CN110709701B - 用于表面等离子体共振测定的传感器表面 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于SPR仪器的改进的传感器表面的生产方法，其包括在表面上形成自组装单层(SAM)，并将配体和蛋白抗性基团、优选聚乙二醇(PEG)直接附接于所述表面上的官能团。本发明还涉及通过这些方法生产的传感器表面、其在SPR(表面等离子体共振)测定或相互作用中的用途。
Description
发明领域
本发明涉及一种用于测定改进的方法和装置。更严密地说，本发明涉及一种改进的传感器表面的生产及其在SPR (表面等离子体共振)测定或相互作用中的用途。本发明还涉及一种由这些方法生产的传感器表面。
发明背景
可以实时监测分子(如生物分子)之间的相互作用的分析传感器系统正在获得越来越浓厚的兴趣。这些系统通常基于光学生物传感器，并且通常称为相互作用分析传感器或生物特异性仪器，其使用表面等离子体共振(SPR)来检测样品中的分子和固定在传感表面上的分子结构之间的相互作用。当样品在传感器表面上通过时，结合的进展直接反映了相互作用发生的速率。样品注入后是缓冲液流，在此过程中检测器的响应反映了表面上复合物的解离速率。来自GE Healthcare的BIACORE®系统的典型输出是描述分子相互作用随时间推移的进展的图表或曲线，包括缔合相部分和解离相部分。
因此，利用BIACORE®系统(和类似的传感器系统)，可以在不使用标记的情况下，并且通常不对所涉及的物质进行纯化的情况下，不仅实时测定样品中特定分子(分析物)的存在和浓度，而且实时测定额外的相互作用参数，包括分子相互作用中结合(缔合和解离)的动力学速率常数，以及对表面相互作用的亲和力。缔合速率常数(ka)和解离速率常数(kd)可通过将对多个不同样品分析物浓度所得到的动力学数据拟合到微分方程形式的相互作用模型的数学描述而获得。亲和力(表示为亲和常数KA或解离常数KD)可由缔合和解离速率常数计算。
当样品中的分子与传感器芯片表面上的捕获分子结合时，检测到浓度，并因此检测到表面折射率的变化和SPR响应。绘制相互作用过程中针对时间的响应将提供相互作用的进展的定量测量。这样的绘图或动力学或曲线(结合等温线)通常称为结合曲线或传感图，本领域有时也称为“亲和迹线”或“亲和图”。在BIACORE®系统中，SPR响应值以共振单位(RU)表示。一个RU代表最小反射光强度的角度的0.0001º的变化，对于大多数蛋白和其它生物分子，其对应于传感器表面上大约1 pg/mm2的浓度变化。当含有分析物的样品与传感器表面接触时，与传感器表面结合的捕获分子(配体)在称为“缔合”的步骤中与分析物相互作用。当样品初始与传感器表面接触时，这一步骤在结合曲线中以RU的增加表示。相反，当样品流被例如缓冲液流替换时，通常发生“解离”。当分析物从表面结合的配体解离时，该步骤在结合曲线中通过随时间推移的RU的下降表示。
因此，SPR仪器系统的一个重要部分是传感器表面，在那里要研究的相互作用发生。它可以由涂覆有一薄层金的玻璃表面组成，在其上，在自组装单层(SAM)上面产生称为基质的亲水层，所述自组装单层防止非特异性结合(NSB)于金芯片。传感器表面也可以是具有不同材料的表面层的刚性基底，所述材料例如聚合物(聚)四氟乙烯、(聚)偏二氟乙烯或其组合。
一种常用的基质是羧甲基化葡聚糖(CMDx)，这是一种具有低的非特异性结合性能的柔性碳水化合物聚合物，其在传感器表面上形成三维结构。随着技术发展的进步，SPR仪器硬件的灵敏度不断提高，对传感器表面化学的要求也随之提高。变得尤其重要的是，尽量减少生物分子的漂移和非特异性结合，以便能够检测低的相互作用信号。通过羧基将配体固定在葡聚糖基质上。大部分的羧基不参与配体固定，它们在活化后被水解成羧基或未被活化。
基质特性取决于所使用的缓冲条件，例如不同的pH和盐浓度由于不同程度的负电荷和电荷排斥导致基质相对于表面的膨胀的差异。在测定过程中，由于在样品和缓冲液流中样品和缓冲液的差异导致的缓冲条件的差异等，导致葡聚糖膨胀的差异，这引起了基线漂移。这种基质变化影响了SPR信号(基线漂移)，并对测定性能产生负面影响。基质膨胀应在测定中最小化。使用固定在基质上的配体，存在着高风险，即基质运动引起较大的信号变化和对测定(分析)性能的负面影响。
不同的捕获分子/配体表现出与其它缓冲液组分不同的性质。测定缓冲液中常见的组分是洗涤剂。洗涤剂特性取决于测定类型。不同的洗涤剂与不同类型的基质结合。
不同的靶标和样品对传感器表面具有不同的要求。CMDx对于许多不同类型的样品和测定是有用的，但是当葡聚糖不发挥作用时需要替代基质。因此，需要使漂移和非特异性结合最小化的改进的传感器表面。
众所周知，PEG (聚乙二醇)或OEG (低聚乙二醇)表面具有蛋白排斥特性，并且PEG或OEG已被用于传感器表面上，以减少测定中不必要的结合。在这样的技术中，PEG或OEG部分也被用于连接在相互作用分析中包括的相互作用物的一种(捕获分子)。或者，如WO2006/041392中所述，配体和蛋白抗性化合物被偶联到水凝胶(例如CMDx)的单独部分。然而，该表面可能不适合某些敏感样品，因为它们受到基线波动的影响。
还存在具有OEG表面的传感器芯片的实例，所述表面通过烷烃-OEG SAM层构建，其中配体被固定到OEG。一个实例是Reicherts。http://www.reichertspr.com/products/sensor-chips/planar-polyethylene-glycol-carboxyl-sensor-chip-part-13206061/back=products。
然而，依赖于样品的类型，目前已知的几种基质有几个缺点，如高的背景噪声和非-特异性结合。因此，需要具有可替换的基质和聚合物的传感器表面。
发明概述
本发明人已经发现，通过将惰性基质和捕获分子固定到SAM上的组合使SPR传感器表面上的基质波动最小化，可以减少测定噪声。
在第一方面，本发明提供了一种用于SPR仪器的传感器表面的生产方法，其包括通过使所述表面与一种或多种具有至少一种官能团的硫醇C10-C30烷烃试剂反应，在表面上形成自组装单层(SAM)，其中一种或多种蛋白抗性化合物与第一部分的官能团偶联；并且其中一种或多种捕获分子被直接偶联到第二部分的官能团，或通过不是所述蛋白抗性化合物的接头偶联到第二部分的官能团，其中没有捕获分子偶联到蛋白抗性化合物。用于配体固定的官能团只在SAM上，而不在蛋白抗性化合物/基质上为可利用的。
所述表面是金属(优选金或银)镀覆的表面或适用于SPR应用的任何其它表面。
第二部分的官能团被包括在通过第一部分的官能团偶联蛋白抗性化合物后残留在表面上的那些中。
SAM上的官能团被用于捕获分子和蛋白抗性化合物的偶联。相同或不同类型的官能团可用于这些偶联，并且如果存在，可以使用相同或不同的接头。
蛋白抗性化合物也称为基质形成化合物或仅仅称为基质，并且可以通过接头与表面偶联。捕获分子是相互作用物的任一种，即直接与分析物相互作用的配体，或者可与配体结合，正如本领域中的常规格式。本发明不限于结合反应的类型，而是涉及分析物与其结合配偶体之间的任何类型的反应。
例如，接头可以是表氯醇、胱胺、双官能活化试剂、卡巴肼等。
C10-C30硫醇烷烃试剂的官能团优选是羧基、羟基、氨基、醛基、环氧基、乙烯基、羰基或硫醇基的一种或多种，或准备用于固定配体的预活化基团。与捕获分子相比，蛋白抗性基团可以固定至SAM上相同或不同的官能团。
优选地，C10-C30硫醇烷烃试剂是MHA (巯基十六烷酸)或其衍生物。
在本发明的一个优选的实施方案中，蛋白抗性化合物是选自聚乙二醇或其衍生物的亲水性聚合物，例如具有<20000的mw的甲氧基聚乙二醇胺。最优选地，蛋白抗性化合物是具有mw 100-20000，优选mw 2000-10000，最优选mw 4000-6000的PEG。
在根据本发明的方法的一个实施方案中，第二部分的官能团可以在捕获分子或配体的偶联之前被活化，并且偶联的捕获分子(配体)的量与超过约5秒的活化时间长度成反比。
使用根据本发明生产的传感器表面运行SPR测定的方法包括在传感器表面上添加可能与捕获分子(配体)相互作用的分析物，并执行动力学测定和/或浓度测定。
在第二个方面，本发明涉及一种传感器表面，其包含常用于SPR的类型的基底或芯片，例如金属镀覆的表面，其具有自组装单层(SAM)，在所述SAM上直接提供有官能团，其中蛋白抗性化合物偶联到第一部分的官能团，且其中捕获分子(配体)偶联到表面上的第二部分的官能团，但没有配体偶联到蛋白抗性化合物。
优选地，表面是金属镀覆的表面，优选金镀覆的表面，SAM是硫醇-烷烃C10-C30 SAM，最优选MHA-SAM，和蛋白抗性化合物是聚乙二醇(PEG)或其衍生物。在一个优选的实施方案中，蛋白抗性化合物是浓度为0.05-50 mM，优选0.5-5 mM的PEG mw 5000。
附图简述
图1是本发明的传感器表面的生产方法步骤的示意图；
图2A是图1中特异性配体连接至传感器表面的示意图，其中箭头指向官能团，和图2B显示PEG基团不参与配体固定；
图3是显示从本发明的传感器表面开始，活化时间相对于配体水平的结果的图；和
图4是用根据图1/实验3合成的PEG表面上固定的配体(30 s活化)，来自动力学特征测定的传感图。
发明详述
在初步研究中，本发明人已经发现，由低聚(乙二醇) (OEG)衍生的烷硫醇化合物或这些化合物与没有OEG的烷硫醇化合物的混合物形成的自组装单层(SAM)显示出高的非特异性结合。得自循环伏安分析的结果不佳，表明不利的填充密度和不佳的表面覆盖率，因此样品的不需要和非特异性结合到金表面/被破坏的SAM的可能性很高。该结果表明，含SAM烷硫醇-OEG的表面不适合于高灵敏度的应用。
本发明提供了一种新的传感器表面，其中捕捉分子将与传感器表面紧密结合，而不与任何基质分子结合，以最大限度地减少基线漂移。捕获分子直接结合到烷硫醇SAM层(或通过SAM上的接头)，而不是通过PEG或OEG或任何其它亲水性或蛋白抗性部分。本发明提供了一种方法，其包括用烷烃-SAM建立传感器表面以实现分离性能，其中在第二步中引入亲水性基质以获得蛋白排斥性质，同时提供用于SAM上配体固定的可利用的官能团以实现低的基线漂移。
用硫醇-烷烃(如C10-C30烷烃)试剂，可以在金表面上产生自组装单层(SAM)。SAMC16显示出具有良好分离性能的高密度SAM，其是避免样品组分与金表面以及传感器表面上任何被破坏的SAM组分的非特异性结合所必需的。
蛋白抗性化合物形成基质，如PEG基质，通过SAM层上的官能团共价固定。加入该基质分子仅是因为它的蛋白排斥性质或其它对测定有益的性质。因此，配体和蛋白抗性化合物(基质)二者均直接或通过接头偶联到SAM单层。例如，接头可以是表氯醇。接头是一种短分子，而不是现有技术的亲水化合物。
本发明的优点是没有配体固定到蛋白抗性化合物(基质)上。如果将相同的配体固定在基质和SAM上，那么固定的配体将代表两个不同的配体群体，一个群体固定在SAM层上，而另一个群体固定在基质上。这将对测定结果产生负面影响。使用本发明，所有配体都只被固定在SAM官能团上，因为PEG基质或替代基质或基质混合物在独立的步骤中被固定在SAM官能团上，并且没有官能团被用于配体固定。在失活(任选的)之后，SAM单层上剩余的官能团可用于配体固定。
在本发明中，优选的硫醇-烷烃试剂是MHA 16 (巯基十六烷酸)。如果硫醇-烷烃试剂是MHA，则具有伯胺的PEG分子可以共价地连接至传感器表面上的MHA SAM层上的羧基部分。通过EDC/NHS化学可以将含有伯胺基团的PEG分子共价连接到含有COOH (羧基)的SAM层。含偶联到羧基化烷硫醇SAM的胺官能化PEG-分子(如5 kDa)的传感器表面表现出良好的基质稳定性特性，并被证明对血浆样品和洗涤剂的非特异性结合具有高的抵抗力。
蛋白抗性化合物(基质)和配体也可以通过SAM层上的其它官能团固定。用于固定的SAM层上的可能官能团的实例是：羟基、氨基、羧基、醛、羰基、环氧、乙烯基和硫醇。
参与SAM层上固定的蛋白抗性化合物(基质)上可能的官能团的实例是：羟基、氨基、羧基、醛、羰基、环氧、乙烯基和硫醇。将蛋白抗性化合物(基质)固定到SAM层后，蛋白抗性化合物(基质)上的任何剩余官能团都必须不能被利用，即不能用于配体/捕获固定，和/或在必要时失活。或者，它们可以不同于SAM上的用于配体固定的官能团。
蛋白抗性化合物(基质)通过自发共价偶联或通过基质上或者SAM层上的官能团(例如SAM上的醛和基质上的肼)的活化，固定到SAM层。对不反应的活化或反应性基团执行失活。可包括基质或接头的稳定化，例如，醛和肼之间的偶联通过NaCNBH4来稳定。
活化和失活程序对本领域的技术人员来说是已知的，可以是例如，通过EDC/NHS化学引入活性酯或通过表氯醇引入环氧化物的SAM或基质的活化。或者，用通过双官能试剂的建立的化学(例如表面上的胺基和双官能试剂上的NHS衍生物)的活化，以及来自双官能试剂的反应性二硫化物用于配体固定。
配体固定
有许多不同的偶联化学能够使配体固定至传感器表面(芯片表面)上的COOH基团。最常见的途径是使用胺偶联，由此芯片表面上的羧基被用于与蛋白(配体)中伯胺基团形成共价酰胺键。然而，这一过程并不是自发发生的，需要活化羧基。用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基-琥珀酰亚胺(NHS)的混合物进行活化。EDC与羧基反应并形成反应中间体，其进而与NHS反应以形成活性NHS酯。当配体在传感器芯片表面上通过时，NHS-部分(其为良好的离去基团)与配体上的伯胺基团自发反应，在配体和芯片表面之间形成共价键。大多数蛋白含有若干伯胺，因此可以在不严重影响配体的生物学活性的情况下实现固定。
为了促进配体固定，在称为预浓缩的过程中使用静电吸引力。将配体溶解在偶联缓冲液中，其pH低于蛋白的等电点(pI)，但高于芯片表面的pI。因此，配体和芯片表面获得相反的净电荷。带正电荷的配体分子被静电吸引到负表面，并且表面附近的高配体浓度导致更有效的固定。
配体固定后，用例如乙醇胺或NaOH (其去除残留的NHS酯)使过量的NHS-活化的羧基失活，使得在注射分析物期间蛋白不再可以固定至表面。也可以用带正电荷的表面和带负电荷的配体进行该过程。
配体水平可通过配体浓度、活化或配体接触时间、配体固定/偶联缓冲液的组成和pH或这些参数的组合来控制。本发明人已惊奇地发现，使用根据本发明的具有MHA SAM层的传感器表面，配体水平通常随着活化时间的缩短而增加。这与具有水凝胶(如CMDx)的可利用的传感器表面相比是相反的。对于后者，配体水平随着活化时间(接触时间)的增加而增加。
实验部分
实验1：具有MHA SAM和PEG的传感器表面的合成
对于该实施例，参考图1。
在25℃下，将包含具有金表面的玻璃芯片的基底浸泡在含1 mM MHA的80%/20%乙醇/水中并孵育过夜。金芯片用以下溶液洗涤5分钟，并按所示顺序洗涤：100%乙醇、80%乙醇、50%乙醇、20%乙醇和100%水。
传感器芯片用氮气干燥，并浸入在水中的0.144 M EDC和0.050 M NHS中，在25℃下孵育30分钟。传感器芯片用水洗涤4次，然后用含1.79 mM O-(2-氨基乙基)聚乙二醇mw5000的0.252 M磷酸钠缓冲液(pH8.5)浸泡并在25℃下孵育30分钟。弃去PEG溶液，用1 M乙醇胺(pH 8.5)使残留的活性酯失活。最后，用水洗涤传感器芯片4次。芯片用氮气干燥。
实验2：使用不同活化时间，使配体(抗体)固定至SAM MHA上的羧基
得自实验1的芯片用塑料载体和罩组装。此后，根据制造商在控制软件中的说明，将芯片对接在Biacore 3000中。用200 mM EDC和50 mM NHS在水中的混合物在仪器中活化SAM上的羧基30、60、90和180秒。
将在10 mM醋酸钠(pH 5)中的50 µg/ml小鼠IgG1抗体在活化的芯片表面上注射7分钟。用1M乙醇胺(pH 8.5)使芯片表面(未反应的琥珀酰亚胺酯)失活5分钟。在不同的流动池中用不同活化时间进行固定。运行缓冲液HBS-EP (BR100188) (GE Healthcare)。
对于这个实施例，参考图3中的图，它表明固定水平与30秒后的活化时间成反比。
实验3：使用本发明的传感器表面的测定
得自实验1的芯片用塑料载体和罩组装。根据控制软件中的说明，将芯片对接在Biacore® 8K中。SAM上的羧基在仪器中用200 mM EDC和50 mM NHS在水中的混合物活化30秒。
将在10 mM醋酸钠(pH 5)中的30 µg/ml小鼠抗-β2µ在活化的芯片表面上注射7分钟。用1M乙醇胺(pH 8.5)使芯片表面(未反应的琥珀酰亚胺酯)失活5分钟。将在运行缓冲液中的不同浓度的β2µ (1、2、4、8、16 nM)在固定的表面和无配体的参考点/表面上注射。运行缓冲液为HBS-P+。确定β2µ对小鼠抗-β2µ的结合动力学是可能的。应用至一对一结合模型的拟合。
对于这个实施例，参考图4，其显示了减去参考的传感图。通过Biacore® 8K评价软件，计算了缔合常数(Ka)、解离常数(Kd)和亲和常数(KD)。结果与先前确定的可获得的结果一致。
Claims (16)
1.一种制备用于SPR仪器的传感器表面的方法，其包括通过使所述表面与一种或多种具有至少一种类型的官能团的硫醇C10-C30烷烃试剂反应，在表面上形成自组装单层，其中一种或多种蛋白抗性化合物与第一部分的所述官能团偶联；和其中一种或多种捕获分子直接或经由接头偶联到所述表面上的第二部分的所述官能团，所述接头不是所述蛋白抗性化合物，其中没有捕获分子偶联到蛋白抗性化合物，其中第二部分的官能团被包括在通过第一部分的官能团偶联蛋白抗性化合物之后在表面上剩余的那些中，并且其中第一和第二部分的官能团具有相同或不同的类型，其中硫醇C10-C30烷烃试剂的官能团是羧基、羟基、氨基、醛基、环氧基、乙烯基、羰基或硫醇基的一种或多种，且其中蛋白抗性化合物是选自聚乙二醇或其衍生物的亲水性聚合物。
2.依据权利要求1所述的方法，其中蛋白抗性化合物是具有<20000的mw的甲氧基聚乙二醇胺。
3.依据权利要求1所述的方法，其中所述表面是金属镀覆的表面。
4.依据权利要求1所述的方法，其中所述表面是金或银镀覆的表面。
5.依据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中硫醇C10-C30烷烃试剂是巯基十六烷酸或其衍生物。
6.依据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中蛋白抗性化合物是具有100-20000的mw的PEG。
7.依据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中蛋白抗性化合物是具有2000-10000的mw的PEG。
8.依据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中蛋白抗性化合物是具有4000-6000的mw的PEG。
9.依据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中第二部分的官能团在捕获分子的偶联之前被活化，并且偶联的捕获分子的量与活化时间长度成反比；并且其中活化试剂选自N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基-琥珀酰亚胺的混合物、表氯醇或双官能试剂。
10.使用依据权利要求1-9中的任一项所述的方法制备的传感器表面运行SPR测定的方法，其包括在传感器表面上加入能够与捕获分子相互作用的分析物，并执行动力学测定和/或浓度测定。
11.依据权利要求1制备的传感器表面，其包括具有自组装单层的基底，其提供有在所述自组装单层上可利用的官能团，其中蛋白抗性化合物偶联到第一部分的官能团和其中捕获分子偶联到表面上的第二部分的官能团，并且其中没有捕获分子偶联到蛋白抗性化合物。
12.依据权利要求11所述的传感器表面，其中蛋白抗性化合物和捕获分子偶联到相同类型的官能团。
13.依据权利要求11所述的传感器表面，其中蛋白抗性化合物和捕获分子偶联到不同类型的官能团。
14.依据权利要求11、12或13所述的传感器表面，其中所述表面是金属镀覆的表面，和自组装单层是硫醇C10-C30烷烃自组装单层，和蛋白抗性化合物是聚乙二醇(PEG)或其衍生物。
15.依据权利要求11、12或13所述的传感器表面，其中所述表面是金镀覆的表面，和自组装单层是巯基十六烷酸-自组装单层，和蛋白抗性化合物是聚乙二醇(PEG)或其衍生物。
16.依据权利要求11、12或13所述的传感器表面，其中蛋白抗性化合物是浓度为0.5-5mM的PEG mw 5000。
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