CN111088248B - 一种用于提取无内毒素质粒的磁性材料及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于提取无内毒素质粒的磁性材料及其使用方法，本发明通过将季铵盐阳离子化修饰到羟乙基纤维素表面，得到季铵盐阳离子化修饰的羟乙基纤维素。可以提取不含内毒素的质粒，使得内毒素大大减少，有利于后续实验的进行。相对于传统方法，更快捷，提取结果更可靠，易于在生产、科研等领域的推广和应用。
Description
技术领域
本发明属于核酸提取技术领域，特别涉及一种用于提取无内毒素质粒的磁性材料及其使用方法。
背景技术
质粒DNA在不同领域有着重要的作用。质粒DNA中菌体内毒素、RNA以及蛋白质等多种杂质，会影响后续实验如细胞转染的效率，尤其是内毒素对细胞转染的影响极大。细菌内毒素是革兰氏阴性菌外膜上的特有结构，细菌生长或者死亡均能被释放出来，细胞破碎后更有大量的内毒素释放。内毒素会形成囊状结构，电荷性、疏水性等性能均与质粒DNA相似，质粒DNA纯化时给研究学者造成加大的困惑。
目前，内毒素去除方法主要有三种：一是基于离子交换，利用核酸和内毒素等电点的差异，搭配特殊的试剂，去除溶液中的内毒素，典型的商品化试剂包括Qiagen公司的EndoFree Plasmid Purification Kit，但是基于离子交换柱（重力柱）的方法去除效率较低；
二是选择性吸附。多粘菌素B（polymyxin-B，PMX-B）是一种环状亲脂性抗生素，有10 个氨基酸的多肽，其中7 个氨基酸形成环状化合物，在N-端连接一个脂肪链。一般认为多粘菌素B 是通过本身的阳离子与内毒素活性部位磷脂A 的阴离子相结合，其作用还包括静电作用、离子作用、亲水作用和其他分子之间的相互作用。环糊精是环状聚糖，呈管状结构。γ环糊精含8个单糖，内径0. 85 nm，外侧亲水，内部疏水。脂多糖疏水链距离约0. 49nm，环糊精可以包裹脂多糖。由于分子筛效应，环糊精不吸附DNA。通过其他分子共聚修饰，可以提高环糊精吸附效率。
三是Triton X-114法。Triton X-114是一种非离子表面活性剂。其浊点为23 ℃，在低于该温度时，Triton X-114能与水互溶；当高于该温度时，则分离成水相和表面活性剂相，基于该特点，可以实现内毒素的分离。
根据现有问题，找出一种简单、高效去除内毒素的方法称为亟需解决的问题。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一种提取无内毒素质粒的磁性材料。
本发明的又一目的在于提供上述磁性材料的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述磁性材料的应用。
为达到上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一方面，提出了一种提取无内毒素质粒的磁性粒子。根据本发明的实施例，所述磁性粒子外表面修饰有羟乙基纤维素，所述羟乙基纤维素修饰有季铵盐。本发明的季铵盐基团，可以在一定条件下提取不含内毒素的质粒。而且基于离子交换原理，通过制备具有离子交换功能的磁珠，搭配本发明其他试剂，可实现无内毒素质粒的提取。
根据本发明的实施例，所述季铵盐选自环氧丙基三甲基氯化铵。
本发明的第二方面，提出了磁性粒子的制备方法，包括以下步骤：
1）将表面经季铵盐阳离子化修饰的羟乙基纤维素溶解为A液；六水合氯化铁、四水合氯化亚铁溶解为B液；
2）A液和B液混合，通入惰性气体后水浴；
3）加氨水后水浴；
4）透析；
5）离心后取上清为磁性粒子。
根据本发明的实施例，六水合氯化铁、四水合氯化亚铁主要是为了添加磁性。
根据本发明的实施例，惰性气体选自氩气、氮气。惰性气体为了隔离氧气。
根据本发明的实施例，加碱性试剂后水浴，所述碱性试剂为氨水。氨水作用是催化反应的进行。
根据本发明的实施例，透析是为了将无相关小分子与本发明磁性粒子进行分离。
根据本发明的实施例，步骤1）所述表面经季铵盐阳离子化修饰的羟乙基纤维素的制备步骤：环氧氯丙烷中通入三甲胺，搅拌反应，过滤弃上清，洗涤即得环氧丙基三甲基氯化铵；将羟乙基纤维、碱性催化剂混合后，再加入环氧丙基三甲基氯化铵，加热；所述碱性催化剂为氨水。
根据本发明的实施例，所述环氧氯丙烷、三甲胺的摩尔比为2:0.4。
根据本发明的实施例，所述环氧丙基三甲基氯化铵、羟乙基纤维的比例为1.5～6mM：1g；优选的，环氧丙基三甲基氯化铵、羟乙基纤维素的比例为4.5mM：1g。
根据本发明的实施例，所述季铵盐阳离子化修饰的羟乙基纤维素、六水合氯化铁、四水合氯化亚铁的质量比为：2:2:（1.5～2）。
本发明的第三方面，提出了一种提取无毒素质粒的试剂盒，包括Buffer X1~X7、前面所述磁性粒子。根据本发明的实施例，所述Buffer X1包括Tris-HCl、EDTA和RNaseA；BufferX2包括NaOH、SDS；BufferX3包括醋酸钾、冰醋酸。
根据本发明的实施例，所述Buffer X4包括NaCl、乙氧基化烷基胺、MOPS。
根据本发明的实施例，所述Buffer X4包括750～800mM NaCl、12～15%乙氧基化烷基胺、90～100mM MOPS；
根据本发明的实施例，所述Buffer X4包括750mM NaCl、12%乙氧基化烷基胺、90mM MOPS。
根据本发明的实施例，所述Buffer X5包括NaCl、MOPS、无水乙醇、Triton X-100。
根据本发明的实施例，所述Buffer X5包括750～800mM NaCl、80～100mM MOPS、20～25%无水乙醇、0.15～0.2%Triton X-100。
根据本发明的实施例，所述Buffer X5包括750mM NaCl、80 mM MOPS、20%无水乙醇、0.15%Triton X-100；
根据本发明的实施例，所述Buffer X6包括NaCl、MOPS、无水乙醇。
根据本发明的实施例，所述Buffer X6包括1～3M NaCl、70～80 mM MOPS、20～25%无水乙醇。
根据本发明的实施例，所述Buffer X6包括1M NaCl、70 mM MOPS、20%无水乙醇。
根据本发明的实施例，所述Buffer X7包括磷酸氢二钾、磷酸二氢钾。
根据本发明的实施例，所述Buffer X7包括25 mM磷酸氢二钾、pH 8.8的磷酸二氢钾。
本发明的第四方面，提出了所述磁性粒子的使用方法。根据本发明的实施例，所述使用方法为：将细菌悬浮，依次添加BufferX1～X4，再添加预先与BufferX5平衡的磁性粒子，磁吸弃上清，BufferX6洗涤，磁吸弃上清，加入BufferX7洗脱，即得不含内毒素的质粒。
本发明制备的磁珠由于具有季铵盐基团，可以在一定条件下提取不含内毒素的质粒。而且，本发明基于离子交换原理，通过制备具有离子交换功能的磁珠，搭配试剂，实现无内毒素质粒的提取。
本发明的有益效果是：
本发明公开了一种用于提取无内毒素质粒的磁性材料及其使用方法，本发明通过将季铵盐阳离子化修饰到羟乙基纤维素表面，得到季铵盐阳离子化修饰的羟乙基纤维素。可以提取不含内毒素的质粒，使得内毒素大大减少，有利于后续实验的进行。相对于传统方法，更快捷，提取结果更可靠。易于在生产、科研等领域的推广和应用。
附图说明
图1是羟乙基磁珠和本发明季铵盐羟乙基纤维素磁珠的红外图谱，由此表征本发明的磁珠已修饰上羟乙基基团。
图2是对比例中羟基磁珠的红外图谱。
图3是现有技术中，典型的羧基磁珠红外图谱。
图4是本发明制备的磁珠外观及显微镜图（10000×）。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整的说明，但并不局限于此。
实施例1
一种用于提取无内毒素质粒的磁性粒子制备方法：
1)称取0.2 g表面经季铵盐阳离子化修饰的羟乙基纤维素，加入20 mL去离子水，搅拌溶解为A液；
2)称取0.2 g六水合氯化铁和0.1 g四水合氯化亚铁，加入5 mL去离子水溶解，为B液；
3)将B液加到A液中，通入氩气避免氧化亚铁被氧化，80 ℃水浴2 h；
4)往其中加入5 mL 12%（W/V）的氨水，一边加入一边搅拌，再水浴60 min；
5)降至室温后，使用8000~14000分子量的透析袋，透析2天；
6)500 rpm离心5min，取上清即为季铵盐羟乙基纤维素磁性粒子。
其中，步骤1）中的表面经季铵盐阳离子化修饰的羟乙基纤维素，制备步骤如下：
（1）阳离子醚化剂环氧丙基三甲基氯化铵的制备
将环氧氯丙烷157mL（2.0mol），冷却至0℃，1h内通入三甲胺气体23.6g(0.4mol)并一直搅拌，在常温下搅拌反应4h。过滤、丙酮洗涤、真空干燥，得到白色固体产品58.5g，即为环氧丙基三甲基氯化铵，其纯度达到96%。
（2）阳离子纤维素醚的制备
向装有羟乙基纤维（HEC）反应容器中加入碱性催化剂（5ml 25%氨水），每克HEC使用1~1.5 mM NaOH或KOH，搅拌30～40 min后，加入步骤（1）制备的环氧丙基三甲基氯化铵（环氧丙基三甲基氯化铵和HEC比例为：4.5mM：1g），一边加热一边搅拌，反应时间为4～6h。混合物用醋酸中和pH至7~7.5后，洗涤、真空干燥，得到季铵盐阳离子化修饰的羟乙基纤维素。
实施例2
一种用于提取无内毒素质粒的磁性粒子制备方法：
①称取0.2 g表面经季铵盐阳离子化修饰的羟乙基纤维素，加入20 mL去离子水，搅拌溶解为A液；
②称取0.2 g六水合氯化铁和0.2 g四水合氯化亚铁，加入5 mL去离子水溶解，为B液；
③将B液加入到A液中，通入氩气避免氧化亚铁被氧化，80 ℃水浴2 h；
④往其中加入5 mL 12%（W/V）的氨水，一边加入一边迅速搅拌，再水浴60 min；
⑤降至室温后，使用8000~14000分子量的透析袋，透析2天；
⑥500 rpm离心5min，取上清即为季铵盐羟乙基纤维素磁性粒子。
其中，步骤1）中的表面经季铵盐阳离子化修饰的羟乙基纤维素，其制备步骤如下：
（1）阳离子醚化剂环氧丙基三甲基氯化铵的制备
将环氧氯丙烷157mL（2.0mol），冷却至0℃，1h内通入三甲胺气体23.6g(0.4mol)并一直搅拌，在常温下搅拌反应4h。过滤、丙酮洗涤、真空干燥，得到白色固体产品58.5g，即为环氧丙基三甲基氯化铵，其纯度达到96%。
（2）阳离子纤维素醚的制备
向装有羟乙基纤维（HEC）反应容器中加入碱性催化剂（（5ml 25%氨水），搅拌30～40 min后，加入步骤（1）制备的环氧丙基三甲基氯化铵（环氧丙基三甲基氯化铵和HEC比例为：4.5mM：1g），一边加热一边搅拌，反应时间为4~6h。混合物中和后，洗涤、真空干燥，得到季铵盐阳离子化修饰的羟乙基纤维素。
实施例3
一种用于提取无内毒素质粒的磁性粒子制备方法：
①称取0.2 g表面经季铵盐阳离子化修饰的羟乙基纤维素，加入20 mL去离子水，搅拌溶解为A液；
②称取0.2 g六水合氯化铁和0.15 g四水合氯化亚铁，加入5 mL去离子水溶解，为B液；
③将B液加入到A液中，通入氩气避免氧化亚铁被氧化，80 ℃水浴2 h；
④加入5 mL 12%（W/V）的氨水，一边加入一边迅速搅拌，再水浴60 min；
⑤降至室温后，使用8000~14000分子量的透析袋，透析2天；
⑥500 rpm离心5min，取上清即为季铵盐羟乙基纤维素磁性粒子。
其中，步骤1）中的表面经季铵盐阳离子化修饰的羟乙基纤维素，其制备步骤如下：
（1）阳离子醚化剂环氧丙基三甲基氯化铵的制备
将环氧氯丙烷157mL（2.0mol），冷却至0℃，1h内通入三甲胺气体23.6g(0.4mol)并一直搅拌，常温下搅拌反应4h。过滤、丙酮洗涤、真空干燥，得到白色固体产品58.5g，即为环氧丙基三甲基氯化铵，其纯度达到96%。
（2）阳离子纤维素醚的制备
向装有羟乙基纤维（HEC）反应容器中加入碱性催化剂（5ml 25%氨水），搅拌30～40min后，加入步骤（1）制备的环氧丙基三甲基氯化铵（环氧丙基三甲基氯化铵、羟乙基纤维素的比例为：4.5mM：1g），一边加热一边搅拌，反应时间为4~6h。混合物中和后，洗涤、真空干燥，得到季铵盐阳离子化修饰的羟乙基纤维素。
对本发明制备的磁性粒子做进一步效果检测。
图谱分析
图1是羟乙基磁珠和本发明制备的季铵盐羟乙基纤维素磁珠的红外图谱。图2是对比例中羟基磁珠的红外图谱。图3是典型的羧基磁珠红外图谱。（图1～3均委托第三方机构检测）
由图中可知，本发明的季铵盐羟乙基纤维素磁珠已经修饰了羟乙基基团，磁珠的官能团已经成功修饰到磁珠上。
形态观察
图4为本发明实施例1制备的季铵盐阳离子化羟乙基纤维素磁性粒子，为纤维状；而传统的磁珠是球状。实施例1的磁性粒子表面积更大，当提取等量核酸时，使用本实施例制备的磁珠量更少（相对于传统用量的1/5~1/2），也进一步提升了核酸的纯度。
表1 本申请质粒提取方法中的溶液编号
表2 本申请质粒提取方法中的溶液及其成分
表3 本申请质粒提取方法中的溶液及其成分
使用本发明制备的季铵盐阳离子羟乙基纤维素磁性粒子，以及表3优化的试剂提取无内毒素质粒的步骤为：
1)取20毫升细菌（大肠杆菌）在25~30℃培养过夜。
2)1000rpm离心10 min，弃上清，收集细菌沉淀。
3)使用1.2 ml Buffer X1悬浮细菌后，等分为两份600μL的悬浮液。
4)每份悬浮液中添加600 μL Buffer X2，倒置轻轻搅拌，孵育5分钟。
5)添加600 μL预冷的Buffer X3，倒置混合，直至溶液澄清、白色物质消失。
6)添加150 μL Buffer X4，搅拌，4℃孵育30分钟。
7)预先使用1mL Buffer X5与20μL本发明实施例1制备的季铵盐阳离子羟乙基纤维素磁性粒子平衡（浸泡）；再与步骤6）溶液混合，磁吸磁珠，弃上清。
8)1mL Buffer X6洗涤磁珠，吸附磁珠，弃上清。
9)添加0.8mL Buffer X7洗脱，使核酸从磁珠洗脱下来，即得不含内毒素的质粒。
本发明使用表3优化的试剂后发现，无内毒素质粒的提取效率提高了10%，内毒素去除效果显著。
使用常规方法，难以提取到无内毒素质粒，对于设备以及实验要求高。而且，相对于柱提取方法，使用本发明磁珠法可以更好地提高通量以及实现实验的自动化。
不同浓度的环氧丙基三甲基氯化铵/g 羟乙基纤维素制备的阳离子羟乙基纤维素对提取效果的影响。
设置不同浓度的环氧丙基三甲基氯化铵修饰羟乙基纤维素制备的季铵盐阳离子羟乙基纤维素（表4的1～8组），其他试剂一样，使用本发明的质粒提取方法提取核酸。
表4 不同浓度的环氧丙基三甲基氯化铵修饰羟乙基纤维素制备而得的季铵盐阳离子羟乙基纤维素磁性材料及其实验处理
不同Buffer对提取效果的影响。
表6 不同组别的Buffer成分
表7 不同组别的提取效果
其中内毒素检测使用试管定量显色基质法鲎试剂盒（厦门鲎试剂生物科技有限公司，货号：EC80545）检测实施例1获得的质粒（核酸）。
表6和表7中可知，使用本发明制备的季铵盐阳离子化修饰的羟乙基纤维素磁性粒子，结合本发明的试剂，使用本发明的提取方法效果最好。质粒回收率最高，收集的质粒纯度高。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种提取无毒素质粒的试剂盒，其特征在于，包括Buffer X1～X7、磁性粒子；
所述磁性粒子外表面修饰有羟乙基纤维素，所述羟乙基纤维素修饰有季铵盐，所述季铵盐选自环氧丙基三甲基氯化铵；
所述磁性粒子的制备方法包括以下步骤：
1)将表面经季铵盐阳离子化修饰的羟乙基纤维素溶解为A液；六水合氯化铁、四水合氯化亚铁溶解为B液；
2)A液和B液混合，通入惰性气体后水浴；
3)加氨水后水浴；
4)透析；
5)离心后取上清得磁性粒子；
所述Buffer X1为Tris-HCl、EDTA和RNaseA；
所述BufferX2为NaOH、SDS；
所述BufferX3为醋酸钾、冰醋酸；
所述Buffer X4为750～800mM NaCl、12～15％乙氧基化烷基胺、90～100mM MOPS；所述Buffer X5为750～800mM NaCl、80～100mM MOPS、20～25％无水乙醇、0.15～0.2％TritonX-100；
所述Buffer X6为1～3M NaCl、70～80mM MOPS、20～25％无水乙醇；
所述Buffer X7为25～30mM磷酸氢二钾和pH 8.8～9.5磷酸二氢钾；
其中，步骤1)所述表面经季铵盐阳离子化修饰的羟乙基纤维素的制备步骤：环氧氯丙烷中通入三甲胺，搅拌反应，过滤弃上清，洗涤即得环氧丙基三甲基氯化铵；将羟乙基纤维、碱性催化剂混合后，再加入环氧丙基三甲基氯化铵，加热；所述碱性催化剂为氨水。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述环氧氯丙烷、三甲胺的摩尔比为2:0.4。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述环氧丙基三甲基氯化铵、羟乙基纤维素的比例为：4.5mM：1g。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，步骤1)所述季铵盐阳离子化修饰的羟乙基纤维素、六水合氯化铁、四水合氯化亚铁的质量比为：2:2:(1.5～2)。
5.权利要求1所述试剂盒中的磁性粒子的使用方法，其特征在于，将细菌悬浮，依次添加权利要求1中所述的BufferX1～X4，再添加预先与权利要求1中所述的BufferX5平衡的磁性粒子，磁吸弃上清，用权利要求1中所述的BufferX6洗涤，磁吸弃上清，用权利要求1中所述的BufferX7洗脱，即得不含内毒素的质粒。
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