CN111229169A - 蛋白功能化磁性复合材料及其制备方法和应用 - Google Patents

蛋白功能化磁性复合材料及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开蛋白功能化磁性复合材料及其制备方法和应用，以四氧化三铁磁性微球为核，以水解产生的二氧化硅和N‑三甲氧基硅丙基‑N,N,N‑三甲基氯化铵为壳，自组装BSA即可。本发明以自组装技术和纳米科学为牵引，将手性主体分子自组装在功能化磁性复合材料表面。以应用为向导来设计和制备材料，构建相应组装路线，这一动态有序自组装方法可有效避免空间无序排列和分布不均匀等现象，有利于规模化制备；而且根据手性主体分子结构特点，通过自组装方式将手性主体负载在磁性材料表面，方法简单、负载容量高，具有巨大的应用前景。

Description

蛋白功能化磁性复合材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于功能材料和手性分离技术领域，更加具体地说，涉及一种自组装型蛋白功能化磁性复合材料和制备方法及其在手性分离中的应用。
背景技术
手性化合物的两个对映异构体除了旋光性外具有相同的物力和化学性质，但是其生化和药理活性却往往不同，甚至有相反的作用。因此，研究手性分离技术对于医药工业、生命科学都具有十分重要的意义。手性拆分技术主要包括机械拆分、优先结晶、化学拆分、酶拆分、膜分离和色谱拆分等多种拆分方法。其中液相色谱手性固定相拆分法被认为是最具有优势的光学异构体拆分方法，目前已经开发了多种手性固定相，按照手性固定相的结构，可分为蛋白质型、刷型/Prikle型、多糖衍生物型、大环抗生素型、配体交换型和环糊精型等。按照手性选择剂在载体上的固定方式，可分为键合型和涂覆型两类。随着现代科学技术的发展，人们对手性化合物不同生物活性的认识越来越深刻，对单一对映体的需求量不断增加，对纯度的要求也越来越高。常规的色谱手性分离技术虽然应用广泛、操作条件温和、分离效率高，但处理量小、放大成本高，多适用于分析和检测。因此，研究新型手性识别材料和高效快速手性分离技术，具有广阔的应用前景。但是手性分离技术的发展更侧重于新技术新材料的研究，手性选择剂在载体上的固定方式，还是主要为键合型和涂覆型两类。键合型固定方式作用力强，稳定性高，但是反应过程复杂且不易达到较高键合率，而且容易破坏手性选择剂结构导致作用位点减少。涂覆型固定方式，操作简易，涂覆量高，能有效提高分离容量，但是不稳定，寿命较短，容易随着流动相流失，导致分离效率下降。
纳米材料的研究已经成为当今国际上的前沿研究课题，其在分析化学领域已有广泛的用途，在手性识别领域也显示了十分诱人的应用前景。纳米颗粒具有高比表面且易于修饰，作为手性选择剂载体，可以起到提高柱容量或信号放大的作用。纳米材料在手性识别领域的研究取得了越来越多的关注，但是多数纳米材料在溶液中难于实现固液分离的不足大大限制了其应用范围。而磁性纳米颗粒具有纳米材料特有的小尺寸效应、表面效应等性质，还具有独特的磁性能，在外加磁场作用下可以快速聚集从而实现固液分离，因此在催化、生物分离和医学等领域得到了广泛应用。研究新型功能化磁性纳米材料及其复合材料的制备和应用，已经引起了科研工作者的广泛兴趣。近年来，通过表面修饰手性选择剂制得的功能化磁性纳米在手性分离领域显示了巨大的应用潜力。
自组装是指系统的构筑元素(如分子)在不受外力借助下，通过非共价键作用自发的形成有序结构的过程，是创造具有多层次结构与功能的新材料的重要途径，是国际学术前沿研究领域。分子自主装技术通过分子间弱相互作用力及其协同效应，形成有序分子聚集体如自组装膜，这里的弱相互作用力包括氢键、范德华力、疏水作用、π-π相互作用、阳离子-π相互作用等。
发明内容
本发明的目的在于克服现有手性固定相材料的稳定性和负载量的不足，提供蛋白功能化磁性复合材料及其制备方法和应用，以磁性纳米材料为手性选择剂载体，结合自主装技术为固定方式来制备蛋白功能化磁性复合材料,该材料可应用于手性化合物进行快速、高效手性分离。
本发明的技术目的通过下述技术方案予以实现。
蛋白功能化磁性复合材料，以四氧化三铁磁性微球为内核，以二氧化硅为外壳并进行表面季铵修饰，再以牛血清白蛋白(BSA)进行自组装，按照下述步骤进行制备：
步骤1，合成磁性四氧化三铁纳米粒子(参考中国发明专利，申请号200410009788.9)
将可溶性三价铁离子盐加入到乙二醇的水溶液中，配成0.05～0.4mol/l的澄清溶液并加入无水乙酸钠和聚乙二醇，将溶液放入密闭加热容器中，在200～300℃下进行溶剂热反应，加热时间为8～72小时，所得产物用去离子水洗涤，40～80℃烘干，制得100～500纳米粒径的四氧化三铁纳米磁性微球；
在步骤1中，反应温度为250—300摄氏度，反应时间为20—60小时。
在步骤1中，可溶性三价铁离子盐为氯化铁、硝酸铁、硫酸铁或醋酸铁。
在步骤1中，无水乙酸钠的用量为3—5质量份，聚乙二醇用量为1—2质量份，每一质量份为1g。
步骤2，在步骤1合成的磁性Fe3O4纳米粒子表面形成二氧化硅外壳，以得到核壳型Fe3O4@SiO2磁性材料
将步骤1制备的磁性Fe3O4纳米粒子重新分散到乙醇和水的混合溶液中，乙醇和水的体积比为(1～10)：1，加入过量的浓氨水和四乙氧基硅，所述步骤1制备的磁性Fe3O4纳米粒子、质量分数为25～28％的浓氨水和四乙氧基硅(烷)的质量比为1：(1—10)：(0.2—10)，室温下持续搅拌，以使四乙氧基硅烷在磁性粒子表面水解聚合，得到Fe3O4/SiO2磁性材料，其中浓氨水为碱性催化剂，为反应体系提供碱性环境，四乙氧基硅烷在磁性粒子表面水解聚合得到二氧化硅的外壳结构；
在步骤2中，选择在室温20—25℃下机械搅拌3—24h，优选10—20小时，机械搅拌速度为每分钟100—300转。
在步骤2中，所述步骤1制备的磁性Fe3O4纳米粒子、质量分数为25～28％的浓氨水和四乙氧基硅(烷)的质量比为1：(4—8)：(2—6)。
在步骤2中，在外加磁场的辅助下收集磁性粒子，以去离子水和乙醇清洗3—6次，在40—80℃下真空干燥6—24h，得到干燥的Fe3O4/SiO2磁性粒子。
步骤3，在步骤2制备的Fe3O4/SiO2磁性粒子的外壳上键接表面修饰的N-三甲氧基硅丙基-N,N,N-三甲基氯化铵(TMAPS)，以得到表面季铵修饰的Fe3O4@SiO2磁性微球(Fe3O4@SiO2@TMA)
将步骤2制备的磁性材料分散到甲苯和N,N-二甲基甲酰胺的混合溶液中，超声分散均匀，然后加入过量的N-三甲氧基硅丙基-N,N,N-三甲基氯化铵的甲醇溶液，以使其充分反应，通过硅烷化反应得到表面修饰季铵的磁性微球；
在步骤3中，甲苯和N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1：(1～10)。
在步骤3中，硅烷化反应在25～60℃下进行，反应时间为2～24h，优选10—20小时，机械搅拌速度为每分钟100—300转。
在步骤3中，在外加磁场的辅助下收集磁性微球，以去离子水和乙醇清洗3～6次，在40～80℃下真空干燥6～24h，得到干燥的表面修饰苯磺酸的Fe3O4@SiO2磁性微球。
在步骤3中，所述步骤2制备的磁性材料与N-三甲氧基硅丙基-N,N,N-三甲基氯化铵的甲醇溶液的质量比为1：(1—20)，优选1：(8—15)，在N-三甲氧基硅丙基-N,N,N-三甲基氯化铵的甲醇溶液中，N-三甲氧基硅丙基-N,N,N-三甲基氯化铵的质量百分数为50wt％。
步骤4，将步骤3制备的表面季铵修饰的Fe3O4@SiO2磁性微球活化后，以牛血清白蛋白进行表面自组装，以得到表面自组装蛋白的Fe3O4@SiO2@TMA磁性微球(Fe3O4@SiO2@TMA-BSA)
将步骤3制备的磁性微球置于等体积比的甲醇和去离子水中进行洗涤活化，然后在外加磁场辅助下收集磁性材料，再以牛血清白蛋白与活化后的磁性材料混合均匀并振荡，在外加磁场辅助下收集自组装了牛血清白蛋白的磁性材料。
在步骤4中，取40mL浓度为0.05-2mg/mL的牛血清白蛋白水样并使用PBS缓冲液调节pH值为6—9，加入活化的步骤3制备的磁性微球进行自组装，季铵基是强碱性基团，它在2～9的pH范围内均电离而带正电荷；牛血清蛋白等电点pH为5，在pH大于5时带负电。
在步骤4中，振荡反应温度为室温20—25摄氏度，反应时间为2—300min，优选30—60min。
在步骤4中，在振荡反应之后，以去离子水和乙醇清洗3～6次，在40～80℃下真空干燥6～24h，得到干燥的表面自组装蛋白的Fe3O4@SiO2@TMA磁性微球(Fe3O4@SiO2@TMA-BSA)。
与现有技术相比，本发明的优点在于：(1)以磁性纳米粒子作为吸附剂的磁性分离技术具有简单、快速、高效等优点；引入磁性纳米颗粒为载体有利于进一步修饰和增加表面负载量，提供更多的主客体作用位点，以增大手性分离容量；而且以磁场分离技术代替传统分离技术，可快速实现分离和再生。磁性纳米颗粒的引入对手性分离的作用主要有三点：一是磁性纳米颗粒的粒径小、表面积大，作为载体可以增加负载容量；二是磁性纳米颗粒易于表面修饰，有利于实现可控设计；三是通过开关磁场实现目标物的选择性分离和吸附剂的简便再生，也可延长吸附剂使用寿命。因此，相比于传统的手性分析技术，引入磁性纳米颗粒负载手性主体来构建手性分离体系更有利于实现快速、高效分离。(2)利用自组装技术将手性主体分子负载到功能化磁性纳米材料表面，从而制得具有手性识别能力又具有磁性的多功能磁性复合材料；通过静电吸引、疏水、配位等相互作用力的协同作用，手性主体通过自组装方式负载在功能化磁性纳米材料表面，该方法简便易行，并易于实现高容量负载。以自组装技术和纳米科学为牵引，将手性主体分子自组装在功能化磁性复合材料表面。以应用为向导来设计和制备材料，构建相应组装路线，这一动态有序自组装方法可有效避免空间无序排列和分布不均匀等现象，有利于规模化制备；而且根据手性主体分子结构特点，通过自组装方式将手性主体负载在磁性材料表面，方法简单、负载容量高，具有巨大的应用前景。
附图说明
图1为本发明磁性材料的TEM照片，其中(a)磁性Fe3O4亚微球，(b)磁性Fe3O4@SiO2@TMA-BSA亚微球。
图2为本发明磁性材料Fe3O4@SiO2@TMA-BSA亚微球的EDS测试曲线图。
图3为本发明磁性材料的XRD谱线图，其中(a)磁性Fe3O4亚微球，(b)磁性Fe3O4@SiO2@TMA-BSA亚微球。
图4为本发明磁性材料的磁滞回线测试曲线图，其中(a)磁性Fe3O4亚微球，(b)磁性Fe3O4@SiO2@TMA亚微球，(c)磁性Fe3O4@SiO2@TMA-BSA亚微球。
图5为本发明磁性材料的FT-IR谱线图，其中(a)BSA，(b)磁性Fe3O4亚微球，(c)磁性磁性Fe3O4@SiO2@TMA-BSA亚微球。
图6为本发明磁性材料的Zeta电位图，其中(a)磁性Fe3O4@SiO2@TMA亚微球，(b)磁性磁性Fe3O4@SiO2@TMA-BSA亚微球，(c)BSA。
具体实施方式
以下结合实施例进一步阐述本发明，但本发明所涉及的主题范围并非仅限于这三个实施例。
实施例1—自组装型牛血清蛋白功能化磁性微球的制备方法
(1)磁性Fe3O4亚微球的制备
称取FeCl3·6H2O溶于40mL乙二醇溶液中，配成0.05mol/L的溶液，然后依次加入3.6g无水乙酸钠、1g聚乙二醇-6000，磁力搅拌0.5h。将所得溶液转移至50mL的不锈钢反应釜中，加热至200℃反应8h。在外加磁场的辅助下收集产物，依次用去离子水和无水乙醇洗涤3～6次，40～80℃真空干燥，制得磁性Fe3O4亚微球。
(2)磁性Fe3O4@SiO2亚微球的制备
将1g磁性Fe3O4亚微球重新分散到120mL乙醇和40mL去离子水混合溶液中，加入氨水3mL(质量百分数25—28wt％)，四乙氧基硅烷(TEOS)1mL，室温机械搅拌8h。在外加磁场的辅助下收集产物，依次用去离子水、乙醇洗涤6次，每次50mL，80℃真空干燥24h，得到干燥的Fe3O4@SiO2磁性亚微球。
(3)磁性Fe3O4@SiO2@TMA亚微球的制备
将1g磁性Fe3O4@SiO2亚微球重新分散到120mL的N,N-二甲基甲酰胺和40mL甲苯混合溶液中，加入N-三甲氧基硅丙基-N,N,N-三甲基氯化铵的甲醇溶液(质量百分比为50wt％，美国Gelest公司生产)5mL，室温机械搅拌24h。在外加磁场的辅助下收集产物，依次用乙醇、去离子水、丙酮洗涤6次，每次50mL，80℃真空干燥24h，得到干燥的苯磺酸修饰磁性Fe3O4@SiO2亚微球(Fe3O4@SiO2@TMA)。
(4)牛血清蛋白功能化磁性Fe3O4@SiO2@TMA的制备
取磁性Fe3O4@SiO2@TMA纳米材料50mg置于50mL离心管中，依次加入5mL甲醇和5mL去离子水洗涤活化，然后在外加磁场辅助下收集磁性Fe3O4@SiO2@TMA纳米材料，溶液弃去；取40mL浓度为1mg/L牛血清蛋白的PBS水样置于离心管中，与活化后的磁性Fe3O4@SiO2@TMAF纳米材料混合均匀并振荡120min，在外加磁场辅助下收集磁性Fe3O4@SiO2@TMA纳米材料，分别加入去离子水和甲醇洗涤3次；80℃真空干燥，制得牛血清蛋白功能化磁性Fe3O4@SiO2@TMA亚微球Fe3O4@SiO2@TMA-BSA)。
实施例2—磁性材料的结构表征
(1)颗粒形貌及粒径大小和表征
采用Tecnai G2F20型透射电子显微镜(美国FEI公司)观察制备的磁性粒子的粒径和形貌。图1为磁性Fe3O4亚微球和磁性Fe3O4@SiO2@TMA-BSA亚微球的TEM图。从图1(a)可以看出磁性Fe3O4亚微球为球形，粒径为190±10nm；图1(b)显示磁性Fe3O4@SiO2@TMA-BSA亚微球外层包裹了一层厚度为20±5nm的二氧化硅，整个磁性Fe3O4@SiO2@TMA-BSA亚微球呈现核壳结构。
(2)元素表征
采用X-射线能谱仪(TEM配件，美国FEI公司)测定磁性微球的X-射线能量损失谱图。图2为磁性Fe3O4@SiO2@TMA-BSA亚微球的EDS图。从图中可以看出，该材料主要含有铁和硅元素，从而可以证实SiO2成功包裹在磁性Fe3O4亚微球上。
(3)晶型表征
采用Rigaku D/max 2500型X-射线衍射仪(日本理学株式会社)表征磁性微球的晶体类型，其XRD谱图如图3所示。与X-射线衍射卡片对照可以看出，磁性Fe3O4亚微球的晶体结构为尖晶石，被二氧化硅、硅烷试剂和蛋白包覆和修饰后，其衍射峰的数量没有增加，位置也没有改变，这表明包覆过程中内核磁性Fe3O4亚微球的晶型没有改变。
(4)磁性表征
采用PPMS-9型物理性质测量系统(美国Quantum Design公司)表征磁性材料的磁性能。磁性Fe3O4、磁性Fe3O4@SiO2@TMA和Fe3O4@SiO2@TMA-BSA的磁滞回线见图4，从图可见两种磁性亚微球的剩磁和矫顽力均趋于零，表现为超顺磁性。由于SiO2和硅烷试剂没有磁响应性能，磁性Fe3O4亚微球被SiO2、硅烷试剂、蛋白包裹后饱和磁化强度有所下降，其饱和磁化强度分别为75、51和47emu g-1。
(5)官能团表征
采用Nicolet 6700型傅立叶红外光谱仪(美国ThermoFisher公司)表征磁性材料的官能团变化，从图5(c)可以看出磁性Fe3O4@SiO2@TMA-BSA亚微球在波数为2955、1645和1531cm-1处出现了吸收峰，该吸收峰是由BSA上的基团产生的，这就表明牛血清蛋白成功自组装磁性Fe3O4@SiO2@TMA-BSA亚微球表面。
(6)Zeta电位表征
采用Nano ZS型Zeta电位仪(英国Malvern公司)表征磁性材料表面的带电情况，从图6可以看出Fe3O4@SiO2@TMA的纳米粒子在pH值为2～9的范围内均为正值，由于季铵基是强碱性基团，它在2～9的pH范围内均电离而带正电荷。牛血清蛋白等电点pH为5，在pH大于5时带负电。结果表明在中性条件下牛血清蛋白能够自组装在磁性Fe3O4@SiO2@TMA亚微球表面。
(7)BSA固载量分析
采用Lambda 750型紫外可见分光光度计(美国Perkin Elmer公司)测量VAN的固载量，三次测试取平均值，结果表明该磁性Fe3O4@SiO2@TMA-BSA亚微球材料表面BSA的固载量为45mg g-1。
实施例3—自组装型牛血清蛋白功能化磁性微球用于拆分手性1，2-二苯乙醇酮异构体
将本发明技术方案制备的自组装型牛血清蛋白功能化磁性微球用于拆分手性1，2-二苯乙醇酮异构体。
选择1，2-二苯乙醇酮异构体作为分析物，采用HPLC分析拆分效果。用正己烷-异丙醇(9:1)配制1,2-二苯乙醇酮质量浓度为1μg/L的标准溶液进行液相色谱(仪器型号为Shimazu HPLC-20A，产商为日本岛津公司，仪器配置SPD-M20A型二极管阵列检测器、CTO-20AC柱温箱、SIL-20AC自动进样器；色谱柱为CHIRALCEL OD手性柱，250×4.6mm，10μm，产商为大赛璐药物手性技术(上海)有限公司；流动相为正己烷-异丙醇(体积比为90:10)，流速为1ml/min，进样量为20μL)测定，得到手性吸附前1,2-二苯乙醇酮两个对映异构体的峰面积。
取100mg Fe3O4@SiO2@TMA-BSA磁性材料加入1mg/mL外消旋1，2-二苯乙醇酮溶液中，振荡5min。磁分离后，取上清液用正己烷萃取氮气吹干。残留物用正己烷-异丙醇(9:1)重新溶解并定容至1mL，用0.22μm的水洗滤膜过滤，每次取20μL该溶液进行手性液相色谱分析，以测定与磁性材料作用后1，2-二苯乙醇酮的两个对映异构体的含峰面积。
手性分离结果表明，与磁性材料作用之前，1，2-二苯乙醇酮的外消旋溶液中含有等量的对映异构体，两个对映异构体的峰面积几乎相等。与磁性材料混合作用之后，上清液中两个对映体的峰面积都发生了明显下降，其中R-对映体的峰面积减少量大于S-对映体的峰面积减少量，两个对映异构体的峰面积比为R:S＝36:64，对映体过量(ee)值为28％，说明该材料选择性地识别了两个对映体，对R-对映体的作用力要大于S-对映体，导致磁性分离之后上清液中S-对映体的含量大于R-对映体。
根据本发明内容进行工艺参数的调整，均可实现蛋白功能化磁性复合材料的制备，且表现出与本发明基本一致的性能，即本发明的蛋白功能化磁性复合材料在分离手性1，2-二苯乙醇酮异构体中的应用。以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.蛋白功能化磁性复合材料，其特征在于，以四氧化三铁磁性微球为内核，以二氧化硅为外壳并进行表面季铵修饰，再以牛血清白蛋白进行自组装，按照下述步骤进行制备：
步骤1，合成磁性四氧化三铁纳米粒子
将可溶性三价铁离子盐加入到乙二醇的水溶液中，配成0.05～0.4mol/l的澄清溶液并加入无水乙酸钠和聚乙二醇，将溶液放入密闭加热容器中，在200～300℃下进行溶剂热反应，加热时间为8～72小时，所得产物用去离子水洗涤，40～80℃烘干，制得100～500纳米粒径的四氧化三铁纳米磁性微球；
步骤2，在步骤1合成的磁性Fe3O4纳米粒子表面形成二氧化硅外壳，以得到核壳型Fe3O4@SiO2磁性材料
将步骤1制备的磁性Fe3O4纳米粒子重新分散到乙醇和水的混合溶液中，乙醇和水的体积比为(1～10)：1，加入过量的浓氨水和四乙氧基硅，所述步骤1制备的磁性Fe3O4纳米粒子、质量分数为25～28％的浓氨水和四乙氧基硅烷的质量比为1：(1—10)：(0.2—10)，室温下持续搅拌，以使四乙氧基硅烷在磁性粒子表面水解聚合，得到Fe3O4/SiO2磁性材料，其中浓氨水为碱性催化剂，为反应体系提供碱性环境，四乙氧基硅烷在磁性粒子表面水解聚合得到二氧化硅的外壳结构；
步骤3，在步骤2制备的Fe3O4/SiO2磁性粒子的外壳上键接表面修饰的N-三甲氧基硅丙基-N,N,N-三甲基氯化铵，以得到表面季铵修饰的Fe3O4@SiO2磁性微球
将步骤2制备的磁性材料分散到甲苯和N,N-二甲基甲酰胺的混合溶液中，超声分散均匀，然后加入过量的N-三甲氧基硅丙基-N,N,N-三甲基氯化铵的甲醇溶液，以使其充分反应，通过硅烷化反应得到表面修饰季铵的磁性微球；
步骤4，将步骤3制备的表面季铵修饰的Fe3O4@SiO2磁性微球活化后，以牛血清白蛋白进行表面自组装，以得到表面自组装蛋白的Fe3O4@SiO2@TMA磁性微球
将步骤3制备的磁性微球置于等体积比的甲醇和去离子水中进行洗涤活化，然后在外加磁场辅助下收集磁性材料，再以牛血清白蛋白与活化后的磁性材料混合均匀并振荡，在外加磁场辅助下收集自组装了牛血清白蛋白的磁性材料。
2.根据权利要求1所述的蛋白功能化磁性复合材料，其特征在于，在步骤1中，反应温度为250—300摄氏度，反应时间为20—60小时；可溶性三价铁离子盐为氯化铁、硝酸铁、硫酸铁或醋酸铁；无水乙酸钠的用量为3—5质量份，聚乙二醇用量为1—2质量份。
3.根据权利要求1所述的蛋白功能化磁性复合材料，其特征在于，在步骤2中，选择在室温20—25℃下机械搅拌3—24h，优选10—20小时，机械搅拌速度为每分钟100—300转；所述步骤1制备的磁性Fe3O4纳米粒子、质量分数为25～28％的浓氨水和四乙氧基硅烷的质量比为1：(4—8)：(2—6)；在外加磁场的辅助下收集磁性粒子，以去离子水和乙醇清洗3—6次，在40—80℃下真空干燥6—24h，得到干燥的Fe3O4/SiO2磁性粒子。
4.根据权利要求1所述的蛋白功能化磁性复合材料，其特征在于，在步骤3中，甲苯和N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1：(1～10)；硅烷化反应在25～60℃下进行，反应时间为2～24h，优选10—20小时，机械搅拌速度为每分钟100—300转；在外加磁场的辅助下收集磁性微球，以去离子水和乙醇清洗3～6次，在40～80℃下真空干燥6～24h，得到干燥的表面修饰苯磺酸的Fe3O4@SiO2磁性微球；所述步骤2制备的磁性材料与N-三甲氧基硅丙基-N,N,N-三甲基氯化铵的甲醇溶液的质量比为1：(1—20)，优选1：(8—15)，在N-三甲氧基硅丙基-N,N,N-三甲基氯化铵的甲醇溶液中，N-三甲氧基硅丙基-N,N,N-三甲基氯化铵的质量百分数为50wt％。
5.根据权利要求1所述的蛋白功能化磁性复合材料，其特征在于，在步骤4中，取40mL浓度为0.05-2mg/mL的牛血清白蛋白水样并使用PBS缓冲液调节pH值为6—9，加入活化的步骤3制备的磁性微球进行自组装；振荡反应温度为室温20—25摄氏度，反应时间为2—300min，优选30—60min；在振荡反应之后，以去离子水和乙醇清洗3～6次，在40～80℃下真空干燥6～24h，得到干燥的表面自组装蛋白的Fe3O4@SiO2@TMA磁性微球。
6.蛋白功能化磁性复合材料的制备方法，其特征在于，按照下述步骤进行制备：
步骤1，合成磁性四氧化三铁纳米粒子
将可溶性三价铁离子盐加入到乙二醇的水溶液中，配成0.05～0.4mol/l的澄清溶液并加入无水乙酸钠和聚乙二醇，将溶液放入密闭加热容器中，在200～300℃下进行溶剂热反应，加热时间为8～72小时，所得产物用去离子水洗涤，40～80℃烘干，制得100～500纳米粒径的四氧化三铁纳米磁性微球；
步骤2，在步骤1合成的磁性Fe3O4纳米粒子表面形成二氧化硅外壳，以得到核壳型Fe3O4@SiO2磁性材料
将步骤1制备的磁性Fe3O4纳米粒子重新分散到乙醇和水的混合溶液中，乙醇和水的体积比为(1～10)：1，加入过量的浓氨水和四乙氧基硅，所述步骤1制备的磁性Fe3O4纳米粒子、质量分数为25～28％的浓氨水和四乙氧基硅烷的质量比为1：(1—10)：(0.2—10)，室温下持续搅拌，以使四乙氧基硅烷在磁性粒子表面水解聚合，得到Fe3O4/SiO2磁性材料，其中浓氨水为碱性催化剂，为反应体系提供碱性环境，四乙氧基硅烷在磁性粒子表面水解聚合得到二氧化硅的外壳结构；
步骤3，在步骤2制备的Fe3O4/SiO2磁性粒子的外壳上键接表面修饰的N-三甲氧基硅丙基-N,N,N-三甲基氯化铵，以得到表面季铵修饰的Fe3O4@SiO2磁性微球
将步骤2制备的磁性材料分散到甲苯和N,N-二甲基甲酰胺的混合溶液中，超声分散均匀，然后加入过量的N-三甲氧基硅丙基-N,N,N-三甲基氯化铵的甲醇溶液，以使其充分反应，通过硅烷化反应得到表面修饰季铵的磁性微球；
步骤4，将步骤3制备的表面季铵修饰的Fe3O4@SiO2磁性微球活化后，以牛血清白蛋白进行表面自组装，以得到表面自组装蛋白的Fe3O4@SiO2@TMA磁性微球
将步骤3制备的磁性微球置于等体积比的甲醇和去离子水中进行洗涤活化，然后在外加磁场辅助下收集磁性材料，再以牛血清白蛋白与活化后的磁性材料混合均匀并振荡，在外加磁场辅助下收集自组装了牛血清白蛋白的磁性材料。
7.根据权利要求6所述的蛋白功能化磁性复合材料的制备方法，其特征在于，在步骤1中，反应温度为250—300摄氏度，反应时间为20—60小时，可溶性三价铁离子盐为氯化铁、硝酸铁、硫酸铁或醋酸铁，无水乙酸钠的用量为3—5质量份，聚乙二醇用量为1—2质量份；在步骤2中，选择在室温20—25℃下机械搅拌3—24h，优选10—20小时，机械搅拌速度为每分钟100—300转；所述步骤1制备的磁性Fe3O4纳米粒子、质量分数为25～28％的浓氨水和四乙氧基硅烷的质量比为1：(4—8)：(2—6)。
8.根据权利要求6所述的蛋白功能化磁性复合材料的制备方法，其特征在于，在步骤3中，甲苯和N,N-二甲基甲酰胺的体积比为1：(1～10)；硅烷化反应在25～60℃下进行，反应时间为2～24h，优选10—20小时，机械搅拌速度为每分钟100—300转；在外加磁场的辅助下收集磁性微球，以去离子水和乙醇清洗3～6次，在40～80℃下真空干燥6～24h，得到干燥的表面修饰苯磺酸的Fe3O4@SiO2磁性微球；所述步骤2制备的磁性材料与N-三甲氧基硅丙基-N,N,N-三甲基氯化铵的甲醇溶液的质量比为1：(1—20)，优选1：(8—15)，在N-三甲氧基硅丙基-N,N,N-三甲基氯化铵的甲醇溶液中，N-三甲氧基硅丙基-N,N,N-三甲基氯化铵的质量百分数为50wt％。
9.根据权利要求6所述的蛋白功能化磁性复合材料的制备方法，其特征在于，在步骤4中，取40mL浓度为0.05-2mg/mL的牛血清白蛋白水样并使用PBS缓冲液调节pH值为6—9，加入活化的步骤3制备的磁性微球进行自组装；振荡反应温度为室温20—25摄氏度，反应时间为2—300min，优选30—60min；在振荡反应之后，以去离子水和乙醇清洗3～6次，在40～80℃下真空干燥6～24h，得到干燥的表面自组装蛋白的Fe3O4@SiO2@TMA磁性微球。
10.如权利要求1—5之一所述的蛋白功能化磁性复合材料在分离手性1，2-二苯乙醇酮异构体中的应用。
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