CN116643041A - 一种用于免疫检测的免疫磁珠、制备及其应用 - Google Patents
一种用于免疫检测的免疫磁珠、制备及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种用于免疫检测的免疫磁珠、制备及其应用，所述免疫磁珠，包括磁珠载体、金属有机框架和抗体；其中，所述抗体以金属有机框架为连接体包覆于所述磁珠载体的表面。该免疫磁珠与常规免疫磁珠相比具有制备方法简单、抗体利用率高、目标物容量大，更有利于免疫检测等优势，进一步，本发明还提供一种免疫磁珠的制备方法，包括以下步骤：将磁珠载体的悬浮液、金属盐溶液、抗体溶液和有机配体溶液混合，在室温下进行反应。该制备方法与常规方法相比，由于无需借助任何有机反应对磁球或抗原抗体进行活化，无需封闭，无需加热等大大简化了操作步骤，因而制备耗时短，可控性更强，更有利于大规模生产应用。
Description
技术领域
本发明属于免疫检测技术领域，具体包含一种用于免疫检测的免疫磁珠、制备及其应用。
背景技术
磁珠是一种直径纳米或微米级别的球形复合材料，其核心是由四氧化三铁或三氧化二铁等超顺磁性材料构成，磁珠的外壳一般包覆有聚苯乙烯、葡聚糖、二氧化硅等材料，这些材料可被修饰产生氨基(NH2)、羧基(COOH)或羟基(OH)等功能基团。通过基团间的偶联反应将抗原、抗体等结合于磁珠表面，使之成为抗原、抗体等物质的载体，我们称之为免疫磁珠(Immunomagnetic bead，IMB)。免疫磁珠表面的抗原/抗体既可与特异性抗体/抗原结合，形成免疫复合物，又可在外界磁场的作用下发生力学移动，使得磁珠-抗体-抗原复合物与其他物质分离，从而达到目标物分离以及浓缩的目的。
目前，常用于免疫检测分析的磁珠载体主要有羧基磁珠、氨基磁珠、链霉亲和素磁珠以及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)修饰的磁珠等。其中，羧基磁珠主要通过对其表面羧基进行活化的方法来实现羧基磁珠与抗原、抗体等物质的偶联。然而，羧基的活化步骤复杂，常用的活化剂乙基(3二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)在水溶液中不稳定，需现用现配，易出现偶联效率低、批间差异大等问题。采用氨基磁珠在制备免疫磁珠时，也需与已经活化好的羧基抗体进行偶联或采用戊二醛作为偶联中间体，偶联步骤复杂且易出现蛋白或磁珠之间自身的偶联反应。NHS修饰的磁珠虽然不需要活化可直接与带有羧基的蛋白发生偶联反应，但是，NHS磁珠表面的NHS官能团仍需要缓冲溶液进行活化且NHS易发生水解反应，从而导致偶联效率不高。此外，还可通过其他方式，如通过巯基和吡啶基二硫基发生共价反应，将引入吡啶二硫基团的抗原共价偶联到巯基磁珠上，得到免疫磁珠。同时也可以通过蛋白G或者蛋白A为基础制备定向免疫磁珠，然而，以上免疫磁珠的制备方法均需通过有机反应来实现，很多时候还需要后续的封闭步骤，大大增加了免疫磁珠制备过程的复杂性，更重要的是，以上方法合成的免疫磁珠表面的免疫配体官能团决定了其表面抗原抗体偶联的最大量，由于免疫磁球表面免疫配体的数量有限，因此通过偶联反应固定到磁珠表面的抗原抗体的量受到限制。
发明内容
鉴于以上问题，本发明的首要目的是提供一种用于免疫检测的新型免疫磁珠，该免疫磁珠中抗原抗体的量不受磁球表面配体数量的限制，可以通过调节金属有机框架的含量进而调控磁珠表面抗体的浓度。
本发明的另一目的是提供一种上述免疫磁珠的制备方法，该方法条件温和，无需任何活化等有机反应步骤，制备方法简单。
为达到上述目的，本发明采取以下方案：
第一方面，本发明提供一种用于免疫检测的免疫磁珠，包括磁珠载体、金属有机框架和抗体；其中，所述抗体以金属有机框架为连接体包覆于所述磁珠载体的表面。
需要说明的是，金属有机框架(MOFs)是指由金属离子或金属簇构建单元和有机桥联配体连接形成的具有周期性结构的多孔材料，在本发明中，以金属有机框架为连接体，可以理解为：金属有机框架自组装在磁珠载体表面，而抗体则利用与金属有机框架之间的相互作用包覆在磁珠载体表面；至于抗体是直接包在金属有机框架的表面，从而对磁珠载体形成包覆；还是结合在框架中孔隙结构内表面和/或外表面，进而接触或直接不接触磁珠载体，从而形成包覆；本发明不作特别限定，以上情况均在本发明的保护范围内。
本发明的免疫磁珠，首先以磁珠为MOFs材料的成核载体，利用MOFs材料灵活的自组装性，将MOFs材料包覆于磁珠表面，同时利用MOFs材料的多孔性以及包裹生物大分子的性能，将大量抗体包覆于磁珠载体表面，以最大限度的提高磁珠表面的抗体的浓度。
优选地，所述磁珠载体、抗体和金属有机框架的质量比为2-10:1-5:0.5-3。
优选地，所述金属有机框架中，金属中心为锌、钴、铜和铁中的任一种，有机配体为含氮类配体和/或羧酸类配体。
优选地，所述磁珠载体为羧基磁珠、氨基磁珠、羟基磁珠、链霉亲和素磁珠、二氧化硅磁珠和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)修饰的磁珠中的任一种。
更优选地，所述磁珠载体为纳米磁珠或直径大于1um的磁珠。
第二方面，本发明提供一种上述免疫磁珠的制备方法，包括以下步骤：
将磁珠载体的悬浮液、金属盐溶液、抗体溶液和有机配体溶液混合，在室温下进行反应。
其中，上述制备方法中，各原料可以依次加入后直接反应，也可以加入一种后搅拌均匀再加下一种。
优选地，所述磁珠载体的悬浮液的浓度为0.2mg/mL-1mg/mL，所述金属盐溶液的浓度为10mg/mL-320mg/mL；所述金属盐溶液与磁珠载体的悬浮液的体积比为2-10:1。
优选地，所述抗体溶液的浓度为0.1mg/mL-mg/mL，所述抗体溶液与磁珠载体的悬浮液的体积比为1-10:1。
优选地，所述有机配体溶液与金属盐溶液中，有机配体和金属离子的摩尔比为4-10:1。
优选地，所述反应的时间为10min-24h。
优选地，反应后还包括利用含有一定浓度表面活性剂的缓冲溶液清洗的步骤。
示例性地，所述表面活性剂可以为吐温-20、吐温-80、聚乙烯比咯烷酮(PVP)、Triton-100、十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基苯磺酸钠中的任一种，优选为吐温-20。
示例性地，所述表面活性剂的浓度可以为0.05％-1％(V/V)，优选为0.1％。
示例性地，所述缓冲溶液可以为3-吗啉丙磺酸(MOPS)缓冲溶液，吗啉乙磺酸(MES)缓冲溶液，4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲溶液等，优选为MOPS缓冲溶液。
示例性地，所述缓冲溶液的浓度为10mM-100mM，优选为10mM。
第三方面，本发明提供一种上述免疫磁珠在真菌毒素、农药残留、过敏原和肿瘤标志物中任一种的富集分离中的应用。
可以理解，本发明的免疫磁珠具有广泛的通用性，可根据具体富集分离物质的种类，选择相应的抗体类型。
另需注意的是，如果没有特别说明，本发明所记载的任何范围包括端值以及端值之间的任何数值以及以端值或者端值之间的任意数值所构成的任意子范围。本发明中制备方法如无特殊说明则均为常规方法，所用的原料如无特别说明均可从公开的商业途径获得或根据现有技术制得。
本发明有益效果：
1.本发明提供的免疫磁珠中抗原抗体的量不受磁球表面配体的影响。抗原抗体能够最大限度的被原位合成的MOFs材料连接于免疫磁珠表面，而磁球表面生物活性物质浓度的提高有助于后续利用所制备的免疫磁珠进行目标物的高效率捕获、分离、净化和浓缩。
2.本发明提供的免疫磁珠能够最大限度的保留或增强抗原抗体的生物活性。具体地：抗原抗体、酶等生物大分子由于其脆弱本质通常在温和条件下才能发挥功能活性作用，由于本发明中提供的免疫磁珠的制备方法条件温和，无需任何活化等有机反应步骤，因此本发明在大大简化制备方法的同时能够最大限度的保留抗原抗体的活性。此外，生物大分子如抗原抗体酶等的蛋白质分子结构在高温、有机溶剂和高强度机械条件下会发生构象变化或解体，从而导致其生物催化和识别性能的显著下降。而MOFs材料在维持抗体分子识别及其活性保护方面也具有很好的性能，因此本发明提供的免疫磁珠能够很好的稳定或增强抗原抗体的生物活性。
3.本发明提供的免疫磁珠的制备新方法极其简单，耗时短，合成效率高。只需将磁球、金属离子、有机配体、具有生物活性的抗体或抗原在温和条件下孵育即可。与常规的制备方法相比，该方法由于无需借助任何有机反应对磁球或抗原抗体进行活化，无需封闭，无需加热等大大简化了操作步骤。
附图说明
图1示出本发明制备免疫磁珠的示意图；
图2示出三种不同类型的磁珠(A：羧基磁珠；B：氨基磁珠；C：链霉亲和素磁珠)、金属离子、有机配体、抗体、免疫磁珠的洗涤上清液、合成的免疫磁珠与考马斯亮蓝溶液的显色反应；
图3示出实施例6中玉米提取液与净溶液的高效液相色谱检测结果。
图4示出实施例1的免疫磁珠和实施例7的免疫磁珠的温度耐受数据对比图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。应当明确，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：以羧基磁珠、醋酸锌、二甲基咪唑和黄曲霉毒素的抗体合成黄曲霉毒素的免疫磁珠
1.将羧基磁珠用10mM PH 7.0MOPS缓冲溶液配制成浓度为1mg/mL的磁珠悬浮液。
2.用10mM PH 7.0MOPS缓冲溶液配制成浓度为40mM的醋酸锌溶液。
3.用10mM PH 7.0MOPS缓冲溶液配制成浓度为160mM的二甲基咪唑溶液。
4.将1mL醋酸锌溶液与200uL磁珠悬浮液混合，室温反应3min。
5.向步骤4获得的反应液中加入200uL黄曲霉毒素抗体溶液(1mg/mL)，涡旋后室温反应3min。
6.向步骤5获得的反应液中加入1mL的2-甲基咪唑溶液，涡旋后室温反应30min。
7.将反应后的溶液在外界磁场的作用下去除上清液，获得免疫磁珠用含0.1％的Tween-20MOPS缓冲溶液(10mM PH 7.0)洗涤2次，再用MOPS缓冲溶液(10mM PH 7.0)洗涤1次。
8.将洗涤后的免疫磁珠用10mM PH 7.0MOPS缓冲溶液重悬为1mg/mL的悬浮液。
利用考马斯亮蓝法定性检测蛋白，结果见图2所示，只有抗体(A4孔)和所得到的免疫磁珠(A6孔)与考马斯亮蓝的显色反应呈蓝色，表明有抗体的定性检出。而单纯的羧基磁珠(A1孔)、金属离子(A2孔)、有机配体(A3孔)、磁珠的洗涤上清液(A5孔)均不与考马斯亮蓝溶液产生显色反应，以上显色反应表明了采用羧基磁珠可成功原位合成免疫磁珠。
实施例2：以氨基磁珠、醋酸锌、二甲基咪唑和黄曲霉毒素的抗体合成黄曲霉毒素的免疫磁珠
1.将氨基磁珠用10mM PH 7.0MOPS缓冲溶液配制成浓度为1mg/mL的磁珠悬浮液。
2.用10mM PH 7.0MOPS缓冲溶液配制成浓度为40mM的醋酸锌溶液。
3.用10mM PH 7.0MOPS缓冲溶液配制成浓度为160mM的二甲基咪唑溶液。
4.将1ml 40mM的醋酸锌溶液与200uL磁珠悬浮液混合，室温反应3min。
5.向步骤4获得的反应液中加入200uL黄曲霉毒素抗体溶液(1mg/mL)，涡旋后室温反应3min。
6.向步骤5获得的反应液中加入1mL 2-甲基咪唑溶液，涡旋后室温反应30min。
7.将反应后的溶液在外界磁场的作用下去除上清液，剩余磁珠用含0.1％的Tween-20MOPS缓冲溶液(10mM PH 7.0)洗涤2次，再用MOPS缓冲溶液(10mM PH 7.0)洗涤1次。
8.将洗涤后的磁珠用10mM PH 7.0MOPS缓冲溶液重悬为1mg/mL的悬浮液。
考马斯亮蓝法定性检测蛋白的结果如图2所示，只有抗体(B4孔)和所得到的免疫磁珠(B6孔)与考马斯亮蓝的显色反应呈蓝色，表明有抗体的定性检出。而单纯的氨基磁珠(B1孔)、金属离子(B2孔)、有机配体(B3孔)、磁珠的洗涤上清液(B5孔)均不与考马斯亮蓝溶液产生显色反应，以上显色反应表明了采用氨基磁珠可成功原位合成免疫磁珠。
实施例3：以链霉亲和素磁珠、醋酸锌、二甲基咪唑和黄曲霉毒素的抗体合成黄曲霉毒素的免疫磁珠
1.将链霉亲和素磁珠用10mM PH 7.0MOPS缓冲溶液配制成浓度为1mg/mL的磁珠悬浮液。
2.用10mM PH 7.0MOPS缓冲溶液配制成浓度为40mM的醋酸锌溶液。
3.用10mM PH 7.0MOPS缓冲溶液配制成浓度为160mM的二甲基咪唑溶液。
4.将1mL 40mM的醋酸锌溶液与200ul磁珠悬浮液混合，室温反应3min。
5.向步骤4获得的反应液中加入200uL黄曲霉毒素抗体溶液(1mg/mL)，涡旋后室温反应3min。
6.向步骤5获得的反应液中加入1mL 160mM的2-甲基咪唑溶液，涡旋后室温反应30min。
7.将反应后的溶液在外界磁场的作用下去除上清液，剩余磁珠用含0.1％的Tween-20MOPS缓冲溶液(10mM PH 7.0)洗涤2次，再用MOPS缓冲溶液(10mM PH 7.0)洗涤1次。
8.将洗涤后的磁珠用10mM PH 7.0MOPS缓冲溶液重悬为1mg/mL的悬浮液。
考马斯亮蓝法定性检测蛋白的结果如图2所示，只有抗体(C4孔)和所得到的免疫磁珠(C6孔)与考马斯亮蓝的显色反应呈蓝色，表明有抗体的定性检出。而单纯的氨基磁珠(C1孔)、金属离子(C2孔)、有机配体(C3孔)、磁珠的洗涤上清液(C5孔)均不与考马斯亮蓝溶液产生显色反应，以上显色反应表明了采用链霉亲和素磁珠可成功原位合成免疫磁珠。
实施例4：以羧基磁珠、硝酸钴、二甲基咪唑、黄曲霉毒素的抗体合成黄曲霉毒素的免疫磁珠
1.将羧基磁珠用10mM PH 7.0MOPS缓冲溶液配制成浓度为1mg/mL的磁珠悬浮液。
2.用10mM PH 7.0MOPS缓冲溶液配制成浓度为80mM的硝酸钴溶液。
3.用10mM PH 7.0MOPS缓冲溶液配制成浓度为400mM的二甲基咪唑溶液。
4.将1ml 100mM的硝酸钴溶液与200uL磁珠悬浮液混合，室温反应5min。
5.向步骤4获得的反应液中加入500uL黄曲霉毒素抗体溶液(1mg/mL)，涡旋后室温反应5min。
6.向步骤5获得的反应液中加入1mL 240mM的2-甲基咪唑溶液，涡旋后室温反应40min。
7.将反应后的溶液在外界磁场的作用下去除上清液，剩余磁珠用含0.1％的Tween-20 MOPS缓冲溶液(10mM PH 7.0)洗涤2次，再用MOPS缓冲溶液(10mM PH 7.0)洗涤1次。
8.将洗涤后的磁珠用10mM PH 7.0MOPS缓冲溶液重悬为1mg/mL的悬浮液。
与实施例1一致，采用考马斯亮蓝显色法成功证明免疫磁珠的合成。
实施例5：以羧基磁珠、醋酸锌、咪唑-2-甲醛、黄曲霉毒素的抗体合成黄曲霉毒素的免疫磁珠
1.将羧基磁珠用10mM PH 7.0MOPS缓冲溶液配制成浓度为1mg/mL的磁珠悬浮液。
2.用10mM PH 7.0MOPS缓冲溶液配制成浓度为100mM的醋酸锌溶液。
3.用10mM PH 7.0MOPS缓冲溶液配制成浓度为640mM的咪唑-2-甲醛溶液。
4.将1mL100mM的醋酸锌溶液与200uL磁珠悬浮液混合，室温反应5min。
5.向步骤4获得的反应液中加入350uL黄曲霉毒素抗体溶液(1mg/mL)，涡旋后室温反应5min。
6.向步骤5获得的反应液中加入1mL 640mM的咪唑-2-甲醛溶液，涡旋后室温反应40min。
7.将反应后的溶液在外界磁场的作用下去除上清液，剩余磁珠用含0.1％的Tween-20 MOPS缓冲溶液(10mM PH 7.0)洗涤2次，再用MOPS缓冲溶液(10mM PH 7.0)洗涤1次。
8.将洗涤后的磁珠用10mM PH 7.0MOPS缓冲溶液重悬为1mg/mL的悬浮液。
与实施例1一致，采用考马斯亮蓝显色法成功证明免疫磁珠的合成。
实施例6：以实施例1合成的免疫磁珠纯化并检测玉米样品中的四种黄曲霉毒素包括以下步骤：
1.将玉米样品用钢磨粉碎后过40目筛。
2.称取5g粉碎后过筛的玉米样品，装入20mL的离心管中，加入提取溶剂，放置在振荡器中振荡20分钟，静止2分钟，取上清液，即为样品提取液。
3.取100uL样品提取液加入800uL MOPS缓冲溶液，再加入100uL免疫磁珠的悬浮液，室温下混合10min。
4.将反应后的免疫磁珠混合液放到磁力架上，磁吸弃上清液。
5.将步骤4获得的磁珠加入1ml含0.1％ Tween 20的MOPS缓冲液(10mM pH 7.0)中洗涤1min，然后将磁珠悬浮液置于磁力架上，磁吸弃上清液。
6.重复5中的洗涤步骤1次。
7.将洗涤液缓冲液换成MOPS缓冲液(10mM pH 7.0)重复5中的洗涤步骤一次。
8.在步骤7获得的磁珠中加入500L甲醇溶液，涡旋混匀1min，使磁珠表面的黄曲霉毒素洗脱下来。
9.用磁珠磁吸收集上清并用超高压液相色谱检测其含量。
结果：玉米提取液与净溶液的高效液相色谱检测结果如图3所示，与标准溶液的色谱图的相比，玉米提取液的高效液相色谱图没有其他杂峰，说明采用本发明的合成方法合成的免疫磁珠具有很好的净化效果。
实施例7：以实施例1合成的免疫磁珠与常规合成法合成的免疫磁珠最大容量对比
1.将实施例1合成的免疫磁珠充分涡旋后取100μL于1mL EP管中，加入800μL MOPS缓冲溶液充分混合，再加入100uL 2ppm的AFB1标准溶液反应10min。
2.将1中的反应混合物磁吸弃上清，用MOPS缓冲液(10mM pH 7.0)洗三遍后磁吸弃上清，加入500μL甲醇，1min后磁吸取上清进行AFB1浓度的测试，并计算100uL免疫磁珠(100ug抗体)的最大容量，如表1所示。
3.常规合成法合成免疫磁珠：将实施例1所用的羧基磁珠用EDC活化后与黄曲霉毒素的抗体进行偶联，将得到的免疫磁珠稀释成1mg/mL。
4.将步骤3合成的免疫磁珠充分涡旋后取100μL于1mL EP管中，加入800μL MOPS缓冲溶液充分混合，再加入100uL 2ppm的AFB1标准溶液反应10min。
5.将4中的反应混合物磁吸弃上清，用MOPS洗三遍后磁吸弃上清，加入500μL甲醇，1min后磁吸取上清进行AFB1浓度的测试，并计算100uL免疫磁珠(100ug)的最大容量，计算结果如表1所示。
表1采用实施例1的免疫磁珠与常规偶联法所得免疫磁珠最大容量的对比
实施例8：免疫磁珠的非特异性研究
1.将实施例1中的黄曲霉毒素抗体换成牛血清蛋白，其他步骤不变，合成MB@MOF@BSA材料。
2.将实施例1中的黄曲霉毒素抗体步骤去掉，其他步骤不变，合成MB@MOF材料。
3.将实施例1中的金属盐溶液以及有机配体步骤去掉，其他步骤不变，合成MB@BSA材料。
4.分别取实施例1中合成的免疫磁珠(记为MB@MOF@anti-AFT)50uL，本例步骤1中的MB@MOF@BSA材料50uL，本例步骤2中的MB@MOF材料50uL，本例步骤3中的MB@BSA材料50uL以及羧基磁珠50uL(1mg/mL)，分别加入450uL MOPS缓冲溶液充分混合，再加入50uL 2ppm的AFB1标准溶液反应10min。
5.将步骤4中的反应混合物分别磁吸弃上清，用MOPS洗三遍后磁吸弃上清，加入500μL甲醇洗脱，1min后磁吸取上清进行AFB1浓度的测试，实验结果表2所示。
实验结果表明，只有偶联了黄曲霉毒素抗体的材料才能够特异性的吸附黄曲霉毒素，其他材料如偶联其他蛋白的磁珠，只包覆有MOFs材料的磁珠以及磁珠本身对黄曲霉毒素都没有吸附作用。同时也表明采用本方法合成的免疫磁珠对黄曲霉毒素只有特异性吸附，没有非特异性吸附。
表2：
实施例9：免疫磁珠的温度耐受性研究
1.分别取实施例1中合成的免疫磁珠和实施例7中按常规合成法合成的免疫磁珠100uL分别置于1mL EP管中。
2.将步骤1中的两个EP管置于80℃水浴中10min后，再进行最大容量的检测：分别加入800μL MOPS缓冲溶液充分混合，再加入100uL 2ppm的AFB1标准溶液反应10min。
3.将2中的反应混合物磁吸弃上清，用MOPS洗三遍后磁吸弃上清，加入500μL甲醇，1min后磁吸取上清进行AFB1浓度的测试，并计算100uL免疫磁珠(100ug)的最大容量，检测结果如图4所示。由图可知采用本方法合成的免疫磁珠在80℃水浴下，对AFB1的最大容量计划不变，而按常规方法合成的免疫磁珠在80℃水浴下的磁珠容量降低明显。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (10)
1.一种用于免疫检测的免疫磁珠，其特征在于，包括磁珠载体、金属有机框架和抗体；其中，所述抗体以金属有机框架为连接体包覆于所述磁珠载体的表面。
2.根据权利要求1所述的免疫磁珠，其特征在于，所述磁珠载体、抗体和金属有机框架的质量比为2-10:1-5:0.5-3。
3.根据权利要求1所述的免疫磁珠，其特征在于，所述金属有机框架中，金属中心为锌、钴、铜和铁中的任一种，有机配体为含氮类配体和/或羧酸类配体。
4.根据权利要求1所述的免疫磁珠，其特征在于，所述磁珠载体为羧基磁珠、氨基磁珠、羟基磁珠、链霉亲和素磁珠、二氧化硅磁珠和N-羟基琥珀酰亚胺修饰的磁珠中的任一种。
5.一种如权利要求1-4任一所述的免疫磁珠的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将磁珠载体的悬浮液、金属盐溶液、抗体溶液和有机配体溶液混合，在室温下进行反应。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述磁珠载体的悬浮液的浓度为0.2mg/mL-1mg/mL，所述金属盐溶液的浓度为10mg/mL-320mg/mL；所述金属盐溶液与磁珠载体的悬浮液的体积比为2-10:1。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述抗体溶液的浓度为0.1mg/mL-1mg/mL，所述抗体溶液与磁珠载体的悬浮液的体积比为1-10:1。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述有机配体溶液与金属盐溶液中，有机配体和金属离子的摩尔比为4-10:1。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述反应的时间为10min-24h。
10.一种如权利要求1-4任一所述的免疫磁珠或如权利要求5-9任一所述的制备方法得到的免疫磁珠在真菌毒素、农药残留、过敏原和肿瘤标志物中任一种的富集分离中的应用。
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