JP4435708B2 - バイオセンサー - Google Patents
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Description
好ましくは、分子量の最も大きい親水性化合物の平均分子量は1000以上100万未満である。
好ましくは、生理活性物質を保持しない表面に平均分子量が互いに少なくとも500以上異なる少なくとも2種以上の親水性化合物が結合している。
好ましくは、金属表面あるいは金属膜は、金、銀、銅、白金、及びアルミニウムからなる群より選ばれる自由電子金属からなるものである。
好ましくは、生理活性物質と相互作用する物質を非電気化学的方法により検出または測定し、さらに好ましくは生理活性物質と相互作用する物質を表面プラズモン共鳴分析により検出または測定する。
本発明のバイオセンサーは、生体分子固定部(測定部)と非固定部(参照部)とを有するバイオセンサーであって、生体分子非固定部(参照部)に分子量が異なる2種以上の親水性化合物が結合していることを特徴とする。好ましくは、分子量が異なる2種以上の親水性化合物は、分子量の大きな化合物から分子量の小さい化合物の順番に1種類ずつ逐次的に結合することができる。
-SeSeRY)、セレニド(SeR'Y"、-SeRY)、チオール(-SH)、ニトリル(-CN)、イソニトリル、ニトロ(-NO2)、セレノール(-SeH)、3価リン化合物、イソチオシアネート、キサンテート、チオカルバメート、ホスフィン、チオ酸またはジチオ酸(-COSH、-CSSH)が好ましく用いられる。
δ=(ΣEcoh/ΣV)1/2
例として、疎水性高分子化合物および溶剤のSP値を挙げると、ポリメチルメタクリレート-ポリスチレンコポリマー(1:1):21.0に対する溶剤2−フェノキシエタノール:25.3、ポリメチルメタクリレート:20.3に対する溶剤アセトニトリル:22.9、ポリスチレン:21.6に対する溶剤トルエン:18.7である。
核酸としては、測定の対象とする核酸と相補的にハイブリダイズするものを使用することができる。核酸は、DNA(cDNAを含む)、RNAのいずれも使用できる。DNAの種類は特に限定されず、天然由来のDNA、遺伝子組換え技術により調製した組換えDNA、又は化学合成DNAの何れでもよい。
低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。
免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインAあるいはプロテインG、リウマチ因子(RF)等を使用することができる。
糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。
脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。
被験物質としては例えば、上記した生理活性物質と相互作用する物質を含む試料などを使用することができる。
以下の方法で、本発明のセンサチップを作成した。
(1)プラスチックプリズム上への金製膜
ゼオネックス(日本ゼオン社製)を射出成型して得られたプラスチックプリズム(図1)の上面に以下の方法で金薄膜を製膜した。
(1−1)金製膜
スパッタ装置の基板ホルダにプリズムを取付け、真空(ベースプレッシャー1×10-3Pa以下)に引いてからArガスを導入し(1Pa)、基板ホルダを回転(20rpm)させながら、基板ホルダにRFパワー(0.5kW)を約9分間印加してプリズム表面をプラズマ処理する。次に、Arガスを止めて真空に引き、Arガスを再び導入し(0.5Pa)、基板ホルダを回転(10〜40rpm)させながら、8inchのCrターゲットにDCパワー(0.2kW)を約30秒間印加して2nmのCr薄膜を成膜する。次に。Arガスを止めて再び真空に引き、Arガスを再び導入し、(0.5Pa)、基板ホルダを回転(20rpm)させながら、8inchのAuターゲットにDCパワー(1kW)を約50秒間印加して50nm程度のAu薄膜を成膜する。得られた試料をチップAと呼ぶ。
チップAの金薄膜上に以下の方法でポリマー薄膜を製膜した。
(2−1)ポリマー溶液Aの調製
ポリマー(F-1) 1.5gを脱水MiBK(メチルイソブチルケトン)100mLに溶解し、孔径0.45μmのミクロフィルターで濾過する。脱水MiBKの含水率は20ppmであった。
チップAをスピンコーター(SC-408S試料密閉型スピンコータ−、有限会社押鐘製)にセットする。チップAはスピンコーターの中心から135mmの位置に図2に示すように固定する。ポリマー溶液A 200μLをチップAの金膜全面を覆うようにキャストする。次に、チップAを完全に覆うように風よけカバーをセットする。その後、200rpmで60秒間スピンする。回転が停止した後、5分間そのまま静置する。
ポリマーをスピンコートしたチップAを16時間真空乾燥する。得られた試料をチップBと呼ぶ。
以下の方法で、チップBのポリマー薄膜表面を加水分解して、最表面にCOOH基を発生させた。
(3−1)加水分解
1N NaOH溶液にチップBを浸漬し、60℃の恒温槽で16時間保管する。
(3−2)洗浄
60℃の恒温槽から取り出した後、15分間自然冷却し、その後、超純水で洗浄する。得られた試料をチップCと呼ぶ。
以下の方法で、チップCの表面に存在するCOOH基に5アミノ吉草酸反応を共有結合させた。
(4−1)活性化液、5アミノ吉草酸溶液の調製
0.1M NHS溶液: 1.16gのNHS(N-hydroxysulfosuccinimide)を超純水で溶解し100mLにする。
0.4M EDC溶液: 7.7gのEDC(1-Ethyl-3-[3-Dimethylaminopropyl]carbodiimide Hydrochloride)を超純水で溶解し100mLにする。
1M 5アミノ吉草酸溶液: 11.7gの5アミノ吉草酸を超純水80mLで溶解し、1N NaOHを用いてpH8.5に調整する。さらに超純水を加え100mLにする。
エアガンでチップCの水切りを行う。チップCを湿箱(濡れ布を敷いたタイトボックス、密封した状態で湿度90%RH以上に保つ)にセットし、0.1M NHS溶液100μLと0.4M EDC溶液100μLの混合液200μLをキャストする。その上に120mm×8.5mmに切った厚さ175μmのPETフイルムをのせて液を拡げつつ表面をカバーする。この反応時の液の空気と接しない部分の表面積と空気と接する部分の表面積の比は26である。湿箱を密閉して、25℃で60分静置する。
湿箱から取り出した試料からPETフイルムを取り外し、純水で洗浄する。得られた試料をチップDと呼ぶ。
5アミノ吉草酸反応は活性化反応終了後1時間以内に開始する。先ずエアガンでチップDの水切りを行う。チップDを湿箱にセットし、1M 5アミノ吉草酸溶液200μLをキャストする。その上に120mm×8.5mmに切った厚さ175μmのPETフイルムをのせて液を拡げつつ表面をカバーする。この反応時の液の空気と接しない部分の表面積と空気と接する部分の表面積の比は24である。湿箱を密閉して、25℃で90分静置する。
湿箱から取り出した試料からPETフイルムを取り外し、純水で洗浄する。得られた試料をチップEと呼ぶ。
以下の方法で、チップEの表面に生理活性物質を保持しない部分を形成した。具体的には、チップEの特定の場所において、チップEの表面に存在する5アミノ吉草酸のCOOH基を利用して以下のPEG誘導体を共有結合させた。
20%PEG誘導体溶液: 4.5gの下記PEG誘導体を超純水18.5mLと1N NaOH 4mLで溶解する。
PEG誘導体(1):NH2-(CH2CH2O)n-CH2CH2OH、平均分子量5000
PEG誘導体(2):NH2-(CH2CH2O)n-CH2CH2OH、平均分子量2000
PEG誘導体(3):NH2-(CH2CH2O)4-CH2CH2OH、分子量237
0.1M Sulfo-NHS溶液: 2.04gのNHSを超純水で溶解し100mLにする。
0.4M EDC溶液: 7.7gのEDCを超純水で溶解し100mLにする。
エアガンでチップEの水切りを行い、武蔵エンジニアリング社製ディスペンサーの台座に固定する。次に、シリンジに0.1M Sulfo-NHS溶液2mLと0.4M EDC溶液2mLの混合液を投入する。チップEに18mm間隔で15μLづつ6点、前記混合液をスポッティングする。液滴の直径は約3.5mmとなる。スポッティングを行ったチップEを湿箱にセットし、湿箱を密閉して、25℃で60分静置する。
湿箱から取り出した試料を純水で洗浄する。得られた試料をチップFと呼ぶ。
エアガンでチップFの水切りを行い、武蔵エンジニアリング社製ディスペンサーの台座に固定する。次に、シリンジに表1に示すPEG誘導体溶液を投入する。チップFに前述(5−2)と同じ位置に18mm間隔で15μLづつ6点、PEG誘導体溶液をスポッティングする。液滴の直径は約3.5mmとなる。スポッティングを行ったチップFを湿箱にセットし、湿箱を密閉して、25℃で16時間静置する。
湿箱から取り出した試料を純水で洗浄する。
以下の方法で、チップGの表面に生理活性物質を保持する表面を形成した。具体的には、チップGの特定の場所において、チップGの表面に存在する5アミノ吉草酸のCOOH基を利用してα-アミノ-ω-カルボキシル-ポリエチレングリコール(平均分子量3400)を共有結合させた。
0.1M Sulfo-NHS溶液: 2.04gのNHSを超純水で溶解し100mLにする。
0.4M EDC溶液: 7.7gのEDCを超純水で溶解し100mLにする。
10%α-アミノ-ω-カルボキシル-ポリエチレングリコール溶液: 10gのα-アミノ-ω-カルボキシル-ポリエチレングリコール(平均分子量3400)を超純水80mLで溶解し、1N NaOHを用いてpH8.5に調整する。さらに超純水を加え100mLにする。
エアガンでチップGの水切りを行い、武蔵エンジニアリング社製ディスペンサーの台座に固定する。次に、シリンジに0.1M Sulfo-NHS溶液2mLと0.4M EDC溶液2mLの混合液を投入する。チップGに前述(5−4)のスポッティング位置に対して中心位置を4.5mmずらして18mm間隔で15μLづつ6点、Sulfo-NHS/EDC混合液をスポッティングする。液滴の直径は約3.5mmとなる。スポッティングを行ったチップGを湿箱にセットし、湿箱を密閉して、25℃で60分静置する。
湿箱から取り出した試料を純水で洗浄する。得られた試料をチップHと呼ぶ。
エアガンでチップHの水切りを行い、武蔵エンジニアリング社製ディスペンサーの台座に固定する。次に、シリンジに10%α-アミノ-ω-カルボキシル-ポリエチレングリコール溶液を投入する。チップHに前述(6−2)と同じ位置に18mm間隔で15μLづつ6点、α-アミノ-ω-カルボキシル-ポリエチレングリコール溶液をスポッティングする。液滴の直径は約3.5mmとなる。スポッティングを行ったチップHを湿箱にセットし、湿箱を密閉して、25℃で16時間静置する。
湿箱から取り出した試料を純水で洗浄する。得られた試料をチップIと呼ぶ。
エアガンでチップIの水切りを行い保管する。
フィブリノーゲン(MP Biomedicals社製)0.5mgをHBS-EPバッファー(ビアコア社製)0.5mlに溶解する。HBS-EPバッファーの組成は、HEPES(N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonicAcid)0.01mol/l(pH7.4)、NaCl0.15mol/l、EDTA 0.003mol/l、Surfactant P20 0.005質量%である。SPR装置に、ランニングバッファーとしてHBS-EPバッファーを流し、基準点をとる。次に作成したフィブリノーゲン溶液を3分間流し、その後、HBS-EPバッファーを3分間流す。基準点からのSPR信号の増加分を非特異吸着量とする。測定結果を表1に示す。
化合物A を0.1mMになるようにHBS-Nバッファー(ビアコア社製)/DMSO 5%溶液に溶解する。HBS-Nバッファーの組成は、HEPES(N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonicAcid)0.01mol/l(pH7.4)、NaCl0.15mol/lである。SPR装置に、ランニングバッファーとしてHBS-Nバッファー/DMSO 5%溶液を流し、基準点をとる。次に作成した化合物A溶液を3分間流し、その後、HBS-Nバッファー/DMSO 5%溶液を3分間流す。基準点からのSPR信号の増加分を非特異吸着量とする。測定結果を表1に示す。
Claims (13)
- 同一面内に少なくとも2種類以上の表面を有する基板から成るバイオセンサーにおいて、該表面の少なくとも1種が生理活性物質を保持しない表面であり、該生理活性物質を保持しない表面に分子量が異なる少なくとも2種以上の親水性化合物が結合しており、上記親水性化合物がポリエチレングリコール又はその誘導体である、上記のバイオセンサー。
- 生理活性物質を保持しない表面に、分子量の異なる少なくとも2種以上の親水性化合物を、分子量の大きい親水性化合物から分子量の小さい親水性化合物の順番に1種類ずつ結合させることにより得られる、請求項1に記載のバイオセンサー。
- 分子量の最も小さい親水性化合物の平均分子量が100以上1000未満である、請求項1又は2に記載のバイオセンサー。
- 分子量の最も大きい親水性化合物の平均分子量が1000以上100万未満である、請求項1から3の何れかに記載のバイオセンサー。
- 生理活性物質を保持しない表面に平均分子量が互いに少なくとも500以上異なる少なくとも2種以上の親水性化合物が結合している、請求項1から4の何れかに記載のバイオセンサー。
- 基板が、金属表面又は金属膜から成る基板である、請求項1から5の何れかに記載のバイオセンサー。
- 金属表面あるいは金属膜が、金、銀、銅、白金、及びアルミニウムからなる群より選ばれる自由電子金属からなるものである、請求項6に記載のバイオセンサー。
- 非電気化学的検出に使用される、請求項1から7の何れかに記載のバイオセンサー。
- 表面プラズモン共鳴分析に使用される、請求項1から8の何れかに記載のバイオセンサー。
- 請求項1から9の何れかに記載のバイオセンサーと生理活性物質とを接触させて、該バイオセンサーの表面に該生理活性物質を結合させた表面と該生理活性物質を結合させない表面を作成する工程を含む、バイオセンサー表面に生理活性物質を固定化する方法。
- 請求項10に記載の方法で作成したバイオセンサーと被験物質とを接触させる工程を含む、該生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する方法。
- 生理活性物質と相互作用する物質を非電気化学的方法により検出または測定する、請求項11に記載の方法。
- 生理活性物質と相互作用する物質を表面プラズモン共鳴分析により検出または測定する、請求項11又は12に記載の方法。
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