CN115340609A

CN115340609A - 一种口蹄疫病毒多抗原表位融合蛋白、蛋白笼纳米颗粒及其制备方法

Info

Publication number: CN115340609A
Application number: CN202110516349.0A
Authority: CN
Inventors: 郑海学; 茹毅; 郝荣增; 马坤; 伍春平; 刘华南; 张贵财; 李亚军; 卢炳州; 李丹; 刘永杰; 杨帆; �田宏; 张克山; 曹伟军; 刘湘涛
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2021-05-12
Filing date: 2021-05-12
Publication date: 2022-11-15
Anticipated expiration: 2041-05-12
Also published as: CN115340609B

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种口蹄疫病毒多抗原表位融合蛋白、蛋白笼纳米颗粒及其制备方法。本发明发现，在氨基酸序列改造后的Encapsulin蛋白片段的特定位置引入口蹄疫病毒抗原表位序列(包括B细胞表位和T细胞表位)能够实现目标蛋白在大肠杆菌中高效、可溶性表达，并且能够成功自组装成蛋白笼纳米颗粒；组装的蛋白笼纳米颗粒，颗粒均一，并具有较高的耐热稳定性；所述组装的蛋白笼纳米颗粒经抗原乳化后免疫豚鼠和猪，均可刺激机体产生病毒中和性抗体，具有较好的免疫保护作用，可用于口蹄疫疫苗的制备。

Description

一种口蹄疫病毒多抗原表位融合蛋白、蛋白笼纳米颗粒及其制备方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种口蹄疫病毒多抗原表位融合蛋白、蛋白笼纳米颗粒及其制备方法。

背景技术

口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus，FMDV)属于小RNA病毒科，口蹄疫病毒属，病毒粒子无囊膜，呈二十面体对称，由结构蛋白VP0、VP3和VP1组成，其中VP0蛋白由VP4和VP2组成。该病毒主要感染猪、牛、羊等偶蹄动物，具有复制快、高度接触感染且致病性强等特征，尤其在猪群中能引起大范围流行。口蹄疫爆发会使动物及其产品贸易受到限制，造成重大的经济损失和社会影响，世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定必报传染病，我国农业部也将其划定为一类动物传染病。

在我国，采取以预防为主的综合防控策略防控口蹄疫，对口蹄疫易感动物接种灭活疫苗是最常用的免疫措施。所述的灭活疫苗是口蹄疫田间毒株经病毒培养系统大量扩增、灭活、乳化等工艺制成，为控制我国口蹄疫的大流行起到了重要作用。但是，传统的灭活疫苗存在诱导体液免疫反应慢、免疫持续期短、细胞免疫应答差，在生产制备过程中还存在因病毒灭活不彻底而散毒的风险、生产成本较高等问题。

亚单位疫苗因其制备过程简单，价格低廉，可区分病毒感染与疫苗免疫，是动物疫苗研发和应用的热点。口蹄疫病毒结构蛋白负责病毒组装，决定抗原特异性，是病毒重要的抗原成份。因此，通过表达高免疫原性的口蹄疫结构蛋白作为疫苗也引起学者的注意。很多表达系统已经被用于表达FMDV VP1蛋白，但大都存在可溶性差，免疫原性弱、外壳蛋白组装效率不高以及成本高等缺点。而FMDV VP1蛋白上的某些氨基酸区域可以作为FMDV的优势抗原表位，不同的FMDV短肽也具有一定的免疫原性，能够刺激机体产生免疫反应。但单独使用短肽作为抗原免疫动物，存在免疫原性不足的问题，通常为了提高其免疫原性，将短肽与外源载体蛋白偶联制备完全抗原以提高短肽分子的免疫原性，但这些方法需要经过多次免疫后才能产生高水平的抗体，而且载体蛋白会影响针对短肽的免疫反应。FMDV抗原表位肽具有的免疫原性以及抗原基因融合蛋白在大肠杆菌中的成功表达为研制多表位疫苗提供了新的思路和技术。

通过DNA重组技术，融合蛋白已经很容易在原核表达系统(大肠杆菌)和真核表达系统(酵母和哺乳动物细胞)进行高效表达，其产物在生物和医学上得到了广泛应用。其中蛋白笼纳米颗粒一般常用做靶向定位给药，而有研究发现铁蛋白在体外可以自组装，形成套袖样的蛋白笼纳米颗粒；同时，铁蛋白纳米笼可以将外源小分子蛋白装入其纳米笼内，从而有效降低小分子抗原的降解，提高抗原的有效浓度，还可以有效协助靶细胞对相应抗原的摄取、加工，显著增强抗原蛋白的抗原稳定性和免疫原性。但是在纳米笼系统中导入抗原表位序列是一项比较复杂的工作，抗原表位序列及导入策略的选择不当，往往导致纳米笼组装不成功；而且即使组装成功，获得的蛋白笼纳米颗粒也可能影响抗原的免疫原性，无法产生中和抗体。

本发明意外发现，在氨基酸改造的Encapsulin蛋白的特定位置引入口蹄疫病毒抗原表位序列，包括1个B细胞表位和1个T细胞表位，能够实现目标蛋白的原核高效、可溶性表达，并且能够成功自组装形成蛋白笼纳米颗粒，所述的蛋白笼纳米颗粒作为抗原具有以下优势：1)可以将融合表达的抗原表位肽段以多拷贝的形式展示在颗粒表面，提高了抗原表位的免疫原性；2)蛋白笼纳米颗粒本身作为一种病毒样颗粒的大分子，除具有很好的体液免疫反应性能外，还具有很好的诱导机体T细胞免疫应答的能力；3)这种融合蛋白纯化方式简单易行，自组装的蛋白笼纳米颗粒具有很好的热稳定性，不影响纳米颗粒的组装和自身免疫原性；4)所述融合蛋白经佐剂乳化后形成的口蹄疫亚单位疫苗免疫豚鼠和猪后均可引发机体产生病毒中和性抗体，并且从免疫第7天的血清中即可检测到INF-γ水平的显著上升，表明所述的口蹄疫亚单位疫苗不仅可以有效诱导动物体液免疫反应，亦可有效诱导机体的细胞免疫应答，具有广阔应用前景。

发明内容

本发明发现，在氨基酸序列改造的Encapsulin蛋白特定位置引入口蹄疫病毒抗原表位序列，包括1个B细胞表位和1个T细胞表位，能够实现目标蛋白的原核高效、可溶性表达，并且能够成功自组装成纳米颗粒，抗原经乳化后免疫豚鼠和猪，均可刺激机体产生病毒中和性抗体。

具体发明内容为：

第一方面，本发明提供了一种口蹄疫病毒多抗原表位融合蛋白，所述口蹄疫病毒多抗原表位融合蛋白包括口蹄疫病毒B细胞抗原表位、口蹄疫病毒T细胞抗原表位和氨基酸序列改造的Encapsulin蛋白片段，所述Encapsulin蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，所述口蹄疫病毒B细胞抗原表位选自VP1蛋白抗原表位的140-158aa；所述口蹄疫病毒T细胞抗原表位选自3A蛋白抗原表位的21-35aa。

优选地，所述口蹄疫病毒多抗原表位融合蛋白包括1个口蹄疫病毒B细胞抗原表位、1个口蹄疫病毒T细胞抗原表位，所述T细胞抗原表位分别位于所述Encapsulin蛋白片段的138-139位之间；所述B细胞抗原表位位于所述Encapsulin蛋白片段的羧基末端。

优选地，所述口蹄疫病毒为O型口蹄疫病毒。

优选地，所述口蹄疫病毒B细胞抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述口蹄疫病毒T细胞抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

优选地，编码所述口蹄疫病毒B细胞抗原表位的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，编码所述口蹄疫病毒T细胞抗原表位的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

优选地，所述口蹄疫病毒多抗原表位融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

第二方面，本发明提供了一种编码上述第一方面所述口蹄疫病毒多抗原表位融合蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

第三方面，本发明提供了一种表达上述第一方面所述口蹄疫病毒多抗原表位融合蛋白的重组载体。

第四方面，本发明提供了一种包含上述第三方面所述重组载体的宿主细胞。

第五方面，本发明提供了一种上述第一方面所述的口蹄疫病毒多抗原表位融合蛋白在制备口蹄疫亚单位疫苗中的应用。

第六方面，本发明提供了一种上述第一方面所述的口蹄疫病毒多抗原表位融合蛋白自组装形成的蛋白笼纳米颗粒。

第七方面，本发明提供了一种上述第六方面所述的蛋白笼纳米颗粒在制备口蹄疫亚单位疫苗中的应用。

第八方面，本发明提供了一种上述第六方面所述的蛋白笼纳米颗粒的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1)将编码口蹄疫病毒B细胞抗原表位、口蹄疫病毒T细胞抗原表位和氨基酸序列改造的Encapsulin蛋白片段的基因序列串联，合成编码口蹄疫病毒多抗原表位融合蛋白的基因片段；

(2)将口蹄疫病毒多抗原表位融合蛋白片段连接至原核表达载体，构建重组表达质粒；

(3)将所述重组表达质粒转化大肠杆菌，经过诱导表达和纯化获得口蹄疫病毒多抗原表位融合蛋白；

(4)所述口蹄疫病毒多抗原表位融合蛋白自组装形成蛋白笼纳米颗粒。

一种用于预防口蹄疫病毒感染的亚单位疫苗，所述亚单位疫苗包括上述第一方面所述的口蹄疫病毒多抗原表位融合蛋白，或上述第六方面所述的蛋白笼纳米颗粒。

本发明的有益效果是：

(1)本发明发现，在氨基酸序列改造的Encapsulin蛋白片段的特定位置引入口蹄疫病毒抗原表位序列(包括1个B细胞表位和1个T细胞表位)，能够实现目标蛋白的原核高效、可溶性表达，并且能够成功自组装成蛋白笼纳米颗粒；

(2)所述自组装的蛋白笼纳米颗粒，颗粒均一，提高了目的蛋白的稳定性；

(3)所述自组装的蛋白笼纳米颗粒经佐剂乳化后制备获得的口蹄疫亚单位疫苗免疫豚鼠和猪后，均可刺激机体产生病毒中和性抗体和IFN-γ，具有较好的免疫保护作用，可用于口蹄疫亚单位疫苗的制备。

附图说明

图1融合蛋白表达鉴定结果；

图2融合蛋白表达的纯化结果，其中包括破菌后的样品处理和经过层析柱纯化结果；

图3融合蛋白自组装纳米颗粒的电镜鉴定结果；

图4口蹄疫亚单位疫苗免疫后豚鼠血清中和抗体检测结果，其中ENC为Encapsulin蛋白对照组，V1B为所述的口蹄疫亚单位疫苗组；

图5口蹄疫亚单位疫苗免疫后猪血清抗体检测结果，其中NC为健康对照猪，819、832和821分别为动物编号；

图6口蹄疫亚单位疫苗免疫后猪血清中和抗体检测结果，其中ENC为Encapsulin蛋白对照组，V1B为所述的口蹄疫亚单位疫苗组；

图7口蹄疫亚单位疫苗免疫后猪血清检测IFN-γ结果，其中NC为健康对照猪，819、832和821分别为动物编号，且图中每一组从左往右依次为NC、819、832和821。

具体实施方式

以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。

以下实施例中所述的实验获得生物安全许可和口蹄疫实验室活动许可：

中国农业科学院兰州兽医研究所根据生物安全3级实验室(BSL-3)和口蹄疫相关生物安全的相关要求，经兰州兽医研究所生物安全委员会、实验动物伦理委员会、中国农业科学院生物安全委员会、兰州兽医研究所实验动物伦理委员会、兰州兽医研究所生物安全委员会逐级上报，获得农业部关于开展高致病性FMDV等病原及动物研究许可，并已在农业农村部备案，符合国家生物安全等级的要求。

本发明中相关术语的说明及解释：

术语“大肠杆菌表达系统”是指由大肠杆菌(菌株)与载体组成，其中大肠杆菌(菌株)来源于市场上可得到的，在此举例但不限于：BL21(DE3)，BL21(DE3)pLysS，B834(DE3)，BLR(DE3)，JM109，XL1Blue，ER2566，Rosetta，GI698，优选BL21(DE3)。

术语“载体”是指可将某编码蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可以通过转化，转导或者转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。举例来说，载体包括：质粒；噬菌体；柯斯质粒等。

术语“疫苗”是指能够在动物中提供保护性应答的生物制剂，其中所述疫苗已经被递送并且不能造成严重疾病。本发明的疫苗是遗传工程改造的由口蹄疫病毒抗原表位组成的亚单位疫苗。

本发明的疫苗，进一步任选地包含一种或多种佐剂，赋形剂，载体和稀释剂。佐剂可以任何合适的佐剂，化学类免疫佐剂如氢氧化铝、弗氏佐剂、矿物油、司盘等；微生物类免疫佐剂如分枝杆菌、BCC、脂多糖、胞壁酰二肽、胞肽、脂溶性蜡质D、短小棒状杆菌；植物类免疫佐剂多为从植物或大真菌中提取的多糖类，如茯苓多糖、红花多糖、中草药类等。而生化类免疫佐剂如胸腺肽、转移因子、白细胞介素等。优选的佐剂可以是纳米佐剂生物佐剂，白介素、干扰素等。

本发明的疫苗的施用可以采用方便的途径，例如肌内注射，鼻内，口服，皮下，透皮和阴道等途径。本发明的减毒疫苗优选采用肌肉注射。疫苗可以在初免-加强方案后施用。例如，在第一次接种后，受试者可以在一段时间(例如约7，14，21或28天)之后接受第二次加强施用。通常，加强施用的剂量相同或低于初免施用的剂量。此外，也可以进行第三次加强免疫，例如免疫后2-3个月、6个月或一年。

以下实施例中所用材料和方法如下所示：

载体pMV-ENC和pMV-FTB由北京六合华大基因科技有限公司合成，其中pMV-ENC为带有Encapsulin基因的对照载体；pMV-FTB为同时带有B细胞表位和T细胞表位的Encapsulin融合蛋白表达片段的过渡载体。pET28质粒为中国农业科学院兰州兽医研究所口蹄疫与新发病流行病学创新团队保存。

带有B细胞表位和T细胞表位的Encapsulin融合蛋白表达片段的过渡载体pMV-FTB和仅插入Encapsulin蛋白的表达载体pMV-ENC分别进行酶切和DNA片段回收后插入pET28原核表达载体(插入位点为Xba I和BamH I之间)，分别构建获得表达载体pET28-V1B和pET28-ENC。

所述FMDV B细胞抗原表位和T细胞抗原表位均源自O型口蹄疫病毒株O/17002(保藏于国家口蹄疫参考实验室)，所述B抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，T细胞抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；表达所述B细胞抗原表位的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示，表达所述T细胞抗原表位的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

所述的Encapsulin蛋白片段是从一种嗜热菌(Thermotoga maritima)中分离得到的蛋白基因片段，该基因片段如SEQ ID NO.8所示，该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

构建的FMDV多抗原表位融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；编码FMDV多抗原表位融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

T4连接酶、限制性内切酶BamH I和Xba I均购自英国NEB公司；DNA分子质量标准DL10000购自TaKaRa公司；Prestained Protein MarkerⅠ购自Thermo公司；质粒小量快速提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒购自OMEGA.Bio-tek公司。

实施例1含B细胞表位和T细胞表位的Encapsulin融合蛋白的可溶性表达

1.原核表达载体的构建及鉴定

将构建获得的同时带有B细胞表位和T细胞表位的Encapsulin融合蛋白表达片段的过渡载体pMV-FTB用Xba I和BamH I双酶切，获得目的片段FTB，然后用T4连接酶将目的片段FTB与BamH I和Xba I双酶切的pET28载体连接，得到含B细胞表位和T细胞表位的Encapsulin融合蛋白的重组载体；将所述重组载体转化至E.coli DH5α，涂布于含卡那霉素(Kna50mg/L)的Luria-Bertanil(LB)固态培养基，37℃培养，挑选阳性克隆，经NdeI-XhoI双酶切验证后，送往杨凌奥科生物科技有限公司测序鉴定，测序正确的重组质粒分别命名为：pET28-V1B。

2.重组蛋白的诱导表达及可溶性鉴定

将测序正确的重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞。在含卡那霉素50mg/L的LB固态培养基上挑取含重组质粒的单个菌落，获得阳性克隆。

取上述阳性克隆接种于含50mg/L的卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养过夜。将得到的菌液按体积比1:100接种于含50mg/L卡那霉素的100ml LB液体培养基中，37℃、220r/min振荡培养至对数中期(OD₆₀₀达0.6-0.8)进行诱导表达，SDS-PAGE检测蛋白的表达。诱导剂IPTG诱导终浓度为0.5mmol/L，16℃、220r/min诱导表达12h为最佳诱导表达条件。次日诱导结束后，吸取1mL菌液，离心去上清，加PBS重悬，加入等体积2×SDS-PAGE上样缓冲液混匀，沸水煮10min。剩余的菌液离心收集沉淀，10mL的Binding Buffer(pH8.0)重悬菌体，加溶菌酶(1g/L)冰浴30min后，低温超声波破碎菌体(超声时间5s，间歇5s，工作时间10分钟)。

分别收集上清和沉淀进行SDS-PAGE分析，检测含有B细胞表位和T细胞表位的Encapsulin融合蛋白的可溶性表达情况。

SDS-PAGE鉴定结果如图1所示，上清中可见明显的目的条带，表明诱导表达后的含B细胞表位和T细胞表位的Encapsulin融合蛋白在39kDa处有与预期大小一致的蛋白条带，表示重组质粒pET28-V1B可以高效、可溶性表达含有B细胞表位和T细胞表位的Encapsulin融合蛋白。

实施例2含B细胞表位和T细胞表位的Encapsulin融合蛋白的纯化及蛋白笼纳米颗粒的自组装

1.重组蛋白的纯化

以IPTG诱导终浓度为0.5mmol/L，16℃、220r/min诱导上述阳性克隆进行诱导表达，制备蛋白表达的大肠杆菌，诱导12h后离心收集菌体，按10mL/g体积加入BindingBuffer(pH8.0)重悬菌体，加溶菌酶(1g/L)进行高压均质机破碎。破碎后18000rpm低温离心1h，离心后弃去沉淀，上清液经65℃煮30min，再进行10000rpm离心30min，离心后弃去沉淀，上清经0.45μm的滤器过滤后，进行分子筛纯化，收集经分子筛纯化的样品。

分别取100μL上清加入loading buffer沸水煮10min，制备SDS-PAGE电泳样品，-20℃保存或电泳鉴定。

含有B细胞表位和T细胞表位的Encapsulin融合蛋白纯化结果如图2所示，结果表明含有B细胞表位和T细胞表位的Encapsulin融合蛋白经过破菌后高温处理即可去除大部分杂蛋白，进一步纯化结果显示在目标蛋白位置可见明显的目的蛋白条带，表明该方法可有效快速的获得纯化的含有B细胞表位和T细胞表位的Encapsulin融合蛋白。

2.蛋白笼纳米颗粒的形成及物理表征(电镜检测)

为了进一步分析含B细胞表位和T细胞表位的Encapsulin融合蛋白是否形成了蛋白笼纳米颗粒以及形成的颗粒是否均一，对含B细胞表位和T细胞表位的Encapsulin融合蛋白进行了透射电镜(TEM)物理表征。

具体步骤：取纯化后的含有B细胞表位和T细胞表位的Encapsulin融合蛋白，经不同梯度稀释后，取10μL蛋白滴到铜网上，静置10min，用滤纸从铜网的一边吸取液体；然后再滴加10μL 1％磷钨酸染色液，静置2min，再用滤纸从铜网的一边吸取染色液；用镊子夹取铜网放入玻璃平皿中，让铜网上的液体自然晾干；将制备好的铜网固定在样品握持杆的样品台上，插入到样品室内，抽真空后，在观察窗找到合适的视野，进行观察和分析纯化的含有B细胞表位和T细胞表位的Encapsulin融合蛋白是否自组装形成蛋白笼纳米颗粒。

结果如图3所示，纯化后的含有B细胞表位和T细胞表位的Encapsulin融合蛋白进行6倍稀释后，电镜下可见到组装完整的纳米颗粒，表明所述的含有B细胞表位和T细胞表位的Encapsulin融合蛋白具有较好的自组装能力，组装形成了20-25nm蛋白笼纳米颗粒。

本实施例成功构建一种含有B细胞表位和T细胞表位的Encapsulin融合蛋白的pET28-V1B原核表达载体，并建立含有B细胞表位和T细胞表位的Encapsulin融合蛋白的制备方法和高效的纯化方法，电镜结果显示含有B细胞表位和T细胞表位的Encapsulin融合蛋白形成了蛋白笼纳米颗粒。

实施例3口蹄疫亚单位疫苗免疫动物中和抗体应答检测

1.口蹄疫亚单位疫苗免疫豚鼠。

取上述实施例2获得的蛋白笼纳米颗粒，经完全弗氏佐剂乳化后获得口蹄疫亚单位疫苗，用所述口蹄疫亚单位疫苗肌肉注射免疫5只200g左右的豚鼠(来源于中国农业科学院兰州兽医研究所动物中心)，其中以Encapsulin蛋白作为蛋白免疫对照组(所述Encapsulin蛋白为将构建获得的仅带有Encapsulin基因的对照载体pMV-ENC用Xba I和BamH I双酶切，获得目的片段ENC，然后用T4连接酶将目的片段ENC与BamHI和Xba I双酶切的pET28载体连接，得到仅含有Encapsulin的重组载体pET28-ENC；参照实施例2所述方法表达获得Encapsulin蛋白。)，PB免疫组作为阴性对照组。第一次免疫21天后加强免疫一次，第二次免疫后28天后对豚鼠执行安乐死。免疫后每周分别采集豚鼠血液分离血清，用于检测血清中和抗体水平。

血清中和抗体水平检测的具体方法如下：将准备好的BHK-21细胞按照2.5-3×10⁵/mL细胞密度铺于96孔细胞培养板，待细胞汇合度达到80-90％时，将分离的血清按照2倍倍比稀释于血清稀释板中，每个血清重复8次，然后将检测用病毒按照200个TCID₅₀准备好病毒稀释液，加入完成倍比稀释好的血清中，37℃条件作用1h，然后将中和后的血清和病毒混合液加入细胞培养板中，继续在37℃和5％CO₂培养2-3天，待阳性对照细胞出现明显CPE，观察每组血清的CPE(细胞病变)情况，并根据Reed-Muench法计算中和效价。

检测结果见图4所示，其中ENC为Encapsulin蛋白对照组，V1B为所述的口蹄疫亚单位疫苗组。结果表明，用本发明所述的蛋白笼纳米颗粒经完全弗氏佐剂乳化获得的口蹄疫亚单位疫苗第一次免疫豚鼠后血清的中和作用不明显，从第二次免疫后7天开始可以检测到中和抗体，二免后14-28天均可以检测到高水平的中和抗体。

2.口蹄疫亚单位疫苗免疫猪

取上述实施例2获得的蛋白笼纳米颗粒，经ISA 206佐剂乳化后获得口蹄疫亚单位疫苗，用所述口蹄疫亚单位疫苗肌肉注射免疫3头90日龄的猪(动物编号：819，821，832)，未免疫的健康猪作为阴性对照组(NC)。第一次免疫28天加强免疫一次。免疫后每周分别采集猪血液分离血清，用于检测血清抗体水平和中和抗体水平，以及血清IFN-γ水平。

血清抗体水平检测方法如下：首先包被ELISA板，用终浓度为1ng/μL的FMDV的VP1、VP2和VP3融合蛋白，50μL/孔，4℃，包被96孔酶标板，过夜；1×PBST洗板5次，拍干，加入5％牛血清白蛋白(BSA)，120μL/孔，4℃，封闭10h；1×PBST洗板5次，加入以1:1000稀释待检血清稀释液，50μL/孔，37℃，孵育30min；1×PBST洗板5次，拍干，加入用二抗稀释液按1:10000稀释的HRP标记的山羊抗猪IgG多克隆抗体，50μL/孔，37℃，孵育30min；1×PBST洗板5次，拍干，加入TMB底物显色液，50μL/孔，37℃，避光孵育12min；加入2mol/L硫酸，50μL/孔，终止反应，读取OD₄₅₀值；当待测待检血清孔OD值(S)大于对照孔OD值(N)的2.1倍则判定为阳性。

血清抗体检测结果如图5所示，用本发明所述的蛋白笼纳米颗粒经ISA 206佐剂乳化获得的口蹄疫亚单位疫苗第一次免疫猪后第7天开始血清抗体水平缓慢上升，加强免疫后，血清抗体水平保持高水平，表明所述的口蹄疫亚单位疫苗引发了强烈免疫反应。

中和抗体检测方法如上述实施例3的1中所述。中和抗体检测结果如图6所示，其中ENC为Encapsulin蛋白对照组，V1B为所述的口蹄疫亚单位疫苗组。结果表明，用本发明所述的蛋白笼纳米颗粒经ISA 206佐剂乳化获得的口蹄疫亚单位疫苗初免猪后第21天可以检测到中和抗体，从加强免疫后第7天至第21天，血清中和抗体水平显著升高，且到达可保护动物抵抗病毒感染的抗体水平。该结果与豚鼠免疫后的中和抗体水平基本一致。

血清IFN-γ水平检测方法如下：使用商品化的IFN-γELISA试剂盒，按照使用说明书检测每个血清样本中的IFN-γ水平。使用标准品稀释液将400pg/mL的标准品稀释成200pg/mL、100pg/mL、50pg/mL、25pg/mL和12.5pg/mL；在预包被的微量滴定板中加入待测血清和标准品，50μL/孔，待测血清和标准品设置两个重复，同时设置空白对照，振荡混匀30s，37℃孵育45min；使用Wash Buffer洗板4次，弃去Wash buffer并拍干，每孔加入50uL生物素标记的IgG，37℃孵育30min；洗板4次，每孔加入50Ul HRP标记的链霉亲和素，振荡混匀30s，37℃孵育30min；洗板4次，每孔中加入显色液50μL，37℃孵育30min；每孔中加入50μL终止液，终止光反应，并读取OD450nm的值；以标准品的OD₄₅₀的值与其对应的标准品浓度作标准曲线，得到线性方程式，再以该方程式与待测样品的OD₄₅₀的值计算待测样品中的IFN-γ含量。

IFN-γ水平检测结果见图7，其中NC为健康对照猪，819、832和821分别备为动物编号，且图中每一组从左往右依次为NC、819、832和821；结果表明，用本发明所述的蛋白笼纳米颗粒经ISA 206佐剂乳化获得的口蹄疫亚单位疫苗初免猪后，从初免第7天开始，动物血清中即可检测到较高水平的IFN-γ水平，并持续至第二次免疫后的21天，依然保持较高的水平。表明所述口蹄疫亚单位疫苗免疫动物后，可以诱导较好的细胞免疫反应。

上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 一种口蹄疫病毒多抗原表位融合蛋白、蛋白笼纳米颗粒及其制备方法

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 280

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Glu Phe Leu Lys Arg Ser Phe Ala Pro Leu Thr Glu Lys Gln Trp

1 5 10 15

Gln Glu Ile Asp Asn Arg Ala Arg Glu Ile Phe Lys Thr Gln Leu Tyr

20 25 30

Gly Arg Lys Phe Val Asp Val Glu Gly Pro Gly Gly Gly Gly Gly His

35 40 45

His His His His His Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Trp Glu Tyr Ala

50 55 60

Ala His Pro Leu Gly Glu Val Glu Val Leu Ser Asp Glu Asn Glu Val

65 70 75 80

Val Lys Trp Gly Leu Arg Lys Ser Leu Pro Leu Ile Glu Leu Arg Ala

85 90 95

Thr Phe Thr Leu Asp Leu Trp Glu Leu Asp Asn Leu Glu Arg Gly Lys

100 105 110

Pro Asn Val Asp Leu Ser Ser Leu Glu Glu Thr Val Arg Lys Val Ala

115 120 125

Glu Phe Glu Asp Glu Val Ile Phe Arg Gly Cys Glu Lys Ser Gly Val

130 135 140

Lys Gly Leu Leu Ser Phe Glu Glu Arg Lys Ile Glu Cys Gly Ser Thr

145 150 155 160

Pro Lys Asp Leu Leu Glu Ala Ile Val Arg Ala Leu Ser Ile Phe Ser

165 170 175

Lys Asp Gly Ile Glu Gly Pro Tyr Thr Leu Val Ile Asn Thr Asp Arg

180 185 190

Trp Ile Asn Phe Leu Lys Glu Glu Ala Gly His Tyr Pro Leu Glu Lys

195 200 205

Arg Val Glu Glu Ser Leu Arg Gly Gly Lys Ile Ile Thr Thr Pro Arg

210 215 220

Ile Glu Asp Ala Leu Val Val Ser Glu Arg Gly Gly Asp Phe Lys Leu

225 230 235 240

Ile Leu Gly Gln Asp Leu Ser Ile Gly Tyr Glu Asp Arg Glu Lys Asp

245 250 255

Ala Val Arg Leu Phe Ile Thr Glu Thr Phe Thr Phe Gln Val Val Asn

260 265 270

Pro Glu Ala Leu Ile Leu Leu Lys

275 280

<210> 2

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Pro Leu Pro Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Pro Lys Ala

1 5 10 15

Ala Arg Pro

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ala Ala Ile Glu Phe Phe Glu Gly Met Val His Asp Ser Ile Lys

1 5 10 15

<210> 4

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccgctgccga atgttcgtgg tgacctgcag gttctggccc cgaaagcagc acgtccg 57

<210> 5

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gctgctatcg aattcttcga aggtatggtt cacgactcta tcaaa 45

<210> 6

<211> 329

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Glu Phe Leu Lys Arg Ser Phe Ala Pro Leu Thr Glu Lys Gln Trp

1 5 10 15

Gln Glu Ile Asp Asn Arg Ala Arg Glu Ile Phe Lys Thr Gln Leu Tyr

20 25 30

Gly Arg Lys Phe Val Asp Val Glu Gly Pro Gly Gly Gly Gly Gly His

35 40 45

His His His His His Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Trp Glu Tyr Ala

50 55 60

Ala His Pro Leu Gly Glu Val Glu Val Leu Ser Asp Glu Asn Glu Val

65 70 75 80

Val Lys Trp Gly Leu Arg Lys Ser Leu Pro Leu Ile Glu Leu Arg Ala

85 90 95

Thr Phe Thr Leu Asp Leu Trp Glu Leu Asp Asn Leu Glu Arg Gly Lys

100 105 110

Pro Asn Val Asp Leu Ser Ser Leu Glu Glu Thr Val Arg Lys Val Ala

115 120 125

Glu Phe Glu Asp Glu Val Ile Phe Arg Gly Cys Glu Lys Ser Gly Val

130 135 140

Lys Gly Leu Leu Ser Phe Glu Glu Arg Lys Gly Gly Gly Gly Ser Ala

145 150 155 160

Ala Ile Glu Phe Phe Glu Gly Met Val His Asp Ser Ile Lys Gly Gly

165 170 175

Gly Gly Ser Ile Glu Cys Gly Ser Thr Pro Lys Asp Leu Leu Glu Ala

180 185 190

Ile Val Arg Ala Leu Ser Ile Phe Ser Lys Asp Gly Ile Glu Gly Pro

195 200 205

Tyr Thr Leu Val Ile Asn Thr Asp Arg Trp Ile Asn Phe Leu Lys Glu

210 215 220

Glu Ala Gly His Tyr Pro Leu Glu Lys Arg Val Glu Glu Ser Leu Arg

225 230 235 240

Gly Gly Lys Ile Ile Thr Thr Pro Arg Ile Glu Asp Ala Leu Val Val

245 250 255

Ser Glu Arg Gly Gly Asp Phe Lys Leu Ile Leu Gly Gln Asp Leu Ser

260 265 270

Ile Gly Tyr Glu Asp Arg Glu Lys Asp Ala Val Arg Leu Phe Ile Thr

275 280 285

Glu Thr Phe Thr Phe Gln Val Val Asn Pro Glu Ala Leu Ile Leu Leu

290 295 300

Lys Gly Gly Gly Gly Ser Pro Leu Pro Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln

305 310 315 320

Val Leu Ala Pro Lys Ala Ala Arg Pro

325

<210> 7

<211> 1014

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atggaatttc tgaaaagatc ctttgctcct ctgacagaaa aacagtggca ggagatagac 60

aacagagcaa gagagatctt caaaacacag ctctacggaa ggaaattcgt cgatgtggaa 120

ggtcccggcg gcggcggtgg tcatcatcat catcatcacg gcggcggcgg tggttacggc 180

tgggagtacg ctgcccatcc actcggggaa gttgaggtgc tttcagacga gaacgaagtg 240

gtgaagtggg gattgaggaa gtctctgccg ctcatcgaac tgagggcaac gttcactctc 300

gatctgtggg aactcgacaa cctcgagaga ggaaaaccga acgtggatct ttccagctta 360

gaagaaacgg tgagaaaggt tgcggaattt gaagacgaag tgatattcag aggatgtgaa 420

aaatcgggtg ttaaaggcct tctttccttc gaagagagga aaggcggcgg cggttccgct 480

gctatcgaat tcttcgaagg tatggttcac gactctatca aaggcggcgg cggttccatc 540

gaatgtggaa gcacaccgaa agacctcctc gaagccatag tgagggctct ttcgatcttc 600

tcaaaagatg gtatagaggg cccttacaca ctcgtcataa acacggacag atggatcaac 660

ttcctgaagg aagaggcagg gcattacccc ctcgagaaga gagtggaaga aagcctcagg 720

ggtggcaaga tcataaccac accgagaatc gaggatgccc tcgtcgtttc tgagcgtgga 780

ggggatttca aattgatcct tggacaggat ctctcgatag ggtacgaaga cagggaaaaa 840

gacgcggtga ggcttttcat aacggagacg ttcaccttcc aggttgtcaa cccggaggcc 900

ttgattcttc taaagggcgg cggcggttcc ccgctgccga atgttcgtgg tgacctgcag 960

gttctggccc cgaaagcagc acgtccgggc ggccatcatc atcatcatca ctaa 1014

<210> 8

<211> 795

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atggaatttc tgaaaagatc ctttgctcct ctgacagaaa aacagtggca ggagatagac 60

aacagagcaa gagagatctt caaaacacag ctctacggaa ggaaattcgt cgatgtggaa 120

ggtccctacg gctgggagta cgctgcccat ccactcgggg aagttgaggt gctttcagac 180

gagaacgaag tggtgaagtg gggattgagg aagtctctgc cgctcatcga actgagggca 240

acgttcactc tcgatctgtg ggaactcgac aacctcgaga gaggaaaacc gaacgtggat 300

ctttccagct tagaagaaac ggtgagaaag gttgcggaat ttgaagacga agtgatattc 360

agaggatgtg aaaaatcggg tgttaaaggc cttctttcct tcgaagagag gaaaatcgaa 420

tgtggaagca caccgaaaga cctcctcgaa gccatagtga gggctctttc gatcttctca 480

aaagatggta tagagggccc ttacacactc gtcataaaca cggacagatg gatcaacttc 540

ctgaaggaag aggcagggca ttaccccctc gagaagagag tggaagaaag cctcaggggt 600

ggcaagatca taaccacacc gagaatcgag gatgccctcg tcgtttctga gcgtggaggg 660

gatttcaaat tgatccttgg acaggatctc tcgatagggt acgaagacag ggaaaaagac 720

gcggtgaggc ttttcataac ggagacgttc accttccagg ttgtcaaccc ggaggccttg 780

attcttctaa agtaa 795

Claims

1.一种口蹄疫病毒多抗原表位融合蛋白，其特征在于，所述口蹄疫病毒多抗原表位融合蛋白包括口蹄疫病毒B细胞抗原表位、口蹄疫病毒T细胞抗原表位和氨基酸序列改造后的Encapsulin蛋白片段，所述改造后的Encapsulin蛋白片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的口蹄疫病毒多抗原表位融合蛋白，其特征在于，所述口蹄疫病毒B细胞抗原表位选自VP1蛋白抗原表位的140-158aa；所述口蹄疫病毒T细胞抗原表位选自3A蛋白抗原表位的21-35aa。

3.如权利要求2所述的口蹄疫病毒多抗原表位融合蛋白，其特征在于，所述口蹄疫病毒多抗原表位融合蛋白包括1个口蹄疫病毒B细胞抗原表位、1个口蹄疫病毒T细胞抗原表位，所述T细胞抗原表位位于所述Encapsulin蛋白片段的138～139位之间；所述B细胞抗原表位位于所述Encapsulin蛋白片段的羧基末端。

4.如权利要求3所述的口蹄疫病毒多抗原表位融合蛋白，其特征在于，所述口蹄疫病毒B细胞抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述口蹄疫病毒T细胞抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

5.如权利要求4所述的口蹄疫病毒多抗原表位融合蛋白，其特征在于，所述口蹄疫病毒多抗原表位融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

6.一种编码权利要求5所述口蹄疫病毒多抗原表位融合蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

7.如权利要求1-5任一所述的口蹄疫病毒多抗原表位融合蛋白在制备口蹄疫亚单位疫苗中的应用。

8.如权利要求1-5任一所述的口蹄疫病毒多抗原表位融合蛋白自组装形成的蛋白笼纳米颗粒。

9.如权利要求8所述的蛋白笼纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将编码口蹄疫病毒B细胞抗原表位、口蹄疫病毒T细胞抗原表位和氨基酸序列突变的Encapsulin蛋白片段的基因序列串联，合成编码口蹄疫病毒多抗原表位融合蛋白的基因片段；

(2)将编码口蹄疫病毒多抗原表位融合蛋白的基因片段连接至原核表达载体，构建重组表达质粒；

10.一种用于预防口蹄疫病毒感染的亚单位疫苗，其特征在于，所述亚单位疫苗包括权利要求1-5任一所述的口蹄疫病毒多抗原表位融合蛋白或权利要求8所述的蛋白笼纳米颗粒。