬菌体加入对数生长期的BLT5403菌株中，37℃培养3小时。

1.2.4噬斑实验：

在M9TB培养基中接种适当的BLT5403宿主菌株，并在37℃下振荡孵育至OD₆₀₀＝1.0。融化足够量的顶部琼脂糖。将熔化的琼脂糖转移到50℃的水浴中。用无菌TB培养基作为稀释剂，制备10³-10⁶稀释样品。准备4毫升无菌管，吸取250微升的宿主细胞到每管。从最高稀释度开始，向每个管中加入100μl噬菌体稀释液。加入3毫升顶部琼脂糖到管中，并将内容物倒入预热的(37℃)琼脂平板上。立即漩涡平板(轻轻)均匀分布琼脂糖。让平板静置几分钟，直到顶部琼脂糖硬化，然后倒置并在37℃孵育4小时。计数斑块并计算噬菌体滴度。

1.2.5PCR扩增斑块：

使用移液器吸头，将单个噬斑刮下，并将其分散在含有100μl 10mM EDTA(Ph 8.0)的管中。短暂涡旋管，然后在65℃加热10分钟。冷却至室温，以14,000×g离心3分钟澄清。将以下组分组合在无菌的PCR管中：

在热循环仪(Perkin-Elmer)中进行35个循环的过程：

1.2.6SDS鉴定噬菌体

制备12％分离胶，制备5％浓缩胶。将制胶器放于试验台静置2h。将胶放入电泳槽中，加入1×电泳液。将双样品加样至浓缩胶中，每孔8微升，加入蛋白Marker。调节电压为80V，30min进行浓缩胶电泳。分离胶120V，60min。3-4h后，等待溴酚蓝到达胶底时，停止电泳。浸入考马斯亮蓝染色液中，于恒温摇床上染色35min。配制新鲜脱色液，于恒温摇床上多次脱色至条带清晰，当胶脱色干净时，停止脱色。放置于Bio-RAD凝集成像仪中，矫正胶的位置，调节图案颜色以及对比度，进行拍照保存。

1.2.7重组口蹄疫表位T7噬菌体反向筛选：

用去离子水冲洗一个塑料ELISA平板的孔3次，倒转平板并敲打干净的纸巾以去除多余的水。将牛口蹄疫阳性血清使用ELISA包被液稀释30倍，100微升/孔包被ELISA板，使用封口膜覆盖ELISA板孔，置于4℃冰箱过夜孵育。将包被血清甩干，使用PBST洗涤2次，除去未结合的抗体；加入200微升/孔5％脱脂奶粉于37℃孵育2h；使用PBST洗涤3次，200微升/孔；分别加入A型和O型噬菌体文库，37℃孵育2h；使用PBST洗涤3次；向孔中加入对数生长期BLT5403菌株置于37℃培养箱中培养1h；将菌液吸出加入到20ml对数生长期的BLT5403中，37℃培养2h，将文库保存，产物用于下一次筛选。重复筛选3次。

1.2.8噬菌体的大量扩繁与收集：

在1L锥形瓶中加入200ml无菌M9TB，并加入1ml过夜培养宿主菌BLT5403。加入0.02ml T7噬菌体，在37℃振荡培养3小时直至观察到裂解。在8,000×g离心10分钟，澄清裂解物。将上清液倒入无菌瓶中。

1.2.9噬菌体免疫小鼠实验：

实验动物：BALB/C鼠；分组：生理盐水，噬菌体A一组，噬菌体O一组。剂量：250微升/只，滴度为4×10¹¹cfu。在0天、14天、28天、42天、56天、70天、84天、98天采血，使用ELISA监测抗体水平。

ELISA检测步骤。将A型噬菌体滴度为4×10¹¹cfu、O型噬菌体滴度为4×10¹¹cfu，使用ELISA包被液(北京索莱宝科技有限公司)进行200倍稀释，加入200微升/孔，4℃过夜封闭。使用PBST(北京索莱宝科技有限公司)洗涤1次，每次200微升/孔。加入5％脱脂奶粉(使用PBS稀释)，100微升/孔。37℃孵育1小时。使用PBST洗涤3次，每次200微升/孔。将血清样品使用PBS进行1 000倍稀释，加入100微升/孔，每个样品3个复孔。37℃孵育1小时。使用PBST洗涤3次，每次200微升/孔。加入10 000倍稀释兔抗鼠HRP标记二抗。37℃孵育1小时。使用PBST洗涤3次，每次200微升/孔。加入TMB显色液(北京索莱宝科技有限公司)，100微升/孔。37℃孵育15分钟。加入终止液(北京索莱宝科技有限公司)100微升/孔。使用酶标仪读取OD450/630值，取差值进行结果分析。

1.2.10微量中和试验

2结果

2.1双酶切：

重组A型口蹄疫噬菌体,使用EcoRⅠ酶与HindⅢ酶，进行质粒双酶切之后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测得到两条清晰的条带，酶切目的片段为760bp左右，与预期大小相符，说明酶切成功。如图2重组A型口蹄疫噬菌体双酶切图所示。

重组O型口蹄疫噬菌体,使用EcoRⅠ酶与HindⅢ酶，进行质粒双酶切之后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测得到两条清晰的条带，酶切目的片段为760bp左右，与预期大小相符，说明酶切成功。如图3重组O型口蹄疫噬菌体双酶切图所示。

2.2口蹄疫噬菌体展示颗粒的构建，如图4原始文库图所示。

重组噬菌体构建成功后，加入BLT5403中培养。菌液清澈的为成功构建的文库，浑浊的为对照组。

2.3噬斑鉴定T7噬菌体文库，如图5重组A型口蹄疫噬菌体噬斑鉴定图所示。

将得到的重组A型口蹄疫噬菌体进行滴度测定。1号板为10¹倍稀释，5号板为10⁶倍稀释，6号板为10⁷倍稀释，7号板为10⁸倍稀释。7号板有8个噬菌斑，因此判定滴度为8×10⁸。如图6重组O型口蹄疫噬菌体噬斑鉴定图所示。

将得到的重组O型口蹄疫噬菌体进行滴度测定。1号板为100倍稀释，5号板为10⁶倍稀释，6号板为10⁷倍稀释，7号板为10⁸倍稀释。7号板有4个噬菌斑，6号板有40个噬菌斑，因此判定滴度为4×10⁸。

2.4PCR检测，如图7重组噬菌体PCR鉴定图所示。

重组A型口蹄疫噬菌体和重组O型口蹄疫噬菌体经PCR扩增得到大小为800bp左右的目的条带，用1％琼脂糖凝胶电泳检测目的条带清晰，与预期大小相符。说明成功扩增出目的条带，PCR鉴定重组噬菌体构建成功。

2.5SDS鉴定噬菌体，如图8重组噬菌体SDS-PAGE图所示。

经蛋白凝胶电泳结果，可以在30ku左右清晰的看到重组O型口蹄疫噬菌体与重组A型口蹄疫噬菌体的条带，证明噬菌体成功表达纯化。

2.6反向筛选，如图9重组O型口蹄疫噬菌体三次反向筛选图所示。

第一轮筛选重组O型口蹄疫噬菌体：3-2板有40个克隆，滴度为4×10¹⁰。第二轮筛选重组O型口蹄疫噬菌体：7-2板的噬斑数量大于1000，滴度为1×10¹²。第三轮筛选重组O型口蹄疫噬菌体：11-2板的噬斑数量大于1000，滴度为1×10¹²，且11-2a多于7-2b。结果表明重组O型口蹄疫噬菌体得到了富集，同时筛选了传代能力快的噬菌体。

如图10重组A型口蹄疫噬菌体三次反向筛选图所示。

第一轮筛选重组A型口蹄疫噬菌体:1-2板有150个噬斑，滴度为1.5×10¹¹。第二轮筛选重组A型口蹄疫噬菌体:5-2板大于800个噬斑，滴度为8×10¹¹。第三轮筛选重组A型口蹄疫噬菌体:9-2板噬斑数量大于1000，滴度为11×10¹²。结果表明重组A型口蹄疫噬菌体得到了富集，同时筛选了传代能力快的噬菌体。

2.7噬菌体大量扩繁，如图11重组O型口蹄疫噬菌体滴度确定图所示。

重组O型口蹄疫噬菌体第一批：1.9为2个噬斑；1.10为1个噬斑；1.11为1个噬斑；1.12为0个噬斑；因此判定重组O型口蹄疫噬菌体第一批滴度为1×10¹¹。重组O型口蹄疫噬菌体第二批：2.9为3个噬斑；2.10为1个噬斑；2.11为0个噬斑；2.12为0个噬斑；因此判定重组O型口蹄疫噬菌体第二批滴度为1×10¹⁰。

如图12重组A型口蹄疫噬菌体滴度确定图所示。

重组A型口蹄疫噬菌体第一批：1.9为0个；1.10为1个；1.11为0个；1.12为0个；因此判定重组A型口蹄疫噬菌体第一批滴度为1×10¹⁰。重组A型口蹄疫噬菌体第二批：2.9为6个；2.10为3个；2.11为0个；2.12为0个；因此判定重组A型口蹄疫噬菌体第二批滴度为3×10¹⁰。

2.8免疫Balb/C小鼠抗体水平，如图13小鼠抗体水平分布图所示。图中，CTRL为生理盐水对照组，STJ A为注射噬菌体A组，SJT O为注射噬菌体O组。横坐标day为每次采血天数，纵坐标OD450为酶标仪检测OD450-OD630。

重组A型口蹄疫噬菌体14天抗体水平与0天抗体水平对比P<0.000，差异极显著。重组O型口蹄疫噬菌体14天抗体水平与0天抗体水平对比差异性为P＝0.002，差异极显著。结果表明，重组O型口蹄疫噬菌体可以很快的诱导小鼠产生高水平的抗体。重组A型口蹄疫噬菌体98天抗体水平与0天抗体水平对比差异性为P<0.000，差异极显著。重组O型口蹄疫噬菌体98天抗体水平与0天抗体水平对比差异性为P<0.000，差异极显著。重组A型口蹄疫噬菌体抗体水平在84天达到最高，重组O型口蹄疫噬菌体抗体水平在98天达到最高。结果表明重组口蹄疫噬菌体可以较快的刺激小鼠产生抗口蹄疫抗体，抗体水平较高且长期维持较高水平。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 石河子大学

<120> 一种噬菌体展示口蹄疫颗粒、制备方法及疫苗

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 212

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Thr Thr Ala Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Thr Thr Val Glu

1 5 10 15

Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg His His Thr Asp Val

20 25 30

Ser Phe Ile Met Asp Arg Phe Val Gln Ile Lys Pro Val Ser Pro Thr

35 40 45

His Val Ile Asp Leu Met Gln Thr His Gln His Gly Leu Val Gly Ala

50 55 60

Met Leu Arg Ala Ala Thr Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Glu Ile Val Val

65 70 75 80

Asn His Thr Gly Arg Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu Ala

85 90 95

Ala Leu Asp Asn Thr Ser Asn Pro Thr Ala Tyr His Lys Ala Pro Phe

100 105 110

Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr

115 120 125

Val Tyr Asn Gly Thr Ser Arg Tyr Ser Ala Pro Ala Thr Arg Gln Gly

130 135 140

Asp Leu Gly Ser Leu Ala Ala Gly Leu Ala Ala Gln Leu Pro Ala Ser

145 150 155 160

Phe Asn Tyr Gly Ala Val Arg Ala Thr Glu Ile Gln Glu Leu Leu Val

165 170 175

Arg Met Lys Arg Ala Glu Leu Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu Ala Val

180 185 190

Glu Val Thr Ser Gln Asp Arg His Lys Gln Lys Ile Ile Ala Pro Ala

195 200 205

Lys Gln Leu Leu

210

<210> 2

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Thr Thr Ser Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Ala Thr Val Glu

1 5 10 15

Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg Gln His Thr Asp Val

20 25 30

Ser Phe Ile Leu Asp Arg Phe Val Lys Val Thr Pro Lys Asp Gln Thr

35 40 45

Asn Val Leu Asp Leu Met Gln Thr Pro Ala His Thr Leu Val Gly Ala

50 55 60

Leu Leu Arg Thr Ala Thr Tyr Tyr Phe Ala Asp Leu Glu Val Ala Val

65 70 75 80

Lys His Glu Gly Asn Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu Thr

85 90 95

Ala Leu Asp Asn Thr Thr Asn Pro Thr Ala Tyr His Lys Ala Pro Leu

100 105 110

Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr

115 120 125

Val Tyr Asn Gly Asp Cys Lys Tyr Gly Gly Ser Pro Val Thr Asn Val

130 135 140

Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Arg Thr Leu Pro

145 150 155 160

Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys Ala Thr Arg Val Thr Glu Leu

165 170 175

Leu Tyr Arg Met Lys Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu

180 185 190

Ala Ile His Pro Ser Glu Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro

195 200 205

Val Lys Gln Leu Leu

210

Claims

1.一种噬菌体展示口蹄疫颗粒，其特征在于，所述噬菌体展示口蹄疫颗粒为噬菌体展示A型口蹄疫颗粒；其中噬菌体展示A型口蹄疫颗粒由A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1与噬菌体衣壳组合在一起；

所述A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1氨基酸序列为SEQ ID NO.1；

所述噬菌体展示口蹄疫颗的制备方法包括：

步骤一，摇菌，提质粒；

步骤二，酶切，跑胶，切胶，胶回收；酶切条件3.5-4 h，37摄氏度；

步骤三，连接体系10微升：目的片段2微升0.02-0.06 pmol /μl，载体2微升0.04 pmol/μg，45摄氏度5分钟，0摄氏度2分钟；加入1微升10×Buffer,加入1微升酶；16摄氏度，12小时；

步骤五，噬斑测试：在M9TB培养基中接种适当的宿主菌株，并在37℃下振荡孵育至OD600 = 1.0；

步骤五中，融化足够量的顶部琼脂糖，用于提供每管5ml稀释液；将熔化的琼脂糖转移到45-50℃的水浴中；用无菌TB培养基作为稀释剂，制备稀释的样品；

样品中的噬菌体总数通过将效价乘以总样品体积确定。

2.一种利用权利要求1所述噬菌体展示口蹄疫颗粒制备的抗口蹄疫疫苗。