CN101883580B - 水产用亚单位疫苗 - Google Patents
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Abstract
一种水产用亚单位疫苗，包括抗原融合蛋白以及适当的载体或佐剂，该抗原融合蛋白自氨基端到羧基端依次包含：绿脓杆菌外毒素A的区域Ⅰ及区域Ⅱ；引起鱼类疾病的病毒抗原性蛋白；以及蛋白质讯号序列。
Description
技术领域
本发明是关于一种水产用次单位疫苗，特别是指一种利用基因重组技术，将鱼类疾病抗原蛋白与绿脓杆菌外毒素A的受体结合区及运输结构区的蛋白，以及KDEL蛋白质讯号序列融合而形成抗原融合蛋白的水产用次单位疫苗。
背景技术
传染性胰脏坏死病(Infectious Pancreatic Necrosis，IPN)是一种具有高度传染力的鱼类疾病，其分布遍其全球，是由传染性胰脏坏死病病毒(InfectiousPancreatic Necrosis Virus，IPNV)所引起，传染性胰脏坏死病病毒(IPNV)属于双股核糖核酸病毒(birnavirus)，具有两段双股核醣核酸(dsRNA)基因体、不具外套膜，外表为二十面体的颗粒，A段基因体长3.2Kb，主要编码VP2(主要壳蛋白)、VP3(次要壳蛋白)，以及VP4(蛋白酵素)。
IPNV感染的寄主以鲑鱼、鳟鱼类为主，但其它经济鱼类及贝类(如：鳗鱼、梭子鱼、鳕鱼、吴郭鱼、泥鳅、虱目鱼、文蛤等)也有发现IPNV的感染；IPNV主要的感染对象为开始喂食时期的鲑鱼、鳟鱼类的稚鱼，在开始喂食几周内以及之后的淡水时期均仍有爆发IPNV感染疫情的危险；然而，在1980年代中期也曾爆发已进入海水的银色幼鲑后期(post-smolt)鲑鱼感染IPNV的疫情，在主要的大西洋鲑鱼(Atlantic salmon)养殖国家如智利、美国以及挪威皆可见到传染性胰脏坏死病(IPN)的踪迹；在挪威鲑鱼养殖场中，传染性胰脏坏死病(IPN)是最严重的传染疾病之一，在淡水时期鲑鱼感染IPNV的死亡率可高达100％，而海水时期鲑鱼感染IPNV的死亡率可由10-20％累积到70％：因此IPNV对鲑鱼养殖业的影响甚巨，若不稍加注意即可能造成重大的经济损失。
接种疫苗是目前鲑鱼养殖业控制IPNV感染最重要的因子，习用抗IPNV水产用疫苗主要包含死毒疫苗以及次单位疫苗(subunit vaccine)两种；死毒疫苗产品研发上须取得无其它病毒感染的细胞株，而目前鱼细胞株尚不普遍且选择少，因此死毒疫苗产品发展不易且成本高；而次单位疫苗则可通过遗传工程技术来操作，常见的IPNV次单位疫苗是利用大肠杆菌表达VP2蛋白，或是以昆虫杆状病毒(insect baculovirus)表达IPNV所有的结构蛋白，以诱导鲑鱼体内特定的抗体反应；然而，这些疫苗所提供的保护效果却无法达到养殖业所需的标准。
关于次单位疫苗无法诱导足以产生保护的免疫力的原因如下；(1)疫苗中的抗原并未适当地对准诱导免疫反应的关键细胞；(2)疫苗中的抗原会经由外源途径(exogenousroute)被捕捉，而无法进入这些诱导免疫反应的关键细胞的细胞质内与内质网结合；(3)因此，疫苗中的抗原无法被正确地被呈现至效应细胞(effector celis)上。
由此可见，上述习用水产用次单位疫苗仍有诸多缺失，实非一良善的设计者，而亟待加以改良。
近年来由于生物技术的快速发展，藉由通过遗传工程的方法，可以修饰、改变基因，使原本对人体或动物体有害的微生物，转变成具有医疗或农业应用价值的工具，其中，绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)便是一个极佳的例子；当绿脓杆菌感染囊状纤维瘤患者后，常会造成患者出现慢性呼吸道感染，进而演变成慢性肺炎，若是感染免疫力缺失的癌症患者或严重烧烫伤患者，则易出现急性肺炎或菌毒血症；造成感染者致病的主要原因为绿脓杆菌所产生的绿脓杆菌外毒素A(exotoxin A)。
绿脓杆菌外毒素A的蛋白结构主要有三个区域，区域I为受体结合区，负责与哺乳动物细胞膜上的α2-巨型球蛋白/低密度脂蛋白(α2-macroglobulin/LDL)细胞受体(receptor)结合后，再经由细胞内噬作用(endocytosis)进入细胞的内膜体(endosome)中，当绿脓杆菌外毒素A被内膜体中的蛋白酶切割后，绿脓杆菌外毒素A的区域II(亦即运输结构区(translocation domain)蛋白)会将含有区域II及具有毒性的区域III片段，由内膜体位移至细胞质内，与高基氏体(Golgi body)及内质网(endoplasmicreticulum，ER)结合，由具有毒性的区域III片段来抑制细胞中蛋白质的合成，最后导致细胞死亡。
目前绿脓杆菌在医疗上的用途主要为抗癌药物的开发，是将抗体与绿脓杆菌外毒素A结合成为免疫毒素，通过抗体作为引导媒介，使该免疫毒素进入特定细胞(例如：癌细胞)中，抑制这些细胞的蛋白质合成，以达到破坏这些特定细胞生长的目的。
发明内容
本发明的目的即在于提供一种水产用次单位疫苗，利用基因转殖技术，将鱼类疾病抗原蛋白与受体结合蛋白、运输蛋白及蛋白质讯号序列融合，使抗原可与正确的细胞结合，并进入该细胞内，确保抗原可以被正确地呈现至效应细胞上，以诱导鱼类产生足以抵抗病毒感染的免疫力。
本发明的次要目的是在于提供一种水产用次单位疫苗，是利用基因重组技术研发次单位疫苗，以生产制程简单、成本低、纯度高、安全性佳的水产用次单位疫苗。
为达成上述发明目的，本案发明人利用绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A(exotoxin A)的受体结合区(即：外毒素蛋白的区域I)以及运输结构区蛋白(即：外毒素蛋白的区域II)作为鱼类疾病抗原蛋白的运输蛋白(以下简称PE蛋白)：此外，本案发明人并使用内质网回收讯号(ER retention signal，即KDEL蛋白质讯号序列(signal peptide)，蛋白质C端具有KDEL蛋白质讯号序列者，会被回收至内质网)，以确保鱼类疾病抗原蛋白会被正确无误的送至内质网。
本案发明人是将PE蛋白(含有外毒素蛋白的区域I及区域II，其胺基酸序列如SEQ ID No：8所示)与鱼类疾病抗原蛋白的氨基端(amino terminal，N端)结合，并将KDEL蛋白质讯号序列(其胺基酸序列如SEQ ID No：10所示)与鱼类疾病抗原蛋白的羧基端(carboxyl terminal，C端)结合；使融合PE蛋白及KDEL蛋白质讯号序列后的鱼类疾病抗原蛋白(以下简称为抗原融合蛋白)，可以在PE蛋白序列的带领下，透过外毒素蛋白的区域I与CD8+T细胞(CD8+T cells)的受体(receptor)结合，而找到正确的细胞(即CD8+T细胞)；再经由细胞内噬作用进入CD8+T细胞的内膜体后，由外毒素蛋白的区域II以及KDEL蛋白质讯号序列的带领下，使鱼类疾病抗原蛋白可以正确无误地与CD8+T细胞的内质网结合，以诱导鱼类体内产生足够的免疫力。
所以，本发明所提供的水产用次单位疫苗，是包括抗原融合蛋白以及适当的载剂或佐剂，该抗原融合蛋白自N端到C端依序包含：(1)绿脓杆菌外毒素A的受体结合区及运输结构区蛋白(即PE蛋白)；(2)引起鱼类疾病的病毒抗原性蛋白；以及(3)蛋白质讯号序列。
于一较佳实施例中，该PE蛋白是为如SEQ ID No：8所示的胺基酸序列：该蛋白质讯号序列是为如SEQ ID No：10所示的KDEL蛋白质讯号序列。
该引起鱼类疾病的病毒抗原性蛋白为：传染性造血组织坏死病毒(InfectiousHematopoietic Necrosis Virus，IHNV)的G蛋白(SEQ ID No：22)及/或N蛋白(SEQID No：24)、神经坏死病毒(Nervous Necrosis Virus，NNV)的RNA2蛋白(SEQ ID No：26)、石斑虹彩病毒(Grouper Iridovirus，GIV)的主要衣壳蛋白(Major Capsidprotein，MCP：SEQ ID No：28)及/或锥体膜蛋白(myristylated membrane protein、MMP；SEQ ID No：30)、鲤鱼春季病毒血症(Spring Viremia of Carp Virus，SVCV)的G蛋白(SEQ ID No：32)及/或N蛋白(SEQ ID No：34)、病毒性出血性败血症(ViralHemorrhagic Septicemia Virus，VHSV)的G蛋白(SEQ ID No：36)及/或N蛋白(SEQID No：38)、传染性胰脏坏死病毒(IPNV)的病毒蛋白VP2(SEQ ID No：1或SEQ ID No：4)。
于一较佳实施例中，该病毒抗原性蛋白为传染性胰脏坏死病毒(IPNV)的病毒蛋白VP2，其具有如SEQ ID No：1或SEQ ID No：4的序列；于另一较佳实施例中，该病毒抗原性蛋白为该IPNV的病毒蛋白VP2的抗原区，亦即IPNV的病毒蛋白VP2第173至第431个胺基酸序列(如SEQ ID No：3或SEQ ID No：6所示)。
本发明所用的抗原融合蛋白是通过基因转殖方式而得，是将编码PE蛋白的DNA序列(如SEQ ID No：7所示)、编码引起鱼类疾病的病毒抗原性蛋白的DNA序列，以及编码KDEL蛋白质讯号序列的DNA序列(如SEQ ID No：9所示)选殖到表现载体系统中，形成含有编码抗原融合蛋白的DNA序列的质体，再将该质体转殖到表现宿主中，经诱导蛋白质表现后萃取而得到抗原融合蛋白。
该引起鱼类疾病的病毒为：传染性造血组织坏死病毒(IHNV)，该抗原性蛋白为G蛋白(其DNA序列如SEQ ID No：21所示)及/或N蛋白(其DNA序列如SEQ ID No：23所示)；神经坏死病毒(NNV)，该抗原性蛋白为RNA2蛋白(其DNA序列如SEQ ID No：25所示)；石斑虹彩病毒(GIV)，该抗原性蛋白为主要衣壳蛋白(MCP；其DNA序列如SEQID No：27所示)及/或锥体膜蛋白(MMP；其DNA序列如SEQ ID No：29所示)：鲤鱼春季病毒血症(SVCV)，该抗原性蛋白为G蛋白(其DNA序列如SEQ ID No：31所示)及/或N蛋白(其DNA序列如SEQ ID No：33所示)；病毒性出血性败血症(VHSV)，该抗原性蛋白为G蛋白(其DNA序列如SEQ ID No：35所示)及/或N蛋白(其DNA序列如SEQ ID No：37所示)；传染性胰脏坏死病毒(IPNV)，该抗原性蛋白为病毒蛋白VP2(其DNA序列如SEQ ID No：2或SEQ ID No：5所示)。
于一较佳实施例中，该引起鱼类疾病的病毒为传染性胰脏坏死病毒(IPNV)，其抗原融合蛋白具有如SEQ ID No：12或SEQID No：14所示的胺基酸序列，编码其抗原融合蛋白的DNA序列则为具有如SEQ ID No：11或SEQ ID No：13所示的核苷酸序列。
该表现载体系统包含但不限于pET载体系统以及pGEX载体系统等；于一较佳实施例中，该表现载体为pET24a；该表现宿主包含但不限于大肠杆菌(Escherichiacoli)，于一较佳实施例中，该表现宿主为大肠杆菌(E.coli)BL21。
该佐剂包含但不限于水性氢氧化铝胶，明矾，Freund氏不完全佐剂，油状佐剂，水溶性佐剂，或水包油包水双相佐剂(water-in-oil-in-water，W/O/W)；于一较佳实施例中，该佐剂为油状佐剂。
本发明所提供的水产用次单位疫苗，与其它现有技术相互比较时，更具有下列的优点：
本发明所提供的水产用次单位疫苗是利用基因重组技术，将抗原性蛋白与PE蛋白(即绿脓杆菌外毒素A的运输结构区蛋白)以及KDEL蛋白质讯号序列进行重组融合，可促进抗原在细胞中的呈现，而获得较佳的免疫效果，使鱼类获得较高的免疫力。
本发明所提供的水产用次单位疫苗是利用基因重组技术所研发的次单位疫苗，其具有生产制程简单、成本低、纯度高、安全性佳等优点。
附图说明
请参阅以下有关本发明一较佳实施例的详细说明及其附图，将可进一步了解本发明的技术内容及其目的功效；有关该实施例的附图为：
图1(a)至图1(d)为本发明水产用次单位疫苗的抗原融合蛋白表现载体(pET24-PE-VP2-KDEL)的构筑策略示意图；
图2为以SDS-PAGE电泳后经coomassie blue染色分析大肠杆菌BL21的蛋白质表现量：图2(a)第1道：含有pET24a载体的大肠杆菌BL21的蛋白质萃取物：图2(a)第2-3道：含有pET24a-VP2-015载体的大肠杆菌BL21的蛋白质萃取物(第2道为未经纯化者，第3道为经纯化者)；第4-5道；含有pET24a-VP2-016载体的大肠杆菌BL21的蛋白质萃取物(第4道为未经纯化者，第5道为经纯化者)；图2(b)第6-7道：含有pET24a-PE-VP2-015-KDEL载体的大肠杆菌BL21的蛋白质萃取物(第6道为未经纯化者，第7道为经纯化者)；第8-9道：含有pET24a-PE-VP2-016-KDEL载体的大肠杆菌BL21的蛋白质萃取物(第8道为未经纯化者，第9道为经纯化者)；以及
图3为实施例三中各试验组的免疫保护率。
具体实施方式
以下将以传染性胰脏坏死病毒(IPNV)的VP2病毒蛋白(viral protein)片段为例，作为本发明水产用次单位疫苗的一可行实施例的具体说明。
实施例一抗原融合蛋白表现载体(pET24-PE-VP2-KDEL)的构筑
于本实施例中，以传染性胰脏坏死病毒(IPNV)VP2病毒蛋白片段作为水产用次单位疫苗的抗原，并于该VP2蛋白片段的N端加上绿脓杆菌外毒素A的受体结合区及运输结构区的蛋白(即：PE蛋白)，于该VP2蛋白片段的C端加上KDEL蛋白质讯号序列，以形成抗原融合蛋白(PE-VP2-KDEL)。
该抗原融合蛋白(PE-VP2-KDEL)是透过基因转殖技术，将编码各蛋白的DNA序列转入表现载体中，形成抗原融合蛋白表现载体(pET24a-PE-VP2-KDEL)，并诱导该抗原融合蛋白表现载体表现该抗原融合蛋白(PE-VP2-KDEL)而得：该抗原融合蛋白表现载体(pET24a-PE-VP2-KDEL)的构筑策略如图1所示；首先，取编码KDEL蛋白质讯号序列的DNA序列，转殖到pET24a质体中，以形成pET24a-KDEL质体(如图1(a)、(b)所示)：然后，取编码IPNV VP2蛋白第173个至第431个胺基酸的DNA序列，转殖到该pET24a-KDEL质体中，以形成pET24a-VP2-KDEL质体(如图1(b)、(c)所示)；最后，取编码PE蛋白的DNA序列，转殖到该pET24a-VP2-KDEL质体中，以形成pET24a-PE-VP2-KDEL质体(如图1(c)、(d)所示)。
1.pET24a-KEDL质体的构筑
编码KDEL蛋白质讯号序列(SEQ ID No：10)的DNA序列如SEQ ID No：9所示，是以聚合酶连锁反应(polymerase chain reaction，PCR)进行扩增(amplification)，KEDL专一性引子(KEDL specificity primers)的序列如下所示：
正向引子(含有Hind III限制酶酶切位置)：
5’-CCCAAGCTTCTCAAAAAAGACGAACTGAGAGATGAACTGAAAGA-3’(SEQ ID No：15)
Hind III
反向引子(含有XhoI限制酶酶切位置)：
5’-GTGCTCGAGTCATTACAGTTCGTCTTTCAGTTCATCT-3’(SEQ ID No：16)
Xho I
PGR反应条件为：94℃反应3分钟后，进行95℃1分钟、55℃1分钟、72℃20秒，共5个循环，最后以72℃反应1分钟以进行延伸反应(elongation)：分别将PCR产物与pET24a载体进行双酶切(以Hind III及Xho I两种限制酶进行酶切反应)，再将酶切后的PCR产物与pET24a载体进行纯化以及接合(ligation)作用，以将PCR产物选殖到pET24a载体形成pET24a-KEDL质体，并将pET24a-KEDL质体利用转殖作用(transformation)送入寄主细胞大肠杆菌(E：coli)RR1中，以进行大量增殖，并进行定序确认增殖的PCR产物序列无误。
2.pET24a-VP2-KDEL质体的构筑
在本实施例中所使用的IPNV VP2蛋白具有两种序列，分别为VP2-015蛋白以及VP2-016蛋白，其蛋白质全长序列各如SEQ ID No：1及SEQ ID No：4所示，两者的差别在于：在VP2-015蛋白中，第217、221、247个胺基酸的序列分别为TAT；而在VP2-016蛋白中，第217、221、247个胺基酸的序列则分别为PTA。
在本实施例中，分别使用VP2-015蛋白以及VP2-016蛋白第173至431个胺基酸序列作为抗原；编码VP2-015蛋白第173至431个胺基酸(其胺基酸序列如SEQ ID No：3所示)的DNA序列如SEQ ID No：2所示，而编码VP2-016蛋白第173至431个胺基酸(其胺基酸序列如SEQ ID No：6所示)的DNA序列如SEQ ID No：5所示，分别以聚合酶连锁反应(PCR)进行扩增，VP2专一性引子(VP2 specificity primers)的序列如下所示：
正向引子(含有EcoR I限制酶酶切位置)：
5’-CGGAATTCCCATACGTCCGCCTAGAGGAC-3’(SEQ ID No：17)
EcoR I
反向引子(含有Hind III限制酶酶切位置)：
5’-CCCAAGCTTCGTGATTTCGTTGAAGA-3’(SEQ ID No：18)
Hind III
PCR反应条件为：94℃反应5分钟后，进行94℃1分钟、55℃1分钟、72℃1分钟，共30个循环，最后以72℃反应7分钟以进行延伸反应；分别将PCR产物与上述pET24a-KEDL质体进行双酶切(以EcoR I及Hind III两种限制酶进行酶切反应)，再将酶切后的PCR产物与pET24a-KEDL质体进行纯化以及接合作用，以将PCR产物选殖到pET24a-KEDL质体形成pET24a-VP2-015-KEDL质体以及pET24a-VP2-016-KEDL质体，并将上述两种pET24a-VP2-KEDL质体分别利用转殖作用(transformation)送入寄主细胞大肠杆菌(E.coli)RR1中，以进行大量增殖，并进行定序确认增殖的PCR产物序列无误。
3.pET24a-PE-VP2-KDEL质体的构筑
编码PE蛋白(SEQ ID No：8)的DNA序列如SEQ ID No：7所示，是以聚合酶连锁反应(PCR)进行扩增，PE专一性引子(PE specificity primers)的序列如下所示：
正向引子(含有BamH I限制酶酶切位置)：
5’-CGGGATCCGCCGAAGAAGGTTTCGACCTCTGGAACGAATGC-3’(SEQ ID No：19)
BamH I
反向引子(含有EcoR I限制酶酶切位置)：
5’-CGGAATTCGCAGGTCAGGCTCACCAC-3’(SEQ ID No：20)
EcoR I
PCR反应条件为：94℃反应5分钟后，进行95℃1分钟、55℃1分钟、72℃1.5分钟，共30个循环，最后以72℃反应7分钟以进行延伸反应；分别将PCR产物与上述pET24a-VP2-015-KEDL质体或pET24a-VP2-016-KEDL质体进行双酶切(以BamH I及EcoR I两种限制酶进行酶切反应)，再将酶切后的PCR产物与pET24a-VP2-015-KEDL质体或pET24a-VP2-016-KEDL质体进行纯化以及接合作用，以将PCR产物选殖到pET24a-VP2-015-KEDL质体或pET24a-VP2-016-KEDL质体，形成pET24a-PE-VP2-015-KEDL质体(其上具有PE-VP2-015-KEDL抗原融合蛋白的DNA序列，如SEQ ID No：11所示)，或pET24a-PE-VP2-016-KEDL质体(其上具有PE-VP2-016-KEDL抗原融合蛋白的DNA序列，如SEQ IDNo：13所示)，并将pET24a-PE-VP2-015-KEDL质体或pET24a-PE-VP2-016-KEDL质体利用转殖作用(transformation)送入表现宿主大肠杆菌(E.coli BL21)中，并进行定序确认增殖的PCR产物序列无误。
4.pET24a-VP2质体的构筑
以IPNV的VP2抗原性蛋白片段(不含有PE蛋白以及KDEL蛋白质讯号序列)作为对照，分别使用VP2-015蛋白以及VP2-016蛋白第173至431个胺基酸序列作为抗原；编码VP2-015蛋白第173至431个胺基酸(其胺基酸序列如SEQ ID No：3所示)的DNA序列如SEQ IDNo：2所示，而编码VP2-016蛋白第173至431个胺基酸(其胺基酸序列如SEQ ID No：6所示)的DNA序列如SEQ ID No：5所示，分别以聚合酶连锁反应(PCR)进行扩增，VP2专一性引子(VP2 specificity primers)的序列如下所示：
正向引子(含有EcoR I限制酶酶切位置)：
5’-CGGAATTCCCATACGTCCGCCTAGAGGAC-3’(SEQ ID No：17)
EcoR I
反向引子(含有Hind III限制酶酶切位置)：
5’-CCCAAGCTTCGTGATTTCGTTGAAGA-3’(SEQ ID No：18)
Hind III
PCR反应条件为：94℃反应5分钟后，进行94℃1分钟、55℃1分钟、72℃1分钟，共30个循环，最后以72℃反应7分钟以进行延伸反应；分别将PCR产物与pET24a载体进行双酶切(以EcoR I及Hind III两种限制酶进行酶切反应)，再将酶切后的PCR产物与pET24a载体进行纯化以及接合作用，以将PCR产物选殖到pET24a载体形成pET24a-VP2-015质体以及pET24a-VP2-016质体，并将上述两种pET24a-VP2质体分别利用转殖作用送入表现宿主大肠杆菌(E.coli BL21)中，并进行定序确认增殖的PCR产物序列无误。
实施例二疫苗的制备
1.抗原融合蛋白的表现
将上述经转殖作用而含有pET24a-PE-VP2-015-KEDL质体或pET24a-PE-VP2-016-KEDL质体的大肠杆菌BL21，以及含有pET24a-VP2-015质体或pET24a-VP2-016质体的大肠杆菌BL21，分别以含有50μg/ml kanamycin的LB液体培养基于37℃下培养隔夜后，取10ml培养液加入990ml含有50μg/ml kanamycin的LB液体培养基内，于37℃下以250rpm振荡培养3小时后，再加入1ml IM IPTG(最终浓度为1mM)以诱导抗原融合蛋白(即PE-VP2-015-KEDL抗原融合蛋白，其胺基酸序列如SEQ ID No：12所示；或PE-VP2-016-KEDL抗原融合蛋白，其胺基酸序列如SEQ ID No：14所示)表现，加入IPTG后继续培养3小时：接着，于4℃下以6,500xg离心30分钟后去除上清液，回收离心下来的细胞团块，并将细胞团块置于-70℃下备用。
2.抗原融合蛋白的萃取
将上述细胞团块以200ml磷酸盐缓冲溶液(PBS)重新悬浮，均匀混合后，于4℃下以6,500xg离心15分钟并去除上清液，回收离心下来的细胞团块；重复上述步骤至少2次后，以100ml 1x IB清洗缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 7.5，10mM EDTA，1％Triton X-100)将细胞团块重新悬浮，并将细胞悬浮液置于冰上，以防止细胞破裂时产生高温；接着，加入100μg/ml溶菌酶(lysozyme)，置于30℃下30分钟以溶解细胞，并配合超音波震荡(sonication)或高速均质乳化机(polytron)处理细胞溶液，直到该溶液不再黏稠为止；随后，以10,000xg离心10分钟以上，去除上清液后，以100ml1x IB清洗缓冲液彻底地重新悬浮该沉淀物；重复上述离心及重新悬浮的步骤，直到沈淀物变成白色为止；接着，再以100ml 1xIB清洗缓冲液重新悬浮该沉淀物，并将悬浮液移到一个已知重量的离心管中，以10,000xg离心10分钟以上，以收集包函体型蛋白质(inclusion bodies)，在彻底去除上清液后，量称该包函体型蛋白质的重量。
接着，以SDS-PAGE检验该包函体型蛋白质的状态，结果如图2所示，抗原融合蛋白PE-VP2-015-KEDL(如图2(b)第6、7道所示)或PE-VP2-016-KEDL(如图2(b)第8、9道所示)的分子量为71kDa，而不具PE蛋白及KDEL讯号序列的VP2-015蛋白片段(如图2(a)第2、3道所示)及VP2-016蛋白片段(如图2(a)第4、5道所示)的分子量则为28kDa。
3.疫苗的制备
将抗原融合蛋白PE-VP2-015-KDEL(SEQ ID No：12)、抗原融合蛋白PE-VP2-016-KDEL(SEQ ID No：14)、VP2-015抗原性蛋白(SEQ ID No：3)，以及VP2-016抗原性蛋白(SEQ ID No：6)分别制成单价疫苗：将含有各抗原融合蛋白或抗原性蛋白的包函体型蛋白质，直接以磷酸缓冲液(PBS)打散定量，使每毫升的疫苗中含有10微克(μg)的抗原融合蛋白或VP2抗原性蛋白，并以油包水型乳化剂(water-in-oil emulsion)包埋，置放于4℃下备用。
实施例三鲑鱼抗病毒试验
供作试验的鲑鱼基本数据如下：
种类：大西洋鲑鱼(Atlantic salmon，Salmo salar L.)
品种：Aquagen AS，LR(low resistance低抗性)06AGHe01
大小：60-90g
接种疫苗历史：未接种过疫苗
疾病史：无
鲑鱼银毛化(smoltification)期间的养殖环境如下：
鲑鱼抗病毒试验共分成4组试验组及1组对照组，每组皆包含30条鲑鱼，将疫苗以腹腔注射(intraperitoneal injection，i.p.)法接种至鲑鱼体内，每条鲑鱼施打的疫苗剂量为0.1ml，亦即每条鲑鱼施打1微克(μg)的抗原融合蛋白或VP2抗原性蛋白；抗病毒试验设计如下：
试验组1：接种含有VP2-015抗原性蛋白的疫苗
试验组2：接种含有抗原融合蛋白PE-VP2-015-KDEL的疫苗
试验组3：接种含有VP2-016抗原性蛋白的疫苗
试验组4：接种含有抗原融合蛋白PE-VP2-016-KDEL的疫苗
对照组：接种磷酸缓冲液(PBS)
试验组与对照组试验均进行2重复，疫苗接种后900℃天(以温度乘以天数，若温度为20℃就要45天；若温度为10℃则要90天)，将试验鲑鱼移至咸水环境下：
所有的鲑鱼皆按照标准程序喂食，将未受感染
的鲑鱼以腹腔注射(i.p.)感染1.0x106TCID60/ml传染性胰脏坏死病毒(IPNV)强毒株血清型Sp基因型TAT(serotype Sp and genotype TAT)，以作为感染带原者(challcnge carrier)进行同居感染；试验鲑鱼移至成水环境一天后，每组皆放置6只(20％受测鱼数)感染带原者，观察并纪录对照组与试验组的死亡情形，观察期为对照组死亡60％以上才进行统计分析，计算免疫保护率(relative percent survival，R.P.S.)，并以卡方测定(chi-squaretest)统计分析，免疫保护率(R.P.S.)的计算方式如下：
免疫保护率(R.P.S.)＝[1-(试验组死亡率/对照组死亡率)]×100％
接着，牺牲试验鲑鱼并采集血液及头肾(head kidney)，收集并冷冻血浆，以进行酵素免疫分析法(ELISA)分析，而头肾则作为病毒培养试验用以确保死亡鱼只的死亡确实为IPNV。
各组的免疫保护率(R.P.S.)如图3所示，试验组1(接种含有VP2-015抗原性蛋白的疫苗)的免疫保护率(R.P.S.)为6％，与对照组(不接种疫苗者)不具有显著差异(对照组在图3中并未显示，根据免疫保护率的计算方式，对照组的免疫保护率为0％)；试验组2(接种含有抗原融合蛋白PE-VP2-015-KDEL的疫苗)则具有23％的免疫保护率，且与试验组1相较，两者具有显著差异(p＜0.01)：而试验组3(接种含有VP2-016抗原性蛋白的疫苗)免疫保护率为12％，则较对照组(不接种疫苗者)具有保护效果，且两者具有显著差异(p＜0.05)；试验组4(接种含有抗原融合蛋白PE-VP2-016-KDEL的疫苗)的免疫保护率则为39％，且与试验组3相较，两者具有显著差异(p＜0.01)。
上列详细说明是针对本发明的可行实施例的具体说明，惟该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明技艺精神所为的等效实施或变更，例如：不同的抗原蛋白序列以及疫苗载剂、佐剂等变化的等效性实施例，均应包含于本案的专利范围中。
Claims (4)
1.一种抗传染性胰脏坏死病的水产用次单位疫苗，包括抗原融合蛋白以及药学上可接受的载剂，该抗原融合蛋白自氨基端到羧基端依序为：
绿脓杆菌外毒素A的受体结合区及运输结构区蛋白，所述绿脓杆菌外毒素A的受体结合区及运输结构区蛋白为SEQ ID No：8序列；
抗传染性胰脏坏死病的病毒抗原性蛋白，所述抗传染性胰脏坏死病的病毒抗原性蛋白为SEQ ID No：3或SEQ ID No：6的抗传染性胰脏坏死病毒的病毒蛋白VP2第173至第431个氨基酸序列；以及
蛋白质讯号序列，所述蛋白质讯号序列为SEQ ID No：10序列。
2.如权利要求1所述的水产用次单位疫苗，其特征是，所述抗原融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No：12。
3.如权利要求1所述的水产用次单位疫苗，其特征是，所述抗原融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No：14。
4.如权利要求1所述的水产用次单位疫苗，其特征是，可进一步包含一佐剂，所述佐剂为水性氢氧化铝胶，油状佐剂，水溶性佐剂，或水包油包水双相佐剂。
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