CN104873967A - O型口蹄疫病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

O型口蹄疫病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用，属于基因工程学和免疫学领域，解决了现有灭活口蹄疫疫苗存在的安全性差、使用效果不理想的问题。该疫苗的氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO:1所示，编码该氨基酸序列的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:2所示。该疫苗免疫后可诱导动物同时产生抗O型口蹄疫的抗体，该疫苗是以病毒样颗粒形式存在，口蹄疫病毒VP1表位在病毒样颗粒的表面，本发明提供了构成病毒样颗粒疫苗的氨基酸序列和编码该氨基酸序列的核苷酸序列，且所述的核苷酸序列含有能够在表达中自我组装成病毒样颗粒的外壳蛋白全部基因。本发明提供的O型口蹄疫病毒样颗粒疫苗制备安全性好，无病毒返强、散毒的可能性；免疫有效期长，运输储存方便。

Description

O型口蹄疫病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程学和免疫学技术领域，具体涉及一种O型口蹄疫病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

口蹄疫是(Foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdisease virus，FMDV)引起的急性热性高度接触性传染病，以传染性强、传播速度快、危害严重而著称。FMD的宿主范围很广，包括家养的反刍动物、鹿和猪以及70多种野生的偶蹄动物均可感染，世界动物卫生组织(OIE)将其列为A类传染病之首。口蹄疫一旦爆发往往造成大流行，不易控制和消灭，给疾病流行国家和地区的畜牧业带来严重的经济损失。目前世界各国对于口蹄疫的防治采取扑灭根除、免疫控制和预防三种策略。大多数发展中国家采取的方式是免疫控制。传统的灭活疫苗在口蹄疫的防治中发挥着主导作用，但灭活疫苗只能激发机体体液免疫、虽然市场广泛使用，但实际应用过程中效果不理想。因此，研制更为安全、有效的新型FMD疫苗显得尤为重要。目前已知口蹄疫病毒在全世界有七个主型A、O、C、南非1、南非2、南非3和亚洲1型，以及65个以上亚型。O型口蹄疫为全世界流行最广的一个血清型。

近年来病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)在疫苗和呈递系统方面的应用受到广泛关注。VLPs具有免疫性强，能激发体液免疫，细胞免疫和粘膜免疫，具有安全、高效的特点，是很有发展前景的候选疫苗或载体。对于多种疾病来说都是一种可开发理想的疫苗形式。已经有乙型肝炎病毒(HBV)、HEV和人类乳头瘤病毒(HPV)VLP疫苗上市。

发明内容

为了解决现有灭活口蹄疫疫苗存在的安全性差、使用效果不理想的问题，本发明提供一种能够有效预防口蹄疫病毒且安全有效的O型口蹄疫病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用。

本发明提供的一种O型口蹄疫病毒样颗粒疫苗，该疫苗的氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO:1所示，编码该氨基酸序列的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:2所示。

进一步的，所述氨基酸序列即序列表中的SEQ ID NO:1包含O型口蹄疫病毒VP1蛋白上的全部抗原决定簇序列。

进一步的，所述核苷酸序列即序列表中的SEQ ID NO:2包含O型口蹄疫病毒VP1基因上的全部抗原决定簇基因序列。

进一步的，所述核苷酸序列是通过将含有O型口蹄疫病毒VP1基因的完整开放阅读框利用XhoI和SalI酶切位点插入到核表达载体pET30a的多克隆酶切位点上获得的。

本发明还提供一种重组表达载体质粒pET30-FMD-VP1，该载体含有两个his标签和O型口蹄疫病毒VP1基因的完整开放阅读框，能将序列表中的SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列翻译成序列表中的SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；该重组表达载体质粒pET30-FMD-VP1经转化后形成一种用于蛋白表达的宿主细菌。

本发明提供的一种O型口蹄疫病毒样颗粒疫苗的制备方法，该方法通过以下步骤实现：

1)采用PCR扩增方法构建O型口蹄疫病毒抗原VP1基因，得到带有XhoI和SalI酶切位点的O型口蹄疫病毒抗原VP1基因片段，该VP1基因片段的核苷酸序列如序列表中的序列2所示，其编码的氨基酸序列如序列表中的序列1所示；

2)将含有O型口蹄疫病毒VP1基因的完整阅读框利用XhoI和SalI酶切位点，插入到原核表达载体pET30a多克隆酶切位点上，经测序正确后得到重组表达载体质粒pET30-FMD-VP1，该重组表达载体质粒上含有序列表中的SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

3)将步骤2)中的重组表达载体质粒pET30-FMD-VP1转化大肠杆菌BL21(DE3)中获得重组基因工程菌，利用LB液体培养基振荡培养至OD600＝0.6，通过添加ITPG至终浓度为1mmol/L诱导重组基因工程菌表达并自主包装成病毒样颗粒结构，诱导条件为：温度37℃，转速180r/min，诱导6h；

4)离心收集诱导后的菌体细胞，反复冻融3次，加入1/10菌液体积的PBS缓冲液重悬菌体，超声波破碎菌体，15000r/min离心15min，取上清液，经过镍柱纯化后得到O型口蹄疫病毒样颗粒疫苗。

进一步的，步骤1)采用PCR扩增方法构建O型口蹄疫病毒抗原VP1基因：首先合成上下游引物，引物序列如下：

上游引物：5’-GGGTCGACATGACCACTTCGACGGGCGAGTCGGCTG-3’，

下游引物：5’-CCCTCGAGCAAGGACTGCTTTACAGGCGCCACT-3’；

PCR扩增出的特异性片段，通过1％琼脂糖凝胶电泳后回收，得到带有XhoI和SalI酶切位点的O型口蹄疫病毒抗原VP1基因片段，该VP1基因的核苷酸序列中，两侧Xhol和SalI酶切位点均含一个碱基的突变。

进一步的，步骤4)中，所述镍柱纯化的具体过程如下：

将上清液加入到平衡好的镍糖中，室温在摇床孵育2h，500r/min离心2min后弃上清，用洗脱液洗5次，除去杂质和残留的培养基，用250ml洗脱液进行蛋白镍柱分离洗脱，先加入200μl洗脱液，孵育2min，然后用收1.5ml管收集，重复收集3～5次，得到O型口蹄疫病毒样颗粒疫苗。

进一步的，还包括步骤5)电镜观察：取10μL纯化的O型口蹄疫病毒样颗粒疫苗样品，加在铜网的碳膜上，经2％的磷钨酸染色5min，室温干燥2h，磷钨酸染色是负染，背景为黑色，病毒样颗粒为白色，呈病毒样形态。

本发明提供的一种O型口蹄疫病毒样颗粒疫苗在动物免疫中的应用，将所述O型口蹄疫病毒样颗粒疫苗与弗氏佐剂混合后通过肌肉注射方法对动物进行免疫，能够诱导动物产生O型口蹄疫病毒的特异性抗体，所述O型口蹄疫病毒样颗粒疫苗的用量为100μg/只。

本发明所述疫苗的结构是以病毒样颗粒形式存在，口蹄疫病毒VP1表位在病毒样颗粒的表面，本发明提供了构成病毒样颗粒疫苗的氨基酸序列和编码该氨基酸序列的核苷酸序列，且所述的核苷酸序列含有能够在表达中自我组装成病毒样颗粒的外壳蛋白全部基因。

本发明的有益效果是：

1)本发明提供的O型口蹄疫病毒样颗粒疫苗，免疫后可诱导动物同时产生抗O型口蹄疫的抗体。

2)本发明提供的O型口蹄疫病毒样颗粒疫苗制备安全性好，无病毒返强、散毒的可能性。

3)本发明提供的O型口蹄疫病毒样颗粒疫苗为病毒样颗粒结构，O型口蹄疫病毒的抗原表位被有效呈递在类病毒颗粒的表面，病毒样颗粒有感染性，但无病毒核酸，不能再体内复制，但可以很好地刺激B、T细胞，引起细胞免疫和体液免疫，引发机体发生免疫应答。

4)病毒样颗粒疫苗因其以病毒粒子样结构存在，在体内半衰期长，抗原性好，稳定性好，可刺激机体产生细胞免疫和体液免疫，免疫有效期长，且疫苗运输储存方便、有利于推广使用。

5)该病毒粒子表达系统为大肠杆菌工程菌，表达量大且易于控制，表达的蛋白小，在上清中，利于纯化和大规模制备。

6)本发明利用大肠杆菌pET30a表达系统，表达含有口蹄疫病毒(FMD)O型VP1蛋白，可在表达上清中形成病毒样颗粒(VLPs)，免疫印迹试验试验表明，表达的病毒样颗粒蛋白能够与标准O型口蹄疫病毒阳性血清特异结合，具有良好的免疫学活性，为口蹄疫病毒感染快速特异诊断试剂研制和颗粒样疫苗研制奠定了基础。

7)本发明提供的一种重组表达载体质粒pET30a-FMD-VP1含有两个his标签和O型口蹄疫病毒VP1基因的完整开放阅读框，能将序列表中的SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列翻译成序列表中的SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；该重组表达载体质粒pET30-FMD-VP1经转化后形成一种用于蛋白表达的宿主细菌，重组表达载体质粒pET30a-FMD-VP1在应用时安全稳定，可广泛用于蛋白表达。

附图说明

图1为VP1基因的PCR扩增结果图。图中：M：DNA分子质量标准；1：VP1的PCR产物。

图2为O型口蹄疫病毒抗原VP1基因片段与原核表达载体pET30a的连接产物的SalI/XholI双酶切鉴定结果图。图中：M：DNA分子质量标准；1：SalI/XholI双酶切产物；2：阳性对照。

图3为重组表达载体质粒pET30-FMD-VP1表达产物的SDS-PAGE电泳检测图。图中：M：蛋白质分子质量标准；1：未诱导的表达产物；2：未诱导的空菌体；3：诱导1h的表达产物；4：诱导1h的空菌体；5：诱导3h的表达产物；6：诱导3h的空菌体；7：诱导6h的表达产物；8：诱导6h的空菌体。

图4为重组表达载体质粒pET30-FMD-VP1表达产物的Western-blot检测图。图中：M：蛋白质分子质量标准；1：阳性血清；2：阴性血清。

图5为重组表达载体质粒pET30-FMD-VP1所表达的VP1蛋白形成病毒样颗粒的电镜图。

图6为小鼠抗血清效价ELISA检测图。

具体实施方式

实施例1：O型口蹄疫病毒抗原VP1基因的获得

采用PCR扩增方法构建O型口蹄疫病毒抗原VP1基因。首先合成上下游引物，引物序列如下：

上游引物：5’-GGGTCGACATGACCACTTCGACGGGCGAGTCGGCTG-3’；

下游引物：5’-CCCTCGAGCAAGGACTGCTTTACAGGCGCCACT-3’。

上述的上下游引物序列中，下划线部分为与VP1基因互补序列，加粗斜体部分为引入的XhoI和SalI酶切位点。PCR扩增出的特异性片段，通过1％琼脂糖凝胶电泳后回收，得到带有XhoI和SalI酶切位点的O型口蹄疫病毒抗原VP1基因片段，该VP1基因片段的核苷酸序列如序列表中的序列2所示(VP1基因的核苷酸序列，两侧Xhol和SalI酶切位点均含一个碱基的突变)，其编码的氨基酸序列如序列表中的序列1所示。结果如图1所示，产生的O型口蹄疫病毒抗原VP1基因片段大小为651bp，与预期大小相符。

实施例2：重组表达载体质粒pET30-FMD-VP1的构建

将实施例1得到的带有XhoI和SalI酶切位点的O型口蹄疫病毒抗原VP1基因片段(即含有O型口蹄疫病毒VP1基因的完整阅读框)插入到经XhoI和SalI双酶切处理的原核表达载体pET30a的多克隆酶切位点上，连接产物转化大肠杆菌DH5α，从抗性平板上挑取白色克隆进行SalI/XholI双酶切测序鉴定，结果如图2所示，通过测序确认连接成功，VP1毒码框正确，且所用连接的酶切位点发生突变，将测序正确的克隆命名为重组表达载体质粒pET30-FMD-VP1。

实施例3：VP1蛋白表达、鉴定及纯化

将实施例2得到的测序正确的重组表达载体质粒pET30-FMD-VP1转化大肠杆菌BL21(DE3)中获得重组基因工程菌，将得到的重组基因工程菌接种于加有卡那抗性的LB液体培养基中，振荡培养至OD600＝0.6左右，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，诱导重组基因工程菌表达，诱导条件为：温度37℃，转速为180r/min，诱导6h；诱导结束后离心收集菌体细胞，SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达情况；将经过IPTG诱导表达菌体蛋白和阴性对照(未诱导的空菌体)进行SDS-PAGE电泳检测。结果如图3所示，经诱导的重组菌与未诱导的重组菌相比，在25.0ku左右表达出一条特异性的蛋白条带，与预测的目的蛋白大小一致。

SDS-PAGE电泳检测后将获得的目的蛋白电转移至尼龙膜，分别以猪抗O型口蹄疫的血清为第一抗体，以辣根过氧化物酶(HRP)偶联的鼠抗猪IgG为第二抗体，进行Western-blote分析，确认目的蛋白是否具有O型口蹄疫病毒的抗原性。结果如图4所示，经诱导的重组菌出现了1条特异性条带，表达的目的蛋白能被O型口蹄疫病毒阳性血清所识别，证明该目的蛋白具有免疫学活性。

将正确表达的目的蛋白大量培养，IPTG诱导表达目的蛋白，诱导条件为：温度37℃，转速为180r/min，诱导6h；诱导结束后离心收集菌体细胞，反复冻融3次，加入约1/10菌液体积的PBS缓冲液重悬菌体，超声波彻底破碎菌体，15000r/min离心15min，取上清液，经镍柱纯化后得到O型口蹄疫病毒样颗粒疫苗。

实施例4：电镜观察原核表达的VP1蛋白

取10μL纯化的O型口蹄疫病毒样颗粒疫苗样品，加在铜网的碳膜上，经2％的磷钨酸染色5min，室温干燥2h，电子显微镜观察。结如图5所示，取表达上清和表达纯化产物进行电镜观察，从表达产物中观察到球型颗粒，直径40nm左右，圆形的颗粒物，结构类似天然FMD病毒颗粒；磷钨酸染色是负染，背景为黑色，病毒样颗粒为白色，呈病毒样形态。

实施例5：动物免疫及抗体测定

肌肉注射免疫：首次免疫将纯化的VP1蛋白与弗氏完全佐剂等体积混合(设置商业化的口蹄疫灭活疫苗做阳性对照；pET30a空载体做阴性对照)，采用皮下多点注射法免疫5～6周龄雌性Balb/c，15只小鼠随机分为3组，每只小鼠免疫纯化VP1蛋白量为100μg；2周后加强免疫一次，加强免疫时纯化的VP1蛋白100μg与弗氏不完全佐剂混合均匀；所有免疫组均在末次免疫后1周眼眶采血处死小鼠，分离血清；免疫小鼠中采集的全血经室温静置2h，血液完全凝固后，5000r/min离心5min，取血清分装后置于-80℃保存备用。

抗体测定：用ELISA检测血清抗体的特异性，抗体效价定为能发生阳性颜色反应的血清最大稀释倍数。ELISA板每孔包被约10μg的O型口蹄疫灭活病毒，4℃过夜，洗涤液洗涤5次，用封闭液37℃封闭1～2h，然后加入梯度稀释过的待测血清，加阴性、阳性血清作为对照，37℃温育1h，再次洗涤后加辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠的二抗，加200μL/孔TMB显色底物，室温避光30min，加入终止液终止反应，酶标仪波长450nm处测OD值，根据试剂判定结果，OD值大于0.935的为阳性。测定纯化蛋白免疫后血清的效价为1:16，与灭活疫苗效果相当。

小鼠抗血清效价ELISA检测结果如图6所示，标记▲为阴性对照pET30a空载体免疫组小鼠抗血清效价；◆为阳性对照Inactivated vaccine免疫组小鼠抗血清效价；■为FMD-VP1类病毒颗粒免疫组小鼠抗血清效价。与pET30a空载体样品免疫阴性对照组相比，VP1蛋白能诱导小鼠产生特异性的抗体；与商业化的口蹄疫灭活疫苗免疫阳性对照组相比，VP1蛋白同样能诱导小鼠产生高效价低特异性抗血清。

Claims (10)

1.O型口蹄疫病毒样颗粒疫苗，其特征在于，该疫苗的氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO:1所示，编码该氨基酸序列的核苷酸序列如序列表中的SEQID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的O型口蹄疫病毒样颗粒疫苗，其特征在于，所述氨基酸序列即序列表中的SEQ ID NO:1包含O型口蹄疫病毒VP1蛋白上的全部抗原决定簇序列。

3.根据权利要求1所述的O型口蹄疫病毒样颗粒疫苗，其特征在于，所述核苷酸序列即序列表中的SEQ ID NO:2包含O型口蹄疫病毒VP1基因上的全部抗原决定簇基因序列。

4.根据权利要求1所述的O型口蹄疫病毒样颗粒疫苗，其特征在于，所述核苷酸序列是通过将含有O型口蹄疫病毒VP1基因的完整开放阅读框利用XhoI和SalI酶切位点插入到核表达载体pET30a的多克隆酶切位点上获得的。

5.重组表达载体质粒pET30-FMD-VP1，其特征在于，该载体含有两个his标签和O型口蹄疫病毒VP1基因的完整开放阅读框，能将序列表中的SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列翻译成序列表中的SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；该重组表达载体质粒pET30-FMD-VP1经转化后形成一种用于蛋白表达的宿主细菌。

6.制备权利要求1所述的O型口蹄疫病毒样颗粒疫苗的方法，其特征在于，该方法通过以下步骤实现：

1)采用PCR扩增方法构建O型口蹄疫病毒抗原VP1基因，得到带有XhoI和SalI酶切位点的O型口蹄疫病毒抗原VP1基因片段，该VP1基因片段的核苷酸序列如序列表中的序列2所示，其编码的氨基酸序列如序列表中的序列1所示；

2)将含有O型口蹄疫病毒VP1基因的完整阅读框利用XhoI和SalI酶切位点，插入到原核表达载体pET30a多克隆酶切位点上，经测序正确后得到重组表达载体质粒pET30-FMD-VP1，该重组表达载体质粒上含有序列表中的SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

3)将步骤2)中的重组表达载体质粒pET30-FMD-VP1转化大肠杆菌BL21(DE3)中获得重组基因工程菌，利用LB液体培养基振荡培养至OD600＝0.6，通过添加ITPG至终浓度为1mmol/L诱导重组基因工程菌表达并自主包装成病毒样颗粒结构，诱导条件为：温度37℃，转速180r/min，诱导6h；

4)离心收集诱导后的菌体细胞，反复冻融3次，加入1/10菌液体积的PBS缓冲液重悬菌体，超声波破碎菌体，15000r/min离心15min，取上清液，经过镍柱纯化后得到O型口蹄疫病毒样颗粒疫苗。

7.根据权利要求6所述的O型口蹄疫病毒样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，步骤1)采用PCR扩增方法构建O型口蹄疫病毒抗原VP1基因：首先合成上下游引物，引物序列如下：

上游引物：5’-GGGTCGACATGACCACTTCGACGGGCGAGTCGGCTG-3’，

下游引物：5’-CCCTCGAGCAAGGACTGCTTTACAGGCGCCACT-3’；

PCR扩增出的特异性片段，通过1％琼脂糖凝胶电泳后回收，得到带有XhoI和SalI酶切位点的O型口蹄疫病毒抗原VP1基因片段，该VP1基因的核苷酸序列中，两侧Xhol和SalI酶切位点均含一个碱基的突变。

8.根据权利要求6所述的O型口蹄疫病毒样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，步骤4)中，所述镍柱纯化的具体过程如下：

将上清液加入到平衡好的镍糖中，室温在摇床孵育2h，500r/min离心2min后弃上清，用洗脱液洗5次，除去杂质和残留的培养基，用250ml洗脱液进行蛋白镍柱分离洗脱，先加入200μl洗脱液，孵育2min，然后用收1.5ml管收集，重复收集3～5次，得到O型口蹄疫病毒样颗粒疫苗。

9.根据权利要求6所述的O型口蹄疫病毒样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，还包括步骤5)电镜观察：取10μL纯化的O型口蹄疫病毒样颗粒疫苗样品，加在铜网的碳膜上，经2％的磷钨酸染色5min，室温干燥2h，磷钨酸染色是负染，背景为黑色，病毒样颗粒为白色，呈病毒样形态。

10.O型口蹄疫病毒样颗粒疫苗在动物免疫中的应用，其特征在于，将所述O型口蹄疫病毒样颗粒疫苗与弗氏佐剂混合后通过肌肉注射方法对动物进行免疫，能够诱导动物产生O型口蹄疫病毒的特异性抗体，所述O型口蹄疫病毒样颗粒疫苗的用量为100μg/只。