JP4361453B2 - バイオセンサーの製造方法 - Google Patents
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好ましくは、金属層はスパッタ法により形成されている。
好ましくは、金属層の膜厚は20〜100nmである。
好ましくは、疎水性ポリマー層が化学処理により表面処理されている。
好ましくは、光反射面に、該光反射面を底面とする流路を形成するようにブロックが圧着されている。
好ましくは、流路を形成するブロックが樹脂により形成されている。
本発明のさらに別の側面によれば、本発明のバイオセンサーと生理活性物質とを接触させて、該バイオセンサーの表面に該生理活性物質を結合させる工程を含む、バイオセンサーに生理活性物質を固定化する方法が提供される。
好ましくは、生理活性物質と相互作用する物質を非電気化学的方法により検出または測定し、さらに好ましくは生理活性物質と相互作用する物質を表面プラズモン共鳴分析により検出または測定する。
本発明のバイオセンサーは、樹脂により成型された光入射面、光反射面及び光出射面の少なくとも3面を持つ光学ブロックの光反射面に対して、10nm/秒以上の金属原子の反射面への付着速度で金属層を形成することによって作製されることを特徴とするバイオセンサーである。
(1)2極DCグロー放電スパッタ装置
1〜10-2Torr程度の不活性ガス(たとえばAr)中で基板とターゲット(本発明では、金属)の間に数100Vの電圧を加えると、イオン化したArがターゲットに向かって加速して衝突し、ターゲットの物質がスパッタされて基板に堆積される。このとき、同時にターゲットから高エネルギーのγ-電子が生じ、Ar原子と衝突する際にAr原子をイオン化し、プラズマが持続する。
ターゲット(金属)の裏側に磁石を置き、 磁界をかけてターゲット近傍にγ電子を閉じ込めることを特徴とする。γ電子は磁力線に絡みついた軌道をとるため,プラズマがターゲット近傍に集中し,基板へのダメージを低減できる。同時にγ電子の運動距離が長くなるため,低ガス圧で高速なスパッタが可能となる。
膜堆積室とイオン発生室とが分離されており、プラズマイオン室から放出されたイオンをターゲットに照射し, スパッタリングを起こす。この装置では、堆積室にはプラズマが侵入しないため, γ電子などによる悪影響を受けず、またターゲットに照射するイオンのエネルギーとイオン密度を独立に制御できる。
δ=(ΣEcoh/ΣV)1/2
疎水性高分子化合物および溶剤のSP値の例を挙げると、ポリメチルメタクリレート-ポリスチレンコポリマー(1:1):21.0に対する溶剤2−フェノキシエタノール:25.3、ポリメチルメタクリレート:20.3に対する溶剤アセトニトリル:22.9、ポリスチレン:21.6に対する溶剤トルエン:18.7である。
核酸としては、測定の対象とする核酸と相補的にハイブリダイズするものを使用することができる。核酸は、DNA(cDNAを含む)、RNAのいずれも使用できる。DNAの種類は特に限定されず、天然由来のDNA、遺伝子組換え技術により調製した組換えDNA、又は化学合成DNAの何れでもよい。
低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。
免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインAあるいはプロテインG、リウマチ因子(RF)等を使用することができる。
糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。
脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。
被験物質としては例えば、上記した生理活性物質と相互作用する物質を含む試料などを使用することができる。
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
以下の方法で、本発明のセンサチップを作成した。
(1)プラスチックプリズム上への金製膜
ゼオネックス(日本ゼオン社製)を射出成型して得られたプラスチックプリズム(図1)の上面に以下の方法で金薄膜を製膜した。
スパッタ装置(ULVAC SH-550)の基板ホルダにプリズムを取付け、真空(ベースプレッシャー1×10-3Pa以下)に引いてからArガスを導入し(1Pa)、基板ホルダを静止した状態で、8inchのAuターゲットにDCパワー(4kW)を1.5秒間印加して50nmのAu薄膜を成膜する。実効の膜厚形成レートは約33nm/secである。得られた試料をチップAと呼ぶ。
チップAの金薄膜上に以下の方法でポリマー薄膜を製膜した。
(2−1)ポリマー溶液Aの調製
ポリマー(F-1) 1.5gを脱水MiBK(メチルイソブチルケトン) 100mLに溶解し、孔径0.45μmのミクロフィルターで濾過する。脱水MiBKの含水率は20ppm。
チップAをスピンコーター(SC-408S試料密閉型スピンコータ−、有限会社押鐘製)にセットする。チップAはスピンコーターの中心から135mmの位置に図2に示すように固定する。ポリマー溶液A 200μLをチップAの金膜全面を覆うようにキャストする。次に、チップAを完全に覆うように風よけカバーをセットする。その後、200rpmで60秒間スピンする。回転が停止した後、5分間そのまま静置する。
(2−3)真空乾燥
ポリマーをスピンコートしたチップAを16時間真空乾燥する。得られた試料をチップBと呼ぶ。
以下の方法で、チップBのポリマー薄膜表面を加水分解して、最表面にCOOH基を発生させた。
(3−1)加水分解
1N NaOH溶液にチップBを浸漬し、60℃の恒温槽で16時間保管する。
60℃の恒温槽から取り出した後、15分間自然冷却し、その後、超純水で洗浄する。得られた試料をチップCと呼ぶ。
実施例1の(1−1)金製膜を下記の方法で行う以外は、実施例1と同様の方法でセンサーチップを作製した。得られた試料をチップDと呼ぶ。
スパッタ装置(ULVAC SH-550)の基板ホルダにプリズムを取付け、真空(ベースプレッシャー1×10-3Pa以下)に引いてからArガスを導入し(1Pa)、基板ホルダを回転(40rpm)させながら、8inchのAuターゲットにDCパワー(4kW)を約16秒間印加して50nm程度のAu薄膜を成膜する。Auターゲット上を通過する時のみ金属膜は製膜され、実効の膜厚形成速度は33nm/secであった。
実施例2と同様な方法で、Auターゲットに印加するDCパワーを変更して、50nmの膜厚になるように印加時間を調整してセンサーチップを作製した。得られた試料をチップE及びFと呼ぶ。印加時間は表1に記載した。チップE及びFの膜厚形成速度はそれぞれ25nm/sec及び10nm/secであった。
実施例2と同様な方法で、Auターゲットに印加するDCパワーを変更して、50nmの膜厚になるように印加時間を調整してセンサーチップを作製した。得られた試料をチップG、H及びIと呼ぶ。印加時間は表1に記載した。チップG、H及びIの膜厚形成速度はそれぞれ5nm/sec、2.5nm/sec及び1.3nm/secであった。
チップC〜F(本発明)並びにチップG〜I(比較例)を用いて、剥離個数を評価した。評価は、20倍の光学顕微鏡での1視野の中の同心円状に発生する剥離個数を5視野分計測し、平均個数を求めた。結果を表1に示す。本発明のチップでは、剥離がほぼ発生しなかった。剥離個数の平均が5個までなら、商品価値上許容できる範囲である。
以下に示す方法で、チップC〜Iの表面処理を行った。
以下の方法で、チップの表面に存在するCOOH基に5アミノ吉草酸反応を共有結合させた。
(1−1)活性化液、5アミノ吉草酸溶液の調製
0.1M NHS溶液: 1.16gのNHS(N−ヒドロキシコハク酸イミド)を超純水で溶解し100mLにする。
0.4M EDC溶液: 7.7gのEDC(塩酸1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド)を超純水で溶解し100mLにする。
1M 5アミノ吉草酸溶液: 11.7gの5アミノ吉草酸を超純水80mLで溶解し、1N NaOHを用いてpH8.5に調整する。さらに超純水を加え100mLにする。
エアガンでチップの水切りを行う。チップを湿箱(濡れ布を敷いたタイトボックス、密封した状態で湿度90%RH以上に保つ)にセットし、0.1M NHS溶液100μLと0.4M EDC溶液100μLの混合液200μLをキャストする。その上に120mm×8.5mmに切った厚さ175μmのPETフイルムをのせて液を拡げつつ表面をカバーする。この反応時の液の空気と接しない部分の表面積と空気と接する部分の表面積の比は26である。湿箱を密閉して、25℃で60分静置する。
湿箱から取り出した試料からPETフイルムを取り外し、純水で洗浄する。得られた試料をチップX1と呼ぶ。
5アミノ吉草酸反応は活性化反応終了後1時間以内に開始する。先ずエアガンでチップX1の水切りを行う。チップX1を湿箱にセットし、1M 5アミノ吉草酸溶液200μLをキャストする。その上に120mm×8.5mmに切った厚さ175μmのPETフイルムをのせて液を拡げつつ表面をカバーする。この反応時の液の空気と接しない部分の表面積と空気と接する部分の表面積の比は24である。湿箱を密閉して、25℃で90分静置する。
湿箱から取り出した試料からPETフイルムを取り外し、純水で洗浄する。得られた試料をチップX2と呼ぶ。
以下の方法で、チップX2の表面に、リガンドが結合できない部分のパターンを形成した。具体的には、チップX2の特定の場所において、5アミノ吉草酸のCOOH基にPEG5000(α-アミノ-ω-メトキシ-ポリエチレングリコール)を共有結合させた。PEG5000の末端はメトキシ基なので、リガンドと共有結合を形成することができない。この部分は、アナライトの結合測定時にリファレンス部として計測される。
20% PEG5000溶液: 4.5gのPEG5000を超純水18.5mLと1N NaOH 4mLで溶解する。
0.2M NHS溶液: 2.32gのNHSを超純水で溶解し100mLにする。
0.4M EDC溶液: 7.7gのEDCを超純水で溶解し100mLにする。
エアガンでチップX2の水切りを行い、武蔵エンジニアリング社製ディスペンサーの台座に固定する。次に、シリンジに20% PEG5000溶液1mLと0.2M NHS溶液1mLと0.4M EDC溶液2mLの混合液を投入する。チップX2に18mm間隔で15μLづつ6点、前記混合液をスポッティングする。液滴の直径は約4mmとなる。スポッティングを行ったチップX2を湿箱にセットし、湿箱を密閉して、25℃で60分静置する。
湿箱から取り出した試料を1Nクエン酸水溶液で洗浄し、さらに純水で洗浄する。得られた試料をチップX3と呼ぶ。
以下の方法で、チップX3の表面に存在する5アミノ吉草酸のCOOH基にPEGリンカー(α-アミノ-ω-カルボキシル-ポリエチレングリコール)を共有結合させた。PEGリンカーはパターン化した表面には結合しない。
0.1M Sulfo-NHS溶液: 2.04gのNHSを超純水で溶解し100mLにする。
0.4M EDC溶液: 7.7gのEDCを超純水で溶解し100mLにする。
10% PEGリンカー溶液: 10gのPEGリンカーを超純水80mLで溶解し、1N NaOHを用いてpH8.5に調整する。さらに超純水を加え100mLにする。
エアガンでチップX3の水切りを行う。チップX3を湿箱にセットし、0.1M Sulfo-NHS溶液100μLと0.4M EDC溶液100μLの混合液200μLをキャストする。その上に120mm×8.5mmに切った厚さ175μmのPETフイルムをのせて液を拡げつつ表面をカバーする。この反応時の液の空気と接しない部分の表面積と空気と接する部分の表面積の比は26である。湿箱を密閉して、25℃で60分静置する。
湿箱から取り出した試料からPETフイルムを取り外し、純水で洗浄する。得られた試料をチップX4と呼ぶ。
PEGリンカー反応は活性化反応終了後1時間以内に開始する。先ずエアガンでチップGの水切りを行い、武蔵エンジニアリング社製ディスペンサーの台座に固定する。次に、シリンジに10%PEGリンカー溶液5mLを投入する。チップX4に18mm間隔で8μLづつ6点、10%PEGリンカー溶液をスポッティングする。その上に120mm×8.5mmに切った厚さ175μmのPETフイルムをのせて液を拡げつつ表面をカバーする。この反応時の液の空気と接しない部分の表面積と空気と接する部分の表面積の比は90である。この試料を湿箱にセットし、湿箱を密閉して、25℃で16時間静置する。
湿箱から取り出した試料を純水で洗浄する。得られた試料をチップX5と呼ぶ。
エアガンでチップX5の水切りを行い保管する。
上記処理を施したチップC〜I各48本について以下の方法でリガンド蛋白を固定し、固定量のばらつきを評価した。蛋白固定量は図3に示すSPR装置を用いた。測定には、図1の部品41に示すタフセレン製の流路を用いた。
(1)リガンド溶液の調製:トリプシン0.5mgを酢酸バッファー(pH5.5) 1mlに溶解。
(2)センサチップ表面の活性化:NHS(0.1M)/EDC(0.4M)=1/1、25℃、30分
(3)リガンドの固定:上記のリガンド溶液、25℃、30分
(4)ブロッキング:1Mエタノールアミン溶液(pH8.5)、25℃、30分
Claims (11)
- 樹脂により成型された光入射面、光反射面及び光出射面の少なくとも3面を持つ光学ブロックの光反射面に対して、10nm/秒以上の金属原子の反射面への付着速度で金属層を形成する工程を含む、バイオセンサーの製造方法。
- 樹脂が合成樹脂である、請求項1に記載の方法。
- 樹脂が無極性ポリマーである、請求項1又は2に記載の方法。
- 樹脂が環状オレフィンポリマーである、請求項1から3の何れかに記載の方法。
- 金属層が金、又は銀から構成されている、請求項1から4の何れかに記載の方法。
- 金属層がスパッタ法により形成される、請求項1から5の何れかに記載の方法。
- 金属層の膜厚が20〜100nmである、請求項1から6の何れかに記載の方法。
- 樹脂により成型された光入射面、光反射面及び光出射面の少なくとも3面を持つ光学ブロックの光反射面に対して、10nm/秒以上の金属原子の反射面への付着速度で金属層を形成する工程の後に、疎水性ポリマー層で上記金属層をコートする工程を更に含む、請求項1から7の何れかに記載の方法。
- 疎水性ポリマー層を化学処理により表面処理する工程を含む、請求項8に記載の方法。
- 光反射面に、該光反射面を底面とする流路を形成するようにブロックを圧着されている、請求項1から9の何れかに記載の方法。
- 流路を形成するブロックが樹脂により形成されている、請求項1から10の何れかに記載の方法。
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