CN109384834A - 重组Protein A蛋白及其高效表达和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种重组Protein A蛋白及其高效表达和应用。所述重组Protein A的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，核酸序列为SEQ ID NO.2。本发明的重组Protein A可广泛用于免疫球蛋白亲和层析技术中。本发明还公开了一种由重组Protein A和琼脂糖凝胶相偶联而成的高产无内毒素抗体Protein A亲和填料，其可被应用于各种抗体的亲和层析技术可大大提高了产物的纯度。本发明首次使用毕赤酵母来表达Protein A重组蛋白，无细菌内毒素产生，极大地提高了Protein A的产量，显著降低生产成本，在抗体，特别是国内外巨大的单克隆抗体药物的生产上，提供巨大的经济效益。

Description

重组Protein A蛋白及其高效表达和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地是一种重组Protein A和其高效表达方法及高产无内毒素抗体纯化用Protein A亲和填料和其制备方法。
背景技术
金黄色葡萄球菌蛋白 A（staphylococcus protein A，SPA）是金黄色葡萄球菌细胞壁上的一种蛋白，能够选择性地与免疫球蛋白的Fc结构域结合。它同自然界中许多细菌相同，表面表达多种与宿主免疫球蛋白、血清白蛋白、纤维蛋白原等血清蛋白具有结合活性的蛋白，并通过此介导细菌的致病性。它们是目前研究最多的免疫球蛋白结合蛋白(immunoglobulin (Ig)–binding proteins，IBPs)之一，IBPs是专指由细菌产生的特异结合宿主抗体的细菌免疫球蛋白结合蛋白。研究表明细菌 IBPs 的抗体结合区，均由多个序列高度同源的结构域以头尾相连组成，每个单结构域具有与分子完全相同的结合特性，形成Ig 结合功能的基本单位。
完整的SPA分子量为42kD的单链多肽，由三个部分组成，自N端开始分别为：信号肽S、Ig结合结构域和C-末端X蛋白。SPA含有五个高度同源的单结构域，自N端起分别为E、D、A、B和C，每个单结构域约含58个氨基酸残基，各结构域形成3股反向平行排列的α-螺旋空间结构，与哺乳动物IgG抗体重链中，第二及第三恒定区(CH2γ，CH3γ)间的分界面结合，以螺旋1和螺旋2与Fc的疏水作用为主，并通过两个分子之间的四对氢键得到进一步稳定。SPA还可以结合由人VHⅢ基因家族编码的Fab片段，同时还能结合除IgG外的其它类型抗体。
抗体（antibody），是一种由浆细胞（效应B细胞）分泌，被免疫系统用来鉴别与中和外来物质如细菌、病毒等的大型Y形蛋白质，仅被发现存在于脊椎动物的血液等体液中，及其B细胞的细胞膜表面。经x线晶体衍射结构分析发现，Ig由四条多肽链组成，各肽链之间南数量不等的链间二硫键连接。Ig可形成“Y”字型结构，称为Ig单体，是构成抗体的基本单位。
天然Ig分子含有四条异源性多肽链，其中，分子量较大的两条链称为重链(heavychain，H)，而分子量较小的两条链称为轻链(Light chain，L)。重链分子量为50 000～75000，由450～550个氨基酸残基组成。重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，其抗原性也不同。据此，可将其分为5类(class)，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链和ε链。轻链分子量约为25 000，由214个氨基酸残基构成。轻链可分为两种，分别为kappa(κ)链和lambda(λ)链。
通过分析不同Ig重链和轻链的氨基酸序列发现，重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸序列变化很大，其他部分氨基酸序列相对恒定。因此，将Ig轻链和重链中靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区(variable region，V)，分别占重链和轻链的1/4和1/2；将靠近C端的氨基酸序列相对稳定的区域，称为恒定区(constant region，C)，分别占重链和轻链的3/4和1/2。重链和轻链的V区分别称为VH和VL。VH和VL中各含有3个氨基酸组成和排列顺序高度可变的区域，称为高变区(hypervariable region，HVR)或互补决定区(complementarity determining region，CDR)。重链和轻链的C区分别称为CH和CL。不同型(κ或λ)Ig的CL长度基本一致，但是不同类Ig的CH长度不同，例如IgG、IgA和IgD包括CH1、CH2和CH3，而IgM和IgE则包括CHl、CH2、CH3和CH4。
Protein A（重组Protein A）蛋白亲和层析技术具有很多优点：1)可以纯化小鼠IgG的4个亚类，在一定条件下，可以纯化人的IgG；2)实验操作方便快捷，易于自动化连续工作，可以少量制备，也可以大规模生产；3)纯化后的单克隆抗体产率高，特异性强；4)A蛋白具有良好的再生性，其耐受低pH反复处理的性能极佳，可反复使用。若长期不用，则应保存于叠氮钠或20%的乙醇中，4℃存放。此项技术的主要缺点是该介质的价格昂贵。Protein A蛋白对IgG有高亲和力和特异性，这一特点使之非常适合用于纯化腹水或细胞培养上清中的单克隆抗体(简称单抗)。
Protein A亲和层析法的原理是，Protein A蛋白可与IgG上的Fc段恒定区特异性地结合，早期的Protein A柱结合的都是天然Protein A。天然Protein A由5个IgG结合域和其它未知功能的非Fc结合域组成。这种柱子对IgG的亲和能力很强，可以吸附大量的lgG。但同时，天然Protein A的其他非结合域会和非目标蛋白结合，这样被洗脱下来的蛋白质纯度不够，会影响到后续的试验。
但是，现有技术中的Protein A还存在以下问题：（1）现有技术中的Protein A基因，存在一些不重要的非结合域，偶联该重组Protein A的琼脂糖凝胶在蛋白质纯化中，获得的产物纯度不高；（2）现有技术中的Protein A重组蛋白大部分是用原核表达系统制备的，内毒素含量比较高；（3）现有技术中的Protein A亲和纯化技术介质价格比较昂贵，提高了实验或生产的成本。
发明内容
本发明就是为了解决上述技术问题，所提出的一种重组Protein A和其高效表达方法及高产无内毒素抗体纯化用Protein A亲和填料和其制备方法。
本发明是按照以下技术方案实现的。
一种重组Protein A，所述重组Protein A的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
进一步的，所述重组Protein A的核酸序列为SEQ ID NO.2。
一种上述重组Protein A作为免疫球蛋白结合蛋白在Protein A蛋白亲和层析技术中的应用。
进一步的，所述亲和填料由重组Protein A和琼脂糖凝胶相偶联而成。
进一步的，所述重组Protein A的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
进一步的，所述重组Protein A的核酸序列为SEQ ID NO.2。
一种上述高产无内毒素抗体纯化用Protein A亲和填料在Protein A蛋白亲和层析技术中的应用。
一种上述高产无内毒素抗体纯化用Protein A亲和填料的制备方法，包括以下步骤：
a．称取琼脂糖微球，加入去离子水悬浮溶胀，用纯化水冲洗，抽干备用；
b．将Protein A置换到PBS溶液中，并加入碳酸钠，备用；
c．将Protein A溶液和上述处理后的琼脂糖微球混合，震荡过夜；
d．静置后离心，用含氯化钠的柠檬酸缓冲液和含氯化钠的PBS，交替洗涤，重复3次，再用大量的纯化水冲洗。
一种上述重组Protein A的高效表达方法，包括以下步骤：
a.Protein A 基因克隆及载体质粒的构建
采用DNA全序列合成法来人工合成Protein A核苷酸序列和对应的氨基酸序列，氨基酸序列为SEQ ID NO.1，核酸序列为SEQ ID NO.2；将Protein A核苷酸序列加入酶切位点与pPICZα酵母表达载体连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，测序验证；
b.毕赤酵母表达工程菌的转化和制备
将步骤a中构建的pPICZα-Protein A经限制性内切酶处理后电转化到毕氏酵母菌菌株X33感受态细胞内培养，经抗性选择而获得阳性转化子；
c. 重组酵母工程菌的筛选
将数个含有待表达基因的酵母菌落分别在含有Zeocin抗生素，具有缓冲能力及甘油的基本培养液中培养；培养一段时候后离心收集菌体，菌体再重悬于不含甘油的同种基本培养液内，含0.5%甲醇；每24小时加入100%甲醇至最终浓度为0.5%，在不同的时间点分别收集培养上清液，筛选表达特异蛋白的重组酵母工程菌株；
d.大规模高密度表达、生产和制备重组Protein A蛋白
使用500L和1000L生物发酵罐系统，取一支工程菌种子库，小规模摇床培养开始，然后扩增到一级种子罐、二级种子罐，进入生产发酵罐；经培养至罐内甘油消耗尽，溶氧随之回至底限再回升时，启动甘油流加；待流加结束，溶氧再回升时，启动甲醇流加，进入诱导和重组蛋白生产阶段，维持72小时甲醇流加。
本发明获得了如下有益效果。
本发明获得了一个优于现有技术和现有研发中的Protein A的分子结构，该蛋白是由核苷酸编码的天然蛋白的E、D、A、B和C结构域，除去了一些不重要的非结合域而形成 。本发明用基因工程方法获得的重组Protein A蛋白在0.5M的氢氧化钠溶液中持续2小时，不影响与抗体的结合能力，可广泛用于免疫球蛋白亲和层析技术中。偶联该重组Protein A的琼脂糖凝胶在蛋白质纯化中，的确是提高了产物的纯度。本发明用毕赤酵母表达Protein A重组蛋白，无细菌内毒素产生。本发明采用毕赤酵母表达系统，大大降低Protein A蛋白的生产成本，在500L和1000L发酵罐的表达验证结果表明，重组Protein A的产量可高达10g/L以上，获得了意想不到结果，也获得了极大和意想不到的潜在的巨大经济效益。
附图说明
图1是本发明pPICZа-Protein A重组质粒的构建；
图2是本发明Protein A基因测序结果图；
图3是本发明pPICZа-Protein A重组毕赤酵母表达工程菌电转后平板生长情况图；
图4是本发明重组酵母工程菌的筛选SDS-PAGE蛋白电泳图；
图5是本发明大规模高密度表达重组Protein A蛋白SDS-PAGE蛋白电泳图；
图6是本发明分泌的重组Protein A蛋白的纯化图；
图7是本发明重组Protein A蛋白的蛋白质免疫印迹实验图；
图8是本发明Protein A亲和填料纯化抗体SDS-PAGE蛋白电泳图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述。
实施例1:Protein A 基因克隆及载体质粒的构建
Protein A核苷酸序列
GCTCAACATGATGAAGCTCAACAAAACGCTTTTTACCAAGTTTTGAACATGCCAAACTTGAACGCTGATCAAAGAAACGGTTTTATTCAATCTTTGAAGGATGATCCATCTCAATCTGCTAACGTTTTGGGTGAAGCTCAAAAGTTGAACGATTCTCAAGCTCCAAAGGCTGATGCTCAACAAAACAACTTTAACAAGGATCAACAATCTGCTTTTTACGAAATTTTGAACATGCCAAACTTGAACGAAGCTCAAAGAAACGGTTTTATTCAATCTTTGAAGGATGATCCATCTCAATCTACTAACGTTTTGGGTGAAGCTAAGAAGTTGAACGAATCTCAAGCTCCAAAGGCTGATAACAACTTTAACAAGGAACAACAAAACGCTTTTTACGAAATTTTGAACATGCCAAACTTGAACGAAGAACAAAGAAACGGTTTTATTCAATCTTTGAAGGATGATCCATCTCAATCTGCTAACTTGTTGTCTGAAGCTAAGAAGTTGAACGAATCTCAAGCTCCAAAGGCTGATAACAAGTTTAACAAGGAACAACAAAACGCTTTTTACGAAATTTTGCATTTGCCAAACTTGAACGAAGAACAAAGAAACGGTTTTATTCAATCTTTGAAGGATGATCCATCTCAATCTGCTAACTTGTTGGCTGAAGCTAAGAAGTTGAACGATGCTCAAGCTCCAAAGGCTGATAACAAGTTTAACAAGGAACAACAAAACGCTTTTTACGAAATTTTGCATTTGCCAAACTTGACTGAAGAACAAAGAAACGGTTTTATTCAATCTTTGAAGGATGATCCATCTGTTTCTAAGGAAATTTTGGCTGAAGCTAAGAAGTTGAACGATGCTCAAGCTCCAAAG
Protein A氨基酸序列
AQHDEAQQNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKDDPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKADAQQNNFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKADNNFNKEQQNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLSEAKKLNESQAPKADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPKADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKDDPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK
采用DNA全序列合成法来人工合成Protein A核苷酸序列（由北京擎科新业生物技术有限公司合成）。分别在其N端加上XhoⅠ酶切位点，在其C端加上XbaⅠ酶切位点，用这两个酶分别酶切合成的目的基因和pPICZα酵母表达载体；目的基因与pPICZα酵母表达载体的连接：具体步骤：将酶切后的目的基因与pPICZα酵母表达载体按一定比例混合，并加入连接buffer和连接酶，22℃连接1小时；连接产物转化DH5α感受态细胞，具体步骤：将连接产物加入DH5α感受态细胞，冰浴30分钟，42℃热激90秒，再冰浴2分钟，加入培养基置于摇床中，150rpm，45分钟，12000rpm离心1分钟，涂板。测序验证，具体步骤：挑取单克隆，扩大培养，小量提取质粒，酶切鉴定（如图1所示，A. Protein A合成基因XhoⅠ&XbaⅠ双酶切，目的条带大小约900bp；B. pPICZа载体XhoⅠ&XbaⅠ双酶切，载体条带大小约3.6kb；C. pPICZа-ProteinA重组质粒XhoⅠ&XbaⅠ双酶切鉴定，目的条带大小约900bp，与预期目的条带大小一致），挑选出酶切得到与目的片段大小一致的质粒，并进行测序确认，测序引物为P1和P2，测序结果如图2所示（测序由北京擎科新业生物技术有限公司进行）。
P1：CTGGTTCCAATTGACAAGC
P2：CAAATGGCATTCTGACATCC
实施例2:毕赤酵母表达工程菌的转化和制备
将毕氏酵母菌菌株X33菌落接种于含5ml YPD培养液的50ml离心管中，以250转/分的速度于30℃下培养过夜。次日取0.2ml过夜培养物再转接入500ml YPD的培养液中，置于2升的三角培养瓶中。在30℃下旋转培养2-3小时，使细胞密度达到OD600=1.3-1.5。酵母菌经离心方法收集，再重悬于500ml冰预冷的无菌水中洗涤两次。然后酵母菌悬于20ml冰预冷的1MSortbitol溶液洗涤一次。
将实施例1构建的pPICZα-Protein A质粒DNA经Pme I限制性内切酶处理后，形成线性质粒分子。取5μg线性化后质粒DNA与80μl处理后的酵母菌相混合并置于0.2厘米厚的电极杯内，置于电转仪上。电脉冲条件为电压7500V/CM，电极间隔时间为5-10（ms）。电击处理后，立即加入1ml冰预冷的1M Sorbitol溶液于酵母菌中，然后转入15ml试管中。转化的酵母菌置于30℃培养箱中放置2小时，然后接种涂布在含Zeocin抗生素的YPD平板培养基上（如图3所示）。经抗性选择而生长出的克隆，再用分子生物学方法鉴定其基因的插入。蛋白质的表达与分泌则以SDS-PAGE或用特异抗体做蛋白质免疫印迹检测。
实施例3: 重组酵母工程菌的筛选
将数个含有待表达基因的酵母菌落分别在含有Zeocin抗生素，具有缓冲能力及甘油的基本培养液中培养。以300转/分的速度培养至菌体密度达到OD600=2-6。培养物经1500转/分，15分钟条件下离心收集菌体，菌体再重悬于同种基本培养液但不含甘油，改含0.5%甲醇，细胞密度达到OD600=1.0，继续培养。酵母菌在甲醇的诱导下，外源蛋白在启动子的作用下开始表达。其后，每24小时加入100%甲醇至最终浓度为0.5%。在不同的时间点分别收集培养上清液。使用SDS-PAGE变性聚丙烯酰胺凝胶电泳初步测定Protein A重组蛋白的表达，筛选表达特异蛋白的重组酵母工程菌株。图4是本发明重组酵母工程菌的筛选SDS-PAGE蛋白电泳图，泳道M：蛋白质标准分子量（由上至下：97.4kD，66.2kD，43.0kD，31.0kD，20.1kD，14.4kD）；泳道1：酵母工程菌表达的重组Protein A，分子量～33kD。
实施例4: 大规模高密度表达重组Protein A蛋白
使用500L和1000L（吨级）生物发酵罐系统开展Protein A重组蛋白的吨级规模化生产和发酵工艺以及公斤级重组Protein A蛋白的制备工艺和技术建立。重组酵母工程菌按上述方法研发的工艺程序制备工程菌种子库。取一支工程菌种子库接种到三角瓶中，从小规模摇床培养开始，然后扩增到一级种子罐、二级种子罐，进入生产发酵罐（1吨体积）。经培养至罐内甘油消耗尽，溶氧随之回至底限再回升时，启动甘油流加。待流加结束，溶氧再回升时，启动甲醇流加，进入诱导和重组蛋白生产阶段，维持72小时甲醇流加。可在不同培养时间点取样测试重组蛋白的表达。对于分泌型蛋白在细胞内及培养液中的含量均用SDS-PAGE方法进行分析，表达水平和纯度在每一步中均进行监测。结果显示发酵液中的重组ProteinA蛋白的表达水平在10g/L左右。图5是本发明大规模高密度表达重组Protein A蛋白SDS-PAGE蛋白电泳图，泳道M：蛋白质标准分子量（由上至下：97.4kD，66.2kD，43.0kD，31.0kD，20.1kD，14.4kD）；泳道1：诱导表达45小时的重组Protein A，分子量～33kD；泳道2：诱导表达72小时的重组Protein A，分子量～33kD。
实施例5: 分泌的重组Protein A蛋白的纯化与特性
重组Protein A蛋白经酵母工程菌发酵培养直接分泌到上清液。经连续流离心将含有分泌出的重组Protein A蛋白上清液与菌体分离后，直接上美国GE公司的MMC分离填料介质，用柱层析法将目标蛋白质收集，纯化方法：25mM NaAc-HAc pH5.0平衡液平衡纯化柱并上样，50mM PB pH 7.0将杂蛋白洗脱，50mM PB pH 7.0，0.6M NH4Cl，将目的蛋白洗脱。进入下一步疏水型层析柱的精纯，纯化方法：50mM PB pH 7.0，1.2M NH4Cl的平衡液平衡纯化柱并上样，20mM PB pH 7.0将目的蛋白洗脱。再进入下一步离子交换层析柱的精纯，纯化方法：50mM Tris-HCl pH7.3的平衡液平衡纯化柱并上样，50mM Tris-HCl+300mM NaClpH7.3，将目的蛋白洗脱，得到纯度达98%以上的重组Protein A。另，纯化过程中所用试剂均是去除内毒素的，具体方法：用0.5摩尔的氢氧化钠冲洗出液口和排压口直至流出碱后继续冲洗3个柱体积，之后用纯水冲洗5个柱体积，即可过滤纯化试剂。利用常规方法来决定蛋白质的浓度，如Lowyr法蛋白质浓度测定方法。精纯后，重组Protein A蛋白的纯度可达98%以上。图6是本发明分泌的重组Protein A蛋白的纯化图，泳道M：蛋白质标准分子量；泳道1：GEMMC分离填料介质纯化结果；泳道2：PHP疏水柱纯化结果；泳道3：QFF离子交换柱纯化结果。
实施例6:纯化后的Protein A内毒素测定
测定方法依据中华人民共和国药典2015年版三部通则1143，细菌内毒素检查，测得纯化后重组Protein A蛋白内毒素含量≤0.5 EU/mg。
实施例7：重组纯化Protein A蛋白的蛋白质免疫印迹实验
精纯得到的重组纯化Protein A蛋白进行SDS-PAGE电泳，然后转PVDF膜，洗膜后加入5%的脱脂奶粉封闭，洗膜后加入HRP标记的鸡抗Protein A多克隆抗体（Abcam公司Cat:ab18596）4℃孵育过夜，次日洗膜并加入显色液。图7是本发明重组纯化Protein A蛋白的蛋白质免疫印迹实验图，泳道M：蛋白质标准分子量；泳道1：重组纯化Protein A蛋白，分子量～33kD。
实施例8: Protein A亲和填料制备和抗体纯化应用
高产无内毒素抗体纯化Protein A亲和填料的制备方法，包括以下步骤：称取琼脂糖微球，加入去离子水悬浮溶胀（质量体积比例为1:10），用纯化水冲洗，抽干备用。将重组Protein A置换到PBS溶液中并浓缩，重组Protein A的浓度为5mg/ml，再加入碳酸钠使其终浓度为0.2摩尔，备用。将重组Protein A和上述处理后的琼脂糖微球混合（混合比例约10mg重组Protein A/1g琼脂糖微球），震荡过夜。静置后离心，用含氯化钠的柠檬酸缓冲液（pH4.0）和含氯化钠的PBS（pH8.0），交替洗涤，重复3次，再用大量的纯化水冲洗。
上述制备Protein A亲和填料用于抗体纯化，并与A公司(英潍捷基公司)的Protein A Sepharose 4B亲和填料对比，SDS-PAGE结果显示，本发明制备的Protein A亲和填料纯化的抗体含量和纯度均高于A公司。图8是本发明Protein A亲和填料纯化抗体SDS-PAGE蛋白电泳图，泳道M：蛋白质标准分子量；泳道1：A公司Protein A亲和填料纯化结果；泳道2：本发明中Protein A亲和填料纯化结果。
序列表
<110> 天津林达生物科技有限公司
天津溥瀛生物科技有限公司
<120> 重组Protein A蛋白及其高效表达和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 291
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
Ala Gln His Asp Glu Ala Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn
1 5 10 15
Met Pro Asn Leu Asn Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu
20 25 30
Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Gln Lys
35 40 45
Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Ala Gln Gln Asn Asn Phe
50 55 60
Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn
65 70 75 80
Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp
85 90 95
Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu
100 105 110
Ser Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Asn Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn
115 120 125
Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg
130 135 140
Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn
145 150 155 160
Leu Leu Ser Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Ala
165 170 175
Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu
180 185 190
His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser
195 200 205
Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys
210 215 220
Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Ala Asp Asn Lys Phe Asn Lys
225 230 235 240
Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Thr
245 250 255
Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser
260 265 270
Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln
275 280 285
Ala Pro Lys
290
<210> 2
<211> 873
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
gctcaacatg atgaagctca acaaaacgct ttttaccaag ttttgaacat gccaaacttg 60
aacgctgatc aaagaaacgg ttttattcaa tctttgaagg atgatccatc tcaatctgct 120
aacgttttgg gtgaagctca aaagttgaac gattctcaag ctccaaaggc tgatgctcaa 180
caaaacaact ttaacaagga tcaacaatct gctttttacg aaattttgaa catgccaaac 240
ttgaacgaag ctcaaagaaa cggttttatt caatctttga aggatgatcc atctcaatct 300
actaacgttt tgggtgaagc taagaagttg aacgaatctc aagctccaaa ggctgataac 360
aactttaaca aggaacaaca aaacgctttt tacgaaattt tgaacatgcc aaacttgaac 420
gaagaacaaa gaaacggttt tattcaatct ttgaaggatg atccatctca atctgctaac 480
ttgttgtctg aagctaagaa gttgaacgaa tctcaagctc caaaggctga taacaagttt 540
aacaaggaac aacaaaacgc tttttacgaa attttgcatt tgccaaactt gaacgaagaa 600
caaagaaacg gttttattca atctttgaag gatgatccat ctcaatctgc taacttgttg 660
gctgaagcta agaagttgaa cgatgctcaa gctccaaagg ctgataacaa gtttaacaag 720
gaacaacaaa acgcttttta cgaaattttg catttgccaa acttgactga agaacaaaga 780
aacggtttta ttcaatcttt gaaggatgat ccatctgttt ctaaggaaat tttggctgaa 840
gctaagaagt tgaacgatgc tcaagctcca aag 873

Claims (9)

1.一种重组Protein A，其特征在于：所述重组Protein A的氨基酸序列为SEQ IDNO.1。
2.根据权利要求1所述的一种重组Protein A，其特征在于：所述重组Protein A的核酸序列为SEQ ID NO.2。
3.一种权利要求1、2所述的重组Protein A作为免疫球蛋白结合蛋白在Protein A蛋白亲和层析技术中的应用。
4.一种高产无内毒素抗体纯化Protein A亲和填料，其特征在于：所述亲和填料由重组Protein A和琼脂糖凝胶相偶联而成。
5.根据权利要求4所述的一种高产无内毒素抗体纯化Protein A亲和填料，其特征在于：所述重组Protein A的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
6.根据权利要求4所述的一种高产无内毒素抗体纯化Protein A亲和填料，其特征在于：所述重组Protein A的核酸序列为SEQ ID NO.2。
7.一种权利要求4-6所述高产无内毒素Protein A亲和填料在抗体纯化的亲和层析技术中的应用。
8.一种权利要求4-6所述高产无内毒素抗体纯化用Protein A亲和填料的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
a．称取琼脂糖微球，加入去离子水悬浮溶胀，用纯化水冲洗，抽干备用；
b．将Protein A置换到PBS溶液中，并加入碳酸钠，备用；
c．将Protein A溶液和上述处理后的琼脂糖微球混合，震荡过夜；
d．静置后离心，用含氯化钠的柠檬酸缓冲液和含氯化钠的PBS，交替洗涤，重复3次，再用大量的纯化水冲洗。
9.一种权利要求1-3所述重组Protein A的高效表达方法，其特征在于：包括以下步骤：
a. Protein A 基因克隆及载体质粒的构建
采用DNA全序列合成法来人工合成Protein A核苷酸序列和对应的氨基酸序列，氨基酸序列为SEQ ID NO.1，核酸序列为SEQ ID NO.2；将Protein A核苷酸序列加入酶切位点与pPICZα酵母表达载体连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，测序验证；
b. 毕赤酵母表达工程菌的转化和制备
将步骤a中构建的pPICZα-Protein A经限制性内切酶处理后电转化到毕氏酵母菌菌株X33感受态细胞内培养，经抗性选择而获得阳性转化子；
c. 重组酵母工程菌的筛选
将数个含有待表达基因的酵母菌落分别在含有Zeocin抗生素，具有缓冲能力及甘油的基本培养液中培养；培养一段时候后离心收集菌体，菌体再重悬于不含甘油的同种基本培养液内，含0.5%甲醇；每24小时加入100%甲醇至最终浓度为0.5%，在不同的时间点分别收集培养上清液，筛选表达特异蛋白的重组酵母工程菌株；
d. 大规模高密度表达和生产制备重组Protein A蛋白
使用500L和1000L生物发酵罐系统，取一支工程菌种子库，小规模摇床培养开始，然后扩增到一级种子罐、二级种子罐，进入生产发酵罐；经培养至罐内甘油消耗尽，溶氧随之回至底限再回升时，启动甘油流加；待流加结束，溶氧再回升时，启动甲醇流加，进入诱导和重组蛋白生产阶段，维持72小时甲醇流加。
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