CN103145813A

CN103145813A - 一种分离纯化重组蛋白a的方法

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Publication number: CN103145813A
Application number: CN201310061920XA
Authority: CN
Inventors: 陈校园; 余波光; 张海珍; 周彤
Original assignee: GUANGZHOU KANG HUAI BIOLOGY SCIENCE AND TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Kangsheng Biotechnology Co., Ltd
Priority date: 2013-02-27
Filing date: 2013-02-27
Publication date: 2013-06-12
Anticipated expiration: 2033-02-27
Also published as: CN103145813B

Abstract

本发明涉及一种分离纯化重组蛋白A的方法，属于生物工程技术领域的蛋白质分离纯化技术。本发明提供一种利用加热处理和活性炭吸附相结合分离纯化重组蛋白A的方法。应用该方法分离纯化得到的重组蛋白A，其纯度可达95%以上，最终蛋白A的回收率可达60%以上，回收的蛋白质溶液中的内毒素含量<10EU/mg，如果纯化方法中还包含疏水层析，则内毒素含量可降至1EU/mg以下。该方法具有成本低，回收率高，便于工业化生产的优点，为重组蛋白A的规模化生产提供了一条切实可行的途径。

Description

一种分离纯化重组蛋白A的方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及重组蛋白A的纯化及内毒素的去除方法。

背景技术

金黄色葡萄球菌蛋白A（Staphylococcus aureus Protein A，SPA）是金黄色葡萄球菌细胞壁的组成成分。SPA能与人及多种哺乳动物的血清IgG分子中的Fc片段特异性结合，因此已经被广泛用于抗体的分离纯化，以及在临床上用于治疗抗体相关性疾病。

由于蛋白A的用途广泛，市场需求量日益增加。仅从金黄色葡萄球菌中直接提取天然蛋白，不仅无法满足市场需求而且这种获取蛋白A的方法复杂性高；金黄色葡萄球菌是致病菌，大规模生产危险性大，容易发生治病物质残留等一系列问题。因此近年来人们开始转向基因工程的方法来生产重组蛋白A。由于使用的基因工程菌-大肠杆菌含大量的内毒素，因此生产的重组蛋白A极易受到内毒素污染；而对于蛋白A用于抗体药物的纯化生产或临床治疗而言，内毒素的危害都是显而易见的。因此，对于蛋白A的分离纯化而言，不仅要求达到较高的纯度，还要严格控制内毒素的含量。

目前，重组蛋白A的分离纯化主要有如下几种：a)一步法，即通过一步凝胶筛分（CN 1432578A,CN 1524957A等）、一步镍离子螯合层析（CN 101050464A）或一步亲和层析（CN 101921818A）获得目的产物；b)多步法，包括采用亲和层析—阴离子交换层析两步法（US 5075423A）、疏水层析—阳离子交换层析两步法（US6555661B1）和热处理—离子交换层析—乙醇沉淀三步法（US 5314993 A）。

国内专利申请所公开的重组蛋白A的纯化方法均未涉及到内毒素去除的效果。对凝胶筛分法而言，由于处理量小、速度慢，而且无法去除内毒素，因而根本无法用于蛋白A的工业化生产。而对于亲和层析、离子交换层析和金属离子螯合层析等的纯化方法，为去除内毒素，必须使用大量的含表面活性剂的缓冲液（体积为层析介质体积的十几倍至几十倍）冲洗层析介质，这不仅很不环保，而且在冲洗过程中由于蛋白A的脱吸附而极大的影响回收率，特别是在介质经多次使用而性能下降时，蛋白A的损失尤为明显。另外，层析介质一般价格昂贵、稳定性不高（如镍离子螯合层析介质、亲和层析介质等）；并且在实际生产蛋白A的两个批次之间，必须使用NaOH或盐酸胍等对介质进行在位清洗和消毒，这也会加速层析介质的性能下降、使用寿命缩短。这些因素都使得采用层析的纯化方法成本较高。综上所述，目前在工业上使用的蛋白A纯化方法主要存在回收率较低或成本高的缺点。

另一方面，众所周知的是，活性炭可以吸附内毒素，却很难用于去除蛋白溶液中的内毒素，原因是在去除内毒素的同时，活性炭也能吸附蛋白质，导致回收率很低。因此若要使用活性炭去除蛋白溶液中的内毒素，必须解决蛋白回收率的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种成本低、回收率高、适于工业化生产的蛋白A分离纯化方法，以解决目前的蛋白A纯化方法存在的回收率较低或成本高的问题，同时解决活性炭吸附过程中蛋白回收率低的问题。

本发明所述的蛋白A或重组蛋白A是指全长或仅含其中某个或某些结构域的蛋白A基因经克隆、转化、并在大肠杆菌细胞内表达得到的重组蛋白质。

本发明所采用的技术方案是：

一种重组蛋白A分离纯化的方法，它包括如下步骤：

（1）菌体悬浮液加热处理；

（2）对步骤（1）所得破碎上清第一次活性炭吸附；

（3）对步骤（2）所得上清溶液第二次活性炭吸附；

特别地，还包括：

（4）将步骤（3）获得的蛋白A溶液上样至已用缓冲液平衡的疏水相互作用层析柱，收集穿流峰，得精纯蛋白A溶液。

具体地，其步骤如下：

（1）取含重组蛋白A的菌体，用PBS缓冲液混匀菌体，加入溶菌酶，水浴搅拌后，置于沸水浴搅拌，冷却后离心得破碎上清；

（2）破碎上清中加入无机盐、Triton X-100，搅拌均匀后，加入活性炭，置水浴中搅拌进行第一次吸附，离心得上清溶液；

（3）上步所得的上清溶液中，再加入无机盐、Triton X-100，搅拌均匀后，加入活性炭，置水浴中搅拌进行第二次吸附，离心后得蛋白A溶液。

另外，上述步骤之后还附加包括下述步骤：

（4）将步骤（3）中所得的蛋白A溶液上样至已用PBS缓冲液平衡的疏水相互作用层析柱，收集穿流峰，即得精纯蛋白A溶液。

更为具体地，包括如下步骤：

（1）取含重组蛋白A的菌体，用4倍体积重量比的PBS缓冲液混匀菌体，加入溶菌酶至浓度为1mg/ml，于60℃水浴搅拌1h，置于沸水浴搅拌30min，冷却后离心得破碎上清，所述PBS缓冲液为含浓度为8.0mmol/L的磷酸氢二钠、2.0mmol/L的磷酸二氢钾和131mmol/L的NaCl的混合溶液；

（2）破碎上清中加入无机盐至浓度增加了0.3mol/L ，加入Triton X-100至体积百分比浓度为0.5-4%（v/v），搅拌均匀后按重量体积比加入4%的活性炭，置60℃水浴中搅拌4h进行第一次吸附，离心得上清溶液；

（3）再加入无机盐至浓度增加了0.3mol/L ，加入Triton X-100至体积百分比浓度增加了0.5-4%（v/v），搅拌均匀后按重量体积比加入4%活性炭，置60℃水浴中搅拌4h进行第二次吸附，离心后得蛋白A溶液。

特别地，还包括：

（4）将步骤（3）中所得的蛋白A溶液上样至已用PBS缓冲液平衡的疏水相互作用层析柱，收集穿流峰，即得精纯蛋白A溶液，所述PBS缓冲液为含浓度为8.0mmol/L的磷酸氢二钠、2.0mmol/L的磷酸二氢钾、1.5mol/L的NaCl和体积百分比浓度为0.5%的Triton X-100的混合溶液。

本发明中用1mg/ml的溶菌酶对菌悬液在60℃下处理1h后，继续加热煮沸30min处理，与溶菌酶-超声破碎相比，操作更为简单，且破碎效率也更高。溶菌酶-超声破碎中，破碎后释放出的蛋白含量约占总细胞蛋白含量的70%，而加热煮沸处理后，可达到80%-90%。

本发明步骤（2）中，Triton X-100的体积百分比浓度为0.5-4%，优选2%；步骤（3）中，加入Triton X-100至体积百分比浓度增加0.5-4%，优选2%。

本发明步骤（2）中所用活性炭为粉末状，优选为药用活性炭，具有纯度高，过滤速度快，孔隙结构较大（200-325目），性质稳定等特点。本发明加入了无机盐可以提高离子强度，可选用的含有钠、钾、铵离子的无机盐，如：NaCl、KCl、硫酸铵；优选NaCl。

经过两次活性炭吸附后，蛋白A纯度可达95%以上，回收率可达60%以上，蛋白A的内毒素含量< 10EU /mg。

为进一步去除内毒素，本发明还可以包括步骤（4），经疏水相互作用后，蛋白A的内毒素含量可降至 1EU /mg以下，同时蛋白A纯度进一步提高。层析介质可采用市场上流通的任一种疏水层析介质，优选是苯基琼脂糖凝胶（Phenyl Sepharose ）6FF。

活性炭吸附在去除内毒素的同时，也会吸附蛋白质。本发明在进行活性炭吸附时加入Triton X-100，可有效抑制活性炭对蛋白的吸附，从而提高蛋白回收率。未使用Triton X-100时，蛋白A回收率为20-40%，加入Triton X-100后升高至60%以上。

离子螯合层析或离子交换层析也可以用于纯化蛋白A，但需要采用大量的冲洗液才能去除内毒素。在冲洗过程中，由于蛋白A脱吸附，回收率往往只有50-60%，特别是在层析介质经多次使用性能下降后，冲洗过程中脱吸附的蛋白A更多，回收率可低至15-25%。另外，层析介质往往价格昂贵，大量冲洗液的使用也大大增加了成本。总的来看，离子螯合层析方法每生产1g蛋白A需要成本3500元人民币，离子交换层析每生产1g蛋白A需要成本500元人民币，而采用本发明方法每生产1g蛋白A只需280元。本发明的成本最低，且材料易于获得。

根据杂蛋白与内毒素的疏水性都很强，容易与疏水填料结合，而重组蛋白A的疏水性较弱的特点，在本发明的步骤（4）中，目的蛋白流经疏水层析柱经穿流峰收集，而杂蛋白及内毒素与层析填料结合，进一步去除内毒素并提高蛋白A纯度。

综上所述，与现有技术相比，本发明的有益效果是：提供了一种新的重组蛋白A的纯化方法，可有效纯化蛋白A和去除内毒素，并且蛋白回收率较高、成本低，适合于工业化生产重组蛋白A。

附图说明

图1为本发明实施例3纯化过程的SDS-PAGE凝胶电泳图。

具体实施方式

以下通过实施例结合附图对本发明作进一步的详细说明，这并不限制本发明的保护范围。

实施例1：活性炭吸附除内毒素

1）取含重组蛋白A的菌体700g，按质量：体积比为1：4加入2800 mL的PBS缓冲液（含8.0mM磷酸氢二钠、2.0mM磷酸二氢钾、131mM NaCl），充分搅拌使菌体溶解，然后加入溶菌酶至浓度为1mg/ml，于60℃水浴搅拌1h，再置于沸水浴搅拌30min，冷却后离心得破碎上清；

2）将破碎上清分成7等份，每份加入NaCl 至浓度增加0.3mol/L，加入Triton X-100至浓度分别为0、0.25%、0.5%、1%、2%、4%、6%（v/v），搅拌均匀后按质量：体积比加入4%活性炭，置60℃水浴中搅拌4h进行第一次吸附，离心得上清溶液；

3）再加入NaCl至浓度增加0.3mol/L，加入Triton X-100至浓度分别增加0、0.25%、0.5%、1%、2%、4%、6%（v/v），Triton X-100的增加量与步骤2）中添加量一一对应。搅拌均匀后按质量：体积比加入4%活性炭，置60℃水浴中搅拌4h进行第二次吸附，离心除去活性炭得蛋白A溶液。经凝胶法检测得到的重组蛋白A溶液中内毒素含量，经BCA法检测吸附前后蛋白质回收率。检测结果如表一所示：

表一：Triton X-100添加量对内毒素和蛋白质回收率的影响。

Figure 201310061920X100002DEST_PATH_IMAGE001

实施例2：疏水层析去除内毒素

1）取含重组蛋白A的菌体100g，按质量：体积比为1：4加入400mL的PBS缓冲液（含

8.0mM磷酸氢二钠、2.0mM磷酸二氢钾、131mM NaCl），充分搅拌使菌体溶解，然后加入溶菌酶至浓度为1mg/ml，于60℃水浴搅拌1h，再置于沸水浴搅拌30min，冷却后离心得破碎上清；

2）破碎上清中加入NaCl 至浓度增加0.3mol/L，加入Triton X-100至浓度为0.5%（v/v），搅拌均匀后按质量：体积比加入4%活性炭，置60℃水浴中搅拌4h进行第一次吸附，离心得上清溶液；

3）再加入NaCl至浓度增加0.3mol/L，加入Triton X-100至浓度浓度增加0.5%（v/v），搅拌均匀后按质量：体积比加入4%活性炭，置60℃水浴中搅拌4h进行第二次吸附，离心除去活性炭得蛋白A溶液；

4) 用pH=7.0的PBS缓冲液（含8.0mM磷酸氢二钠、2.0mM磷酸二氢钾、1.5MNaCl、0.5%Triton X-100）平衡Phenyl Sepharose 6 Fast Flow疏水相互作用层析柱，至基线；

5) 取步骤3）得到的重组蛋白A溶液（内毒素小于10EU/mg），调节离子强度和pH值与步骤4）中PBS缓冲液一致然后上样，收集穿流峰，得到精纯重组蛋白A溶液；

6）经凝胶法检测得到回收的重组蛋白A溶液中内毒素含量小于1EU/mg，经BCA法测得过柱前后蛋白质回收率为95%。

实施例3：疏水层析去除内毒素

2）破碎上清中加入NaCl 至浓度增加0.3mol/L，加入Triton X-100至浓度为2%（v/v），搅拌均匀后按质量：体积比加入4%活性炭，置60℃水浴中搅拌4h进行第一次吸附，离心得上清溶液；

3）再加入NaCl至浓度增加0.3mol/L，加入Triton X-100至浓度增加2%（v/v），搅拌均匀后按质量：体积比加入4%活性炭，置60℃水浴中搅拌4h进行第二次吸附，离心除去活性炭得蛋白A溶液；

6）经凝胶法检测得到回收的重组蛋白A溶液中内毒素含量小于1EU/mg，经BCA法测得过柱前后蛋白质回收率为96%。

本发明实施例3纯化过程的SDS-PAGE凝胶电泳结果如图1所示，其中泳道1为菌体破碎后的上清，泳道2为活性炭第一次吸附后的上清溶液，泳道3活性炭第二次吸附后的蛋白A溶液，泳道4为精纯重组蛋白A，重组蛋白A的分子量大小约为21 kDa。泳道5为低分子量蛋白marker，由上往下分子量大小分别为97.2kDa、66.4 kDa、44.3 kDa、29.0 kDa、20.1 kDa、14.3 kDa。

实施例4：疏水层析去除内毒素。

1）取含重组蛋白A的菌体100g，按质量：体积比为1：4加入400mL的PBS缓冲液（含8.0mM磷酸氢二钠、2.0mM磷酸二氢钾、131mM NaCl），充分搅拌使菌体溶解，然后加入溶菌酶至浓度为1mg/ml，于60℃水浴搅拌1h，再置于沸水浴搅拌30min，冷却后离心得破碎上清；

2）破碎上清中加入NaCl 至浓度增加0.3mol/L，加入Triton X-100至浓度为4%（v/v），搅拌均匀后按质量：体积比加入4%活性炭，置60℃水浴中搅拌4h进行第一次吸附，离心得上清溶液；

3）再加入NaCl至浓度增加0.3mol/L，加入Triton X-100至浓度增加4%（v/v），搅拌均匀后按质量：体积比加入4%活性炭，置60℃水浴中搅拌4h进行第二次吸附，离心除去活性炭得蛋白A溶液；

实施例5：效果评价

以重组蛋白A为配基的吸附剂，对人血清中抗体的吸附效果评价。

利用高碘酸钠氧化法，将实施例1步骤2）中Triton X-100加入量或步骤3中Triton X-100增加量为0.5%、2%、4% 时得到的蛋白A溶液及实施例2、3、4得到的精纯蛋白A溶液分别偶联到Sepharose 6 F.F上。具体方法如中国专利20100512304.8所述。通过模拟临床上免疫吸附的步骤，采用体外对血浆内免疫球蛋白吸附性能测试，以此来评价免疫吸附材料的吸附性能，进而可以了解其临床使用价值，具体步骤如中国专利20100512304.8所示，以差值法计算以重组蛋白A为配基的免疫吸附剂对人血浆中IgG的吸附量。结果如表二所示：

表二蛋白A吸附性能测定

实施例编号	Triton X-100加入量（%）	吸附量（mg/mL胶）
			1	0.5	26
1	2	27
			1	4	26
2	0.5	29
			3	2	30
4	4	29

Claims

1.一种分离纯化蛋白A的方法，其步骤如下：

（1）菌体悬浮液加热处理；

（2）对步骤（1）所得破碎上清第一次活性炭吸附；

（3）对步骤（2）所得上清溶液第二次活性炭吸附。

2.根据权利要求1所述的一种分离纯化蛋白A的方法，其特征在于还包括步骤（4）：将步骤（3）中获得的蛋白A溶液上样至已用缓冲液平衡的疏水相互作用层析柱，收集穿流峰，得精纯蛋白A溶液。

3.根据权利要求1所述的一种分离纯化蛋白A的方法，其步骤如下：

4.根据权利要求3所述的一种分离纯化蛋白A的方法，其特征在于还包括步骤（4）：将步骤（3）中所得的蛋白A溶液上样至已用PBS缓冲液平衡的疏水相互作用层析柱，收集穿流峰，即得精纯蛋白A溶液。

5.根据权利要求3所述的一种分离纯化蛋白A的方法，其步骤如下：

（2）破碎上清中加入无机盐至浓度增加了0.3mol/L ，加入Triton X-100至体积百分浓度为0.5-4%（v/v），搅拌均匀后按重量体积比加入4%的活性炭，置60℃水浴中搅拌4h进行第一次吸附，离心得上清溶液；

6.根据权利要求5所述的一种分离纯化蛋白A的方法，其特征在于还包括步骤（4）：将步骤（3）中所得的蛋白A溶液上样至已用PBS缓冲液平衡的疏水相互作用层析柱，收集穿流峰，即得精纯蛋白A溶液，所述PBS缓冲液为含浓度为8.0mmol/L的磷酸氢二钠、2.0mmol/L的磷酸二氢钾、1.5mol/L的NaCl、体积百分比浓度为0.5%的Triton X-100的混合溶液。

7.根据权利要求 5所述的一种分离纯化蛋白A的方法，其特征在于：步骤（2）所述的加入Triton X-100至体积百分比浓度为2%（v/v）；步骤（3）所述的加入Triton X-100至体积百分比浓度增加为2%（v/v）。

8.根据权利要求3或5所述的一种分离纯化蛋白A的方法，其特征在于：所述无机盐选自含有钠、钾或铵离子的无机盐。

9.根据权利要求3或5所述的一种分离纯化蛋白A的方法，其特征在于：所述无机盐选自NaCl、KCl或硫酸铵。

10.根据权利要求2、4或6所述的一种分离纯化蛋白A的方法，其特征在于：所述的疏水相互作用层析柱所用介质为苯基琼脂糖凝胶6 FF。