CN110272498A

CN110272498A - 一种基于内含肽介导纳米载体及其应用

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Publication number: CN110272498A
Application number: CN201910421450.0A
Authority: CN
Inventors: 汤书兵; 周伟; 袁伟明
Original assignee: Guangzhou Women and Childrens Medical Center
Current assignee: Guangzhou Women and Childrens Medical Center
Priority date: 2019-05-21
Filing date: 2019-05-21
Publication date: 2019-09-24

Abstract

本发明公开了一种基于内含肽介导纳米载体及其应用，旨在提供一种综合使用基因工程技术和内含肽介导的蛋白编辑剪切技术，完美解决encapsulin的C端亚稳定性这一不利因素，提供一种通用的纳米载体，可在encapsulin的表面特异、高效递送不同的货物分子的载体，该纳米载体是通过下述步骤构建的：encapsulin蛋白的C端通过基因融合的方法引入int^N、gb1和halo共3个串联蛋白形成重组蛋白encapsulin‑int^N‑gb1‑halo；60个重组蛋白单体自装配成纳米颗粒，其暴露的int^N‑gb1‑halo作为通用“适配器”，与货物重组蛋白gb1‑int^C和cargo混合后，在DTT的帮助下发生分子重组；内含肽intein自我切除，形成副产物int^N‑gb1‑halo和gb1‑int^C，而encapsulin与cargo共价偶联，生产目的产物encapsulin‑cargo；属于纳米载体技术领域。

Description

一种基于内含肽介导纳米载体及其应用

技术领域

本发明公开了一种纳米载体，具体地说，是一种基于内含肽介导的纳米载体，本发明还公开了该纳米载体的构建方法以及应用，属于纳米载体技术领域。

背景技术

近年研究发现六十个拷贝的encapsulin蛋白可自装配成直径28nm的球形纳米颗粒，在抗原递送和肿瘤治疗等领域展示出较大的应用潜力。该蛋白的C端是货物分子基因插入的主要位点，用以在纳米载体表面负载货物蛋白。然而该蛋白的C端处于“亚稳定性状态”，其C端基因融合的较小蛋白分子通常因重组蛋白无法正确组装(misassembly)进而限制其应用前景。随着蛋白质组学的飞速发展，越来越多的未知蛋白被发现，迫切需要制备这些蛋白相关抗体以研究其功能。

纳米递送技术在疫苗设计、药物靶向性运输、活体成像诊断等生物医疗领域的重要性与日俱增。新发现的encapsulin自装配的纳米颗粒拥有可塑性强、pH适应范围广、热稳定性强等天然性优势，应用潜力巨大。

目前，已有研究利用encapsulin蛋白可特异性包裹C端带有信号肽蛋白的性质，将之开发为货物运输载体，然而该应用严重受制于纳米颗粒内部空间容量。encapsulin纳米载体的另外一个负载技术是将其表面氨基酸定点突变为赖氨酸或半胱氨酸，用以共价偶联负载分子。但是，化学偶联的方法存在效率较低、特异性较差、副反应产物存在安全隐患等缺点，限制其应用的广度。也有研究表明encapsulin的C端基因融合负载货物分子可展示至纳米载体表面，但是亦有研究表明C端融合基因未能展示至纳米颗粒表面，但是其不稳定性极大影响该方法的通用性。简而言之，利用encapsulin纳米载体递送货物备受已有递送技术的制约。

在人类后基因组时代，研究基因编码的蛋白质功能的重要性与日俱增。随着经典的遗传方法(yeast two-hybrid(Y2H)酵母双杂交)和生化相关方法(co-immunoprecipitation(Co-IP)共免疫沉淀，affinity purification(AP)亲和纯及tandemaffinity purification-mass spectrometry(TAP-MS)串联亲和纯化-质谱分析)的应用，越来越多的未知蛋白被发现。实验室的研究迫切需求这些新发现蛋白的相关抗体，以探索其功能。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的综合使用基因工程技术和内含肽介导的蛋白编辑剪切技术，完美解决encapsulin的C端亚稳定性这一不利因素，提供一种通用的纳米载体，可在encapsulin的表面特异、高效递送不同的货物分子。

为此，本发明提供的第一个技术方案是这样的：

一种基于内含肽介导的纳米载体，所述的纳米载体是通过下述步骤构建的：

1)encapsulin蛋白的C端通过基因融合的方法引入int^N、gb1和halo共3个串联蛋白形成重组蛋白encapsulin-int^N-gb1-halo，其核酸序列如SEQ ID No.8所示；

2)60个重组蛋白单体自装配成纳米颗粒，其暴露的int^N-gb1-halo作为通用“适配器”，与货物重组蛋白gb1-int^C和cargo混合后，在DTT的帮助下发生分子重组；

3)内含肽intein自我切除，形成副产物int^N-gb1-halo和gb1-int^C，而encapsulin与cargo共价偶联，生产目的产物encapsulin-cargo。

进一步的，上述的一种基于内含肽介导的纳米载体，所述的cargo为GFP或M44或者strep2。

进一步的，上述的一种基于内含肽介导的纳米载体，步骤3)为encapsulin-int^N-gb1-halo和gb1-int^C-GFP按照浓度比例为1:1-2，两者在室温条件下孵育2小时后，用superose 6B increase分子排阻法分离目的产物encapsulin-GFP。

进一步的，上述的一种基于内含肽介导的纳米载体，步骤3)为encapsulin-int^N-gb1-halo和gb1-int^C-strep2按照浓度比例为1:1-3，两者在室温条件下孵育2小时后，用superose 6B increase分子排阻法分离目的产物encapsulin-strep2。

进一步的，上述的一种基于内含肽介导的纳米载体，步骤2)为encapsulin-int^N-gb1-halo和gb1-int^C-M44按照浓度比例为1:1-2，两者在室温条件下孵育2小时后，用superose 6B increase分子排阻法分离目的产物encapsulin-M44。

本发明提供的第二个技术方案是该纳米载体作为货物蛋白，接种小鼠诱导高滴度特异性抗体的应用。

进一步的，上述的纳米载体作为递送权利要求1所述的货物蛋白，接种小鼠诱导高滴度特异性抗体的应用，所述的抗体的纯化方法为：

1)使用gb1-int^C-GFP或gb1-intein^C-M44与halo-int^N-gb1蛋白进行蛋白编辑剪切，生成重组蛋白halo-cargo，以及副产物gb1-int^C和int^N-gb1；

2)反应结束后，混合物与Promega halo^TM beads混合，目的产物halo-cargo共价结合至halo^TM beads，离心弃上清后，加入免疫后的血清，货物分子相关抗体利用抗原-抗体之间高亲和相互作用与halo^TM-halo-cargo结合，其它抗体和蛋白通过离心、洗涤后分离，最后用200mMglycine pH2.8洗脱目的抗体。

进一步的，上述纳米载体作为递送货物蛋白，接种小鼠诱导高滴度特异性抗体的应用，所述的halo^TM-halo-GFP的制备与纯化方法为：将halo-int^N-gb1和gb1-int^C-GFP按照浓度比1：1-2在室温条件下孵育4小时后，将250μL反应液与50μL平衡好的Promega halo^TM室温摇床混合半个小时后离心，用500μL PBS洗涤beads，除去非特异性结合蛋白；免疫2次后的血清；血清与halo^TM-halo-GFP孵育后的流出；先用500μL PBST洗涤halo^TM-halo-GFP；再90μL的200mM glycine pH2.8洗脱目的抗体。

进一步的，上述纳米载体作为货物蛋白，接种小鼠诱导高滴度特异性抗体的应用，所述的halo^TM-halo-M44的制备及M44相关抗体的纯化方法为：将halo-int^N-gb1和gb1-int^C-M44按照浓度比1：1-2在室温条件下孵育2-4小时后，250μL反应液与50μL平衡好的Promegahalo^TM室温摇床混合半个小时，而后离心，用500μL PBS洗涤beads，除去非特异性结合蛋白，反应液与Promega halo^TM混合后离心上清；PBS洗涤液洗涤3次，使得目的蛋白halo-GFP特异性结合至Promega halo^TM beads；免疫2次后的血清；血清与halo^TM-halo-M44孵育后的流出；先用500μL PBST洗涤halo^TM-halo-M44；再90μL的200mM glycine pH2.8洗脱目的抗体。

进一步的，上述的纳米载体作为递送货物蛋白，接种小鼠诱导高滴度特异性抗体的应用，诱导后的抗体做为WB和/或IF分析。

与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有如下技术优点：

1、本发明提供的技术方案通过分子设计，成功将内含肽介导蛋白编辑技术引入encapsulin纳米载体的表面修饰；制备的纳米颗粒与N端带有互补的断裂内含肽C片段(split intein C，gp41-1-int^C，简称int^C，核酸序列如SEQ ID No.16所示))货物分子混合，intein自我切除，货物分子共价偶联至纳米颗粒表面，改纳米颗粒表面修饰技术有效解决encapsulin的C端亚稳定性的限制，可在encapsulin的表面特异、高效递送不同的货物分子。

2、本发明提供的技术方案本发明以GFP蛋白和鼠巨细胞病毒(mousecytomegalovirus，MCMV)M44蛋白的C端氨基酸315-411(简称M44蛋白，该蛋白是MCMV复制中心标志物即marker)为模型，利用新开发的纳米递送技术递送上述货物蛋白，接种小鼠诱导高滴度的特异性抗体。而后利用halo共交联技术和抗原-抗体高亲和相互作用，成功纯化出GFP和M44相关IgG抗体，可用于western blotting检测和免疫荧光(immunofluorescence，IF)分析。

附图说明

图1是基于内含肽intein介导蛋白编辑剪切的方法修饰encapsulin纳米载体原理示意图；

图2是encapsulin的分子改造及重组纳米颗粒的纯化与分析图；

图3是基于内含肽介导蛋白编辑剪切技术在encapsulin表面高效负载GFP蛋白。

图4是基于内含肽介导蛋白编辑剪切技术在encapsulin表面高效负载2xstrep2多肽。

图5是基于内含肽介导蛋白编辑剪切技术在encapsulin表面高效负载MCMV的M44蛋白C端氨基酸315-411。

图6是酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)滴定货物分子相关IgG抗体滴度。

图7是基于halo共价交联技术和抗原-抗体相互作用纯化货物分子相关抗体原理示意图。

图8是halo^TM-halo-GFP的制备及GFP相关抗体的纯化。

图9是halo^TM-halo-M44的制备及M44相关抗体的纯化。

图10是用western blotting(WB)分析新纯化的GFP和M44相关抗体的功能。

图11是用immunofluorescence(IF)分析新纯化的GFP抗体功能检测。

图12是用IF分析新纯化的M44抗体功能检测。

具体实施例

下面结合具体实施例，对本发明的权利要求做进一步的详细说明。

实施例1

基于内含肽intein介导蛋白编辑剪切的方法修饰encapsulin纳米载体的构建方法，其原理示意图参阅图1：

1)encapsulin蛋白(核酸序列如SEQ ID No.1所示)的C端通过基因融合的方法引入int^N(gp41-1-intein^N，简写为int^N；核酸序列如SEQ ID No.2所示)、gb1(核酸序列如SEQID No.3所示)和halo(核酸序列如SEQ ID No.4所示)共3个串联蛋白形成重组蛋白(A-B)；

在本申请中的研究中，设计了4个不同的encapsulin重组蛋白，其编号为1、2、3和4，分别对应：encapsulin-int^N(核酸序列如SEQ ID No.5所示)、encapsulin-int^N-gb1(核酸序列如SEQ ID No.6所示)、halo(核酸序列如SEQ ID No.4所示)、encapsulin-int^N-halo(核酸序列如SEQ ID No.7所示)和encapsulin-int^N-gb1-halo(核酸序列如SEQ ID No.8所示)；参阅图2，encapsulin(核酸序列如SEQ ID No.1所示)与int^N(核酸序列如SEQ ID No.2所示)融合表达生成包涵体沉淀(图2a)，引入辅助溶解蛋白gb1(核酸序列如SEQ ID No.3所示)或halo(核酸序列如SEQ ID No.4所示)可使部分重组蛋白可溶。两者联合使用则显著改善重组蛋白可溶性(图2a-c)。重组蛋白4的的上清加入0.15g/mL的硫酸铵沉淀用含10％甘油的PBS重悬溶解后，可用分子排阻法进一步分离纯化(图2d-e)。用透射电镜观察目的样品，我们发现重组蛋白4自装配为球形纳米颗粒(图2e)。a：本发明设计的4个不同的encapsulin(核酸序列如SEQ ID No.1所示)重组蛋白。b：小量诱导(1.5mL)表达上述4个重组蛋白，离心弃上清后用500μL PBS重悬，超声破碎后检测重组蛋白的可溶性。all：细菌裂解液；up：细菌裂解液离心后的上清。仅有4号重组蛋白可溶性高。c：构建4个重组蛋白可溶性分析。用ImageJ软件统计all和up的蛋白条带强度，而后计算上清中蛋白的百分比。计算公式：up百分比＝(up/all)*10。百分比分析图用Graph Padprism5绘画而成。三次重复，经two-tailedt test分析发现4重组蛋白上清比例远高于2和3，表面可溶标签gb1和halo联合使用具有显著协同作用。d：12％Tricine-SDS电泳检测使用superose 6B increase分子排阻法分离纯化重组蛋白4。数字编号代表收集器的收集管编号，每个收集管收集体积为1mL。e：分子排阻法纯化重组蛋白4的紫外吸光图谱。横轴为收集体积，纵轴为紫外光在A280nm的吸光度。目的产物用箭头标示。f：透射电镜观察重组蛋白4，发现该蛋白以球形纳米颗粒形式存在。白色标尺为20nm。

2)货物蛋白由于分子量大，利于暴露至纳米颗粒表面，60个重组蛋白单体自装配成纳米颗粒，其暴露的int^N-gb1-halo(B)作为通用“适配器”，与货物重组蛋白gb1-int^C-cargo(C-D)混合后，在DTT的帮助下发生分子重组；

3)内含肽intein自我切除，形成副产物内含肽intein自我切除，形成副产物int^N-gb1-halo和gb1-int^C(A和C)，而encapsulin与cargo共价偶联，生产目的产物encapsulin-cargo(A-D)。

所述的货物蛋白cargo为GFP(核酸序列如SEQ ID No.9所示)或M44(M44 315-411aa，简写为M44核酸序列如SEQ ID No.10所示)或者strep2(核酸序列如SEQ ID No.11所示)。

具体地说：

A)基于内含肽介导蛋白编辑剪切技术在encapsulin表面高效负载GFP蛋白的方法如下，参阅图3。

首先开展体外小量剪切(总体积30μL)分析实验，探索合理的剪切条件。

a：初始反应底物浓度分别为：encapsulin-int^N-gb1-halo(核酸序列如SEQ IDNo.8所示)10μM，gb1-int^C-GFP(核酸序列如SEQ ID No.12所示)20μM。两者在室温条件下孵育2小时后，随着时间延长反应底物encapsulin-int^N-gb1-halo(核酸序列如SEQ ID No.8所示)不再明显减少，目的产物encapsulin-GFP不再增加。

b：用ImageJ计算剪切产物(spliced production)随时间变化(三次重复，各点代表值包含平均值和标准方差)。

通过计算反应底物encapsulin-int^N-gb1-halo(核酸序列如SEQ ID No.8所示)的减少量来衡量反应效率。横坐标为反应时间，纵坐标为剪切效率。计算公式为：splicedproduction＝(1-未反应底物/初始反应底物)*100。经半定量计算，2小时后反应效果高达90％以上。

c：探索不同gb1-int^C-GFP(核酸序列如SEQ ID No.12所示)浓度对反应效率的影响。

初始反应底物encapsulin-int^N-gb1-halo(核酸序列如SEQ ID No.8所示)浓度为10μM，以两倍梯度增加反应底物gb1-int^C-GFP(核酸序列如SEQ ID No.12所示)浓度，当两者比例为1:1时反应效率高于90％。再增加gb1-int^C-GFP(核酸序列如SEQ ID No.12所示)浓度不再促进更多目的产物生成。

d：用ImageJ计算剪切产物(spliced production)随反应底物浓度变化(三次重复，各点代表值包含平均值和标准方差)。

横坐标代表gb1-int^C-GFP浓度变化，纵坐标代表反应效率。剪切效率计算公式与b相同。

e：剪切2mL的反应体系(encapsulin-int^N-gb1-halo(核酸序列如SEQ ID No.8所示)浓度为10μM，gb1-int^C-GFP浓度为15μM)，室温2h后用superose 6B increase分子排阻法分离目的产物encapsulin-GFP。before：反应前，after：剪切后；不同数字代表收集管编号，每管收集1mL。

f：分子排阻法分离纯化目的产物紫外吸光图谱。

横坐标代表洗脱体积，纵坐标代表紫外光在A280nm处的吸光度变化。目的产物用箭头标示。

g：用透射电镜观察发现目的产物encapsulin-GFP维持球形纳米颗粒形状。白色标尺代表20nm。

B)基于内含肽介导蛋白编辑剪切技术在encapsulin表面高效负载2xstrep2多肽(简写为strep2)的具体方法如下，参阅图4：

先开展体外小量剪切(总体积30μL)分析实验，探索合理的剪切条件。

a：初始反应底物浓度分别为：encapsulin-int^N-gb1-halo(核酸序列如SEQ IDNo.8所示)10μM，gb1-int^C-strep2(核酸序列如SEQ ID No.13所示)30μM。两者在室温条件下孵育2小时后，随着时间延长反应底物encapsulin-int^N-gb1-halo(核酸序列如SEQ IDNo.8所示)不再明显减少，目的产物encapsulin-strep2不再增加。

b：用ImageJ计算目的产物(spliced production)随时间变化(三次重复，各点代表值包含平均值和标准方差)。

通过计算反应底物encapsulin-intein^N-gb1-halo(核酸序列如SEQ ID No.8所示)减少比例来衡量反应效率。横坐标为反应时间，纵坐标为剪切效率。计算公式为：spliced production＝(1-未反应底物/初始反应底物)*100。经半定量计算，2小时后反应效果高达90％以上。

c：探索不同gb1-int^C-strep2(核酸序列如SEQ ID No.13所示)浓度对反应效率的影响。

初始反应底物encapsulin-int^N-gb1-halo(核酸序列如SEQ ID No.8所示)浓度为10μM，逐步增加反应底物gb1-int^C-strep2(核酸序列如SEQ ID No.13所示)浓度，当两者比例为1:1时反应效率大于90％。再增加gb1-int^C-strep2(核酸序列如SEQ ID No.13所示)浓度不再促进更多目的产物生成。

横坐标代表gb1-int^C-strep2(核酸序列如SEQ ID No.13所示)浓度变化，纵坐标代表反应效率。剪切效率计算公式与b相同。

e：剪切2mL的反应体系encapsulin-int^N-gb1-halo(核酸序列如SEQ ID No.8所示)浓度为10μM，gb1-int^C-strep2(核酸序列如SEQ ID No.13所示)浓度为30μM)，室温2h后用superose 6B increase分子排阻法分离目的产物encapsulin-strep2。before：反应前，after：剪切后；不同数字代表收集管编号，每管收集1mL。

f：分子排阻法分离纯化目的产物紫外吸光图谱。横坐标代表洗脱体积，纵坐标代表紫外光在A280nm处的吸光度变化。目的产物用箭头标示。

g：用透射电镜观察发现目的产物encapsulin-strep2保持球形纳米颗粒形状。白色标尺代表20nm。

C)基于内含肽介导蛋白编辑剪切技术在encapsulin表面高效负载MCMV的M44蛋白C端氨基酸315-411(简称M44蛋白)的具体方法如下，参阅图5：

我们先开展体外小量剪切(总体积30μL)分析实验，探索合理的剪切条件。

a：初始反应底物浓度分别为：encapsulin-int^N-gb1-halo(核酸序列如SEQ IDNo.8所示)10μM，gb1-int^C-M44(核酸序列如SEQ ID No.14所示)20μM。两者在室温条件下孵育2小时后，随着时间延长反应底物encapsulin-int^N-gb1-halo(核酸序列如SEQ ID No.8所示)不再明显减少，目的产物encapsulin-M44不再增加。

b：用ImageJ计算剪切产物(spliced production)随时间变化(三次重复，各点代表值包含平均值和标准方差)。通过计算反应底物encapsulin-intein^N-gb1-halo减少比例来衡量反应效率。横坐标为反应时间，纵坐标为剪切效率。计算公式为：splicedproduction＝(1-未反应底物/初始反应底物)*100。经半定量计算，2小时后反应效果高达90％以上。

c：探索不同gb1-int^C-M44(核酸序列如SEQ ID No.14所示)浓度对反应效率的影响。

初始反应底物encapsulin-int^N-gb1-halo(核酸序列如SEQ ID No.8所示)浓度为10μM，两倍梯度逐步增加反应底物gb1-int^C-M44(核酸序列如SEQ ID No.14所示)浓度，当两者比例为1:1时反应效率高于90％。再增加gb1-int^C-M44(核酸序列如SEQ ID No.14所示)浓度不再促进更多目的产物生成。

横坐标代表gb1-int^C-M44(核酸序列如SEQ ID No.14所示)浓度变化，纵坐标代表反应效率。剪切效率计算公式与b相同。

e：剪切2mL的反应体系(encapsulin-int^N-gb1-halo(核酸序列如SEQ ID No.8所示)浓度为10μM，gb1-int^C-M44(核酸序列如SEQ ID No.14所示)浓度为15μM)，室温2h后用superose 6B increase分子排阻法分离目的产物encapsulin-M44。before：反应前，after：剪切后；不同数字代表收集管编号，每管收集1mL。

g：用透射电镜观察发现目的产物encapsulin-M44以纳米颗粒形式存在。白色标尺代表20nm。

本发明中涉及的分子排阻法分离纳米颗粒产物，均使用superose 6B increase层析柱在上海闪谱有限公司Clear-First 3000系统上开展。用12％的Tricine-SDS-PAGE电泳检测分子排阻法纯化纳米颗粒样品，取编号为7-18的收集管(每管收集体积1mL)中的样品30μL，加入10μL的4xSDS loading buffer后100℃煮样10分钟。剪切前、后上样2μL，收集管每个样品上样6μL。紫外吸光度随洗脱体积变化的图谱的横轴代表洗脱体积，纵轴代表A280nm吸光度。

本发明中涉及蛋白的诱导表达：本发明中使用的重组基因均插入pET28a载体中，转化至BL21(DE3)plysS中诱导表达。

纳米载体相关的重组蛋白涉及的基因在金斯瑞生物技术公司(南京)合成，而后用overlap的方法进行扩增。encapsulin-int^N(核酸序列如SEQ ID No.14所示)、encapsulin-int^N-gb1融合基因用NcoI和XhoI酶切位点，encapsulin-int^N-halo、encapsulin-int^N-gb1-halo(核酸序列如SEQ ID No.8所示)使用NcoI和Hind III酶切后，与相关限制性内切酶线性化的pET28a载体连接后转化至Top10感受态进行克隆扩增。单克隆经测序正确后转化至BL21(DE3)plysS诱导表达纯化。

货物分子相关融合基因gb1-intein^C-2xstrep2(简写为strep2)、gb1-intein^C-GFP和gb1-intein^C-M44亦通过overlap扩增目的基因，而后用EcoRI和XhoI作为酶切位点插入线性化的pET28a载体中，再转化至Top10扩增。halo-intein^N-gb1重组基因所用酶切位点为NcoI和XhoI，克隆构建方法同上。所有重组基因转换至BL21(DE3)plysS，在LB培养至OD为0.6-0.8时，加入0.2mM IPTG，25℃摇床培养5小时，而后4000rpm、4℃离心30分钟后，收集细菌沉淀。用30mL的PBS重悬细菌，相同条件离心后弃上清，细菌可用于下一步纯化或-80℃长期冷冻。

本发明中纳米载体相关蛋白纯化：用30mL的50mM Tris，pH 7.5，150mM NaCl(NTbuffer)重悬500mL的LB培养细菌，而后超声破碎。超声结束后，12000rpm、4℃、30分钟离心，上清转移至50mL的离心管中。加入0.15g/mL的硫酸铵固体，在4℃摇床混匀15分钟后，12000rpm、4℃、30分钟离心。弃上清，往离心管中加入10ml的含10％甘油的PBS，在4℃冷库摇床缓慢溶解沉淀产物。BCA测得encapsulin-int^N-gb1-halo(核酸序列如SEQ ID No.8所示)浓度为2.75mg/mL，可用来开展体外剪切分析或-80℃冻存。

本发明中其它蛋白纯化：所有的蛋白均采用Ni²⁺亲和层析的方法纯化细菌裂解液上清中可溶蛋白。30mL NT buffer重悬细菌后超声破碎裂解，离心后上清与1mL的N²⁺树脂在4℃摇床上混匀30分钟。非特异性结合蛋白随液体以重力方式流出。接着，加入20mL含10mM、20mM咪唑的NT buffer洗涤树脂，去掉结合不紧密蛋白。随后，加入10mL含500mM咪唑的NTbuffer洗脱。BCA法测得蛋白浓度分别为halo-intein^N-gb1:1.2mg/ml；gb1-intein^C-strep2：1.8mg/ml；gb1-intein^C-GFP：1.8mg/ml，gb1-intein^C-M44:1.92mg/ml。上述蛋白不需要透析，可直接用于内含肽介导的蛋白编辑剪切或-80℃长期冻存。

本发明中体外分析内含肽介导蛋白编辑剪切效率：本发明先在小量体积条件(30μL)下探索不同反应时间与底物浓度对反应效率的影响。初始反应底物encapsulin-int^N-gb1-halo(核酸序列如SEQ ID No.8所示)或halo-int^N-gb1核酸序列如SEQ ID No.15所示)浓度固定为10μM，gb1-int^C-cargo(cargo为GFP、strep2或M44)浓度范围为：1～30μM。探索反应时间对反应效率影响，初始反应底物浓度固定，以时间为变量，范围为1分钟-16小时，发现所有反应在4小时内完成，效率高达90％以上。探索底物浓度对反应效率的影响，固定encapsulin-int^N-gb1-halo(核酸序列如SEQ ID No.8所示)或halo-int^N-gb1核酸序列如SEQ ID No.15所示)浓度固定为10μM，逐步增加gb1-int^C-cargo浓度。当底物gb1-int^C-cargo超过10μM时，所有反应效率达最大，效率高达90％以上。所有反应均在室温(25℃左右)进行，反应溶液含2mM DTT(二硫苏糖醇)。以encapsulin-int^N-gb1-halo(核酸序列如SEQ ID No.8所示)或halo-int^N-gb1核酸序列如SEQ ID No.15所示)为目标，用ImageJ计算反应效率，公式为：(1-未反应底物/初始反应底物)*100。

实施例2

encapsulin-cargo酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)滴定货物分子相关IgG抗体滴度实验，参阅图6。

小鼠免疫及酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)滴定货物分子相关IgG抗体滴度：对5-8周龄的雌性Balb/c小鼠腹腔接种10μg的货物蛋白(GFP或M44)或纳米载体递送的货物蛋白(encapsulin-GFP或encapsulin-M44)，共接种两次，间隔两周。免疫两周后眼眶采取200μL左右血液，37℃放置30分钟后4℃放置过夜以充分析出血清。第二天5,000rpm、4℃离心30分钟，取血清。1:1000稀释血清，而后以10倍梯度稀释血清来滴定货物分子相关抗体滴度。往高吸附96孔板内加入PBS稀释的抗原，GFP蛋白每孔25ng，M44蛋白每孔50ng，4℃过夜吸附。第二天用PBST洗涤三次后加入含5％脱脂牛奶的PBS在37℃培养箱中封闭45分钟。PBST洗涤三次后加入50μL、10倍梯度稀释的抗体，37℃培养箱中孵育1小时。PBST洗涤三次后加入1:5000的HRP修饰的anti-mouse，37℃培养箱中孵育1小时。PBST洗涤三次后加入TMB显色2-5分钟，再用1M硫酸终止反应。最后在酶标仪中检测450nm处吸光值，本发明以吸光值>0.2认定为阳性。特异性抗体滴度用Graph Padprism5分组(grouped)绘画，蛋白与纳米载体递送蛋白诱导的抗体滴度相关性用Mann Whitneytest，nonparametric tests进行显著性分析。

结果：腹腔免疫小鼠10μg的蛋白抗原或纳米载体递送的抗原，接种2次，每次间隔两周。免疫两周后眼眶采血，ELISA检测抗体滴度。a：一次和两次免疫后，用纳米技术递送的encapsulin-GFP诱导GFP相关抗体滴度显著高于GFP蛋白(Mann Whitney test，nonparametric tests,p<0.01)，抗体滴度是后者的四倍。b：一次和两次免疫后，encapsulin-M44诱导M44相关抗体滴度是M44蛋白的5倍，引起免疫应答水平显著高于后者(Mann Whitney test，nonparametric tests,p<0.01)。显著性统计用Graph Padprism5进行分析。

实施例3

基于halo共价交联技术和抗原-抗体相互作用纯化货物分子相关抗体原理示意图，参阅图7。

使用的gb1-int^C-GFP或gb1-intein^C-M44可与halo-int^N-gb1核酸序列如SEQ IDNo.15所示)蛋白进行蛋白编辑剪切，生成重组蛋白halo-cargo(cargo为GFP或M44)，gb1-int^C和int^N-gb1以副产物的形式存在。反应结束后，混合物与Promega halo^TM beads混合，目的产物halo-cargo共价结合至halo^TM beads。离心弃上清后，加入免疫后的血清。货物分子相关抗体利用抗原-抗体之间高亲和相互作用与halo^TM-halo-cargo结合，其它抗体和蛋白通过离心、洗涤后分离。最后用200mM glycine pH2.8洗脱目的抗体。

上述的halo^TM-halo-GFP的制备及GFP相关抗体的纯化方法如下，参阅图8：

首先，通过体外剪切分析实验，探索合适的反应时间和底物浓度。

a：初始反应底物浓度分别为：halo-int^N-gb1核酸序列如SEQ ID No.15所示)10μM，gb1-int^C-GFP(核酸序列如SEQ ID No.12所示)20μM。两者在室温条件下孵育4小时后，随着时间延长反应底物halo-int^N-gb1核酸序列如SEQ ID No.15所示)不再明显减少，目的产物halo-GFP不再增加。

b：用ImageJ计算剪切产物(spliced production)随时间变化(三次重复，各点代表值包含平均值和标准方差)。通过计算反应底物halo-int^N-gb1核酸序列如SEQ ID No.15所示)减少比例来衡量反应效率。横坐标为反应时间，纵坐标为剪切效率。计算公式为：spliced production＝(1-未反应底物/初始反应底物)*100。经半定量计算，4小时后反应效果高达90％以上。

c：探索不同gb1-int^C-GFP(核酸序列如SEQ ID No.12所示)浓度对反应效率的影响。初始反应底物halo-intein^N-gb1浓度为10μM，两倍梯度逐步增加反应底物gb1-int^C-GFP浓度，当两者比例为1:1时反应效率达高于90％。再增加gb1-int^C-GFP浓度不再促进更多目的产物生成。

d：用ImageJ计算目的产物(spliced production)随反应底物浓度变化(三次重复，各点代表值包含平均值和标准方差)。横坐标代表gb1-int^C-GFP浓度变化，纵坐标代表反应效率。剪切效率计算公式与b相同。

e：12％Tricine-SDS-PAGE电泳分析halo-GFP与Promega halo^TM结合。室温孵育(halo-int^N-gb1核酸序列如SEQ ID No.15所示)浓度为10μM，gb1-int^C-GFP(核酸序列如SEQID No.12所示)浓度为20μM)4小时后，250μL反应液与50μL平衡好的Promega halo^TM室温摇床混合半个小时。而后离心，用500μL PBS洗涤beads，除去非特异性结合蛋白。before：剪切前；after：剪切后；flow：反应液与Promega halo^TM混合后离心上清；wash1-wash3：3次PBS洗涤液。结果表明目的蛋白halo-GFP特异性结合至Promega halo^TM beads。

f：12％Tricine-SDS-PAGE检测用新制备的halo^TM-halo-GFP从血清中分离纯化GFP相关蛋白。input：免疫2次后的血清；flow：血清与halo^TM-halo-GFP孵育后的流出；wash1-wash3：用500μL PBST洗涤halo^TM-halo-GFP；elution：90μL的200mM glycine pH2.8洗脱目的抗体(EP管提前添加10μL 1M Tris，pH9.0缓冲液以保护抗体)。

上述的halo^TM-halo-M44的制备及M44相关抗体的纯化方法为，参阅图9：

首先，体外剪切分析实验，探索合适的反应时间和底物浓度。

a：初始反应底物浓度分别为：halo-int^N-gb1核酸序列如SEQ ID No.15所示)10μM，gb1-int^C-M44(核酸序列如SEQ ID No.14所示)20μM。两者在室温条件下孵育2小时后，随着时间延长反应底物halo-int^N-gb1核酸序列如SEQ ID No.15所示)不再明显减少，目的产物halo-GFP不再增加。

b：用ImageJ计算目的产物(spliced production)随时间变化(三次重复，各点代表值包含平均值和标准方差)。通过计算反应底物halo-int^N-gb1核酸序列如SEQ ID No.15所示)减少比例来衡量反应效率。横坐标为反应时间，纵坐标为剪切效率。计算公式为：spliced production＝(1-未反应底物/初始反应底物)*100。经半定量计算，2小时后反应效果高达90％以上。

c：探索不同gb1-int^C-M44(核酸序列如SEQ ID No.14所示)浓度对反应效率的影响。初始反应底物halo-intein^N-gb1浓度为10μM，两倍梯度逐步增加反应底物gb1-int^C-M44(核酸序列如SEQ ID No.14所示)浓度，当两者比例为1:1时反应效率达最大。再增加gb1-int^C-M44(核酸序列如SEQ ID No.14所示)浓度不再促进更多目的产物生成。

d：用ImageJ计算目的产物(spliced production)随反应底物浓度变化(三次重复，各点代表值包含平均值和标准方差)。横坐标代表gb1-int^C-M44(核酸序列如SEQ IDNo.14所示)浓度变化，纵坐标代表反应效率。剪切效率计算公式与b相同。

e：12％Tricine-SDS-PAGE电泳分析halo-M44与Promega halo^TM结合。室温孵育(halo-int^N-gb1核酸序列如SEQ ID No.15所示)浓度为10μM，gb1-int^C-M44(核酸序列如SEQID No.14所示)浓度为20μM)4小时后，250μL反应液与50μL平衡好的Promega halo^TM室温摇床混合半个小时。而后离心，用500μL PBS洗涤beads，除去非特异性结合蛋白。before：剪切前；after：剪切后；flow：反应液与Promega halo^TM混合后离心上清；wash1-wash3：3次PBS洗涤液。结果显示目的蛋白halo-GFP特异性结合至Promega halo^TM beads。

f：12％Tricine-SDS-PAGE检测用新制备的halo^TM-halo-M44从血清中分离纯化M44相关蛋白。input：免疫2次后的血清；flow：血清与halo^TM-halo-M44孵育后的流出；wash1-wash3：用500μL PBST洗涤halo^TM-halo-M44；elution：90μL的200mM glycine pH2.8洗脱目的抗体(EP管提前添加10μL 1M Tris，pH9.0缓冲液以保护抗体)。

其中：halo-GFP或halo-M44与Promega halo^TM的共价交联：250μL的halo-int^N-gb1核酸序列如SEQ ID No.15所示)(10μM)与gb1-int^C-GFP/M44(20μM)室温孵育4小时后，加入用PBS平衡好的50μL Promega halo^TMbeads室温摇床混合半个小时。而后离心弃上清，再用500μL PBS洗涤三次即可完成halo^TM-halo-GFP/M44的制备。最后用500μL PBS保存halo^TM-halo-GFP/M44，4℃放置。

7.基于抗原-抗体相互作用纯化目的抗体：弃halo^TM-halo-GFP/M44的PBS保存液，加入12,000rpm、4℃离心10分钟的血清，4℃摇床混匀1小时后离心弃上清。加入1ml的PBST洗涤3次除去非特定结合蛋白或抗体，最后加入90μL的200mM glycine pH2.8洗脱目的抗体。在新的EP管中加入10μL 1M Tris，pH 9.0，而加入抗体洗脱液。halo^TM-halo-GFP/M44可反复使用，4℃放置2个月仍稳定。

用western blotting(WB)分析新纯化的GFP和M44相关抗体的功能。用pLKO载体在293T细胞中过量表达GFP蛋白和M44蛋白，而后用新纯化的GFP和M44抗体检测到特异的GFP(a)和M44(b)条带，表明新制备的抗体可用于WB分析，参阅图10。在293T细胞中用pLKO载体过表达3xflag-GFP蛋白，用本发明制备的GFP抗体(鼠源anti-GFP)和flag抗体(兔源anti-flag)均能特异识别GFP蛋白。相应的二抗anti-mouse(带555nm荧光素标记)和anti-rabbit(带647nm荧光素标记)所发荧光与GFP蛋白本身的荧光位置高度重合，且强度相若。免疫荧光(immunofluorescence，IF)分析表明本发明制备的抗体特异性高，可用于IF检测，参阅图11。用MCMV(带有荧光标记的SMgfp)以病毒感染复数(multiplicity of infection，MOI)为1感染MEF10.1细胞，24小时IF分析发现本发明制备的M44相关抗体可识别病毒的复制中心(M44为MCMV复制中心marker)，参阅图12。综合而言，本发明制备的抗体可用于WB和IF分析。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 广州市妇女儿童医疗中心

<120> 一种基于内含肽介导纳米载体及其应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 279

<212> PRT

<213> encapsulin

<400> 1

Glu Phe Leu Lys Arg Ser Phe Ala Pro Leu Thr Glu Lys Gln Trp Gln

1 5 10 15

Glu Ile Asp Asn Arg Ala Arg Glu Ile Phe Lys Thr Gln Leu Tyr Gly

20 25 30

Arg Lys Phe Val Asp Val Glu Gly Pro Gly Gly Gly Gly Gly His His

35 40 45

His His His His Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Trp Glu Tyr Ala Ala

50 55 60

His Pro Leu Gly Glu Val Glu Val Leu Ser Asp Glu Asn Glu Val Val

65 70 75 80

Lys Trp Gly Leu Arg Lys Ser Leu Pro Leu Ile Glu Leu Arg Ala Thr

85 90 95

Phe Thr Leu Asp Leu Trp Glu Leu Asp Asn Leu Glu Arg Gly Lys Pro

100 105 110

Asn Val Asp Leu Ser Ser Leu Glu Glu Thr Val Arg Lys Val Ala Glu

115 120 125

Phe Glu Asp Glu Val Ile Phe Arg Gly Cys Glu Lys Ser Gly Val Lys

130 135 140

Gly Leu Leu Ser Phe Glu Glu Arg Lys Ile Glu Cys Gly Ser Thr Pro

145 150 155 160

Lys Asp Leu Leu Glu Ala Ile Val Arg Ala Leu Ser Ile Phe Ser Lys

165 170 175

Asp Gly Ile Glu Gly Pro Tyr Thr Leu Val Ile Asn Thr Asp Arg Trp

180 185 190

Ile Asn Phe Leu Lys Glu Glu Ala Gly His Tyr Pro Leu Glu Lys Arg

195 200 205

Val Glu Glu Ser Leu Arg Gly Gly Lys Ile Ile Thr Thr Pro Arg Ile

210 215 220

Glu Asp Ala Leu Val Val Ser Glu Arg Gly Gly Asp Phe Lys Leu Ile

225 230 235 240

Leu Gly Gln Asp Leu Ser Ile Gly Tyr Glu Asp Arg Glu Lys Asp Ala

245 250 255

Val Arg Leu Phe Ile Thr Glu Thr Phe Thr Phe Gln Val Val Asn Pro

260 265 270

Glu Ala Leu Ile Leu Leu Lys

275

<210> 2

<211> 93

<212> PRT

<213> encapsulin

<400> 2

Thr Arg Ser Gly Tyr Cys Leu Asp Leu Lys Thr Gln Val Gln Thr Pro

1 5 10 15

Gln Gly Met Lys Glu Ile Ser Asn Ile Gln Val Gly Asp Leu Val Leu

20 25 30

Ser Asn Thr Gly Tyr Asn Glu Val Leu Asn Val Phe Pro Lys Ser Lys

35 40 45

Lys Lys Ser Tyr Lys Ile Thr Leu Glu Asp Gly Lys Glu Ile Ile Cys

50 55 60

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65 70 75 80

Gly Gly Leu Lys Glu Gly Met Cys Leu Tyr Val Lys Glu

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<210> 3

<211> 56

<212> PRT

<213> encapsulin

<400> 3

Gln Tyr Lys Leu Ile Leu Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr

1 5 10 15

Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln Tyr

20 25 30

Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr

35 40 45

Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Lys

50 55

<210> 4

<211> 296

<212> PRT

<213> encapsulin

<400> 4

Ala Glu Ile Gly Thr Gly Phe Pro Phe Asp Pro His Tyr Val Glu Val

1 5 10 15

Leu Gly Glu Arg Met His Tyr Val Asp Val Gly Pro Arg Asp Gly Thr

20 25 30

Pro Val Leu Phe Leu His Gly Asn Pro Thr Ser Ser Tyr Val Trp Arg

35 40 45

Asn Ile Ile Pro His Val Ala Pro Thr His Arg Cys Ile Ala Pro Asp

50 55 60

Leu Ile Gly Met Gly Lys Ser Asp Lys Pro Asp Leu Gly Tyr Phe Phe

65 70 75 80

Asp Asp His Val Arg Phe Met Asp Ala Phe Ile Glu Ala Leu Gly Leu

85 90 95

Glu Glu Val Val Leu Val Ile His Asp Trp Gly Ser Ala Leu Gly Phe

100 105 110

His Trp Ala Lys Arg Asn Pro Glu Arg Val Lys Gly Ile Ala Phe Met

115 120 125

Glu Phe Ile Arg Pro Ile Pro Thr Trp Asp Glu Trp Pro Glu Phe Ala

130 135 140

Arg Glu Thr Phe Gln Ala Phe Arg Thr Thr Asp Val Gly Arg Lys Leu

145 150 155 160

Ile Ile Asp Gln Asn Val Phe Ile Glu Gly Thr Leu Pro Met Gly Val

165 170 175

Val Arg Pro Leu Thr Glu Val Glu Met Asp His Tyr Arg Glu Pro Phe

180 185 190

Leu Asn Pro Val Asp Arg Glu Pro Leu Trp Arg Phe Pro Asn Glu Leu

195 200 205

Pro Ile Ala Gly Glu Pro Ala Asn Ile Val Ala Leu Val Glu Glu Tyr

210 215 220

Met Asp Trp Leu His Gln Ser Pro Val Pro Lys Leu Leu Phe Trp Gly

225 230 235 240

Thr Pro Gly Val Leu Ile Pro Pro Ala Glu Ala Ala Arg Leu Ala Lys

245 250 255

Ser Leu Pro Asn Cys Lys Ala Val Asp Ile Gly Pro Gly Leu Phe Leu

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Leu Gln Glu Asp Asn Pro Asp Leu Ile Gly Ser Glu Ile Ala Arg Trp

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290 295

<210> 5

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<212> PRT

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Met Glu Phe Leu Lys Arg Ser Phe Ala Pro Leu Thr Glu Lys Gln Trp

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Gly Arg Lys Phe Val Asp Val Glu Gly Pro Gly Gly Gly Gly Gly His

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100 105 110

Pro Asn Val Asp Leu Ser Ser Leu Glu Glu Thr Val Arg Lys Val Ala

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Glu Phe Glu Asp Glu Val Ile Phe Arg Gly Cys Glu Lys Ser Gly Val

130 135 140

Lys Gly Leu Leu Ser Phe Glu Glu Arg Lys Ile Glu Cys Gly Ser Thr

145 150 155 160

Pro Lys Asp Leu Leu Glu Ala Ile Val Arg Ala Leu Ser Ile Phe Ser

165 170 175

Lys Asp Gly Ile Glu Gly Pro Tyr Thr Leu Val Ile Asn Thr Asp Arg

180 185 190

Trp Ile Asn Phe Leu Lys Glu Glu Ala Gly His Tyr Pro Leu Glu Lys

195 200 205

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210 215 220

Ile Glu Asp Ala Leu Val Val Ser Glu Arg Gly Gly Asp Phe Lys Leu

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Ile Leu Gly Gln Asp Leu Ser Ile Gly Tyr Glu Asp Arg Glu Lys Asp

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Pro Glu Ala Leu Ile Leu Leu Lys Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

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Gly Gly Leu Lys Glu Gly Met Cys Leu Tyr Val Lys Glu Leu Glu His

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<210> 6

<211> 457

<212> PRT

<213> encapsulin

<400> 6

Met Glu Phe Leu Lys Arg Ser Phe Ala Pro Leu Thr Glu Lys Gln Trp

1 5 10 15

Gln Glu Ile Asp Asn Arg Ala Arg Glu Ile Phe Lys Thr Gln Leu Tyr

20 25 30

Gly Arg Lys Phe Val Asp Val Glu Gly Pro Gly Gly Gly Gly Gly His

35 40 45

His His His His His Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Trp Glu Tyr Ala

50 55 60

Ala His Pro Leu Gly Glu Val Glu Val Leu Ser Asp Glu Asn Glu Val

65 70 75 80

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100 105 110

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Glu Phe Glu Asp Glu Val Ile Phe Arg Gly Cys Glu Lys Ser Gly Val

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Lys Gly Leu Leu Ser Phe Glu Glu Arg Lys Ile Glu Cys Gly Ser Thr

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<211> 702

<212> PRT

<213> encapsulin

<400> 7

Met Glu Phe Leu Lys Arg Ser Phe Ala Pro Leu Thr Glu Lys Gln Trp

1 5 10 15

Gln Glu Ile Asp Asn Arg Ala Arg Glu Ile Phe Lys Thr Gln Leu Tyr

20 25 30

Gly Arg Lys Phe Val Asp Val Glu Gly Pro Gly Gly Gly Gly Gly His

35 40 45

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50 55 60

Ala His Pro Leu Gly Glu Val Glu Val Leu Ser Asp Glu Asn Glu Val

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Thr Phe Thr Leu Asp Leu Trp Glu Leu Asp Asn Leu Glu Arg Gly Lys

100 105 110

Pro Asn Val Asp Leu Ser Ser Leu Glu Glu Thr Val Arg Lys Val Ala

115 120 125

Glu Phe Glu Asp Glu Val Ile Phe Arg Gly Cys Glu Lys Ser Gly Val

130 135 140

Lys Gly Leu Leu Ser Phe Glu Glu Arg Lys Ile Glu Cys Gly Ser Thr

145 150 155 160

Pro Lys Asp Leu Leu Glu Ala Ile Val Arg Ala Leu Ser Ile Phe Ser

165 170 175

Lys Asp Gly Ile Glu Gly Pro Tyr Thr Leu Val Ile Asn Thr Asp Arg

180 185 190

Trp Ile Asn Phe Leu Lys Glu Glu Ala Gly His Tyr Pro Leu Glu Lys

195 200 205

Arg Val Glu Glu Ser Leu Arg Gly Gly Lys Ile Ile Thr Thr Pro Arg

210 215 220

Ile Glu Asp Ala Leu Val Val Ser Glu Arg Gly Gly Asp Phe Lys Leu

225 230 235 240

Ile Leu Gly Gln Asp Leu Ser Ile Gly Tyr Glu Asp Arg Glu Lys Asp

245 250 255

Ala Val Arg Leu Phe Ile Thr Glu Thr Phe Thr Phe Gln Val Val Asn

260 265 270

Pro Glu Ala Leu Ile Leu Leu Lys Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

275 280 285

Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala Thr Arg Ser Gly

290 295 300

Tyr Cys Leu Asp Leu Lys Thr Gln Val Gln Thr Pro Gln Gly Met Lys

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Glu Ile Ser Asn Ile Gln Val Gly Asp Leu Val Leu Ser Asn Thr Gly

325 330 335

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340 345 350

Lys Ile Thr Leu Glu Asp Gly Lys Glu Ile Ile Cys Ser Glu Glu His

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Glu Gly Met Cys Leu Tyr Val Lys Glu Ala Glu Ile Gly Thr Gly Phe

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Pro Phe Asp Pro His Tyr Val Glu Val Leu Gly Glu Arg Met His Tyr

405 410 415

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660 665 670

Leu Ile Gly Ser Glu Ile Ala Arg Trp Leu Ser Thr Leu Glu Ile Ser

675 680 685

Gly Lys Leu Ala Ala Ala Leu Glu His His His His His His

690 695 700

<210> 8

<211> 764

<212> PRT

<213> encapsulin

<400> 8

Met Glu Phe Leu Lys Arg Ser Phe Ala Pro Leu Thr Glu Lys Gln Trp

1 5 10 15

Gln Glu Ile Asp Asn Arg Ala Arg Glu Ile Phe Lys Thr Gln Leu Tyr

20 25 30

Gly Arg Lys Phe Val Asp Val Glu Gly Pro Gly Gly Gly Gly Gly His

35 40 45

His His His His His Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Gly Trp Glu Tyr Ala

50 55 60

Ala His Pro Leu Gly Glu Val Glu Val Leu Ser Asp Glu Asn Glu Val

65 70 75 80

Val Lys Trp Gly Leu Arg Lys Ser Leu Pro Leu Ile Glu Leu Arg Ala

85 90 95

Thr Phe Thr Leu Asp Leu Trp Glu Leu Asp Asn Leu Glu Arg Gly Lys

100 105 110

Pro Asn Val Asp Leu Ser Ser Leu Glu Glu Thr Val Arg Lys Val Ala

115 120 125

Glu Phe Glu Asp Glu Val Ile Phe Arg Gly Cys Glu Lys Ser Gly Val

130 135 140

Lys Gly Leu Leu Ser Phe Glu Glu Arg Lys Ile Glu Cys Gly Ser Thr

145 150 155 160

Pro Lys Asp Leu Leu Glu Ala Ile Val Arg Ala Leu Ser Ile Phe Ser

165 170 175

Lys Asp Gly Ile Glu Gly Pro Tyr Thr Leu Val Ile Asn Thr Asp Arg

180 185 190

Trp Ile Asn Phe Leu Lys Glu Glu Ala Gly His Tyr Pro Leu Glu Lys

195 200 205

Arg Val Glu Glu Ser Leu Arg Gly Gly Lys Ile Ile Thr Thr Pro Arg

210 215 220

Ile Glu Asp Ala Leu Val Val Ser Glu Arg Gly Gly Asp Phe Lys Leu

225 230 235 240

Ile Leu Gly Gln Asp Leu Ser Ile Gly Tyr Glu Asp Arg Glu Lys Asp

245 250 255

Ala Val Arg Leu Phe Ile Thr Glu Thr Phe Thr Phe Gln Val Val Asn

260 265 270

Pro Glu Ala Leu Ile Leu Leu Lys Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

275 280 285

Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala Thr Arg Ser Gly

290 295 300

Tyr Cys Leu Asp Leu Lys Thr Gln Val Gln Thr Pro Gln Gly Met Lys

305 310 315 320

Glu Ile Ser Asn Ile Gln Val Gly Asp Leu Val Leu Ser Asn Thr Gly

325 330 335

Tyr Asn Glu Val Leu Asn Val Phe Pro Lys Ser Lys Lys Lys Ser Tyr

340 345 350

Lys Ile Thr Leu Glu Asp Gly Lys Glu Ile Ile Cys Ser Glu Glu His

355 360 365

Leu Phe Pro Thr Gln Thr Gly Glu Met Asn Ile Ser Gly Gly Leu Lys

370 375 380

Glu Gly Met Cys Leu Tyr Val Lys Glu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

385 390 395 400

Gln Tyr Lys Leu Ile Leu Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr

405 410 415

Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln Tyr

420 425 430

Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr

435 440 445

Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Lys Glu Ile Gly Thr Gly Phe Pro Phe

450 455 460

Asp Pro His Tyr Val Glu Val Leu Gly Glu Arg Met His Tyr Val Asp

465 470 475 480

Val Gly Pro Arg Asp Gly Thr Pro Val Leu Phe Leu His Gly Asn Pro

485 490 495

Thr Ser Ser Tyr Val Trp Arg Asn Ile Ile Pro His Val Ala Pro Thr

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His Arg Cys Ile Ala Pro Asp Leu Ile Gly Met Gly Lys Ser Asp Lys

515 520 525

Pro Asp Leu Gly Tyr Phe Phe Asp Asp His Val Arg Phe Met Asp Ala

530 535 540

Phe Ile Glu Ala Leu Gly Leu Glu Glu Val Val Leu Val Ile His Asp

545 550 555 560

Trp Gly Ser Ala Leu Gly Phe His Trp Ala Lys Arg Asn Pro Glu Arg

565 570 575

Val Lys Gly Ile Ala Phe Met Glu Phe Ile Arg Pro Ile Pro Thr Trp

580 585 590

Asp Glu Trp Pro Glu Phe Ala Arg Glu Thr Phe Gln Ala Phe Arg Thr

595 600 605

Thr Asp Val Gly Arg Lys Leu Ile Ile Asp Gln Asn Val Phe Ile Glu

610 615 620

Gly Thr Leu Pro Met Gly Val Val Arg Pro Leu Thr Glu Val Glu Met

625 630 635 640

Asp His Tyr Arg Glu Pro Phe Leu Asn Pro Val Asp Arg Glu Pro Leu

645 650 655

Trp Arg Phe Pro Asn Glu Leu Pro Ile Ala Gly Glu Pro Ala Asn Ile

660 665 670

Val Ala Leu Val Glu Glu Tyr Met Asp Trp Leu His Gln Ser Pro Val

675 680 685

Pro Lys Leu Leu Phe Trp Gly Thr Pro Gly Val Leu Ile Pro Pro Ala

690 695 700

Glu Ala Ala Arg Leu Ala Lys Ser Leu Pro Asn Cys Lys Ala Val Asp

705 710 715 720

Ile Gly Pro Gly Leu Phe Leu Leu Gln Glu Asp Asn Pro Asp Leu Ile

725 730 735

Gly Ser Glu Ile Ala Arg Trp Leu Ser Thr Leu Glu Ile Ser Gly Lys

740 745 750

Leu Ala Ala Ala Leu Glu His His His His His His

755 760

<210> 9

<211> 241

<212> PRT

<213> encapsulin

<400> 9

Gly Ser Gly Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro

1 5 10 15

Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val

20 25 30

Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys

35 40 45

Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val

50 55 60

Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His

65 70 75 80

Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val

85 90 95

Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg

100 105 110

Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu

115 120 125

Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu

130 135 140

Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln

145 150 155 160

Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp

165 170 175

Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly

180 185 190

Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser

195 200 205

Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu

210 215 220

Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr

225 230 235 240

Lys

<210> 10

<211> 104

<212> PRT

<213> encapsulin

<400> 10

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Thr Lys Lys His Glu Arg Val Ser Arg

1 5 10 15

Lys Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Val Val Val Asn Asp

20 25 30

Asp His Gln Gly Gly Gly Gly Ser Gly Lys Asp Asn Lys Tyr Asp Gln

35 40 45

His Lys Ile Thr Ser Phe Met Val Ser Lys Gly Ala Val Gly Gly Gly

50 55 60

Ala Gly Gly Gly Gly Ser Asp Arg Gly Gly Tyr Phe Asn Asp Thr Lys

65 70 75 80

Glu Glu Ser Asp Ser Glu Asp Ser Val Thr Phe Glu Tyr Thr Pro Asn

85 90 95

Thr Lys Lys Gln Lys Cys Ala Ala

100

<210> 11

<211> 22

<212> PRT

<213> encapsulin

<400> 11

Gly Ser Gly Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ser Gly Trp Ser

1 5 10 15

His Pro Gln Phe Glu Lys

20

<210> 12

<211> 375

<212> PRT

<213> encapsulin

<400> 12

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg

20 25 30

Gly Ser Glu Phe Gln Tyr Lys Leu Ile Leu Asn Gly Lys Thr Leu Lys

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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Ser Ser Ser Ser Asp Val Gly Ser Gly Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu

130 135 140

Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn

145 150 155 160

Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr

165 170 175

Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val

180 185 190

Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe

195 200 205

Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala

210 215 220

Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp

225 230 235 240

Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu

245 250 255

Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn

260 265 270

Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr

275 280 285

Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile

290 295 300

Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln

305 310 315 320

Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His

325 330 335

Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg

340 345 350

Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu

355 360 365

Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

370 375

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<211> 156

<212> PRT

<213> encapsulin

<400> 13

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Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg

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Gly Ser Glu Phe Gln Tyr Lys Leu Ile Leu Asn Gly Lys Thr Leu Lys

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Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val

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Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr

65 70 75 80

Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Lys Met Leu Lys Lys

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115 120 125

Ser Ser Ser Ser Asp Val Gly Ser Gly Trp Ser His Pro Gln Phe Glu

130 135 140

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145 150 155

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<211> 238

<212> PRT

<213> encapsulin

<400> 14

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg

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Gly Ser Glu Phe Gln Tyr Lys Leu Ile Leu Asn Gly Lys Thr Leu Lys

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Ser Ser Ser Ser Asp Val Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Thr Lys Lys

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Gly Val Val Val Asn Asp Asp His Gln Gly Gly Gly Gly Ser Gly Lys

165 170 175

Asp Asn Lys Tyr Asp Gln His Lys Ile Thr Ser Phe Met Val Ser Lys

180 185 190

Gly Ala Val Gly Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser Asp Arg Gly Gly

195 200 205

Tyr Phe Asn Asp Thr Lys Glu Glu Ser Asp Ser Glu Asp Ser Val Thr

210 215 220

Phe Glu Tyr Thr Pro Asn Thr Lys Lys Gln Lys Cys Ala Ala

225 230 235

<210> 15

<211> 453

<212> PRT

<213> encapsulin

<400> 15

Met Glu Ile Gly Thr Gly Phe Pro Phe Asp Pro His Tyr Val Glu Val

1 5 10 15

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20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

Leu Ile Gly Met Gly Lys Ser Asp Lys Pro Asp Leu Gly Tyr Phe Phe

65 70 75 80

Asp Asp His Val Arg Phe Met Asp Ala Phe Ile Glu Ala Leu Gly Leu

85 90 95

Glu Glu Val Val Leu Val Ile His Asp Trp Gly Ser Ala Leu Gly Phe

100 105 110

His Trp Ala Lys Arg Asn Pro Glu Arg Val Lys Gly Ile Ala Phe Met

115 120 125

Glu Phe Ile Arg Pro Ile Pro Thr Trp Asp Glu Trp Pro Glu Phe Ala

130 135 140

Arg Glu Thr Phe Gln Ala Phe Arg Thr Thr Asp Val Gly Arg Lys Leu

145 150 155 160

Ile Ile Asp Gln Asn Val Phe Ile Glu Gly Thr Leu Pro Met Gly Val

165 170 175

Val Arg Pro Leu Thr Glu Val Glu Met Asp His Tyr Arg Glu Pro Phe

180 185 190

Leu Asn Pro Val Asp Arg Glu Pro Leu Trp Arg Phe Pro Asn Glu Leu

195 200 205

Pro Ile Ala Gly Glu Pro Ala Asn Ile Val Ala Leu Val Glu Glu Tyr

210 215 220

Met Asp Trp Leu His Gln Ser Pro Val Pro Lys Leu Leu Phe Trp Gly

225 230 235 240

Thr Pro Gly Val Leu Ile Pro Pro Ala Glu Ala Ala Arg Leu Ala Lys

245 250 255

Ser Leu Pro Asn Cys Lys Ala Val Asp Ile Gly Pro Gly Leu Phe Leu

260 265 270

Leu Gln Glu Asp Asn Pro Asp Leu Ile Gly Ser Glu Ile Ala Arg Trp

275 280 285

Leu Ser Thr Leu Glu Ile Ser Gly Thr Arg Ser Gly Tyr Cys Leu Asp

290 295 300

Leu Lys Thr Gln Val Gln Thr Pro Gln Gly Met Lys Glu Ile Ser Asn

305 310 315 320

Ile Gln Val Gly Asp Leu Val Leu Ser Asn Thr Gly Tyr Asn Glu Val

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Leu Asn Val Phe Pro Lys Ser Lys Lys Lys Ser Tyr Lys Ile Thr Leu

340 345 350

Glu Asp Gly Lys Glu Ile Ile Cys Ser Glu Glu His Leu Phe Pro Thr

355 360 365

Gln Thr Gly Glu Met Asn Ile Ser Gly Gly Leu Lys Glu Gly Met Cys

370 375 380

Leu Tyr Val Lys Glu Gln Tyr Lys Leu Ile Leu Asn Gly Lys Thr Leu

385 390 395 400

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405 410 415

Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr

420 425 430

Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Lys Leu Glu His

435 440 445

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450

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<211> 42

<212> PRT

<213> encapsulin

<400> 16

Met Leu Lys Lys Ile Leu Lys Ile Glu Glu Leu Asp Glu Arg Glu Leu

1 5 10 15

Ile Asp Ile Glu Val Ser Gly Asn His Leu Phe Tyr Ala Asn Asp Ile

20 25 30

Leu Thr His Asn Ser Ser Ser Ser Asp Val

35 40

Claims

1.一种基于内含肽介导的纳米载体，其特征在于，所述的纳米载体是通过下述步骤构建的：

1)encapsulin蛋白的C端通过基因融合的方法引入int^N、gb1和halo共3个串联蛋白形成重组蛋白encapsulin-int^N-gb1-halo；

2.根据权利要求1所述的一种基于内含肽介导的纳米载体，其特征在于，所述的cargo为GFP或M44或者strep2。

3.根据权利要求2所述的一种基于内含肽介导的纳米载体，其特征在于，步骤3)为encapsulin-int^N-gb1-halo和gb1-int^C-GFP按照浓度比例为1:1-2，两者在室温条件下孵育2小时后，用superose 6B increase分子排阻法分离目的产物encapsulin-GFP。

4.根据权利要求2所述的一种基于内含肽介导的纳米载体，其特征在于，步骤3)为encapsulin-int^N-gb1-halo和gb1-int^C-strep2按照浓度比例为1:1-3，两者在室温条件下孵育2小时后，用superose 6B increase分子排阻法分离目的产物encapsulin-strep2。

5.根据权利要求2所述的一种基于内含肽介导的纳米载体，其特征在于，步骤2)为encapsulin-int^N-gb1-halo和gb1-int^C-M44按照浓度比例为1:1-2，两者在室温条件下孵育2小时后，用superose 6B increase分子排阻法分离目的产物encapsulin-M44。

6.权利要求1所述的纳米载体作为递送权利要求1所述的货物蛋白，接种小鼠诱导高滴度特异性抗体的应用。

7.根据权利要求6所述的纳米载体作为递送权利要求1所述的货物蛋白，接种小鼠诱导高滴度特异性抗体的应用，其特征在于，所述的抗体的纯化方法为：

2)反应结束后，混合物与Promega halo^TM beads混合，目的产物halo-cargo共价结合至halo^TM beads，离心弃上清后，加入免疫后的血清，货物分子相关抗体利用抗原-抗体之间高亲和相互作用与halo^TM-halo-cargo结合，其它抗体和蛋白通过离心、洗涤后分离，最后用200mM glycine pH2.8洗脱目的抗体。

8.根据权利要求7所述纳米载体作为递送权利要求1所述的货物蛋白，接种小鼠诱导高滴度特异性抗体的应用，其特征在于，所述的halo^TM-halo-GFP的制备与纯化方法为：将halo-int^N-gb1和gb1-int^C-GFP按照浓度比1：1-2在室温条件下孵育4小时后，将250μL反应液与50μL平衡好的Promega halo^TM室温摇床混合半个小时后离心，用500μL PBS洗涤beads，除去非特异性结合蛋白；免疫2次后的血清；血清与halo^TM-halo-GFP孵育后的流出；先用500μL PBST洗涤halo^TM-halo-GFP；再90μL的200mM glycine pH2.8洗脱目的抗体。

9.根据权利要求6所述纳米载体作为递送权利要求1所述的货物蛋白，接种小鼠诱导高滴度特异性抗体的应用，其特征在于，所述的halo^TM-halo-M44的制备及M44相关抗体的纯化方法为：将halo-int^N-gb1和gb1-int^C-M44按照浓度比1：1-2在室温条件下孵育2-4小时后，250μL反应液与50μL平衡好的Promega halo^TM室温摇床混合半个小时，而后离心，用500μLPBS洗涤beads，除去非特异性结合蛋白，反应液与Promega halo^TM混合后离心上清；PBS洗涤液洗涤3次，使得目的蛋白halo-GFP特异性结合至Promega halo^TM beads；免疫2次后的血清；血清与halo^TM-halo-M44孵育后的流出；先用500μL PBST洗涤halo^TM-halo-M44；再90μL的200mM glycine pH2.8洗脱目的抗体。

10.根据权利要求6所述的纳米载体作为递送权利要求1所述的货物蛋白，接种小鼠诱导高滴度特异性抗体的应用，其特征在于，诱导后的抗体用于WB和/或IF分析。