CN113527476A - 抗h5亚型禽流感病毒新纳米抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗H5亚型禽流感病毒新纳米抗体及其应用，所述抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。并将抗体基因通过连接肽与麦芽糖结合蛋白(MBP)基因连接，构建表达载体，诱导融合蛋白表达，来促进抗H5禽流感病毒纳米抗体融合蛋白在表达系统中的可溶表达，从而解决了抗H5禽流感纳米抗体蛋白在原核系统呈不可溶的难题，提高了准确性和重复性。可用于探测、诊断、预防或治疗禽流感病毒，特别是H5亚型禽流感病毒。对鸡H5禽流感的监测具有重大的意义。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种抗H5亚型禽流感病毒新纳米抗体及其应用。
背景技术
禽流感病毒(AIV)属于正黏病毒科正黏病毒属，是一类有包膜的单股负链分节段RNA病毒，根据流感病毒核衣壳蛋(NP)和基质蛋白(M)的不同分为A、B和C型，国内又称甲、乙和丙型。根据血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原性差异，甲型流感病毒可分为不同的亚型。到目前为止，已有17种抗原上不同的甲型流感血凝素亚型，它们被进一步归类为第一组或第二组血凝素(第一组：H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、H16和H17病毒；第二组：H3、H4、H7、H10、H14、H15病毒)。
血凝素(HA)作为一种糖蛋白三聚体存在于细胞表面流感病毒粒子的表面。每个HA单体最初表达为HA0，随后被宿主蛋白酶裂解成HA1和HA2亚基，通过二硫键连接。HA可分为球状头(HA1)和茎(部分HA1与全部HA2)两个区域，头部HA1相对茎部HA2较为容易发生突变，头部区域包含调节病毒与宿主底物结合能力的受体结合位点，针对该区域的抗体可以阻断受体结合，并被认为具有中和作用。而茎部相对保守，针对柄的抗体更可能存在交叉反应，因此茎部是广谱中和抗体的潜在靶点。
H5是由甲型流感病毒引起的一种禽类烈性传染病，我国将其列为一类动物疫病，其潜伏期短，发病急剧，发病率和死亡率高。甲型流感病毒由8个基因节段构成，当不同的流感感染同一个细胞时会出现基因节段随机交换重组，也叫重配，导致流感抗原性转变，出现新的亚型和致病力的改变。近5年来，H5亚型AIV的基因分化速度快，出现多个亚分支，增加了与其他亚型发生重配的概率。而高致病性病毒是源于低致病性病毒，病毒在不断进化和广泛传播，研制H5流感病毒检测设备和检测方法具有重要意义。在流感病毒发生快速、准确地诊断其亚型，大量研究报道了各种检测流感病毒的方法，比如病毒分离、免疫荧光、聚合酶链式反应(PCR)、酶染免疫吸附试验(ELISA)和血清学方法，然而这些方法费时费力，需要实验室设备以外花费还较高。例如，病毒分离被认为是诊断的金标准，也是常规的快速实验室确认人流感必不可少的，但它往往需要5～7天的测试与劳动密集型和长程序；而分子检测方法PCR、实时PCR等费时且技术要求高，而且样品间的交叉污染可能导致假阳性结果。
抗体介导的免疫检测因其简便而成为一种流行的检测方法，多克隆抗体容易产生交叉反应导致亚型判断错误，单克隆抗体开发周期长、稳定性差，价格不菲，若动物源的抗体在人体治疗上则很可能引起人体的免疫反应；核糖体展示技术的稳定性问题使得特异性和高亲和力、体积小的抗体难以获得。趋向于小型化的抗体——纳米抗体(Nbs)能避开上文提到的诸多不足，在食品、环境、化学检测上的运用逐年呈现上升趋势。
纳米抗体是骆驼科动物(骆驼、大羊驼、羊驼及其近亲物种)缺失轻链的天然重链抗体的可变区(VHH)组成的单域抗体，该抗体只包含一个VHH和两个常规的重链恒定(CH2与CH3区)。具体地说，VHH是由不同的区域组成的，其中非CDR部分成为骨架区(FR)比较保守，其他区域负责特异性的识别抗原，称为互补决定区域(CDRs)，CDR3是识别程度最好的识别位点，VHH的高变区CDR3为16-18个氨基酸较任何小鼠的CDR3区平均长度要长，可变区的扩大能够形成更丰富的抗原结合构象，在一定程度上弥补了轻链缺失导致结合力下降的不足，从而使得纳米抗体本身具有较强的抗原结合能力，发生特异性结合时更容易且紧密和稳定。CDR3区还会形成一个大部分折叠在FR2上的凸环，凸环上的半胱氨酸和CDR1或者FR2上的半胱氨酸形成二硫键而增加其结构的稳定性，抗体基因序列多样性使得重链抗体可形成大量不同抗体结构形式的凸环；另外，人类VH3和骆驼VHH胚系基因具有高度相似性，实现抗体人源化降低免疫原性反应只需要较少的改变即可实现。VHH晶体为2.5nm，长4nm，分子量只有15KD。它具有分子量小，易表达，可溶性好，穿透性强，亲和性强、特异性高、稳定性高，能微生物表达，免疫原性低等优点，克服分子大、结构复杂、价格昂贵等缺点，与传统抗体相比较，在结构上存在较大差异，所以其特性也表现不一样，成为生物医药领域的新方向，具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种抗H5亚型禽流感病毒纳米抗体。
本发明的第二个目的在于提供一种融合蛋白。
本发明的第三个目的在于提供一种核酸分子。
本发明的第四个目的在于提供一种表达载体。
本发明的第五个目的在于提供一种重组细胞。
本发明的第六个目的在于提供上述纳米抗体、融合蛋白、核酸分子、表达载体或菌株在制备探测、诊断、预防或治疗禽流感病毒试剂中的应用。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种抗H5亚型禽流感病毒纳米抗体，所述抗体包含3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3，其中，CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.6、7、8所示。
在本发明的一些实施方式中，所述抗体还包含框架区FR1、FR2、FR3、FR4，其中FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2、3、4、5所示。
在本发明的一些优选实施方式中，所述抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二个方面，提供一种融合蛋白，含有本发明第一方面所述的抗体。
在本发明的一些实施方式中，所述融合蛋白还包含麦芽糖结合蛋白。
本发明的第三个方面，提供一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含以下成分：
(1)用于编码本发明第一方面所述抗体的核酸片段；
(2)用于编码本发明第二方面述融合蛋白核酸片段。
在本发明的一些实施方式中，所述用于编码本发明第一方面所述抗体的核酸片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.9。
在本发明的一些实施方式中个，所述用于编码本发明第二方面述融合蛋白核酸片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
在本发明的第四个方面，提供一种表达载体，所述表达载体包含本发明第三方面所述核酸分子。
在本发明的一些实施方式中，所述表达载体具体为将本发明第三方面所述核酸分子克隆进入载体得到。
在本发明的一些实施方式中，所述载体为PET系列载体。
在本发明的一些优选实施方式中，所述载体为pET-9a、pET-28a(+)、pET-22b(+)、pET-26b(+)或pET-31b(+)。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述载体为pET28a(+)。
在本发明的一些实施方式中，所述表达载体具体将本发明第三方面所述核酸分子通过酶切位点XhoI和NcoI插入pET28a(+)中得到。
本发明的第五个方面，提供一种重组细胞，所述重组细胞包含本发明第四个方面所述的表达载体。
在本发明的一些实施方式中，所述重组细胞具体为将本发明第四个方面所述表达载体转入细胞中得到。
在本发明的一些实施方式中，所述重组细胞为细菌、酵母或真菌。
在本发明的一些优选实施方式中，所述重组细胞为大肠杆菌(Escherichiacoli)。
在本发明的一些更优选实施方式中，所述重组细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明的第六个方面，提供本发明第一方面所述抗体或本发明第二所述融合蛋白或本发明第三方面所述核酸分子或本发明第四方面所述表达载体或本发明第五方面所述重组细胞在制备探测、诊断、预防或治疗禽流感病毒试剂中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述禽流感病毒为H5亚型禽流感病毒。
本发明还提供本发明第二方面所述融合蛋白的制备方法，具体为将本发明第三方面所述融合蛋白的基因克隆进入表达载体，得到重组表达载体，然后将重组表达载体转入BL21(DE3)，得到重组表达细胞并进行表达，收集表达产物，进行破碎、分离纯化。
在本发明的一些实施方式中，所述得到重组表达细胞并进行表达具体为诱导表达。
在本发明的一些实施方式中，所述诱导表达的诱导剂优选为IPTG。
在本发明的一些实施方式中，所述的IPTG的终浓度为0.05～0.15mmol/L。
在本发明的一些实施方式中，所述的IPTG的终浓度为0.1mmol/L。
在本发明的一些实施方式中，所述的诱导表达的条件为27～29℃诱导14～18h。
在本发明的一些优选实施方式中，所述的诱导表达的条件为28℃诱导16h。
在本发明的一些实施方式中，步骤(4)中所述的重组表达菌株培养至菌液OD600为0.6～0.8时加入诱导剂进行诱导。
在本发明的一些优选实施方式中，步骤(4)中所述的重组表达菌株培养至菌液OD600为0.6时加入诱导剂进行诱导。
在本发明的一些实施方式中，所述的分离纯化的方法为镍柱亲和层析法。
本发明的有益效果是：
(1)本发明通过基因工程的方法，将抗H5禽流感病毒纳米抗体基因通过连接肽(GGCGGCGGGTCA)与麦芽糖结合蛋白(MBP)基因连接，构建表达载体，诱导融合蛋白表达，来促进抗H5禽流感病毒纳米抗体融合蛋白在表达系统中的可溶表达，从而解决了抗H5禽流感纳米抗体蛋白在原核系统呈不可溶的难题，提高了准确性和重复性。克服了禽流感抗体在原核表达系统中以包涵体形式存在，产量低和变复性、生产成本高限制禽流感抗体在生产的运用等缺点和不足。
(2)本发明提供的抗H5禽流病毒感纳米抗体融合蛋白的生产方法操作简单、成本低，可实现抗H5禽流感病毒纳米抗体规模化生产。
(3)本发明生产的抗H5禽流感病毒纳米抗体蛋白纯度较高、检测过程中灵敏度低高，具有良好的稳定性和生物学活性，也建立了该纳米抗体在诊断中的应用方法，以解决现有H5亚型禽流感诊断试剂研发过程中抗体亲和力低、生产过程中纯度低、检测过程中灵敏度低的问题，对鸡H5禽流感的监测具有重大的意义。
附图说明
图1为抗H5禽流感病毒纳米抗体蛋白重组表达载体。
图2为重组表达载体转化进入受体菌DH5后对质粒进行酶切验证的PCR结果图。其中道1为DL10000 Marker、泳道2为载体PET28a(+)，泳道3为对转化了重组表达载体的受体菌DH5进行质粒抽提后，并对质粒做XhoI和NcoI双酶切后的酶切产物。
图3为SDS-PAGE电泳检测融合蛋白纯化结果分析结果图。其中，泳道1为Thermo26616Marker，泳道2为融合蛋白纯化结果。
图4为LC/Q-TOF检测融合蛋白分子量和蛋白质谱鉴定分析图。
图5为针对不同抗原的血凝抑制(HI)图。
图6为纳米抗体蛋白与不同的包被抗原的ELISA反应折线图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例1
将重组AIV灭活疫苗(H5N1亚型，Re-8株)禽流感病毒免疫双峰驼，每三周免疫一次，一共免疫四次，抽取免疫后的供体外周淋巴血液，分离其中的外周血淋巴细胞(PBMC)进行RNA抽提，进行反转录获得cDNA，利用两次巢氏PCR扩增得到VHH片段，将VHH片段与pcantab-5E噬菌粒载体相连，将连接后产物转化至XL-Blue菌，构建对抗原有针对性的纳米抗体文库；辅助噬菌体VCSM13超染宿主菌XL-Blue菌，过夜培养后收集上清即可获得噬菌体纳米抗体库。
实施例2
用碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(0.05mol/L，pH9.6)将灭活抗原H5亚型禽流感(Re-8株)包被在酶标板上，每孔100μL，灭活抗原占10％，放于37℃2h；弃去孔中液体，用100μLPBS洗一遍后加入300μL3％BSA置于室温封闭1h；弃去封闭液，加入100μL噬菌体抗体液，在室温孵育1h；弃去孔中液体及未结合噬菌体，再用0.05％PBST洗5次，5min/次，加入100μL的甘氨酸-盐酸pH＝2.2的洗脱液，将洗脱液收集起来，加入适量2MTris碱，使得含有噬菌体的液体呈中性，获得第一轮富集筛选的噬菌体；将该噬菌体进一步扩增，进入下一轮筛选；五轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选过程，就可以最终获得特异性较强的噬菌体克隆(其中第一轮筛选采用非特异性条件，后几轮筛选通过改变抗原包被浓度提高特异性)。
实施例3
挑选单菌落进行ELISA法筛选阳性克隆：将单菌落按照上述包被方法包被至酶标板上后进行封闭处理，以空白酶标板(即不包被)为空白对照，再加入100μL/孔HRP-M13，37℃孵育1h，用0.05％PBST洗5次，5min/次，加入100μL/孔TMB底物显色液，避光室温放置20min，酶标仪测波长620nm的OD数值，以P/N值(即阳性孔OD读数/对照孔OD读数的比值)大于等于3为阳性。将阳性克隆送去测序，即可得到抗H5亚型禽流感病毒纳米抗体序列。
其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：包括框架区(FR)和抗体基因互补决定区(CDR)，所述框架区分为四部分，依次定义FR1、FR2、FR3、FR4，依次记为SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5；所述互补决定区分为三部分，依次可定义为CDR1、CDR2、CDR3，依次记为SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8。
其中SEQ ID NO.1：MDNQVQLQESGGGLVQPGGSLRLACAASGFTLQSDSIAWVRLAPGKGLEWVSSIYSNSHNTFYAQSVMGRFTISRDFAKDTTYLQMDNLKSEDTALYFCAADPRISLPDLLVAGTVSLADFGYWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO.2：MDNQVQLQES GGGLVQPGGSLRLACAAS；
SEQ ID NO.3：WVRLAPGKGLEWVSS；
SEQ ID NO.4：FYAQSVMGRFTISRDFAKDTTYLQMDNLKSEDTALYFC；
SEQ ID NO.5：WGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO.6：GFTLQSDSIA；
SEQ ID NO.7：IYSNSHNT；
SEQ ID NO.8：AADPRISLPDL LVAGTVSLADFGY。
编码上述抗H5亚型禽流感病毒纳米抗体蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示，其中SEQ ID NO.9：ATGGACAATCAAGTTCAGTTACAGGAATCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGGCTCGCCTGCGCAGCATCAGGATTCACCTTACAGAGCGACTCCATCGCCTGGGTCCGCCTGGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCAGCATTTATAGTAATAGTCACAACACATTCTATGCACAGTCCGTGATGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACTTCGCCAAGGACACGACGTATCTGCAAATGGACAATTTGAAATCTGAAGACACGGCCCTGTATTTTTGTGCCGCTGATCCCCGAATCAGTCTCCCCGATTTGCTGGTAGCTGGCACGGTCTCACTCGCTGACTTTGGTTATTGGGGCCAGGGGACCCTGGTCACCGTCTCCTCA。
实施例4
(1)抗H5禽流感纳米抗体融合蛋白质粒p16-mbp in pET-28a(+)的构建
根据抗H5禽流感纳米抗体基因序列(SEQ ID NO.9)，将其C末端与麦芽糖结合蛋白(MBP)通过连接肽(GGCGGCGGGTCA，SEQ ID NO.12)进行连接，融合表达的核苷酸序列如SEQID NO.10，构成抗H5禽流感病毒纳米抗体融合蛋白氨基酸序列SEQ ID NO.11，所示，其中SEQ ID NO.10：
ATGGACAATCAAGTTCAGTTACAGGAATCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGTCTCTGAGGCTCGCCTGCGCAGCATCAGGATTCACCTTACAGAGCGACTCCATCGCCTGGGTCCGCCTGGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTGTCCAGCATTTATAGTAATAGTCACAACACATTCTATGCACAGTCCGTGATGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACTTCGCCAAGGACACGACGTATCTGCAAATGGACAATTTGAAATCTGAAGACACGGCCCTGTATTTTTGTGCCGCTGATCCCCGAATCAGTCTCCCCGATTTGCTGGTAGCTGGCACGGTCTCACTCGCTGACTTTGGTTATTGGGGCCAGGGGACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGCGGCGGGTCAAAAATCGAAGAAGGTAAACTGGTAATCTGGATTAACGGCGATAAAGGCTATAACGGTCTCGCTGAAGTCGGTAAGAAATTCGAGAAAGATACCGGAATTAAAGTCACCGTTGAGCATCCGGATAAACTGGAAGAGAAATTCCCACAGGTTGCGGCAACTGGCGATGGCCCTGACATTATCTTCTGGGCACACGACCGCTTTGGTGGCTACGCTCAATCTGGCCTGTTGGCTGAAATCACCCCGGACAAAGCGTTCCAGGACAAGCTGTATCCGTTTACCTGGGATGCCGTACGTTACAACGGCAAGCTGATTGCTTACCCGATCGCTGTTGAAGCGTTATCGCTGATTTATAACAAAGATCTGCTGCCGAACCCGCCAAAAACCTGGGAAGAGATCCCGGCGCTGGATAAAGAACTGAAAGCGAAAGGTAAGAGCGCGCTGATGTTCAACCTGCAAGAACCGTACTTCACCTGGCCGCTGATTGCTGCTGACGGGGGTTATGCGTTCAAGTATGAAAACGGCAAGTACGACATTAAAGACGTGGGCGTGGATAACGCTGGCGCGAAAGCGGGTCTGACCTTCCTGGTTGACCTGATTAAAAACAAACACATGAATGCAGACACCGATTACTCCATCGCAGAAGCTGCCTTTAATAAAGGCGAAACAGCGATGACCATCAACGGCCCGTGGGCATGGTCCAACATCGACACCAGCAAAGTGAATTATGGTGTAACGGTACTGCCGACCTTCAAGGGTCAACCATCCAAACCGTTCGTTGGCGTGCTGAGCGCAGGTATTAACGCCGCCAGTCCGAACAAAGAGCTGGCAAAAGAGTTCCTCGAAAACTATCTGCTGACTGATGAAGGTCTGGAAGCGGTTAATAAAGACAAACCGCTGGGTGCCGTAGCGCTGAAGTCTTACGAGGAAGAGTTGGTGAAAGATCCGCGTATTGCCGCCACTATGGAAAACGCCCAGAAAGGTGAAATCATGCCGAACATCCCGCAGATGTCCGCTTTCTGGTATGCCGTGCGTACTGCGGTGATCAACGCCGCCAGCGGTCGTCAGACTGTCGATGAAGCCCTGAAAGACGCGCAGACTCACCACCACCATCATCACTAA。
SEQ ID NO.11如下所示：
MDNQVQLQESGGGLVQPGGSLRLACAASGFTLQSDSIAWVRLAPGKGLEWVSSIYSNSHNTFYAQSVMGRFTISRDFAKDTTYLQMDNLKSEDTALYFCAADPRISLPDLLVAGTVSLADFGYWGQGTLVTVSSGGGSKIEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELVKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQTHHHHHH。
通过基因合成对融合基因两端分别加上XhoI和NcoI酶切位点，与进行XhoI和NcoI双酶切的pET-28a(+)载体相连，命名为p6-mbp in pET-28a(+)，其结果见图1，抗H5禽流感纳米抗体的基因和编码麦芽糖结合蛋白MBP蛋白的基因依次连接。VHH-16基因是抗H5禽流感纳米抗体的基因。得到的连接片段核苷酸序列由上海通用公司合成，经测序正确后，获得大小为6770bp的融合基因。
(2)质粒抽提，双酶切确认质粒并送测序
将步骤(1)得到的抗H5禽流感纳米抗体融合蛋白质粒为p16-mbp in pET-28a(+)的合成质粒转化至受体菌DH5α，菌液涂含卡那霉素的LB(含50mg/L的卡那霉素(Kan))板进行复苏活化，37℃培养16h后，挑取单个菌落重新转接涂板；将转接后的菌落，挑取一部分菌落转接至100mL的液体LB培养基中，37℃、200rpm的摇床上摇菌16h，先将部分菌液暂时分装放4℃保存；再取一部分菌液使用50mL离心管进行收集，8000rpm离心10min，弃去上清，进行质粒抽提，并对质粒做XhoI和NcoI双酶切，跑核酸电泳确认酶切片段大小，结果见图2。并将大小为2000bp左右的目的条带的克隆质粒进一步测序，将测序正确的阳性克隆扩大培养，抽取质粒保存至-20℃冰箱，将菌液用含有15％～20％甘油的LB溶液放置-80℃进行保种。
实施例5
抗H5禽流感病毒纳米抗体蛋白的诱导表达：
(1)将上述实施例中保存的表达抗H5禽流感病毒纳米抗体融合蛋白的质粒转化至受体大肠杆菌BL21(DE3)上，冰上放置30min后，42℃水浴锅中热击90s后加入1ml LB肉汤，在37℃，220rpm的摇床上复苏活化之后，6000rpm离心1min，弃去90％的上清后将菌液涂含卡那霉素的LB(含30mg/L的卡那霉素(Kan))板进行复苏活化，37℃培养16h后，挑取单个菌落利用T7引物(T7-f：TAATACGACTCACTATAGG(SEQ ID NO.13)；T7-r：TGCTAGTTATTGCTCAGCGG(SEQ ID NO.14))进行菌落PCR确认，将大小为2000bp左右的目的条带的克隆菌落重新转接涂板，并保存；具体操作步骤如下所示：
正向引物(t7-f)：TAATACGACTCACTATAGG(SEQ ID NO.13)；
反向引物(t7-r)：TGCTAGTTATTGCTCAGCGG(SEQ ID NO.14)。
扩增体系：
PCR Master Mix酶25μL，正向引物(10pmol/μL)1μL，反向引物(10pmol/μL)1μL，基因模板2μL，ddH2O补足至50μL。
扩增反应条件：98℃3min；98℃15s、58℃15s、72℃60s，40个循环；72℃5min。
PCR反应完成之后，使用1％琼脂糖凝胶电泳。凝胶电泳显示大小为2000bp左右的目的条带。
(2)将转接后的菌落，挑取一部分菌落转接至100mL的液体LB培养基中，37℃、200rpm的摇床上摇菌；待菌液OD600值为0.6时，用IPTG进行诱导，IPTG的终浓度为0.1mmol/L；诱导16h后将菌液使用50mL离心管进行收集，8000rpm离心10min，弃去上清。
(3)用的蛋白裂解液Lysis buffer(H2PO4·H2O(MW137.99g/mol)6.9g，即0.05M/L，NaCl(MW58.44g/mol)17.54g即0.3M/L，imidazole(MW 68.08g/mol)0.68g即0.01mM/L,加入约900mL去离子水，搅拌溶解后，加入NaOH调节溶液pH值至8.0，加入去离子水定容至1000mL)，取约30mL将保存的菌液重悬，使用超声破碎仪进行破碎，超声程序为破碎3s，间隔5s，超声破碎30min。
(4)将超声破碎后的产物8000rpm离心10min，收集上清，进行镍柱亲和层析，对上清进行浓缩纯化，获得纯化的抗H5禽流感病毒纳米抗体蛋白。具体操作方法如下：取0.5mL购于GE Healthcare公司的HisTrap affinity columns于Poly-Prep ChromatographyColumns(购于BIO-RAD)，加入三次每次7mL上述Lysis buffer，共21mL以平衡柱子，然后缓慢加入裂解后上清，任其缓慢滴落进入废液缸，最后加入洗脱液Elution buffer(H2PO4·H2O(MW137.99g/mol)6.9g，即0.05M/L，NaCl(MW58.44g/mol)17.54g即0.3M/L，imidazole(MW 68.08g/mol)0.68g即0.25mM/L,加入约900mL去离子水，搅拌溶解后，加入NaOH调节溶液pH值至8.0，加入去离子水定容至1000mL)1mL，收集洗脱液，用PBS过夜4℃透析，收集透析后液体即为纯化后蛋白，加入体积百分数20％的甘油，置于-20℃冰箱保存。取纯化后蛋白，取出适量上清样品加入2×SDS上样缓冲液，混匀后，至沸水中煮10min，若加热后的样品有粘性产物，将样品进行瞬时离心后，取上清上样于购自金斯瑞的SDS-PAGE胶孔，同时加入10μL的蛋白Thermo Marker 26616，以电泳电压调节至120V跑胶，跑胶30min。将凝胶块从玻璃板中取出，轻放于摇床上含有考马斯亮蓝溶液的染色槽中1h；然后将染色槽的考马斯亮蓝溶液倒出，加入清水冲洗干净后，凝胶块放于摇床中的染色槽中，用清水对凝胶块进行脱色30min即可见清洗条带。将脱色的凝胶放于成像系统中进行扫描，如图3所示。
然后将诱导表达并纯化的抗H5禽流感病毒纳米抗体蛋白送至广州辉骏生物科技有限公司LC/Q-TOF检测融合蛋白分子量和蛋白质谱鉴定分析。
实施例6
本实施例验证抗H5禽流感纳米抗体融合蛋白的功能。抗H5禽流感纳米抗体融合蛋白有抑制血凝的功能，因此我们通过血凝抑制(HI)实验检验该抗体，过程如下：先通过血凝(HA)试验测得病毒效价，配置四单位，再进行HI实验。本实施例的血凝(HA)试验操作按照GB/T14926.53-2001标准进行操作，血凝抑制(HI)试验按照均按照GB/T14926.54-2001标准进行操作。
(1)HA实验：
①在96孔板1-11孔加入25μL PBS，第12孔加入50μL PBS；
②第1孔加重组AIV H5亚型Re-8株HI试验抗原(购自哈尔滨维科生物技术开发公司)25μL，混匀吸至第2孔，依次倍比稀释至第11孔，混匀后弃去25μL，第12孔不加；
③从1～11孔，每空加稀释好的25μL PBS；
④将1％的红细胞轻轻摇动混匀，在1～12孔中每孔加入25μL；震荡，室温(24～25℃)静置40min后观察结果；其中，1％鸡红细胞悬液的制备：抽取抗凝血鸡血，700rpm，5min离心；用PBS清洗。再离心，吸取沉淀红细胞表面的白细胞，不断清洗直至红细胞表面无白细胞，PBS洗液呈透亮无颜色。以PBS：红细胞＝99：1的比例轻轻混匀，制得1％鸡红细胞悬液。
四单位配置：测得HA效价后，按照原液稀释2n-2倍的方法配置四单位抗原(4HAU)，配好后，进行HA的步骤进行四单位验证，在验证四单位时，前两孔出现血凝现象即为四单位配置合格。
(2)HI实验：
①在96孔板1-11孔加入25μL PBS，第12孔加入50μL PBS；
②第1孔加抗H5禽流感病毒纳米抗体融合蛋白25μL，混匀吸至第2孔，依次倍比稀释至第10孔，混匀后弃去25μL PBS，第11、12孔不加；
③从1～11孔，每空加稀释好的25μL AIV H5亚型Re-8株4单位抗原悬液，室温(24～25℃)静置至少30min，第12孔不加；
④将1％的红细胞轻轻摇动混匀，在1～12孔中每孔加入25μL；震荡，室温(24～25℃)静置40min后观察结果。
H7、H9血凝抑制实验步骤与H5亚型Re-8株的血凝抑制实验相同。H5、H7、H9禽流感血凝抑制试验抗原分别为Re-8株、H7-Re1株、H9亚型，均为购自哈尔滨维科生物技术有限公司的禽流感血凝抑制试验抗原。
结果见图5，可以看出，抗H5禽流感纳米抗体融合蛋白抗体对H5抗原效价为4log2，对H7、H9无血凝抑制，是特异性结合的抗H5禽流感纳米抗体融合蛋白抗体。
实施例7
纳米抗体是针对H5禽流感的特异性抗体，为此通过包被不同的抗原，用筛选表达的纳米抗体对包被的抗原进行检测。具体实验方案如下：
1.抗原包被：分别取H5、H7、H9禽流感血凝抑制试验抗原(分别为Re-8株、H7-Re1株、H9亚型)10μL，按照第一孔抗原(抗原：碳酸盐包被缓冲液＝1:9)按照10倍稀释，第二孔开始4倍稀释，将抗原吸附在固相载体聚苯乙烯。即第一孔将抗原和包被液稀释均匀后，吸取25μL至第二孔，一次稀释至第七孔，第八孔只加包被液做为空白对照，每孔最终75μL，37℃孵育2h或者4℃过夜孵育后，弃去板内液体；
2.封闭：加300μL 3％BSA封闭1h；
3.一抗：抗H5禽流感病毒纳米抗体融合蛋白即为一抗，按照1:1000的比例用PBS稀释加75μL稀释后抗体至每孔；
4.洗涤：用含0.5％的Tween-20的PBS洗涤液洗涤3～5次，每次洗涤浸泡时间5min洗5次；
5.二抗：以翊圣公司的兔源抗mbp多抗按照1:5000比例用PBS稀释，稀释加75μL稀释后抗体至每孔孵育1h；
6.洗涤：用含0.5％的Tween-20的PBS洗涤液洗涤3～5次，每次洗涤浸泡时间5min，洗5次；
7.三抗：以翊圣公司的羊抗兔-HRP抗体按照1:10000比例用PBS稀释，稀释加75μL稀释后抗体至每孔，孵育1h；
8.洗涤：用含0.5％的Tween-20的PBS洗涤液洗涤3～5次，每次洗涤浸泡时间5min，洗5次；
9.显色：加入HRP底物显色液进行显色20min，用酶标仪的波长620nm进行读数。
ELISA结果见图6，可以看出，随着H5抗原(Re-8)梯度递减的包被抗原(一定范围内)，P/N比值也梯度递减，其中空白对照数值为0.05，P/N最大比值大于3，证明原核表达的抗H5亚型禽流感病毒的纳米抗体具有良好的生物活性；对比H7抗原、H9抗原，P/N最大比值均小于3，证明原核表达的抗H5亚型禽流感病毒的纳米抗体具有良好的特异性。
上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学
<120> 抗H5亚型禽流感病毒新纳米抗体及其应用
<130>
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Asp Asn Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
1 5 10 15
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu
20 25 30
Gln Ser Asp Ser Ile Ala Trp Val Arg Leu Ala Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Val Ser Ser Ile Tyr Ser Asn Ser His Asn Thr Phe Tyr Ala
50 55 60
Gln Ser Val Met Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Phe Ala Lys Asp
65 70 75 80
Thr Thr Tyr Leu Gln Met Asp Asn Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Leu
85 90 95
Tyr Phe Cys Ala Ala Asp Pro Arg Ile Ser Leu Pro Asp Leu Leu Val
100 105 110
Ala Gly Thr Val Ser Leu Ala Asp Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
115 120 125
Leu Val Thr Val Ser Ser
130
<210> 2
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Asp Asn Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
1 5 10 15
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Trp Val Arg Leu Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser
1 5 10 15
<210> 4
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Phe Tyr Ala Gln Ser Val Met Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Phe
1 5 10 15
Ala Lys Asp Thr Thr Tyr Leu Gln Met Asp Asn Leu Lys Ser Glu Asp
20 25 30
Thr Ala Leu Tyr Phe Cys
35
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Gly Phe Thr Leu Gln Ser Asp Ser Ile Ala
1 5 10
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Ile Tyr Ser Asn Ser His Asn Thr
1 5
<210> 8
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Ala Ala Asp Pro Arg Ile Ser Leu Pro Asp Leu Leu Val Ala Gly Thr
1 5 10 15
Val Ser Leu Ala Asp Phe Gly Tyr
20
<210> 9
<211> 402
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
atggacaatc aagttcagtt acaggaatct gggggaggct tggtgcagcc tggggggtct 60
ctgaggctcg cctgcgcagc atcaggattc accttacaga gcgactccat cgcctgggtc 120
cgcctggctc cagggaaggg cctggagtgg gtgtccagca tttatagtaa tagtcacaac 180
acattctatg cacagtccgt gatgggccga ttcaccatct ccagagactt cgccaaggac 240
acgacgtatc tgcaaatgga caatttgaaa tctgaagaca cggccctgta tttttgtgcc 300
gctgatcccc gaatcagtct ccccgatttg ctggtagctg gcacggtctc actcgctgac 360
tttggttatt ggggccaggg gaccctggtc accgtctcct ca 402
<210> 10
<211> 1533
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
atggacaatc aagttcagtt acaggaatct gggggaggct tggtgcagcc tggggggtct 60
ctgaggctcg cctgcgcagc atcaggattc accttacaga gcgactccat cgcctgggtc 120
cgcctggctc cagggaaggg cctggagtgg gtgtccagca tttatagtaa tagtcacaac 180
acattctatg cacagtccgt gatgggccga ttcaccatct ccagagactt cgccaaggac 240
acgacgtatc tgcaaatgga caatttgaaa tctgaagaca cggccctgta tttttgtgcc 300
gctgatcccc gaatcagtct ccccgatttg ctggtagctg gcacggtctc actcgctgac 360
tttggttatt ggggccaggg gaccctggtc accgtctcct caggcggcgg gtcaaaaatc 420
gaagaaggta aactggtaat ctggattaac ggcgataaag gctataacgg tctcgctgaa 480
gtcggtaaga aattcgagaa agataccgga attaaagtca ccgttgagca tccggataaa 540
ctggaagaga aattcccaca ggttgcggca actggcgatg gccctgacat tatcttctgg 600
gcacacgacc gctttggtgg ctacgctcaa tctggcctgt tggctgaaat caccccggac 660
aaagcgttcc aggacaagct gtatccgttt acctgggatg ccgtacgtta caacggcaag 720
ctgattgctt acccgatcgc tgttgaagcg ttatcgctga tttataacaa agatctgctg 780
ccgaacccgc caaaaacctg ggaagagatc ccggcgctgg ataaagaact gaaagcgaaa 840
ggtaagagcg cgctgatgtt caacctgcaa gaaccgtact tcacctggcc gctgattgct 900
gctgacgggg gttatgcgtt caagtatgaa aacggcaagt acgacattaa agacgtgggc 960
gtggataacg ctggcgcgaa agcgggtctg accttcctgg ttgacctgat taaaaacaaa 1020
cacatgaatg cagacaccga ttactccatc gcagaagctg cctttaataa aggcgaaaca 1080
gcgatgacca tcaacggccc gtgggcatgg tccaacatcg acaccagcaa agtgaattat 1140
ggtgtaacgg tactgccgac cttcaagggt caaccatcca aaccgttcgt tggcgtgctg 1200
agcgcaggta ttaacgccgc cagtccgaac aaagagctgg caaaagagtt cctcgaaaac 1260
tatctgctga ctgatgaagg tctggaagcg gttaataaag acaaaccgct gggtgccgta 1320
gcgctgaagt cttacgagga agagttggtg aaagatccgc gtattgccgc cactatggaa 1380
aacgcccaga aaggtgaaat catgccgaac atcccgcaga tgtccgcttt ctggtatgcc 1440
gtgcgtactg cggtgatcaa cgccgccagc ggtcgtcaga ctgtcgatga agccctgaaa 1500
gacgcgcaga ctcaccacca ccatcatcac taa 1533
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<211> 510
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 11
Met Asp Asn Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
1 5 10 15
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu
20 25 30
Gln Ser Asp Ser Ile Ala Trp Val Arg Leu Ala Pro Gly Lys Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Val Ser Ser Ile Tyr Ser Asn Ser His Asn Thr Phe Tyr Ala
50 55 60
Gln Ser Val Met Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Phe Ala Lys Asp
65 70 75 80
Thr Thr Tyr Leu Gln Met Asp Asn Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Leu
85 90 95
Tyr Phe Cys Ala Ala Asp Pro Arg Ile Ser Leu Pro Asp Leu Leu Val
100 105 110
Ala Gly Thr Val Ser Leu Ala Asp Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
115 120 125
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Lys Ile Glu Glu Gly Lys
130 135 140
Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu
145 150 155 160
Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr Gly Ile Lys Val Thr Val Glu
165 170 175
His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly
180 185 190
Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr
195 200 205
Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln
210 215 220
Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys
225 230 235 240
Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn
245 250 255
Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala
260 265 270
Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn
275 280 285
Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly
290 295 300
Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly
305 310 315 320
Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu
325 330 335
Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu
340 345 350
Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp
355 360 365
Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys Val Asn Tyr Gly Val Thr Val
370 375 380
Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser Lys Pro Phe Val Gly Val Leu
385 390 395 400
Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu
405 410 415
Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn
420 425 430
Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu
435 440 445
Leu Val Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys
450 455 460
Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala
465 470 475 480
Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp
485 490 495
Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr His His His His His His
500 505 510
<210> 12
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ggcggcgggt ca 12
<210> 13
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
taatacgact cactatagg 19
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
tgctagttat tgctcagcgg 20
Claims (10)
1.一种抗H5亚型禽流感病毒纳米抗体，其特征在于，所述抗体包含3个互补决定区CDR1、CDR2、CDR3；
其中，CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.6、7、8所示。
2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体还包含框架区FR1、FR2、FR3、FR4，其中FR1、FR2、FR3、FR4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.2、3、4、5所示。
3.根据权利要求1～2任一项所述的抗体，其特征在于，所述抗体的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。
4.一种融合蛋白，其特征在于，含有权利要求1～3任一项所述抗体。
5.根据权利要求6所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还包含麦芽糖结合蛋白。
6.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含以下成分：
(1)用于编码权利要求1～3任一项所述抗体的核酸片段；
(2)用于编码权利要求4～5任一项所述融合蛋白核酸片段。
7.根据权利要求6所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQIDNO.9或SEQ ID NO.10所示。
8.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求6～7任一项所述核酸分子。
9.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞包含有权利要求8所述表达载体；所述细胞为非植物细胞。
10.权利要求1～3任一项所述抗体或权利要求4～5任一项所述融合蛋白或权利要求6～7任一项所述核酸分子或权利要求8所述表达载体或权利要求9所述重组细胞在制备探测、诊断、预防或治疗禽流感病毒试剂中的应用，优选为H5亚型禽流感病毒。
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