CN102224160A - 用于纯化治疗蛋白的水性两相萃取加强的沉淀方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及水性两相萃取(ATPE)加强的沉淀方法，其可用来从粗多组分混合物中回收以及部分纯化包括单克隆抗体的治疗蛋白。所述方法包括形成正向萃取PEG-磷酸盐ATPE体系，其中目标产物优先分配到富聚合物相中。第二ATPE反向萃取体系随后通过将来自所述正向萃取的富聚合物相引入富新磷酸盐相中而形成，这引起产物在两相之间的界面处沉淀。随后将该沉淀物回收并再溶解在合适的缓冲液中且可将其传送以便进一步纯化。

Description

用于纯化治疗蛋白的水性两相萃取加强的沉淀方法

发明领域

本发明涉及蛋白纯化领域，特别是，涉及从粗多组分混合物中捕获并纯化蛋白的方法。具体地说，本发明涉及水性两相萃取体系和蛋白沉淀方法的组合用以实现目标分子的生物分离的用途。

发明背景

单克隆抗体(mAb)当前代表着由全世界各组织制造或研发的最流行的生物药用产品(参见Jacobi A、Eckermann C和Ambrosius，“生物分离和生物加工(Bioseparation and Bioprocessing)”，第二版，第2卷，2007，Wiley-VCH，431页)。该特定治疗市场的高商业需求和由此的价值使得医药公司的着重点放在使其相应mAb制造工艺的生产率达到最大、同时控制相关成本。

在过去的十年中，随着哺乳动物细胞培养技术的进展，使典型mAb滴度从十分之几克/升上升到数十克/升，上游技术研发已经朝向解决该挑战有一些迈进(参见

 J、Etzel M.，“色谱分离的供选方案(Alternatives to Chromatographic Separations)”，Biotechnology Progress 2007；23：42-45)。伴随这些较高产品浓度，生物反应器技术中的进展意味着公司现在以高达25,000L的体积操作细胞培养工艺(参见Kelley B.，“超大规模单克隆抗体纯化：常规单元操作的情形(Very Large Scale Monoclonal Antibody Purification：The Case for Conventional Unit Operation)”，Biotechnology Progress 2008；23：995-1008)。虽然上游操作已有进展，以满足产品需求增加的挑战，但是已经指出下游加工(DSP)技术的发展没有跟上。市售或研发中的大部分mAb产品的下游纯化目前基于利用涉及使用蛋白A亲和色谱法而构造的加工平台(参见Shukla AA，Hubbard B，Tressel T，Guhan S，Low D.，“单克隆抗体的下游加工-平台方法的应用(Downstream processing of monoclonal antibodies-Application of platform approaches)”，Journal of Chromatography B 848：28-39及Sommerfeld S和Strube J.，“生物技术生产的挑战-单克隆抗体的通用方法和工艺优化(Challenges in biotechnology production-generic processes and process optimisation for monoclonal antibodies)”，Chemical Engineering and Processing 2005；44：1123-1137)。mAb纯化对蛋白A使用的强烈依赖已引起参与mAb产品纯化的工艺工程师中的某些关注。

蛋白A色谱法基于需要被捕获的产物的质量来确定规模。可使用10,000L发酵罐来以1g/L的浓度培养表达mAb的细胞系，由此产生总共10kg mAb/批料。如果使用相同的发酵罐来以10g/L的浓度培养表达mAb的细胞系，细胞培养物的体积仍为10,000L，但是其中所含的mAb的质量现在将为100kg。因此，蛋白A色谱柱将需要做成用以捕获10kg批料的管柱的10倍大(这由于成套设备空间限制而可能是不允许的)，或者作为替代，每批料循环更多次，这将增加工艺时间。因此，色谱法实际上对生物制药用设施的最大生产率强加了限制。就mAb治疗剂的当前市场而言，已经达到这些限制的情况是罕有的(参见Kelley B.“超大规模单克隆抗体纯化：常规单元操作的情况(Very Large Scale Monoclonal Antibody Purification：The Case for Conventional Unit Operation)”，Biotechnology Progress 2008；23：995-1008)。然而，面对增加的产品需求，一些工程师已经质疑用于mAb纯化的当前范例的长期可持续性。各公司现在不断增加研发渠道中对mAb候选物的投资。即使这些候选物中仅一部分通过临床试验，这也仍将导致需要多产物设施、非常快速地操作、可挑战生产率限制的密集制造活动。另外，发现mAb产物用于除最初预期的那些应用之外的应用。这可显著增加对特定mAb的需要，可再次推动成套设备生产率超出其极限。

鉴于此，工艺工程师已经开始研究可被称为供选生物分离技术的技术，其具有提供更高加工容量以及可能提供比填充床色谱法更好的规模经济的潜力(参见Przybycien，T.M.；Pujar，N.S.；Steele，L.M.“供选的生物分离操作：寿命高于填充床色谱法(Alternative bioseparation operations：life beyond packed-bed chromatography)”Current Opinion in Biotechnology 2004，15(5)，469-478)。两种这类的分离技术为水性两相萃取(ATPE)和沉淀。它们由于比较低的相关操作成本和易于规模化而引起关注。而且因为两者都是基于工艺流体的本体混合，这些技术将用工艺物流的体积、而不是其中所含产物的质量来确定规模，而填充床色谱法基于其中所含产物的质量来确定规模。例如，10,000L细胞培养物将需要10,000L沉淀槽，不管细胞培养物产生的mAb的浓度是1g/L还是10g/L。

沉淀工艺的缺点为可实现的纯化因子比较低。这不仅是由于(down to)非特异性分离机制，还由于杂质截留在沉淀复合物内的潜力，导致在再溶解之前需要彻底洗涤沉淀物以使产物纯度达到最大。工艺稳定性是另一问题，需要筛选宽范围条件来确定每种新抗体产物的最优操作参数。

同样，也已经发现了水性两相萃取(ATPE)具有一些缺点。已经进行了数次研究，其中针对单克隆抗体的纯化来优化水性两相萃取方法(参见Andrews BA，Nielsen S，Asenjo JA.“单克隆抗体在水性两相体系中的分配和纯化(Partitioning and purification of monoclonal antibodies in aqueous two-phase systems)”，Bioseparation 1996；6：303-313和Azevedo AM，Rosa PAJ，Ferreira IF，Aires-Barros MR.“人类抗体的水性两相萃取的优化(Optimisation of aqueous two-phase extraction of human antibodies)”，Journal of Biotechnology 2007；132：209-217)。这些研究显示出比较有前途的结果，获得了高抗体产率，然而，由于ATPE方法所使用的非特异性分离机制而仅得到中度的纯化因子。

认为与ATPE相关的关键工艺参数全部影响工艺物流组分的分配行为。分子是分配到顶部相还是分配到底部相中将由分子的性质(例如电荷、MW和溶解)以及聚合物的性质(例如浓度、MW、疏水性)来决定。体系的理化环境(例如温度、pH和离子强度)也将影响分配行为。由于各种相互作用因子和在不同操作参数之间需要的用以确保最佳性能的精细平衡，ATPE体系会相对不稳定。该情形还因缺乏有关生物组分在水性两相体系中分配的基本知识而加重。工艺优化因此需要筛选宽范围的条件以及采用实验方法设计。因此，对于新抗体产物，ATPE操作的深入工艺开发不仅是非常必需的努力，也是漫长的努力。这不利地与蛋白A亲和色谱法比较，后者表现出高水平的稳定性且仅需要对操作条件进行微调以获得对于新抗体产物的最佳性能。

不同水性两相体系的分配行为(就相体积比而言)可不仅受体系内相形成组分的选择及其浓度影响，而且受进料性质影响。产物浓度对于在下游工艺初期使用的任何生物分离技术都是关键目标。偏斜相体积比(skewed phase volumn ratio)可不利地影响ATPE的浓缩功能，因为抗体可分配到高体积相中。

近来，已经公开了关于使用沉淀来纯化蛋白治疗剂的数个专利申请。它们是：

Coffman等，“分离方法(Separation Methods)”(US 2007/0066806)；

Farhner等，“蛋白的聚电解质沉淀和纯化(Polyelectrolyte Precipitation and Purification of Proteins)”(US 2008/0193981)；

Ramanan等，“通过沉淀分离抗体的方法(Method of Isolating Antibodies by Precipitation)”(WO 2008/100578)；和

Moya等，“蛋白的纯化(Purification of Proteins)”(WO 2008/079302)。

虽然所有上述专利申请都涉及单克隆抗体(mAb)的纯化，但是差别在于通过其实现该纯化的特定路径。WO 2008/079302和US 2007/0066806都涉及使工艺物流中的杂质、而不是目标抗体沉淀。随后除去沉淀的杂质，从而纯化mAb。WO 2008/100578和US 2008/0193981描述的沉淀法可用以使工艺物流中的目标抗体产物或杂质沉淀。

这些申请描述的沉淀法都可用以加工含全细胞的粗发酵肉汤。如果正在沉淀的组分为工艺物流杂质，则WO 2008/100578、US 2008/0193981和WO 2008/079302中所述的方法仅可以该方式使用。US 2007/0066806描述的沉淀法仅可用以沉淀杂质。

这些申请描述利用不同沉淀剂的方法。US 2008/0193981描述利用可与目标分子相互作用允许选择性沉淀的聚电解质的沉淀方法。US 2007/0066806利用当一起处于溶液中时彼此反应以形成不溶性盐沉淀物的可溶性盐的组合。这些沉淀物与工艺物流中的杂质结合(在形成期间和形成之后)，允许选择性沉淀。WO 2008/100578利用对目标分子具有亲和力的可溶性聚合物。引入物理化学刺激物(例如温度、pH、离子强度等的改变)可导致该聚合物从溶液中出来且形成沉淀物，随其带出目标分子。WO 2008/079302利用等电沉淀以及作为额外沉淀剂的PEG的组合。该方法也必须在相对低的温度(2-8℃)下进行，以进一步降低目标分子的溶解性。

仍然需要更加稳定且对于含有所关注的不同治疗蛋白的显著不同的进料获得相当的性能的分离技术。

发明概述

提供纯化蛋白的方法。该方法基于对含有目标蛋白的多组分混合物(即，进料)进行的聚合物-盐水性两相萃取(ATPE)，最终导致产物沉淀，可将所述产物再溶解和传送以便进一步纯化。

新的ATPE-沉淀法由两个离散阶段组成。第一正向萃取阶段包括将相形成组分(诸如聚乙二醇(PEG)、磷酸盐和NaCl)引入进料中，导致形成聚合物-盐水性两相体系，其中目标蛋白优先分配到富聚合物相中，而一些杂质移动到富盐相或以沉淀物形式在两相之间的界面处收集。在第二反向萃取阶段，回收来自正向萃取的富聚合物相且使其与反向萃取缓冲液(例如磷酸盐缓冲液)接触，形成第二水性两相体系且继而导致目标蛋白从富聚合物相移动出来并以界面沉淀物形式收集。使用过滤器或离心机回收该含产物的沉淀物，随后将其再溶解于适当再溶解缓冲液中，以便进一步加工。

在将该方法用于从哺乳动物细胞培养上清液中初级捕获单克隆抗体(mAb)的情况下，在不同的mAb和进料范围内，发现由该ATPE辅助的沉淀方法得到的产率可与使用蛋白A色谱法得到的产率相当。该方法因此提供从细胞培养上清液中初级捕获mAb的潜在供选方案。

该方法通过整体沉淀方法和二阶段(two-stage)ATPE方法克服了与沉淀和ATPE方法单个相关的缺点。ATPE方法的第一正向萃取阶段允许部分纯化产物mAb，因为其优先分配到富聚合物相中。对从正向萃取回收的富聚合物相进行的第二反向萃取工艺允许进一步纯化，因为杂质分配到顶部相或底部相，而产物mAb在两相之间的界面处沉淀。纯化机制的组合允许产物不仅比通常可用沉淀或ATPE单个得到的产物更纯，而且产物可以比可从单独的典型ATPE工艺中得到的产物浓度更高的形式得到。ATPE和沉淀的组合还产生了更加稳定、对含有不同目标蛋白的显著不同的进料显示出相当的性能的分离技术。

附图简述

作为示意，图1-12提到本文所述的本发明用于纯化单克隆抗体的用途。

图1示出了用于从哺乳动物细胞培养物中捕获mAb的以制备或制造规模的PEG-磷酸盐正向萃取水性两相体系的工艺方案。

图2示出了用于从哺乳动物细胞培养物中捕获mAb的以制备或制造规模的PEG-磷酸盐反向萃取水性两相体系的工艺方案。

图3示出了以制备或制造规模的用于mAb沉淀物回收和再溶解的工艺方案。

图4示出了说明对于以制备或制造规模的该ATPE加强的沉淀方法的可能设备需求的总工艺流程图。

图5为结合本发明的某些实施方案示出单克隆抗体纯化工艺流程的示意图。该示意图用来说明从整体生物工艺观点来看可采用所述方法的方式。

图6示出了施用于含有抗体A且指定为“细胞培养上清液进料A”的细胞培养进料上清液的正向萃取水性两相体系的顶部相和底部相的蛋白A分析的色谱图的比较。

图7示出了施用于含有抗体B且指定为“细胞培养上清液进料B”的细胞培养进料上清液的正向萃取水性两相体系的顶部相和底部相的蛋白A分析的色谱图的比较。

图8示出了对从细胞培养上清液进料A的正向萃取得到的顶部相进行的反向萃取水性两相体系的顶部相和底部相的蛋白A分析的色谱图的比较。

图9示出了对从细胞培养上清液进料B的正向萃取得到的顶部相进行的反向萃取水性两相体系的顶部相和底部相的色谱图(类似于图8)的比较。

图10示出了对含有抗体B的细胞培养上清液进料B进行的正向萃取得到的顶部相和在反向萃取水性两相体系中形成并从其中回收的再溶解的沉淀物的蛋白A分析的色谱图的比较。

图11示出了含有抗体B的细胞培养上清液进料B、得自对细胞培养上清液进料B进行的正向萃取水性两相体系的顶部相和随后在反向萃取水性两相体系中形成的再溶解沉淀物的尺寸排阻色谱的色谱图的比较。

发明详述

定义

汇总并定义发明说明书中使用的术语。

术语“目标分子”、“目标蛋白”和“蛋白产物”是指所述方法旨在使其沉淀的蛋白。蛋白包括治疗蛋白和抗体。

术语“多组分混合物”是指含有多于一种类型的生物或有机分子的任何水性混合物，所述生物或有机分子包括重组蛋白、天然宿主细胞蛋白、DNA、RNA、病毒和脂质。术语“多组分混合物”涵盖的水性混合物还可含有包括哺乳动物、微生物和酵母的各种类型的未裂解的全细胞。所述术语还涵盖含有由哺乳动物、微生物和酵母细胞的裂解和/或匀浆产生的细胞片段的水性混合物。术语“多组分混合物”具体涵盖哺乳动物细胞培养上清液和澄清微生物发酵液。该术语还涵盖澄清的微生物裂解物和匀浆、血液和血液流分和在本文中已经定义以由该术语具体涵盖的所有多组分混合物的部分纯化的变体。

术语“抗体”是指天然存在的完整抗体的任何重组体，例如抗体包括抗原结合可变区以及轻链恒定域(CL)和重链恒定域。该术语还涵盖抗体片段或包括抗体片段的分子，所述抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv和Fc片段。术语“抗体”具体涵盖融合蛋白，诸如Fc融合蛋白、肽抗体及其他嵌合抗体。术语“抗体”具体涵盖单克隆抗体和多克隆抗体二者。

术语“细胞培养上清液”是指已经通过例如过滤从其中除去全细胞的细胞培养基。细胞培养上清液可以是澄清的，但不必为澄清的。就本发明目的而言，细胞培养上清液为多组分混合物的一种形式，其含有所关注的目标蛋白。

术语“宿主细胞蛋白”是指除了蛋白产物以外在细胞培养过程期间由所培养的宿主细胞表达的所有蛋白。

术语“上述专利”是指US 2007/0066806(Coffman等)、US 2008/0193981(Farhner等)、WO 2008/100578(Ramanan等)和WO 2008/079302(Moya等)。

术语“水性两相体系”是指由两种水基不混溶的水溶液组成的水性混合物。

术语“不相容阴离子”是指在与某些聚合物一起处于溶液中时将导致溶液分离，形成两个离散相：富聚合物相和富盐相的盐的阴离子。术语“不相容阴离子”涵盖的阴离子包括kosmotropic阴离子，诸如磷酸盐(phosphate)(PO₄ ^3-)、柠檬酸盐(citrate)(C₃H₅O(COO)₃ ^3-)和硫酸盐(sulphate)(SO₄ ^2-)。

除非上下文另有清楚规定或另有明确陈述，否则术语“磷酸盐”是指磷酸的盐，例如磷酸钠，而不是磷酸盐离子(PO₄ ^3-)。

术语“富聚合物相”是指含有最高浓度的聚合物的水性两相体系的相。

术语“富盐相”是指含有最高浓度的用以形成两相体系的盐的不相容阴离子的水性两相体系的相。

术语“顶部相”是指水性两相体系的低密度相，其集中在底部相以及任何界面沉淀物之上，在使两相体系在重力影响下沉降或如果沉降例如通过使用离心分离而加速时，可在水性两相体系中形成所述界面沉淀物。

术语“底部相”是指水性两相体系的高密度相，其集中在顶部相以及任何界面沉淀物之下，在使两相体系在重力影响下沉降或如果沉降例如通过使用离心分离而加速时，可在水性两相体系中形成所述界面沉淀物。

术语“界面沉淀物”是指当使水性两相体系在重力影响下沉降或如果沉降例如通过使用离心分离而加速时在水性两相体系中形成并集中在顶部相和底部相之间的界面处的沉淀物。

纯化目标蛋白的方法

本文提供的方法是整体两步ATPE辅助的沉淀方法，其中第一步骤(所谓的正向萃取ATPE步骤)通过使杂质优先分配到两相体系的富盐相中以及引起一些杂质沉淀而除去所述杂质，而第二步骤(所谓的反向萃取ATPE步骤)使产物沉淀。该方法为整体的，因为正向萃取步骤之后的工艺物流的条件直接将其准备用于第二反向萃取步骤。

在某些实施方案中，目标蛋白可为抗体。所述抗体可为单克隆抗体或多克隆抗体。抗体也可为IgG抗体，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。术语抗体还涵盖抗体片段、嵌合抗体、诸如Fc融合蛋白的融合蛋白和肽抗体(peptibodies)。

在其他实施方案中，目标蛋白可为重组蛋白，诸如重组人类生长激素、重组人类胰岛素或干扰素。目标蛋白还可为以重组形式或天然形式的酶。在其他实施方案中，目标蛋白还可为血液因子。

本文所述的纯化方法可施用于任何多组分混合物，其中目的在于使混合物内的蛋白产物与其他组分分离或将其纯化，所述蛋白产物可包括但不限于天然宿主细胞蛋白、DNA、RNA、病毒和脂质。在本发明的一个实施方案中，多组分混合物(即纯化工艺的进料)为通过将表达并分泌所关注抗体的哺乳动物细胞在培养基中培养而产生的细胞培养上清液。细胞培养上清液可通过过滤或离心分离细胞培养液以除去全细胞来得到。纯化工艺的进料因此应该优选不含未裂解的全细胞。然而，细胞培养上清液不必是澄清的。可使用含有未裂解的全细胞的进料，条件是ATPE正向萃取体系的组成和条件使抗体产物优先分配到顶部相中，因为在这类体系中全细胞将移动到底部相中。进料还可含有大细胞片段，诸如细胞碎片，其将分配到底部相中或在正向萃取期间在界面处沉淀。细胞培养上清液的任选澄清化可通过使用例如微滤或深度过滤的任何方便可行的方法实现。

本文所述的水性两相萃取辅助的沉淀纯化方法由3个离散阶段组成：

1.正向萃取

2.反向萃取

3.沉淀物回收和再溶解

1.正向萃取

第一正向萃取阶段包括形成聚合物-盐水性两相体系，其中条件是使得目标蛋白(例如抗体)优选分配到富聚合物相中。两相体系可通过向进料中加入适当量的相形成组分而形成。相形成组分应包括至少一种水溶性聚合物、具有阴离子的可溶性盐和另一可溶性盐，所述阴离子在溶液中与所述聚合物不相容并因此能够与其形成水性两相体系，所述另一可溶性盐用以调节各组分在两相体系中的分配。水溶性聚合物可选自下列，包括但不限于聚乙二醇(PEG)或环氧乙烷-环氧丙烷(EOPO)。不相容的盐应含有强烈水合的阴离子，且可选自下列，包括但不限于柠檬酸盐、磷酸盐或硫酸盐。分配调节盐应含有水合程度较低的阴离子且可选自下列，包括但不限于氯化物、碘化物或硝酸盐。

在一个实施方案中，所述聚合物为聚乙二醇(PEG)。所述PEG的分子量可为1,450Da-6,000Da，例如1,500Da。不相容的盐为磷酸二氢钠和磷酸氢二钠盐的混合物且分配调节盐为氯化钠(NaCl)。在另一实施方案中，聚合物为具有4000Da的分子量的PEG，不相容的盐为柠檬酸钠且分配调节盐为碘化钾(KI)。

在本发明的一个实施方案中，将相形成组分以粉末形式加入进料中。在另一实施方案中，将相形成组分以浓储备溶液形式加到进料中。在另一实施方案中，一些相形成组分是以粉末形式加入，而其他相形成组分是以浓储备溶液形式加入。例如，在PEG-磷酸盐ATPE体系中，其中NaCl作为分配调节盐，PEG和磷酸盐可以浓储备溶液形式加到进料中，而NaCl以粉末形式加入。

相形成组分应该以如下相对量加入，以导致形成水性两相体系，进料中的组分在其中表现出所要的分配行为。合适的体系组成可见于Albertsson等进行的透彻研究(参见Albertsson，

1986.细胞颗粒和大分子的分配(Partition of Cell Particles and Macromolecules)，第三版，Wiley，N.Y.)中。本领域的普通技术人员将承认需要优化相形成组分的相对浓度以不仅在正向萃取期间提供所要的分配行为，而且使得产生负责反向萃取工艺的富聚合物相，并在其中沉淀产物蛋白。

在一个实施方案中，加入PEG、磷酸盐和NaCl，以产生12％-20％(w/w)PEG、9％-19％(w/w)磷酸盐和4％-12％(w/w)NaCl的最终体系组成。在另一实施方案中，加入PEG、单碱式磷酸盐和二碱式磷酸盐的混合物及NaCl，以产生15％(w/w)PEG、14％(w/w)磷酸盐和12％(w/w)NaCl的最终体系组成。所加的单碱式磷酸盐可为磷酸二氢钠(NaH₂PO₄)或磷酸二氢钾(KH₂PO₄)。所用的二碱式磷酸盐可为磷酸氢二钾(K₂HPO₄)或磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)。在确定加到这类体系中的磷酸盐的量时，磷酸盐的质量组成不仅应包括磷酸盐离子的重量，还应包括该盐的阳离子的重量。例如，在形成最终总质量为30g的体系中，其中磷酸盐以粉末形式加入，应该加入4.2g无水磷酸二氢钠(NaH₂PO₄)粉末，以得到14％(w/w)的最终磷酸盐浓度，虽然磷酸二氢钠(NaH₂PO₄)中磷酸盐(PO₄ ^3-)的质量分数意味着仅加入了对应约11.1％(w/w)的PO₄ ^3-浓度的3.325g磷酸盐。可使用水合盐粉末，例如磷酸二氢钠单水合物(NaH₂PO₄.H₂O)，但必须考虑水对质量的贡献。在加入以浓储备溶液形式的磷酸盐时，情况也类似。

相形成组分优选应该依次加入，在加入下一组分之前在混合本体流体下使各组分完全溶解(在以粉末形式加入时)和/或分散(在以浓储备溶液形式加入时)。相形成组分可以任何次序加入。组分可以全部一次性加入，然而，这可能具有不合需要的结果，诸如过度沉淀和较久的盐和聚合物的溶解和/或分散时间，这是由作为流体粘度增加的结果的不良流体混合引起。相形成组分的溶解/分散可在室温和压力下进行，虽然这可以在发现有益于相形成组分的溶解/分散的任何温度下进行，例如，发现一些聚乙二醇在较低温度下更易溶。

体系pH应比目标蛋白或抗体的pI低至少1个pH单位，以确保目标蛋白带正电荷。这不仅保证避免过早沉淀，而且帮助目标蛋白分配到两相体系的富聚合物相中。

在使用单碱式磷酸盐和二碱式磷酸盐的混合物的本发明的一个实施方案中，体系pH可通过改变加入以形成两相体系的单碱式磷酸盐和二碱式磷酸盐的量之间的比率来建立。增加单碱式磷酸盐的使用量，同时降低二碱式磷酸盐的加入量将产生较低体系pH，而增加二碱式磷酸盐的加入量且降低单碱式磷酸盐的使用量将增加体系的pH。正向萃取体系的pH可为pH 3.0-pH 9.0，虽然优选相对中性的pH，例如pH 5.0-7.0，诸如pH 6.0。

在完成相形成组分的溶解和/或分散之后，正向萃取体系应该继续混合10分钟-1小时、例如30分钟，此后在室温下培养10分钟-24小时，例如30分钟。在完成粉末溶解和/或储备溶液分散之后的混合期首先使用于各相之间质量传递的表面积达到最大，而且确保在各组分在富聚合物相和富盐相之间的分配方面达到平衡。培养期在重力下让相分离。根据进料的复杂性、沉淀物的存在、由此两相体系的所得粘度，可以此方式实现完全相分离。在一个实施方案中，其中本发明用以从细胞培养上清液中纯化抗体产物，细胞培养上清液的复杂性将意味着该可能性是不太可能的，这归因于由正向萃取期间进料组分沉淀而引起的体系粘度增加。作为替代，完全相分离和富聚合物相的回收可使用例如离心分离的任何方便可行的方法实现。在正向萃取期间形成的任何沉淀物将沉降(可能需要一些帮助，例如使用离心分离)在顶部相和底部相之间的界面处。该沉淀物将主要由杂质构成且含有可忽略量的目标蛋白，因而其不需要回收。

在正向萃取中，盐析作用和静电相互作用之间的组合将导致目标蛋白优选分配到富聚合物相中。目标蛋白的分配系数(顶部相浓度/底部相浓度)(指定为K)将在5至大于100之间，例如K＝50。

在本发明的一个实施方案中，正向萃取工艺可在单一搅拌容器中进行。可将多组分混合物(例如细胞培养上清液)放在搅拌容器中，向该容器中直接且依次加入相形成组分粉末形式的PEG、磷酸盐和NaCl。该容器的内含物可被混合，直到所有相形成组分都已完全溶解。可进行进一步混合，以确保达到平衡且发生组分的完全分配。本领域的普通技术人员将承认需要优化混合工艺，以使在搅拌容器内的混合时间减至最少。混合工艺的优化将需要尤其考虑诸如搅拌器设计、容器尺寸和挡板存在的因素。

接下来，正向萃取工艺的混合阶段一旦完成，即可停止搅拌容器的搅拌，且让内含物在重力影响下沉降。根据水性两相体系的粘度和容许用于培养期的时间，可以此方式实现完全相分离。倘若如此，可排出容器内含物的底部部分以从体系中除去底部相，在容器中仅留下顶部相和在正向萃取工艺期间可能已经形成的任何沉淀物。如果底部相对应于富聚合物相，则其可使用诸如过滤和离心分离的任何方便可行的方法澄清化，以除去从正向萃取工艺带出的任何沉淀物，之后将其传送到反向萃取工艺。或者，顶部相可为富聚合物相，因此为含产物相。在这种情况下，顶部相可使用例如过滤和离心分离的任何方便可行的方法回收。该实施方案例示于图1中。如果在重力下仅有部分相分离，则从容器中可排出仅一小部分底部相。剩余部分的底部相以及在正向萃取工艺期间可能已经形成的任何沉淀物必须使用例如离心分离的任何方便可行的方法从富聚合物顶部相中除去。随后可将回收的富聚合物的含目标蛋白的顶部相传送到反向萃取工艺中。

2.反向萃取

反向萃取步骤是在正向萃取之后进行(图2)。将来自正向萃取的富聚合物相回收并使其与反向萃取缓冲液接触。反向萃取缓冲液可为含有具有与正向萃取体系中所用聚合物不相容阴离子的盐的浓盐溶液。阴离子不必与正向萃取体系中使用的阴离子相同。

在一个实施方案中，反向萃取缓冲液为具有10％(w/w)磷酸盐-40％(w/w)磷酸盐、例如21％(w/w)磷酸盐的浓度的磷酸盐溶液。反向萃取缓冲液使用单碱式磷酸盐和二碱式磷酸盐二者的组合制备。所用的单碱式磷酸盐可为磷酸二氢钠(NaH₂PO₄)或磷酸二氢钾(KH₂PO₄)。所用的二碱式磷酸盐可为磷酸氢二钾(K₂HPO₄)或磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)。可以改变所加的单碱式磷酸盐与二碱式磷酸盐之比以控制反向萃取缓冲液的pH。增加单碱式磷酸盐的使用量，同时降低二碱式磷酸盐的加入量将产生较低体系pH，而增加二碱式磷酸盐的加入量且降低单碱式磷酸盐的使用量将增加体系的pH。反向萃取缓冲液应具有3.0-9.0的pH，虽然优选相对中性的pH，例如pH 5.0-7.0，诸如pH 6。

在另一实施方案中，反向萃取缓冲液为具有10％(w/w)柠檬酸盐-40％(w/w)柠檬酸盐、例如30％柠檬酸盐的浓度的柠檬酸盐溶液。该柠檬酸盐反向萃取缓冲液可使用柠檬酸钠盐制备。

反向萃取缓冲液应与来自正向萃取的富聚合物相混合以形成新的水性两相体系。反向萃取缓冲液的加入体积应为来自正向萃取的富聚合物相体积的1-2倍。例如，应将10mL反向萃取缓冲液加到10mL富聚合物相中，或将15mL反向萃取缓冲液加到10mL富聚合物相中，或将20mL反向萃取缓冲液加到10mL顶部相中。

本领域的普通技术人员将承认需要优化反向萃取缓冲液的浓度以及来自正向萃取的富聚合物相与反向萃取缓冲液之间的体积比二者。

反向萃取两相体系应混合5分钟-30分钟，例如10分钟。可使水性两相体系在室温下培养5分钟-60分钟，例如10分钟。混合期使用于相之间质量传递的表面积达到最大，而且确保在组分在富聚合物相和富盐相之间的分配方面达到平衡。培养期在重力下让相分离。在该反向萃取工艺期间将发生沉淀，其将沉降(可能需要一些帮助，例如使用离心分离)在顶部相和底部相之间的界面处。该沉淀物将含有大部分目标蛋白。在反向萃取体系的顶部相和底部相中将存在可忽略量的目标蛋白。

在一个实施方案中，反向萃取工艺可在单一搅拌容器中进行。在使来自正向萃取的富聚合物相澄清以除去可能已经存在的任何沉淀物之后，富聚合物相可放在搅拌槽中，将反向萃取缓冲液直接加到搅拌槽中。随后可将反向萃取水性两相体系混合以确保达到平衡且发生组分的完全分配。本领域的普通技术人员将承认需要优化混合工艺，以使在搅拌容器内的混合时间减至最少。混合工艺的优化将需要尤其考虑诸如搅拌器的设计、容器尺寸和挡板存在的因素。另外，因为目标蛋白在工艺的该阶段期间形成沉淀物，所以混合工艺的优化必须考虑需要保持沉淀物的完整性以及目标产物的质量。混合一旦完成，则可停止搅拌容器的搅拌，且让内含物在重力影响下部分沉降。此时容器将含有含大部分杂质的顶部相和底部相和含大部分产物蛋白的界面沉淀物。下一阶段将回收在该反向萃取工艺期间形成的沉淀物。该实施方案例示于图2中。

3.沉淀物回收和再溶解

在反向萃取工艺期间形成的沉淀物可通过例如微滤或离心分离的任何方便可行的方法回收。本领域技术人员将承认需要根据所用方法优化沉淀物回收工艺。例如，使用过滤将需要优化膜表面积和膜通量，以使膜结垢的速率减至最小且使工艺生产率达到最大。使用离心分离将需要优化以使沉淀物的脱水达到最大，同时使沉淀物压实减至最低，这可降低再悬浮的容易度。无论如何，将需要在所要工艺性质之间进行权衡。

在回收之后，沉淀物随后还可使用合适的缓冲液洗涤，以从反向萃取两相体系中除去任何残余液体。该洗涤步骤是任选的，但可通过使过量体积的洗涤缓冲液与回收的沉淀物接触且使用例如过滤、离心分离或简单倾析的任何方便可行的方法除去洗涤缓冲液来完成。随后可将沉淀物再悬浮于合适的缓冲液中。再悬浮缓冲液的选择将取决于许多因素，诸如纯化的目标蛋白的特征以及在本文所述的纯化方法之后使用的生物分离技术的需求。再悬浮缓冲液的pH应为3.0-9.0。例如，再悬浮缓冲液可为pH 3.4的60mM柠檬酸钠。产物蛋白沉淀物的再悬浮应在反向萃取工艺期间在初始形成的20小时内进行。优选再悬浮工艺应在初始沉淀物形成之后的6小时或更短时间内进行。例如，沉淀物的再悬浮应在反向萃取工艺期间在形成之后的1小时内进行。

在再溶解之后，可将含产物的溶液调节到合适pH和离子强度，将其过滤以保持无菌并放置储存。例如，当将pH 3.4的60mM柠檬酸钠缓冲液用于再悬浮时，含所得产物的溶液可使用0.1M氢氧化钠(NaOH)滴定到更加中性的pH，诸如pH 5.0，之后使用0.22微米过滤器过滤以除去任何潜在的细菌或病毒污染物。该无菌过滤溶液随后可在4℃下储存以便随后使用和/或进一步纯化。

在一个实施方案中，其中产物为抗体，将来自反向萃取工艺的沉淀物回收在微滤器的表面上。反向萃取水性两相体系以合适流速泵送通过0.22微米过滤器。含抗体的沉淀物捕获在滤膜表面上，而顶部相和底部相通过进入滤液。所述膜任选可用合适缓冲液洗涤以除去任何残留顶部相和底部相。随后可将膜用再溶解缓冲液、例如pH 3.4的60mM柠檬酸钠洗涤，以使沉淀物再溶解，使抗体出现在滤液中，随后可将其收集在储存容器中。随后可将该滤液传送以便进一步加工。本领域的普通技术人员将承认需要优化沉淀物再溶解，以使抗体产物的浓度达到最大，使抗体产率达到最大以及使缓冲液消耗减至最低。这将尤其包括优化穿过膜和跨膜表面的流体流动以及再溶解缓冲液经膜再循环的次数。收集的滤液随后可例如保持在pH 3.4下，以进行病毒灭活，之后使用0.1M氢氧化钠滴定到至多pH 5.0或6.0。该调节的产物池随后可经再次过滤以确保并保持无菌性，之后在4℃下储存，以便随后使用和/或进一步纯化。该实施方案示于图3中。

图4汇集图1-3所示的实施方案，且示出了在制备或制造规模下该ATPE加强的沉淀工艺的整个工艺流程图和设备需求。将需要总共3个混合容器，以进行正向萃取、反向萃取和最后的病毒灭活(如果需要)。用以进行正向萃取的第一容器也可用以进行病毒灭活，条件是可及时进行就地清洗(CIP)和就地杀菌(SIP)程序。在这种情况下，总工艺可仅使用两个混合容器进行。将需要离心或过滤单元以从正向萃取回收顶部相，以及随后最后需要过滤单元以回收并再溶解沉淀物以及用于病毒去除。还可使用离心来回收含产物的沉淀物，随后将其转移到混合容器以便再溶解。

在本发明的一个实施方案中，整个方法可替代蛋白A亲和色谱法使用用于抗体的初级捕获。随后可将再溶解的沉淀物用于单元操作，该单元操作通常在mAb纯化工艺中在蛋白A亲和色谱法之后随后见到。例如，再溶解的沉淀物可以结合和洗脱方式在填充有例如Capto^TMS的阳离子交换色谱柱上操作。随后可将来自阳离子交换步骤的含抗体洗脱液与经收集的含抗体流以流经模式施用到填充有例如Capto Q的阴离子交换柱。

在另一实施方案中，可将含抗体的再溶解的沉淀物以流经模式施用到填充有例如Capto adhere的多模色谱柱。随后可将流经的含抗体流与经收集的含抗体流以流经模式施用到填充有例如Capto Q的阴离子交换柱。这些实施方案在图5中共同示出。

应注意本发明的所有实施方案都可以任何规模使用。例如，本发明可用于大规模抗体生产，其中抗体从数以万计升的细胞培养上清液中纯化。在另一实施例中，本发明可以小得多的规模、例如以实验台规模操作使用，其中抗体从数升或更少的细胞培养上清液中纯化。

实施例

以下实施例用来说明本发明的实施方案。这些实施例是用来说明本发明人已经发现适用于实践本发明的技术。因此，详述了这些实施例，以提供给本领域的普通技术人员可执行本发明的方法的方式的完全公开和描述。以下实施例仅用来示例且可在不偏离本发明的范围的情况下对本文所述的条件进行改变、改进或变更。

实施例1

使用ATPE辅助的沉淀进行MAb的初级捕获和纯化

中国仓鼠卵巢(CHO)细胞培养上清液通过培养来自从Polymun Scientific(Vienna，Austria)得到的细胞系的细胞由GE Healthcare Biosciences(Uppsala，Sweden)内部产生。细胞培养上清液通过收集细胞培养物、接着离心分离并深度过滤以除去未裂解的全细胞来得到。发现细胞培养上清液含有滴度小于1g/L的单克隆抗体人类IgG抗体，表示为抗体A。该上清液通过使用超滤浓缩约10倍，得到4.5g/L的最终mAb浓度。该细胞培养上清液使用0.22微米微滤器无菌过滤，之后储存在4℃下，随后进行ATPE辅助的沉淀工艺。

从Sigma-Aldrich得到粉末形式的分子量为1500-6000的聚乙二醇(PEG)以及三(羟甲基)氨基甲烷和3-溴丙基三甲基溴化铵。磷酸二氢钠单水合物(NaH₂PO₄.H₂O)、磷酸氢二钾三水合物(K₂HPO₄.3H₂O)、柠檬酸单水合物(C₆H₈O₇.H₂O)、柠檬酸三钠(Na₃C₆H₅O₇)和氢氧化钠(NaOH)也以粉末形式得到且从Merck Chemicals Ltd(Nottingham，UK)购得。氯化钠(NaCl)从VWR International Inc得到。

水性两相萃取

I.正向萃取

30g ATPE正向萃取体系通过将适当量的PEG 1500、K₂HPO₄.3H₂O、NaH₂PO₄.H₂O和NaCl粉末直接加到细胞培养上清液进料中以得到15％PEG 1500、14％磷酸盐和12％NaCl的最终体系组成来产生。更具体地讲，将4.50g PEG 1500、2.44g K₂HPO₄.3H₂O、2.66g NaH₂PO₄.H₂O和3.60g NaCl加到17.7mL细胞培养上清液中以形成ATPE正向萃取体系。

体系在50mL Falcon管(BD Biosciences)中形成，体系混合通过将Falcon管置于摇摆平台式震荡器(在GE Healthcare定制)上实现。依次加入粉末，其中首先加入NaCl、接着加入PEG 1500，最后加入K₂HPO₄.3H₂O和NaH₂PO₄.H₂O。加入单碱式磷酸盐和二碱式磷酸盐，以得到所要体系磷酸盐质量百分数，而体系的pH通过改变单碱式盐和二碱式盐的加入质量之比来控制。在这种情况下，单碱式磷酸盐和二碱式磷酸盐的加入量之间的实际比率产生pH为6.0的正向萃取体系。在粉末添加之间允许有足够的时间，以确保在引入下一组分之前先前加入的组分完全溶解。粉末通常在约10分钟之后完全溶解。在加入磷酸盐之后观察到沉淀。

在加入所有粉末并使其溶解之后，将体系进一步混合60分钟，之后让其在重力下沉降30分钟以进行相分离。仅实现了部分相分离，这可能归因于水性两相体系中的沉淀物影响底部富盐相的沉降速度。使用Eppendorf 5810R(Eppendorf，Hamburg，Germany)离心机将体系以3000rpm离心分离30分钟以实现完全相分离。在离心分离之后，观察到正向萃取体系由3个离散相组成，一个相沉降在另一相之上：顶部富聚合物相、界面沉淀物和底部富盐相。随后小心分离顶部相和底部相并测定体积。取得样品并分析以测定各相中抗体的浓度。图6为从该分析中得到的结果的实例。其表示施用于含有抗体A且指定为“细胞培养上清液进料A”的细胞培养上清液进料的正向萃取水性两相体系的顶部相和底部相的蛋白A分析(使用MabSelect SuRe^TM 1mL HiTrap^TM柱)的色谱图的比较。还包括了该进料的蛋白A分析的色谱图，以便比较。抗体A为单克隆抗体IgG。峰1(在总色谱图中柱保留为约1.5-2mL)对应于样品中存在的未结合的UV₂₈₀吸收杂质(adsorbing impurities)。峰2(在总色谱图中保留为约7.5mL)对应于结合抗体A。图6中所示的色谱图表明大量抗体A分配到正向萃取体系的顶部相中，底部相中存在几乎没有到没有抗体。基于峰积分的质量平衡显示大于100的分配系数。质量平衡还显示在顶部相中大于100％的产率。这表明PEG的存在在某些方面影响抗体的UV吸收性质(PEG的空白体系显示在UV_280nm下无吸光)。由于这个原因，难以准确测定在正向萃取期间形成的界面沉淀物的MAb含量。

图7示出类似于图6中所示色谱图的比较，只是用不同进料，这次为含抗体B的CHO细胞培养进料上清液且指定为“细胞培养物上清液进料B”。包括该进料的蛋白A分析的色谱图，以便比较。抗体B也为单克隆IgG。正如图6中所示的结果，图7示出大量抗体B分配到正向萃取体系的顶部相中，底部相中几乎没有到没有抗体。基于峰积分的质量平衡显示约70的分配系数。此外，质量平衡显示顶部相中大于100％的产率，显然归因于PEG的存在影响抗体的UV吸收性质。

II.反向萃取

反向萃取通过从正向萃取体系中取得顶部相并加入反向萃取缓冲液以产生新的两相体系来进行。所利用的反向萃取缓冲液为磷酸盐缓冲溶液，使用经加入以得到21％(w/w)的磷酸盐浓度且以一定比率得到6.0的pH的K₂HPO₄.3H₂O和NaH₂PO₄.H₂O制备。

反向萃取体系在50mL Falcon管中形成，其中将反向萃取缓冲液加到从正向萃取回收的顶部相中，体积比(顶部相∶底部相)为1∶2。反向萃取体系以与正向萃取体系相同的方式使用摇摆式平台混合约10分钟。在混合工艺期间观察到沉淀。随后让反向萃取体系在重力下沉降15分钟，之后使用Eppendorf 5810R(Eppendorf，Hamburg，Germany)离心机将其以3000rpm离心分离以确保完全相分离。在离心分离之后，观察到反向萃取体系由3个离散相组成，一个相沉降在另一相之上：顶部富聚合物相、界面沉淀物和底部富盐相。取得顶部相和底部相的样品以便分析。图8和图9示出从得自反向萃取体系的顶部相和底部相的蛋白A亲和色谱分析得到的色谱图。图8示出对从细胞培养上清液进料A的正向萃取得到的顶部相进行的反向萃取水性两相体系的顶部相和底部相的蛋白A分析的色谱图的比较。还包括得自对含有抗体A的CHO细胞培养上清液A的正向萃取的顶部相的蛋白A分析的色谱图，以便比较。峰1(在总色谱图中柱保留为约1.5-2mL)对应于样品中存在的未结合的UV₂₈₀吸收杂质。峰2(在总色谱图中保留为约7.5mL)对应于结合抗体A。抗体A在顶部相和底部相中的低浓度表明大部分抗体收集在发现是在反向萃取期间形成的界面沉淀物中。基于顶部相和底部相中和来自正向萃取的顶部相中存在的抗体浓度，计算表明沉淀物中抗体产率为85-90％。使用峰积分的质量平衡也表明该沉淀物含有低杂质含量。

图9示出对从细胞培养上清液进料B的正向萃取得到的顶部相进行的反向萃取水性两相体系的顶部相和底部相的色谱图(类似于图8)的比较。还包括得自对含有抗体B的CHO细胞培养上清液B的正向萃取的顶部相的蛋白A分析的色谱图，以便比较。计算表明沉淀物中抗体产率为85-90％。使用峰积分的质量平衡也表明该沉淀物含有低杂质含量。

沉淀物回收和再溶解

反向萃取体系的顶部相和底部相使用移液器(VWR International Inc.)小心移出，在Falcon管中仅留下沉淀物。将pH 3.4的60mM柠檬酸钠缓冲液置于具有沉淀物的Falcon管中且使用RX3旋转混合器(VELP Scientifica，Italy)混合。在以此方式混合时，沉淀物几乎即时再溶解。沉淀物再溶解在室温下进行。该再溶解程序是在反向萃取工艺期间在初始沉淀物形成的1小时内进行。

在再溶解之后，将含抗体的样品在室温下培养60分钟以便进行病毒灭活。随后使用0.1M NaOH缓慢滴定样品至pH 5.0。随后使用蛋白A色谱法分析样品的抗体含量。图10示出从该分析得到的结果的实例。具体地讲，其示出对含有抗体B的细胞培养上清液进料B进行的正向萃取得到的顶部相的蛋白A分析的色谱图和在反向萃取水性两相体系中形成并从其中回收的再溶解的沉淀物的蛋白A分析的色谱图的比较。还包括含抗体B的CHO细胞培养进料上清液且指定为“细胞培养上清液进料B”的色谱图，以便比较。峰1(在总色谱图中柱保留为约1.5-2mL)对应于样品中存在的未结合的UV₂₈₀吸收杂质。峰2(在总色谱图中保留为约7.5mL)对应于结合抗体B。图10示出MAb纯度随着其在正向萃取期间移动到顶部相且随后在反向萃取期间移动到沉淀物而增加。MAb在再溶解的沉淀物样品中的低浓度归因于在该特定实验中使用过量的再溶解缓冲液。峰的相对高度表明该ATPE加强的沉淀方法提供显著纯化水平。

在整个ATPE加强的沉淀工艺中的产物质量和聚集物含量的分析使用尺寸排阻色谱进行。例如，图11示出含有抗体B的细胞培养上清液进料B、得自对细胞培养上清液进料B进行的正向萃取水性两相体系的顶部相和随后在反向萃取水性两相体系中形成并从其中回收的再溶解沉淀物的尺寸排阻色谱分析(使用Superdex^TM 20010/30柱)的色谱图的比较。发现初始进料具有约16％的聚集物含量。最终再溶解的沉淀物中聚集物含量经计算为约20％。这可与使用蛋白A作为初级捕获步骤通常得到的含量相当。尺寸排阻分析进一步表明使用该当前工艺实现的显著纯化水平。

本文提到的所有专利、专利公开和其他发表的文献在此通过引用全文结合到本文中，引用的程度就如同已单个地及具体地将各文献通过引用结合到本文中一般。虽然描述了本发明的优选的说明性实施方案，但是本领域技术人员应理解本发明可不同于所述实施方案来实践，提供这些实施方案是出于举例说明的目的而不是为了限制。本发明仅受随后的权利要求书限制。

引用的参考文献

专利和专利申请

Coffman等，“分离方法(Separation Methods)”(US 2007/0066806)

Farhner等，“蛋白的聚电解质沉淀和纯化(Polyelectrolyte Precipitation and Purification of Proteins)”(US 2008/0193981)

Ramanan等，“通过沉淀分离抗体的方法(Method of Isolating Antibodies by Precipitation)”(WO 2008/100578)

Moya等，“蛋白的纯化(Purification of Proteins)”(WO 2008/079302)

其他出版物

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Claims (29)

1.从多组分混合物中回收并纯化蛋白的方法，所述方法包括：

a.向所述多组分混合物中加入包括聚合物、含不相容阴离子的盐和分配调节盐的相形成组分；

b.混合并完全溶解上述相形成组分以形成正向萃取水性两相体系；

c.回收富聚合物相；

d.使所述富聚合物相与反向萃取缓冲液接触以形成包括含所述蛋白的界面沉淀物的反向萃取水性两相体系；

e.从所述两相体系中回收所述界面沉淀物；和

f.任选地使所述沉淀物再悬浮在再悬浮缓冲液中。

2.权利要求1的方法，其中所述聚合物选自聚乙二醇(PEG)和环氧乙烷-环氧丙烷(EOPO)，所述不相容阴离子选自强烈水合的阴离子，包括磷酸盐、柠檬酸盐和硫酸盐，且所述分配调节盐选自不太强水合的阴离子，包括NaCl和碘化钾(KI)。

3.权利要求2的方法，其中所用聚合物为聚乙二醇(PEG)，所述不相容阴离子为磷酸盐且所述分配调节盐为NaCl。

4.权利要求3的方法，其中在所述两相体系中PEG的浓度为12％-20％(w/w)，磷酸盐的浓度为9％-19％(w/w)且在所述正向萃取水性两相体系中NaCl的浓度为4％-12％(w/w)。

5.权利要求4的方法，其中在所述正向萃取体系中PEG的浓度为15％(w/w)，磷酸盐的浓度为14％(w/w)且NaCl的浓度为12％(w/w)。

6.权利要求3的方法，其中加入进料中的PEG的分子量为1,450Da-6,000Da，诸如分子量为1,500Da。

7.权利要求3的方法，其中所述磷酸盐以单碱式磷酸盐和二碱式磷酸盐的混合物的形式加入。

8.权利要求7的方法，其中所述单碱式磷酸盐选自磷酸二氢钠和磷酸二氢钾，且所述二碱式磷酸盐选自磷酸氢二钠和磷酸氢二钾。

9.权利要求1的方法，步骤(a)，其中将所述相形成组分以粉末形式加入所述进料中。

10.权利要求1的方法，其中所述正向萃取水性两相体系的pH为3.0-9.0，诸如体系pH为6.0。

11.权利要求1的方法，其中在完成相形成组分的溶解之后，将所述正向萃取体系培养10分钟-24小时，诸如30分钟。

12.权利要求1的方法，其中包括病毒的一些杂质收集在在正向萃取或分配到所述正向萃取体系的富盐相中期间形成的沉淀物中。

13.权利要求1的方法，其中步骤(c)的富聚合物相通过以下方式回收：

a.重力沉降所述两相体系，让其完全相分离；接着

b.排出有或没有任何界面沉淀物的底部相或抽吸顶部相。

14.权利要求1的方法，其中步骤(c)的富聚合物相通过以下方式回收：

a.离心分离所述两相体系；接着

b.除去底部相和任何界面沉淀物或抽吸顶部相。

15.权利要求1的方法，其中所述反向萃取缓冲液为浓盐溶液。

16.权利要求15的方法，其中构成所述反向萃取缓冲液的盐的阴离子选自柠檬酸盐、磷酸盐和硫酸盐。

17.权利要求16的方法，其中所述反向萃取缓冲液为浓度为10％(w/w)-40％(w/w)的磷酸盐溶液。

18.权利要求17的方法，其中所述反向萃取缓冲液的pH为3.0-9.0，诸如pH为6.0。

19.权利要求1的方法，其中与来自所述正向萃取的富聚合物相接触的反向萃取缓冲液的体积为来自所述正向萃取的富聚合物相体积的1-2倍。

20.权利要求1的方法，其中在混合之后，将所述反向萃取水性两相体系培养5分钟-15分钟，诸如10分钟。

21.权利要求1的方法，其中在所述反向萃取期间形成的沉淀物通过以下方式回收并再悬浮：

a.过滤反向萃取体系；

b.在膜表面上捕获沉淀物；和

c.用再悬浮缓冲液冲洗膜以使抗体沉淀物再悬浮并收集滤液。

22.权利要求21的方法，其中所述再悬浮缓冲液跨越并穿过所述膜再循环以实现沉淀物再溶解。

23.权利要求1的方法，其中在反向萃取期间形成的沉淀物通过以下方式回收并再溶解：

a.离心分离反向萃取水性两相体系；

b.除去液体顶部相和底部相；和

c.使沉淀物再悬浮在再悬浮缓冲液中。

24.权利要求1的方法，其中所述再悬浮缓冲液的pH为3.0-9.0。

25.权利要求23的方法，其中所述再悬浮缓冲液含有在pH 3.4下的60mM柠檬酸钠。

26.权利要求1的方法，其中所述方法在室温和大气压力下进行。

27.权利要求1的方法，其中所述沉淀物的回收和再悬浮在反向萃取工艺期间形成的20小时内、诸如6小时内或1小时内进行。

28.权利要求1的方法，其中所述蛋白为单克隆抗体。

29.权利要求1的方法，其中所述多组分混合物为不澄清的细胞培养物或细胞培养物上清液。

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