JP7370987B2 - 固液相系を用いて核酸を単離して精製するための方法 - Google Patents
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Description
表面および複数の細孔を有する多孔質材料を含み、表面および細孔が複数のカチオン性基を含有する固相と、第1の相および第2の相を含有する水性二相系(ATPS)を含む液相と、を含む固液相系を得るステップa)と、
核酸含有材料を液相と混合することにより、混合物を得るステップb)と、
ステップb)で得られた混合物を固相と接触させるステップc)と
を含み、核酸が、固相に結合し、続いて多孔質材料の細孔を通過することができ、その結果、核酸を精製する。
いくつかの実施形態では、本発明は、核酸がその細孔または毛細管系内を通過することを可能にする修飾多孔質材料を含む固相を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、固相上での核酸の化学吸着性を何ら必要としない。多孔質材料は、標的核酸が通過できる任意の適切な多孔質材料で作られてもよく、当該多孔質材料は、様々な紙、ポリマー発泡体、セルロース発泡体、その他の発泡体、レーヨン織物、綿織物、その他の織物、木材、石、セラミック、金属、アガロースゲル、および炭素繊維を含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態で使用される材料は、ガラス繊維紙、綿系の紙、単層マトリックス紙またはポリオレフィン発泡体パッドを含むがこれらに限定されない。このような材料は、核酸の構造的および機能的完全性を良好に保持することができる。
本発明の液相は、第1の相および第2の相を含む水性二相系(ATPS)である。いくつかの実施形態では、ATPSの相のうちの一方はミセル溶液を含み、他方の相は1種以上のポリマーを含む。いくつかの実施形態では、ATPSの一方の相はミセル溶液を含み、他方の相は1種以上の塩を含む。いくつかの実施形態では、ミセル溶液は、Triton-X溶液である。いくつかの実施形態では、一方の相は第1のポリマーを含み、他方の相は第2のポリマーを含む。いくつかの実施形態では、第1および/または第2のポリマーは、ポリエチレングリコールおよびデキストランから選択される。いくつかの実施形態では、一方の相は1種以上のポリマーを含み、他方の相は1種以上の塩を含む。いくつかの実施形態では、一方の相はポリエチレングリコールを含み、他方の相はリン酸カリウムを含む。いくつかの実施形態では、一方の相は1種以上の塩を含み、他方の相は1種以上の塩を含む。いくつかの実施形態では、一方の相は1種以上のコスモトロピック塩を含み、他方の相は1種以上のカオトロピック塩を含む。いくつかの実施形態では、一方の相は1種以上のアルコールを含み、他方の相は1種以上の塩を含む。
アミンを緩衝液に溶解してアミン溶液を調製するステップ(a)と、
ステップ(a)で得られたアミン溶液に多孔質材料を浸すステップ(b)と、
ステップ(b)で得られた多孔質材料を水で洗浄するステップ(c)と、
ステップ(c)で得られた多孔質材料を乾燥させることにより、複数のカチオン性基を含む多孔質材料を得るステップ(d)と
を含む方法を提供する。
固相および液相を含む固液相系を得るステップであって、固相が表面および複数の細孔を含む多孔質材料を含み、表面および細孔が複数のカチオン性基を含み、液相が水性二相系(ATPS)を含むステップ(a)と、
核酸含有材料を液相と混合することにより、混合物を得るステップ(b)と、
ステップ(b)で得られた混合物を固相と接触させるステップ(c)とを含み、
核酸は、固相に結合し、続いて多孔質材料の細孔を通過することができ、かつ核酸は、多孔質材料上で濃縮される、核酸含有材料から核酸を精製するための方法を提供する。
本実施例では、以下のように修飾多孔質材料を製造した。スペルミジンをmilli-Q水に溶解して5Mアミン水溶液を得た。各枚厚さ0.37mmおよび細孔径2μmのガラス繊維紙シート4枚に、調製した溶液を噴霧した。前処理された4枚のシートを互いに積み重ね、積み重ねたシートを4cm×0.5cmサイズの長方形に切断して、紙スタックを製造した。次に、紙スタックを水で2回洗浄し、凍結乾燥機で乾燥させた。
実施例1に記載したように紙スタックを製造した。得られた紙スタックに、以下のようにATPS成分を組み込んだ。12%(w/w)PEG400、14.5%(w/w)Na2SO4、2%(w/w)SDSおよび0.16%(w/w)Triton-X114を含むATPS成分の水溶液を調製した。紙スタックをこの溶液に浸し、次いで圧縮空気下で乾燥させた。このようにして、ATPS成分を紙に組み込んだ。ATPS成分が組み込まれた紙スタックは、本明細書では、ATPS組み込み紙スタックと呼ばれる。
実施例1に記載されたように紙スタックを製造した。紙スタックにATPS成分を以下のように組み込んだ。12%(w/w)PEG400、14.5%(w/w)Na2SO4、2%(w/w)SDSおよび0.16%(w/w)Triton-X114を含むATPS成分の水溶液を調製した。実施例2に記載したように、ATPS成分を紙スタックに組み込んだ。ATPS組み込み紙スタックと対照紙スタック(アミン溶液で処理せず、ATPS成分が組み込まれていない未修飾紙で製造)は、(実施例2に記載されたのと同様に)タンパク質を最終濃度60~80mg/mL、DNAラダーを最終濃度200ng/mLでスパイクしたpH7.4の緩衝溶液を含む予備混合された疑似血液の混合物を含有する別々のチューブに挿入し、溶液が頂部に到達するまで約2分間吸い上げた。上相と下相との比は約1:1であることを観察した。
本実施例では、50bpDNAラダーおよび100bpDNAラダーを小さなDNA試料として使用した。1μgの50bpDNAラダーと1μgの100bpDNAラダーを200μLの1x PBS溶液中にスパイクして、最終濃度を10μg/mLにした。本発明の方法またはQIAamp(登録商標)循環核酸キット(QIAGEN(登録商標))を使用して、混合物からDNAを精製した。実施例1に記載したように紙スタックを製造し、実施例2に記載したようにATPS成分を組み込んだ。ATPS組み込み紙スタックと対照紙(アミン溶液で処理せず、ATPS成分が組み込まれていない未修飾紙で製造)は、(実施例2に記載したのと同様に)DNAラダーを含む溶液を含有する別々のチューブに挿入し、溶液が頂部に到達するまで約2分間吸い上げた。上相と下相との比は約1:1であることを観察した。各紙スタックの長さ約7mmの頂部部分を切り取り、その部分から5~7μLのDNA含有溶液をピペットで吸い出した。DNAをエタノールで沈殿させ、milli-Q水に再懸濁させ、Nanodrop(登録商標)によって分析した。その結果を、QIAamp(登録商標)循環核酸キット(QIAGEN(登録商標))を使用して得られた結果と比較した。表4の結果は、本発明が、使用される市販のキットよりも高い収率で小さなDNAを単離できることを示している。
患者と健常者から血清試料を収集した。本発明またはQIAamp(登録商標)循環核酸キット(QIAGEN(登録商標))を使用して、血清試料からccfDNAを精製した。実施例1に記載したように紙スタックを製造し、実施例2に記載したようにATPS成分を組み込んだ。ATPS組み込み紙スタックと対照紙スタック(アミン溶液で処理せず、ATPS成分が組み込まれていない未修飾紙で製造)は、(実施例2に記載したのと同様に)血清試料を含有する別々のチューブに挿入し、溶液が頂部に到達するまで約2分間吸い上げた。上相と下相との比は約1:1~1:3であることを観察した。実施例2~4で用いた模倣試料と比較して、実際の生体試料(例えば、本実施例5で用いた血清、実施例6で使用したスワブ試料および尿)を用いた場合には、個々の生体試料中の様々な成分の濃度が変動するため、2つの相の比の変動が大きかった。各紙スタックの長さ約7mmの頂部部分を切り取り、その部分から5~7μLのDNA含有溶液をピペットで吸い出した。エタノールでDNAを沈殿させ、milli-Q水に再懸濁させ、NanoDrop(登録商標)によって分析した。その結果を、QIAamp(登録商標)循環核酸キット(QIAGEN(登録商標))を使用して得られた結果と比較した。表5は、本発明が、使用される市販のキットよりも高い収量で、患者または健常者から得られた血清試料からccfDNAを単離できることを示している。
口腔スワブ試料を、A/H1N1ウイルスを保有する患者と健常者によって自己収集した。次に、各スワブ試料を、12%(w/w)PEG400、14.5%(w/w)Na2SO4、2%(w/w)SDSおよび0.16%(w/w)Triton-X114を含むATPS成分の水溶液500μLを含む別々のチューブ中で5分間インキュベートした。その後、本方法またはQIAamp(登録商標)循環核酸キット(QIAGEN(登録商標))を使用して、ウイルスRNAをこの溶液から精製した。実施例1に記載したように紙スタックを製造して、患者からのスワブと共にインキュベートされた溶液(患者試料)、健常者からのスワブと共にインキュベートされた溶液(健常対照)、または等量のPBS(陰性対照)のいずれかに挿入して、各紙スタックの長さ約7mmの部分が溶液中に浸漬されないようにし、溶液が頂部に到達するまで約2分間吸い上げた。上相と下相との比は約1:1~1:3であることを観察した。各紙スタックの長さ約7mmの頂部部分を切り取り、その部分から5~7μLのDNA含有溶液をピペットで吸い出した。DNAをエタノールで沈殿させ、milli-Q水に再懸濁させ、NanoDrop(登録商標)によって分析した。その結果を、QIAamp(登録商標)循環核酸キット(QIAGEN(登録商標))から得られた結果と比較した。表6は、本発明が、使用される市販のキットよりも高い収量で患者または健常者からウイルスRNAを単離できることを示す。
Claims (16)
- 核酸含有材料から核酸を精製するための固液相系であって、多孔質材料および水性二相系(ATPS)を含み、前記多孔質材料はガラス繊維紙であり、表面および複数の細孔を含み、前記表面および前記細孔は複数のカチオン性アミン基を含み、前記複数のカチオン性アミン基はスペルミジンであり、前記水性二相系は第1の相および第2の相を含み、前記第1の相はポリマー溶液であり前記第2の相は塩溶液である、系。
- 前記多孔質材料が、0.1~100μmの範囲の平均細孔径を有する、請求項1に記載の系。
- 前記第1の相の体積と前記第2の相の体積との比が1:1~1:1000である、請求項1に記載の系。
- 前記精製される核酸が約20~1000塩基対のサイズを有する、請求項1に記載の系。
- 10秒~5分以内に標的核酸を精製することができる、請求項1に記載の系。
- 前記固液相系を用いて精製された標的核酸の濃度が、前記核酸含有材料中の前記標的核酸の濃度の10~1000倍である、請求項1に記載の系。
- 前記精製される核酸が、1pg/mL以上の濃度で前記核酸含有材料中に存在する、請求項1に記載の系。
- 請求項1に記載の固液相系を用いて核酸含有材料から核酸を迅速に精製して濃縮するための方法。
- 核酸含有材料から核酸を精製するための方法であって、
表面および複数の細孔を含む多孔質材料を含み、前記表面および前記細孔が複数のカチオン性アミン基を含む固相と、水性二相系(ATPS)を含む液相とを含む固液相系を得るステップ(a)と、
前記核酸含有材料を前記液相と混合することにより、混合物を得るステップ(b)と、
ステップ(b)で得られた前記混合物を前記固相と接触させるステップ(c)とを含み、
前記多孔質材料はガラス繊維紙であり、前記複数のカチオン性アミン基はスペルミジンであり、前記水性二相系は第1の相および第2の相を含み、前記第1の相はポリマー溶液であり前記第2の相は塩溶液であり、
前記核酸は、前記固相に結合し、続いて前記多孔質材料の前記細孔を通過することができ、かつ前記核酸を前記多孔質材料上で濃縮する方法。 - 前記固相の前記多孔質材料から前記核酸を溶出させるステップをさらに含む、請求項9に記載の方法。
- 前記多孔質材料が、0.1~100μmの範囲の平均細孔径を有する、請求項9に記載の方法。
- 前記第1の相の体積と前記第2の相の体積との比が1:1~1:1000である、請求項9に記載の方法。
- 前記精製される核酸が約20~1000塩基対のサイズを有する、請求項9に記載の方法。
- 10秒~5分以内に標的核酸を精製することができる、請求項9に記載の方法。
- 前記固液相系を用いて精製された標的核酸の濃度が、前記核酸含有材料中の前記標的核酸の濃度の10~1000倍である、請求項9に記載の方法。
- 前記精製される核酸が、1pg/mL以上の濃度で前記核酸含有材料中に存在する、請求項9に記載の方法。
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