CN111592596A - 一株微囊藻毒素广谱识别单链抗体及其在抗原表位预测中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种微囊藻毒素(MC)广谱识别单链抗体，该单链抗体以保藏号为CCTCC No.C2019的一株抗MC‑LR的鼠杂交瘤细胞株为模板构建；该单链抗体对三种4号位精氨酸微囊藻毒素(MC‑LR、MC‑YR、MC‑RR)具有相似的识别能力，对非4号位精氨酸微囊藻毒素MC‑LA也具有较高的交叉反应率，广谱性高；该单链抗体被用于MC‑LR的抗原表位预测，表明MC‑LR的5号位Adda氨基酸的羰基和苯基，以及4号位精氨酸的胍基是MC‑LR的关键抗原表位，该表位预测结果与抗体交叉反应率结果一致。该研究结果为MC家族半抗原设计、抗体的定向改造，以及抗体识别能力的理解提供了有益信息。

Description

一株微囊藻毒素广谱识别单链抗体及其在抗原表位预测中的 应用

技术领域

本发明涉及基因工程抗体，特别是一种对MC-LR、MC-RR、MC-YR和 MC-LA具有广谱识别能力的单链抗体及该抗体在抗原表位预测中的应用。

背景技术

微囊藻毒素(Microcystin,MC)是富营养化的淡水水体中常见的藻类毒素，它是一类具有蛋白磷酸酶抑制和强烈致肝癌作用的环状七肽。目前已经报道的 MC已有279种，其中2号和4号位的氨基酸是最常见的氨基酸替换位点(Bouaicha N,Miles CO,Beach DG,Labidi Z,Djabri A,Benayache NY,et al.Structural Diversity,Characterizationand Toxicology of Microcystins.Toxins.2019；11,714)。故不同类型的MC缩写常以这两个位点氨基酸进行命名，如MC-LR代表2号位为亮氨酸 (L)和4号位为精氨酸(R)；MC-YR代表2号为络氨酸(Y)和4号位为精氨酸(R)。

早在上世纪八十年代国际上就启动了微囊藻毒素抗体的制备工作(Kfir R,Johannsen E,Botes DP.Monoclonal antibody specific for cyanoginosin-LA:preparation and characterization.Toxicon.1986；24(6):543-52.)，目前已报道的MC抗体类型包括多克隆抗体(Yu FY,Liu BH,Chou HN,Chu FS.Development of a sensitiveELISA for the determination of microcystins in algae.Journal of Agriculturaland Food Chemistry.2002； 50(15):4176-82.)、单克隆抗体(Zeck A,Eikenberg A,Weller MG,Niessner R.Highly sensitive immunoassay based on a monoclonalantibody specific for[4-arginine]microcystins.Analytica Chimica Acta.2001；441(1):1-13.)、单链抗体(Murphy C,Stack E,Krivelo S,McPartlin DA, Byrne B,Greef C,et al.Detection of the cyanobacterial toxin,microcystin-LR,using anovelrecombinant antibody-based optical-planar waveguide platform.Biosensors&Bioelectronics. 2015；67:708-14.)、纳米抗体(Xu C,Yang Y,Liu L,Li J,Liu X,ZhangX,et al.Microcystin-LR nanobody screening from an alpaca phage displaynanobody library and its expression and application.Ecotoxicol EnvironSaf.2018；151:220-7.)等，这些抗体主要应用于MC-LR 的免疫检测方法的建立或免疫亲和柱的制备。

抗原表位是抗原分子中决定其抗原性的特殊化学基团，抗原表位分析不仅可以帮助了解”抗原-抗体”相互作用，而且对抗原设计和抗体的体外定向改造具有重要的指导意义。常用的抗原表位预测方法包括针对线性表位的单一参数的预测方法(亲水性、可及性、可塑性、二级结构预测等)，多参数综合预测法，以及针对构象表位的结构预测法和模拟肽预测法(马凡舒、张蕾、王洋等.B细胞抗原表位预测方法的研究进展.中国畜牧兽医，2016,43(1)：63-67)。然而这些方法主要适用于大分子蛋白抗原，对小分子半抗原(分子量小于1000Da)，这些抗原表位预测的方法却并不适用。半抗原表位预测的报道相比于蛋白抗原非常少见，造成了其抗体制备的盲目性(Hongtao Mu,Hongtao Lei,Baoling Wang.Molecular modeling application on hapten epitope prediction:anenantioselective immunoassay for ofloxacin optical isomers.Journal ofAgricultural and Food Chemistry.2014,62,7804-7812)，阻碍了对抗体的研究。目前关于MC抗原表位分析的研究主要停留在通过抗体的交叉反应率结果对抗原表位的推测(Nagata S, Soutome H,Tsutsumi T,Hasegawa A,Sekijima M,Sugamata M,et al.Novelmonoclonal antibodies against microcystin and their protective activity forhepatotoxicity.Nat Toxins. 1995；3(2):78-86.)，对于MC分子中直接参与抗体结合的化学基团尚无定论。

分子对接技术是通过计算机模拟将配体置于大分子受体的结合区域，再通过计算物理化学参数预测两者的结合力和结合方式，并找到配体和受体在其活性区相结合是能量最低构象的方法(李博，刘书霞，房森彪，陈禹保，胡文祥.分子对接与分子动力学计算模拟概论.比较化学,2019,3(1)，1-10.)。将分子对接技术应用于抗原抗体相互作用分析，可以较为直观的反应抗原与抗体结合模式及其相互作用力，预测参与结合的抗原表位和直接接触氨基酸残基，为抗原表位的识别提供了一个简便而有效的手段(张巍，冯健男，沈倍奋.借助计算机建模与缺失突变技术确定人抗TNF- 单抗Z12识别的抗原表位.中国科学C辑生命科学,2004,34(1):61-67.)。

由于早期报道的MC抗体以多克隆抗体和单克隆抗体为主，抗体的氨基酸序列并不明确，无法通过同源建模和分子对接的方法预测MC分子的抗原表位信息。另外现有报道的单链抗体或杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体的广谱识别能力相对较弱。如Zhang等报道MC-LR单链抗体，对MC-RR、MC-YR和MC-LA广谱识别能力分别仅有2.15％,1.42％和小于0.01％(Xiuyuan Zhang,Kuo He,Ruiping Zhao,et al.Cloning of scFv from hybridomasusing a rational strategy:Application as a receptor to sensitive detectionmicrocystin-LR in water.Chemosphere 160(2016) 230-236)；Melnik等报道的植物表达单链抗体虽有超高的灵敏度，但其仅对 MC-RR有58％交叉反应率、对MC-LW和MC-LF的交叉反应率均小于0.1％ (Stanislav Melnik,Anna-Cathrine Neumann,Ryan Karongo,etal.Cloning and plant-based production of antibody MC10E7 for a lateral flowimmunoassay to detect [4-arginine]microcystin in freshwater.PlantBiotechnology Journal(2018)16, 27–38)。Zeck等(Zeck A,Eikenberg A,Weller MG,Niessner R.Highly sensitive immunoassay based on a monoclonal antibodyspecific for[4-arginine]microcystins.Analytica Chimica Acta. 2001；441(1):1-13)公开的MC-LR杂交瘤细胞株MC10E7对4号位精氨酸MC具有高度的特异性，该细胞株分泌的单抗对MC-LR、MC-RR、MC-WR和MC-YR具有相似的识别能力，但其对非4号位精氨酸MC，如MC-LA、MC-LW、MC-LF和MC-LY 的交叉反应率均小于0.0063％；Nagata等报道的MC-LR杂交瘤细胞株M8H5主要对MC-LR和MC-RR具有相似识别能力，但对MC-YR和MC-LA交叉反应率偏低，分别为44％和26％(Satoshi Nagata,Hiroshi Soutome,Tomoaki Tsutsumi,et al.Novelmonoclonal antibodies against microcystin and their protective activity forhepatotoxicity.Natural toxins,1995,3:78-86)。另外，Sheng等报道的MC-LR杂交瘤细胞株对MC-YR和 MC-RR交叉反应率仅为12％和7.5％，对非4号位精氨酸的MC-LF和MC-LW的交叉反应率均小于10^-4(％)，广谱识别能力较弱(Jian-Wu Sheng,Miao He*,Han-Chang Shi.Ahighly specific immunoassay for microcystin-LR detection based on amonoclonal antibody. Analytica Chimica Acta,2007,111-118)。如采用这些单链抗体或杂交瘤细胞株为模板构建单链抗体，用于分子对接的模板，获得的MC-LR抗原表位预测结果对MC家族同系物的参考能力较弱。故目前，利用分子对接技术对MC分子进行抗原表位预测的技术尚未见报道。

发明内容

针对上述问题，本发明通过以一株具有对4种MC具有广谱识别能力的抗 MC-LR杂交瘤细胞株为模板，构建其单链抗体，测序获得核苷酸及氨基酸序列。再通过同源建模和分子对接的方法对MC-LR的抗原表位进行了预测，开拓路抗原表位预测的新方式。具体而言，

本发明首先提供了一株微囊藻毒素广谱识别单链抗体，其核苷酸和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

该单链抗体以一株识别MC-LR的杂交瘤细胞株H1-3B3为模板构建(中国典型培养物保藏中心保藏编号：CCTCC No.C2019285，保藏时间：2019年10月30 日，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072)，分类学名称：杂交瘤细胞株5H1-3B3。

保藏号为CCTCC No.C2019的细胞株5H1-3B3与现有报道的MC-LR杂交瘤细胞株相比，具有更强的广谱识别能力。其对MC-LR、MC-RR和MC-YR的识别能力相当(交叉反应率分别为100％、113％和104％)，对非4号位精氨酸的MC-LA 也有较高的交叉反应率(65％)。采用该细胞株为模板构建单链抗体用于的抗原表位预测，相比于特异性强的杂交瘤细胞株，其获得的抗原表位分析结果对其他具有相似识别能力的MC家族同系物具有广泛的参考价值。

申请人在提取该杂交瘤细胞株5H1-3B3总RNA后，扩增出抗体的重链可变区和轻链可变区基因。再通过SOE-PCR法，完成单链抗体的拼接，经过基因测序并推导其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

该单链抗体基因通过人工合成，转入的表达载体pET26b(+)后，化转大肠杆菌BL21进行可溶性表达，并经过酶联免疫吸附试验(ELISA)证明其活性。与现有以杂交瘤细胞株为模板构建的MC-LR单链抗体相比，本申请提供的单链抗体广谱识别能力更强，对MC-RR、MC-YR和MC-LA交叉反应率分别为115％、 112％和58％，对MC-LR、MC-RR、MC-YR、MC-LA具有广谱识别能力。

其次，本发明还提供了该单链抗体在MC-LR抗原表位分析中的应用。

具体而言，上述“单链抗体在MC-LR抗原表位预测中的应用”具体是指：对单链抗体进行同源建模，通过与MC-LR分子对接，预测MC-LR分子中参与单链抗体结合的关键抗原表位及其之间的相互作用力。该抗原表位预测结果通过测定单链抗体交叉反应率的方法得到了验证。

总体而言，本研究以一株抗MC-LR杂交瘤细胞株为模板，构建了单链抗体并验证其活性。再通过同源建模和分子对接，直观的展示了MC-LR与其单链抗体的结合模式，预测了MC-LR的关键抗原表位，并在交叉反应率测定结果中得到了验证。该研究结果有助于加深对MC抗体的广谱或特异性识别能力的理解，并为MC半抗原设计和抗体的体外定向进化提供了有益信息。

附图说明

图1是MC-LR单链抗体基因的构建图。

图2是MC-LR单链抗体的标准抑制曲线示意图。

图3是MC-LR与单链抗体的分子对接结果示意图；

图3A为表面模式(surface mode)，图3B为卡通模式(cartoon mode)。

图4是MC-LR及其同系物的二级结构示意图；

图4A-图4D依次为MC-LR、MC-RR、MC-YR、MC-LA二级结构示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步的描述。

实施例中涉及的试剂、仪器来源：

MC-LR杂交瘤细胞株5H1-3B3由江苏省农业科学院农产品质量安全与营养研究所筛选获得，并在中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号：CCTCC No.C2019285，细胞株编号5H1-3B3，抗体亚型：重链IgG2a型，轻链Kappa型。

MC-LR与牛血清白蛋白的偶联物(MC-BSA)由江苏省农业科学院农产品质量安全与营养研究所制备、保存，制备方法参见“Yu FY,Liu BH,Chou HN,Chu FS.Development of asensitive ELISA for the determination of microcystins in algae. Journal ofAgricultural and Food Chemistry.2002；50(15):4176-82.”的报道。

TRIzol试剂和SuperScriptTMⅢ第一链合成试剂盒购自美国Invitrogen公司。

小鼠scFv构建试剂盒购自南京禾鸣英固生物科技有限公司。

pClone007 Versatile Simple Vector试剂盒购自擎科生物有限公司。

MC-LR单链抗体基因序列委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成，并克隆至pET26b(+)载体。

DNA凝胶回收试剂盒、96孔酶标板购自美国Corning公司。

转化感受态E.coli BL21(DE3)、脱脂奶粉、DEPC水购自北京索莱宝科技有限公司。

酵母提取物和蛋白胨购自Oxoid公司。

葡萄糖、异丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)、脱脂奶粉购自索莱宝生物科技有限公司。

卡那霉素购自迈基生物。镍离子亲和层析柱(His Trap HP)购自GE Health care公司。

HRP标记的抗His标签鼠单克隆抗体购自康为世纪生物科技有限公司。

预制胶、Tris-MOPS蛋白电泳缓冲液和Western blot TMB显色液 (ChromoSensor^TMOne-Solution TMB Substrate)购自南京金斯瑞生物科技有限公司。

3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB)购自南京奥多福尼生物科技有限公司。

MC-LR、MC-RR分别购自农业部环境保护科研检测所。

MC-YR、MC-LA分别购自美国Abraxis BioSciences公司。

以下实施例所用其他化学试剂及有机溶剂均为国产分析纯。

PCR仪(Takara)、金属浴(杭州欧米仪器MIULAB)、小型台式冷冻离心机(Eppendoff)、核酸电泳仪(北京六一DYY-6C型)、垂直板电泳槽(北京君意JY-SCZ2+)、电泳仪电源(北京君意JY600E型)、Western blot转膜电泳仪(北京君意JY-ZY5型)、小型台式离心机(EppendorffCentrifuge 5424R)、超声波细胞破碎仪(南京月旭生物科技YX-1000H)、酶标仪(Thermo Multiskan GO)、洗板机(Thermo Wellwash)、高压灭菌锅(三洋MLS-3750)、超低温冰箱(海尔)、纯水仪(Millipore Direct-Q 3UV)、天平(良平仪器FA2004)、pH计(Sartorius PB-10)、脱色摇床(Scilogex SF-O180-E)、摇床(上海知楚仪器ZQZY-70BF)、恒温培养箱(精宏)。

实施例1 MC-LR单链抗体基因及其表达载体构建

(1)总RNA提取和cDNA第一链的合成

本发明涉及的一株微囊藻毒素广谱识别单链抗体是以江苏省农业科学院农产品质量安全与营养研究所筛选、保存的抗MC-LR杂交瘤细胞株5H1-3B3(保藏编号：CCTCCNo.C2019285)为模板构建而成。该细胞株分泌的单克隆抗体经过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定发现，其对MC-LR、MC-RR和MC-YR 的识别能力相当(交叉反应率分别为100％、113％和104％)，对非4号位精氨酸的MC-LA也有较高的交叉识别能力(65％)。

取1只液氮中冻存的抗MC-LR杂交瘤细胞株(5H1-3B3)，解冻后室温下， 1000g离心3min，弃净上清。参照TRIzol试剂说明书提取总RNA，将提取的总RNA用SuperScript^TMⅢ试剂盒合成cDNA第一链。

(2)单链抗体基因的扩增与拼接

采用小鼠scFv构建试剂盒，以cDNA第一链为模板完成抗体重轻链可变区扩增和单链抗体拼接。拼接后的单链抗体基因经过胶回收纯化后，采用pClone007 VersatileSimple Vector试剂盒，将单链抗体基因连接至克隆载体，化转感受态的 E.coli BL21(DE3)，经M13F和M13R通用引物测序，获得单链抗体核苷酸及氨基酸序列。在单链抗体两端设计引入NotI和NcoI酶切位点，委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成单链抗体基因序列并构建至pet26b(+)载体。

取50μL E.coli BL21(DE3)化转感受态细胞在冰上解冻，加入取1μL带有 MC-LR单链抗体基因的pet26(+)载体(约20ng)，轻柔混合，置于冰上30min， 42℃水浴热击90s，再置于冰面3min，加入1mL 2×TY培养基，37℃100rpm 震荡培养1h。取100μL涂布一块含有1％葡萄糖和50μg/mL卡那霉素的TYE 平板，37℃倒置培养过夜。次日挑取单菌落，接入含1％葡萄糖和50μg/mL卡那霉素的2×TY培养基，37℃，250rpm过夜培养后，菌液测序后，用VectorNIT suite 5.5软件进行核酸和氨基酸序列分析。

图1(A)显示了抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的PCR扩增结果，其中VH基因、VL基因分子量在250bp至500bp之间，分子量大小复合预期。

图1(B)显示了对SOE-PCR的拼接结果，在750bp附近有清晰条带，片段大小符合单链抗体的分子量预期。

经过测序和翻译，单链抗体的核苷酸和氨基酸序列分别为SEQ ID NO.1和 SEQ IDNO.2所示。

(3)单链抗体的可溶性表达与纯化

取50μL-80℃冻存的MC-LR单链抗体株，加入5mL 2×TY(含1％葡萄糖和50μg/mL卡那霉素)，37℃，250rpm震荡培养过夜。次日将2.5mL过夜培养物加入250mL 2×TY(含终浓度0.1％的葡萄糖和50μg/mL卡那霉素)的三角瓶， 37℃，250rpm震荡培养至OD600＝0.9(约3h)。加入终浓度0.25mM的IPTG， 16℃，250rpm震荡培养，培养过夜。次日，培养液4℃1800g离心10min，弃上清。剩余菌体用125mL PBS重悬，斡旋混合均匀，置于冰水浴中超声破碎。超声条件为：输出功率30％，25度，模式06，工作时间30min，超声3s，间隔 4s。4℃，10,000g，离心30min后取上清。用HisTrap HP柱对全菌破碎上清中可溶性表达的单链抗体进行纯化，操作步骤见说明书。

实施例2 MC-LR标准抑制曲线及交叉反应率的测定

本试验用实施例1获得的纯化后的MC-LR单链抗体建立了MC-LR间接竞争性ELISA检测方法，具体步骤如下：

用CBS缓冲液将包被原MC-BSA稀释为2.5μg/mL,100μL/孔加入酶标板， 4℃过夜，PBST洗板3次。200μL/孔加入2％MPBS，37℃温浴1h，PBST洗板 3次。每孔加入50μL 20倍PBS稀释的纯化单链抗体与50μL 0-200ng/mL MC-LR 标准品(0.1％DMF-PBS溶解)。37℃温浴1h，PBST洗板3次。将1:5000倍PBS 稀释的HRP标记的抗His单抗以100μL/孔加入酶标板，37℃温浴1h，PBST洗板3次。将现配的底物溶液(10mL CPBS缓冲液加入100μL二甲亚砜溶解的10mg/ml TMB和25μL 0.65％的H₂O₂)以100μL/孔加入酶标板，37℃静置显色 15min。将2MH₂SO₄以50μL/孔快速加到入酶标板，450nm下读取吸光值。

用MC-LR浓度对数分别对相应的B/B₀值(标准品对应吸光值与零浓度标准品时对应吸光值的比值)作图绘制标准抑制曲线，用Graphpad Prism软件的 ELISA模块进行回归分析，计算抑制中浓度I₅₀，最低检测限I₁₀和线性检测范围 (I₂₀-I₈₀)。

上述标准曲线建立方法为本领域常规技术，本实施例中是使用文献“Liu Yuan,Zhang Cun-zhen,Yu Xiang-yang,Zhang Zhi-yong,Zhang Xiao,Liu Rong-rong, LiuXian-jin,Gong Zhen-ming.Establishment and evaluation of immunoassay forzeranol in bovine urine.Journal of Zhejiang University Science B.2007,8(12):900-905.”中报道的方法。

检测结果如图2所示，图中，B/B₀代表MC-LR标准品对应吸光值与零浓度标准品时对应吸光值的比值。通过标准曲线的回归分析，计算得到MC-LR对单链抗体的抑制终浓度(I₅₀)为7.41μg/mL，最低检测限I₁₀为0.30ng/mL，线性检测范围(I₂₀-I₈₀)在1.32-28.80ng/mL之间。

试验用上述的间接竞争性ELISA检测方法，建立三种同系物MC-RR、 MC-YR和MC-LA对单链抗体的标准抑制曲线，计算I₅₀值。将I₅₀值依据分子量折算成摩尔浓度后，以下公式计算抗体的交叉反应率。

交叉反应率＝100╳I₅₀(MC-LR)/I₅₀(同系物)

实施例3单链抗体在MC-LR抗原表位分析中的应用

(1)单链抗体的同源建模

将MC-LR单链抗体的氨基酸序列上传至SWISS-MODEL网站检索模板和同源建模。发现该单链抗体与PDB编号为5yd5.1.A的单链抗体具有67.93％的序列一致性，且其GMQE和GMEAN评分分别为0.76和-1.16，该序列被作为模板用于MC-LR的同源建模。通过拉氏图模型评价表明92.77％的氨基酸残基位于满意区域，该模型质量良好可以用于分子对接研究。

(2)分子对接与抗原表位预测

采用Autodock vina 1.1.2软件对MC-LR和单链抗体进行对接分析。MC-LR 用ChemBio3D Ultra 14.0package绘制2D结构，再用ChemBio3D Ultra 14.0软件将其转换为3D结构。AutoDockTools 1.5.6package用于生成对接文件。在对接过程中，极性的氢原子被加入抗体分子。单链抗体的grid被设定为center_x: 24.992,center_y:13.734,andcenter_z:44.514with dimensions size_x:18,size_y:15, and size_z:15.exhaustiveness值设定为20.Vina docking score评分最高的对接方式用PyMoL 1.7.6软件(http://www.pymol.org/)进行显示。

结果表明MC-LR和其单链抗体之间的结合能为-8.2kcal·moL^-1。MC-LR采用紧凑形态与富含酪氨酸的单链抗体发生结合(图3)。MC-LR分子中5号位Adda 氨基酸的羰基与Trp-57之间存在氢键，键长为

另外，MC-LR的5号位 Adda氨基酸的苯基与Tyr-186之间存在π-π堆积作用。而MC-LR的4号精氨酸的胍基与Tyr-186和Tyr-245之间存在阳离子-π作用。这几种相互作用力共同使得MC-LR锚定与单链抗体的结合区中。通过分子对接预测表明，5号位Adda 氨基酸的羰基和苯基，以及4号精氨酸的胍基是MC-LR的关键抗原表位。

(4)抗原表位预测结果的验证

表1 MC-LR单链抗体的交叉反应率测定

随后通过试验测定了MC-LR单链抗体对三种MC-LR同系物的交叉反应率 (表1)的方法对抗原表位预测结果进行了验证。

交叉反应率结果表明，MC-LR单链抗体对MC-RR、MC-YR的交叉反应率分别为115％和112％，对MC-LA的交叉反应率为59％，MC-LR单链抗体对 MC-RR和MC-YR具有相似的识别能力，对MC-LA也具有较高的交叉反应率。

如图4所示，图4A-图4D依次为MC-LR、MC-RR、MC-YR、MC-LA二级结构示意图。通过对这些MC同系物的结构比对分析发现：MC-RR和MC-YR 与MC-LR相比，差别仅在于2号位氨基酸(MC-LR为L-Leu，而MC-RR和MC-YR分别为L-Arg和L-Tyr)。而主要参与抗体结合的5号位Adda氨基酸以及4号精氨酸则与MC-LR完全相同。按照抗原表位分析结果，5号位Adda氨基酸的羰基和苯基，以及4号精氨酸的胍基是参与抗体的关键抗原表位，而2号位 L-Leu与单链抗体之间没有较强的相互作用力，这就解释了MC-LR单链抗体对另外两种4号位精氨酸微囊藻毒素(MC-RR和MC-YR)具有相似的识别能力。

另外，MC-LA虽然也具有5号位Adda氨基酸，但其4号位精氨酸被缺乏侧链结构的丙氨酸所替代，胍基的缺失导致了与单链抗体之间无法形成阳离子--π作用，因此单链抗体对MC-LA的结合能力下降，交叉反应率为59％。单链抗体的交叉反应率结果与抗原表位预测结果一致。

以上实施例以保藏编号为CCTCC No.C2019285的MC-LR杂交瘤细胞株 5H1-3B为模板，构建了MC-LR单链抗体，该单链抗体对三种4号位精氨酸微囊藻毒素MC-LR、MC-RR、MC-YR具有相似的识别能力，对非4号位精氨酸微囊藻毒素MC-LA也具有较高的广谱识别能力。该单链抗体被其应用于MC-LR 的抗原表位分析，加深了MC抗体广谱或特异性识别能力的理解，并为MC半抗原设计与抗体的定向改造提供了有益信息。

序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一株微囊藻毒素广谱识别单链抗体及其在抗原表位预测中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 714

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

caggttcagc tgcagcagtc tggagctgag ctgatgaggc ctggggcctc agtgaagata 60

ccctgcaagg ctactggcta cacattcagt agttactgga tagagtgggt aaagcagagg 120

cctggacatg gccttgagtg gattggagag attttacctg gaagtggcag tactcattac 180

aatgagaagt tcaagggcag ggccacattc actgcagata catcctccaa cacagcctac 240

atgcaactca agagcctgac atctgaggac tctgccgtct attattgtgc tagagggact 300

gggagagctt actggggcca agggaccacg gtcaccgtct cctcaggtgg tggtggttct 360

ggtggtggtg gttctggcgg cggcggctcc gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc 420

ttatctgcct ctctgggaga aagagtcagt ctcacttgtc gggcaagtca ggaaattagt 480

ggttacttaa gctggcttca gcagaaacca gatggaactt ttaaacgcct gatctacgcc 540

gcatccactt tagattctgg tgtcccaaaa aggttcagtg gcagtaggtc tgggtcggat 600

tattctctca ccatcagcag ccttgagtct gaagattttg cagactatta ctgtctacaa 660

tatggtagtt atccgtacac gttcggaggg gggaccaagc tggagctgaa acgg 714

<210> 2

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Pro Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr His Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Thr Gly Arg Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser

130 135 140

Leu Gly Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser

145 150 155 160

Gly Tyr Leu Ser Trp Leu Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Phe Lys Arg

165 170 175

Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe

180 185 190

Ser Gly Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu

195 200 205

Glu Ser Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Gly Ser Tyr

210 215 220

Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

225 230 235

Claims (2)

1.一株核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的微囊藻毒素广谱识别单链抗体。

2.如权利要求1所述的微囊藻毒素广谱识别单链抗体在MC-LR抗原表位分析中的应用。

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