JP5095386B2 - プラスミド精製 - Google Patents
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Description
本明細書で用いる「プラスミド」という用語は「プラスミドDNA」という用語と同義に用いられ、様々なプラスミドの形態、すなわち開環状(oc、ニックプラスミドDNAとしても知られる。)及びスーパーコイル(ccc)プラスミドDNAを包含する。
(a)外表面及び細孔表面に陰イオン交換基を呈し、細孔表面にプラスミドがアクセスできない孔径分布を有する1種以上の多孔性担体からなる分離マトリックスを用意する段階、
(b)上記マトリックスを上記液体と接触させてプラスミドを分離マトリックスの外表面に存在するリガンドへ吸着させる段階、及び、適宜、
(c)溶出液を上記分離マトリックスと接触させてプラスミドを遊離させ、溶出液の画分からプラスミドを回収する段階
を含ンでなる方法に関する。
(a)外表面及び細孔表面に陰イオン交換基を呈する1以上の多孔性担体からなる分離マトリックスを用意する段階、
(b)上記マトリックスを上記液体と接触させて分離マトリックスの外表面に存在するリガンドに限定してプラスミドを吸着させる段階、及び、適宜、
(c)溶出液を上記分離マトリックスと接触させてプラスミドを遊離させ、溶出液の画分からプラスミドを回収する段階
を含んでなる方法に関する。
(a)外表面及び細孔表面に陰イオン交換基を呈し、DNA排除限界が約270塩基対以上である1種以上の多孔性担体からなる分離マトリックスを用意する段階、
(b)上記マトリックスを上記液体と接触させてプラスミドを分離マトリックスの外表面に存在するリガンドへ吸着させる段階、及び、適宜、
(c)溶出液を上記分離マトリックスと接触させてプラスミドを遊離させ、溶出液の画分からプラスミドを回収する段階
を含んでなる方法に関する。
図1は、第4級陰イオン交換基を結合させたアリルデキストラン/N,N′−メチレンビスアクリルアミド系に基づく分離マトリックスつまり以下の実施例1に記載の通り調製したQ−Sephacryl 500での本発明によるプラスミドの単離例を示すクロマトグラムを示す。用いた導電率は48mS/cmであり、分離マトリックスは約1078塩基対のDNA排除限界を示す。
Sephacryl(商標)S−500 HR(Amersham Biosciences社(スウェーデン、ウプサラ)製)をガラス濾過器上で吸引して水抜きし、ビーズ200gを反応容器に加えた。水酸化ナトリウム8.0g及び水素化ホウ素ナトリウム0.2gを40ml蒸留水と透明溶液が得られるまで攪拌して、容器に仕込んだ。400mlの塩化グリシジルトリメチルアンモニウム(GMAC)を、反応容器に2時間かけて送入した。温度を25℃に維持して、一晩(18時間)反応を続けた。生成物(本明細書ではQ−Sephacrylという。)を60%酢酸で中和し、蒸留水で洗浄した。
実施例2a:ジエチルアミンカップリング
常法によってアリルグリシジルエーテル(AGE)とNaOHでアリル化して、アリル含量140μmol/mlとしたSephacryl(商標)S500 HR(Amersham Biosciences社(スウェーデン、ウプサラ)製)ゲル25mlを減圧下で水抜きし、400mlの水と共に600mlビーカーに入れた。懸濁液で黄色が現れ続けるまで、臭素を滴下した。臭素化ゲルを次いでガラス濾過器上で500mlを超える量の蒸留水で洗浄した。
実施例2aに記載の通り、140μmol/mlのアリル含量にアリル化したSephacryl(商標)S500(Amersham Biosciences社(スウェーデン、ウプサラ)製)ゲル25mlを減圧下で水抜きし、400mlの水と共に600mlビーカーに入れた。懸濁液で黄色が現れ続けるまで、臭素を滴下した。臭素化ゲルを次いでガラス濾過器上で500mlを超える量の蒸留水で洗浄した。
試料は7kbプラスミドを含む35gの細菌細胞(湿重量)から得たもので、清澄化ライセートは標準プロトコルによって調製した。得られた上清は、中空糸モジュール(300kDa MWCO)での限外濾過(UF)によって最終体積250ml及び導電率48mS/cm(図1参照)に濃縮/透析濾過した。2回目の実験では、試料は水の添加によって導電率38mS/cmに調整した(図2参照)。
緩衝液A:0.4M NaCl、100mM Tris/Cl、10mM EDTA、pH7。
緩衝液B:1M NaCl、100mM Tris/Cl、10mM EDTA、pH7。
Claims (8)
- 液体中のRNAから1種以上のプラスミドを単離する方法であって、
(a)外表面及び細孔表面に陰イオン交換基を呈し、DNA排除限界が1000塩基対以上である架橋炭水化物材料からなる分離マトリックスを用意する段階、及び
(b)上記マトリックスを上記液体と接触させて、RNAを分離マトリックスの細孔表面に吸着させるとともにプラスミドを分離マトリックスの外表面に存在するリガンドだけに吸着させる段階
を含んでなる方法。 - 前記工程(b)の後に、
(c)溶出液を上記分離マトリックスと接触させてプラスミドを遊離させ、溶出液の画分からプラスミドを回収する段階
をさらに含む、請求項1記載の方法。 - 前記分離マトリックスのDNA排除限界が20000塩基対である、請求項1又は請求項2記載の方法。
- 前記分離マトリックスが平均直径30〜50μmの略球形の粒子である、請求項1乃至請求項3のいずれか1項記載の方法。
- 前記プラスミドの大きさが3000塩基対を超える、請求項1乃至請求項4のいずれか1項記載の方法。
- 1g以上のプラスミドを回収する大規模プロセスである、請求項1乃至請求項5のいずれか1項記載の方法。
- (d)段階(c)で得られるプラスミド含有溶出液を疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)にかける追加の段階をさらに含む、請求項2乃至請求項6のいずれか1項記載の方法。
- 前記陰イオン交換基が、第4級アミン(Q)基及びジエチルアミン基からなる群から選択される、請求項1乃至請求項7のいずれか1項記載の方法。
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