CN110878118B - 度拉糖肽的纯化方法与纯化试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及多肽纯化技术领域，尤其涉及度拉糖肽的纯化方法与纯化试剂。本发明提供的纯化试剂适用于对度拉糖肽的裂解液进行液液萃取，其配合本发明提供的方法，能够在保证产品纯度的同时提高收率，且产品中残留较少。本发明提供的方法，参数合理能够使度拉糖肽更好的从裂解液中被萃取。经鉴定，本发明方法的收率可达35％，纯度可达99％。该方法所得产物的纯度与柱纯化所得产物的纯度相当，而收率提高3倍以上。
Description
技术领域
本发明涉及多肽纯化技术领域，尤其涉及度拉糖肽的纯化方法与纯化试剂。
背景技术
2型糖尿病，是一种胰岛素分泌缺陷和作用障碍为特征的慢性疾病。根据国际糖尿病联盟(IDF)统计，预计到2030年，全球将有5亿人罹患糖尿病，我国也已成为糖尿病的重灾区。
根据肠促胰岛素的特性，目前已研发上市的药品有2大类，即GLP-1受体激动剂和DPP-4抑制剂，GLP-1是胃肠内分泌细胞产生的肽类物质，能够促进胰岛素的分泌、刺激β细胞增生，抑制胰高血糖素的释放等等，国内已上市的GLP-1受体激动剂主要有艾塞那肽、利拉鲁肽、索玛鲁泰。度拉糖肽(dulaglutide，LY2189265)是GLP-1的受体激动素之一，由美国礼来公司开发，2014年底获FDA批准上市，商品名为：Trulicity。度拉糖肽的多项相关临床研究均表明其是一种安全性及有效性均较高的超长效治疗2型糖尿病药物；也是唯一一个在III期临床中疗效相当于Liraglutide的GLP-1受体激动剂，预测其2020年的年销售额将达到13亿美元。
度拉糖肽是由两条同样肽链组成的靠二硫键连接起来的二聚体。度拉糖肽的分量为59671，每条链的分子量为29841，12个半胱氨酸以二硫键形式存在，寡糖位于Asn126位。目前对度拉糖肽的纯化大多使用多步色谱层析法来纯化宿主细胞裂解物。此种纯化方法不仅费用昂贵、费时费力，而且需要操作人员有丰富的实验经验，因此，降低了度拉糖肽的生产效率，且提高了生产成本。因此，应进一步研发简单实用的液液萃取方法来纯化度拉糖肽。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供度拉糖肽的纯化方法与纯化试剂，该方法简单实用，通过液液萃取实现度拉糖肽的高效纯化。
本发明提供的度拉糖肽的纯化方法包括：
破碎表达度拉糖肽的菌体，经过滤获得滤液；
以萃取剂萃取所述滤液，收集有机层；
所述有机层与水混合后，以反萃取剂萃取，收集水层；
所述水层经冻干获得度拉糖肽；
所述萃取剂为甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、四氢呋喃、乙腈、正丁醇、异丁醇、叔丁醇中至少一种；
所述反萃取剂为乙酸乙酯、乙酸异丙酯、乙醚、异丁醚、甲基叔丁醚中至少一种。
本发明实施例中，所述萃取剂为乙醇与正丁醇的混合液、甲醇与正丁醇的混合液、甲醇与异丁醇的混合液、乙醇与异丁醇的混合液、乙醇与叔丁醇的混合液；所述反萃取剂为乙酸异丙酯与甲基叔丁醚的混合液、乙酸乙酯与甲基叔丁醚的混合液。
一些实施例中，所述萃取剂为乙醇与正丁醇的混合液，其中乙醇与正丁醇的体积比为1：(1～2)。
一些具体实施例中，所述萃取剂为乙醇与正丁醇的混合液，其中乙醇与正丁醇的体积比为1：1。
一些具体实施例中，所述萃取剂为乙醇与正丁醇的混合液，其中乙醇与正丁醇的体积比为1：2。
一些具体实施例中，所述萃取剂为甲醇与正丁醇的混合液，其中甲醇与正丁醇的体积比为1：1。
一些具体实施例中，所述萃取剂为甲醇与异丁醇的混合液，其中甲醇与异丁醇的体积比为1：1。
一些具体实施例中，所述萃取剂为乙醇与异丁醇的混合液，其中乙醇与异丁醇的体积比为1：1。
一些具体实施例中，所述萃取剂为乙醇与叔丁醇的混合液，其中乙醇与叔丁醇的体积比为1：1。
一些实施例中，所述反萃取剂为乙酸异丙酯与甲基叔丁醚的混合液，其中乙酸异丙酯与甲基叔丁醚的体积比为1:(1～3)。
一些具体实施例中，所述反萃取剂为乙酸异丙酯与甲基叔丁醚的混合液，其中乙酸异丙酯与甲基叔丁醚的体积比为1:1。
一些具体实施例中，所述反萃取剂为乙酸异丙酯与甲基叔丁醚的混合液，其中乙酸异丙酯与甲基叔丁醚的体积比为1:3。
一些具体实施例中，所述反萃取剂为乙酸乙酯与甲基叔丁醚的混合液，其中乙酸乙酯与甲基叔丁醚的体积比为1:3。
本发明实施例中，所述滤液与萃取剂的体积比为1：(20～40)。
一些实施例中，所述滤液与萃取剂的体积比为1：20。
一些实施例中，所述滤液与萃取剂的体积比为1：40。
本发明实施例中，所述萃取剂与水的体积比为(4～8):1.5。
本发明实施例中，所述反萃取剂与水的体积比为2:1。
本发明实施例中，对滤液萃取的条件为15℃～35℃，搅拌10～20min。
一些实施例中，对滤液萃取的条件为25℃，搅拌15min。
本发明实施例中，对有机层萃取的条件为10℃～15℃，3000g离心3～7min。
一些实施例中，对有机层萃取的条件为12℃，3000g离心5min。
一些具体实施例中，
每200mL滤液与体积比为1：(1～2)的乙醇与正丁醇的混合液4L～8L混合，15℃～35℃搅拌萃取10～20min，收集有机层；
所述有机层降温至10℃～15℃，与发酵液0.75倍体积的水混合后，与2倍水体积的反萃取剂混合，3000g离心3～7min，收集水层；所述反萃取剂为体积比为1：(1～3)的乙酸异丙酯与甲基叔丁醚混合液。
一个具体实施例中，
每200mL滤液与体积比为1：1的乙醇与正丁醇的混合液4L混合，25℃搅拌萃取15min，收集有机层；
所述有机层降温至12℃，与发酵液0.75倍体积的水混合后，与2倍水体积的反萃取剂混合，3000g离心5min，收集水层；所述反萃取剂为体积比为1：3的乙酸异丙酯与甲基叔丁醚混合液。
一个具体实施例中，
每200mL滤液与体积比为1：2的乙醇与正丁醇的混合液4L混合，25℃搅拌萃取15min，收集有机层；
所述有机层降温至12℃，与发酵液0.75倍体积的水混合后，与2倍水体积的反萃取剂混合，3000g离心5min，收集水层；所述反萃取剂为体积比为1：3的乙酸异丙酯与甲基叔丁醚混合液。
一个具体实施例中，
每200mL滤液与体积比为1：1的乙醇与正丁醇的混合液4L混合，25℃搅拌萃取15min，收集有机层；
所述有机层降温至12℃，与发酵液0.75倍体积的水混合后，与2倍水体积的反萃取剂混合，3000g离心5min，收集水层；所述反萃取剂为体积比为1：1的乙酸异丙酯与甲基叔丁醚混合液。
一个具体实施例中，
每200mL滤液与体积比为1：1的乙醇与正丁醇的混合液8L混合，25℃搅拌萃取15min，收集有机层；
所述有机层降温至12℃，与发酵液0.75倍体积的水混合后，与2倍水体积的反萃取剂混合，3000g离心5min，收集水层；所述反萃取剂为体积比为1：3的乙酸异丙酯与甲基叔丁醚混合液。
一个具体实施例中，
每200mL滤液与体积比为1：1的乙醇与正丁醇的混合液4L混合，35℃搅拌萃取15min，收集有机层；
所述有机层降温至12℃，与发酵液0.75倍体积的水混合后，与2倍水体积的反萃取剂混合，3000g离心5min，收集水层；所述反萃取剂为体积比为1：3的乙酸异丙酯与甲基叔丁醚混合液。
一个具体实施例中，
每200mL滤液与体积比为1：1的甲醇与正丁醇的混合液4L混合，25℃搅拌萃取15min，收集有机层；
所述有机层降温至12℃，与发酵液0.75倍体积的水混合后，与2倍水体积的反萃取剂混合，3000g离心5min，收集水层；所述反萃取剂为体积比为1：3的乙酸异丙酯与甲基叔丁醚混合液。
一个具体实施例中，
每200mL滤液与体积比为1：1的甲醇与正丁醇的混合液4L混合，25℃搅拌萃取15min，收集有机层；
所述有机层降温至12℃，与发酵液0.75倍体积的水混合后，与2倍水体积的反萃取剂混合，3000g离心5min，收集水层；所述反萃取剂为体积比为1：3的乙酸乙酯与甲基叔丁醚混合液。
一个具体实施例中，
每200mL滤液与体积比为1：1的甲醇与异丁醇的混合液4L混合，25℃搅拌萃取15min，收集有机层；
所述有机层降温至12℃，与发酵液0.75倍体积的水混合后，与2倍水体积的反萃取剂混合，3000g离心5min，收集水层；所述反萃取剂为体积比为1：3的乙酸异丙酯与甲基叔丁醚混合液。
一个具体实施例中，
每200mL滤液与体积比为1：1的乙醇与异丁醇的混合液4L混合，25℃搅拌萃取15min，收集有机层；
所述有机层降温至12℃，与发酵液0.75倍体积的水混合后，与2倍水体积的反萃取剂混合，3000g离心5min，收集水层；所述反萃取剂为体积比为1：3的乙酸异丙酯与甲基叔丁醚混合液。
一个具体实施例中，
每200mL滤液与体积比为1：1的甲醇与叔丁醇的混合液4L混合，25℃搅拌萃取15min，收集有机层；
所述有机层降温至12℃，与发酵液0.75倍体积的水混合后，与2倍水体积的反萃取剂混合，3000g离心5min，收集水层；所述反萃取剂为体积比为1：3的乙酸异丙酯与甲基叔丁醚混合液。
本发明实施例中，所述破碎包括：将菌体以水重悬后，加入磁珠以超声破碎。
本发明中，所述菌体破碎后过滤采用0.45微米的滤膜。
所述菌体为表达度拉糖肽的菌种发酵制得，所述发酵液经离心后，取沉淀以水重悬。所述发酵液的体积与水的体积比为10:1。所述水为纯化水。
本发明提供的方法使用宿主细胞裂解液，分两步纯化完成。第一步直接用有机溶剂萃取发酵得到宿主细胞裂解液；第二步在含有度拉糖肽的有机溶液中，先加入纯化水，再加入反萃取剂，离心分层，下层溶液经冻干得到度拉糖肽精品。该纯化方法操作简单、成本低，度拉糖肽收率高，适合于规模产业化生产，并且制得的度拉糖肽纯度高、杂质含量少，具有可观的经济实用价值和广泛的应用前景。经鉴定，本发明方法的收率可达35％，纯度可达99％。该方法所得产物的纯度与柱纯化所得产物的纯度相当，而收率提高3倍以上。
本发明还提供了度拉糖肽的纯化试剂，其特征在于，包括萃取剂和反萃取剂；
所述萃取剂为甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、四氢呋喃、乙腈、正丁醇、异丁醇、叔丁醇中至少一种；
所述反萃取剂为乙酸乙酯、乙酸异丙酯、乙醚、异丁醚、甲基叔丁醚中至少一种。
本发明实施例中，所述萃取剂为乙醇与正丁醇的混合液、甲醇与正丁醇的混合液、甲醇与异丁醇的混合液、乙醇与异丁醇的混合液、乙醇与叔丁醇的混合液；所述反萃取剂为乙酸异丙酯与甲基叔丁醚的混合液、乙酸乙酯与甲基叔丁醚的混合液。
一些实施例中，所述萃取剂为乙醇与正丁醇的混合液，其中乙醇与正丁醇的体积比为1：(1～2)。
一些具体实施例中，所述萃取剂为乙醇与正丁醇的混合液，其中乙醇与正丁醇的体积比为1：1。
一些具体实施例中，所述萃取剂为乙醇与正丁醇的混合液，其中乙醇与正丁醇的体积比为1：2。
一些具体实施例中，所述萃取剂为甲醇与正丁醇的混合液，其中甲醇与正丁醇的体积比为1：1。
一些具体实施例中，所述萃取剂为甲醇与异丁醇的混合液，其中甲醇与异丁醇的体积比为1：1。
一些具体实施例中，所述萃取剂为乙醇与异丁醇的混合液，其中乙醇与异丁醇的体积比为1：1。
一些具体实施例中，所述萃取剂为乙醇与叔丁醇的混合液，其中乙醇与叔丁醇的体积比为1：1。
一些实施例中，所述反萃取剂为乙酸异丙酯与甲基叔丁醚的混合液，其中乙酸异丙酯与甲基叔丁醚的体积比为1:(1～3)。
一些具体实施例中，所述反萃取剂为乙酸异丙酯与甲基叔丁醚的混合液，其中乙酸异丙酯与甲基叔丁醚的体积比为1:1。
一些具体实施例中，所述反萃取剂为乙酸异丙酯与甲基叔丁醚的混合液，其中乙酸异丙酯与甲基叔丁醚的体积比为1:3。
一些具体实施例中，所述反萃取剂为乙酸乙酯与甲基叔丁醚的混合液，其中乙酸乙酯与甲基叔丁醚的体积比为1:3。
本发明的纯化试剂中，所述萃取剂与反萃取剂的体积比为(4～8)：3。
一些实施例中，本发明的纯化试剂中所述萃取剂与反萃取剂的体积比为4：3。
一些实施例中，本发明的纯化试剂中所述萃取剂与反萃取剂的体积比为8：3。
本发明提供的纯化试剂适用于对度拉糖肽的裂解液进行液液萃取，其配合本发明提供的方法，能够在保证产品纯度的同时提高收率，且产品中残留较少。本发明提供的方法，参数合理能够使度拉糖肽更好的从裂解液中被萃取。经鉴定，本发明方法的收率可达35％，纯度可达99％。该方法所得产物的纯度与柱纯化所得产物的纯度相当，而收率提高3倍以上。
附图说明
图1示实施例1度拉糖肽色谱图；
图2示对比例1度拉糖肽色谱图。
具体实施方式
本发明提供了度拉糖肽的纯化方法与纯化试剂，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试剂皆为普通市售品，皆可于市场购得。
参照专利CN1802386B制备发酵液。宿主细胞中，含有融合蛋白核酸序列，宿主细胞在培养基中表达，发酵后获得发酵液。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
25℃下，25℃,将2L发酵液(表达量2g/L)进行离心，去除发酵液，加入200ml纯化水，加入磁珠，然后采用超声破碎菌体，释放度拉糖肽，然后过0.45微米的滤膜，去除宿主细胞残留包体等其它物质，过滤液备用。
25℃，在200mL过滤液中加入体积比为1：1的乙醇与正丁醇的混合液4L，搅拌15分钟，收集有机层澄清溶液；然后将有机层溶液温度降至12℃，加入纯化水1.5L，再加入体积比为1：3的乙酸异丙酯与甲基叔丁醚混合液3L，放入离心机中，3000g离心5分钟，倒出上层有机层，下层水层冻干得到度拉糖肽1.4克，收率为35％，纯度99％(采用凝胶色谱法检测，本实施例的检测结果见图1)。
实施例2
25℃下，25℃,将2L发酵液(表达量2g/L)进行离心，去除发酵液，加入200ml纯化水，加入磁珠，然后采用超声破碎菌体，释放度拉糖肽，然后过0.45微米的滤膜，去除宿主细胞残留包体等其它物质，过滤液备用。
25℃，在200mL过滤液中加入体积比为1：2的乙醇与正丁醇的混合液4L，搅拌15分钟，收集有机层澄清溶液；然后将有机层溶液温度降至12℃，加入纯化水1.5L，再加入体积比为1：3的乙酸异丙酯与甲基叔丁醚混合液3L，放入离心机中，3000g离心5分钟，倒出上层有机层，下层水层冻干得到度拉糖肽1.2克，收率为30％，纯度96％。
实施例3
25℃下，25℃,将2L发酵液(表达量2g/L)进行离心，去除发酵液，加入200ml纯化水，加入磁珠，然后采用超声破碎菌体，释放度拉糖肽，然后过0.45微米的滤膜，去除宿主细胞残留包体等其它物质，过滤液备用。
25℃，在200mL过滤液中加入体积比为1：1的乙醇与正丁醇的混合液4L，搅拌15分钟，收集有机层澄清溶液；然后将有机层溶液温度降至12℃，加入纯化水1.5L，再加入体积比为1：1的乙酸异丙酯与甲基叔丁醚混合液3L，放入离心机中，3000g离心5分钟，倒出上层有机层，下层水层冻干得到度拉糖肽1.3克，收率为32.5％，纯度99％。
实施例4
25℃下，25℃,将2L发酵液(表达量2g/L)进行离心，去除发酵液，加入200ml纯化水，加入磁珠，然后采用超声破碎菌体，释放度拉糖肽，然后过0.45微米的滤膜，去除宿主细胞残留包体等其它物质，过滤液备用。
25℃下，在200mL过滤液中加入体积比为1：1的乙醇与正丁醇的混合液8L，搅拌15分钟，收集有机层澄清溶液；然后将有机层溶液温度降至12℃，加入纯化水1.5L，再加入体积比为1：3的乙酸异丙酯与甲基叔丁醚混合液3L，放入离心机中，3000g离心5分钟，倒出上层有机层，下层水层冻干得到度拉糖肽1.2克，收率为30％，纯度99％。
实施例5
25℃,将2L发酵液(表达量2g/L)进行离心，去除发酵液，加入200ml纯化水，加入磁珠，然后采用超声破碎菌体，释放度拉糖肽，然后过0.45微米的滤膜，去除宿主细胞残留包体等其它物质，过滤液备用。
35℃，在200mL过滤液中加入体积比为1：1的乙醇与正丁醇的混合液4L，搅拌15分钟，收集有机层澄清溶液；然后将有机层溶液温度降至12℃，加入纯化水1.5L，再加入体积比为1：3的乙酸异丙酯与甲基叔丁醚混合液3L，放入离心机中，3000g离心5分钟，倒出上层有机层，下层水层冻干得到度拉糖肽1.3克，收率为32.5％，纯度99％。
实施例6
25℃下，25℃,将2L发酵液(表达量2g/L)进行离心，去除发酵液，加入200ml纯化水，加入磁珠，然后采用超声破碎菌体，释放度拉糖肽，然后过0.45微米的滤膜，去除宿主细胞残留包体等其它物质，过滤液备用。
25℃，在200mL过滤液中加入体积比为1：1的甲醇与正丁醇的混合液4L，搅拌15分钟，收集有机层澄清溶液；然后将有机层溶液温度降至12℃，加入纯化水1.5L，再加入体积比为1：3的乙酸异丙酯与甲基叔丁醚混合液3L，放入离心机中，3000g离心5分钟，倒出上层有机层，下层水层冻干得到度拉糖肽1.4克，收率为28％，纯度96％。
实施例7
25℃下，25℃,将2L发酵液(表达量2g/L)进行离心，去除发酵液，加入200ml纯化水，加入磁珠，然后采用超声破碎菌体，释放度拉糖肽，然后过0.45微米的滤膜，去除宿主细胞残留包体等其它物质，过滤液备用。
25℃，在200mL过滤液中加入体积比为1：1的甲醇与正丁醇的混合液4L，搅拌15分钟，收集有机层澄清溶液；然后将有机层溶液温度降至12℃，加入纯化水1.5L，再加入体积比为1：3的乙酸乙酯与甲基叔丁醚混合液3L，放入离心机中，3000g离心5分钟，倒出上层有机层，下层水层冻干得到度拉糖肽1.4克，收率为30％，纯度95％。
实施例8
25℃下，25℃,将2L发酵液(表达量2g/L)进行离心，去除发酵液，加入200ml纯化水，加入磁珠，然后采用超声破碎菌体，释放度拉糖肽，然后过0.45微米的滤膜，去除宿主细胞残留包体等其它物质，过滤液备用。
25℃，在200mL过滤液中加入体积比为1：1的甲醇与异丁醇的混合液4L，搅拌15分钟，收集有机层澄清溶液；然后将有机层溶液温度降至12℃，加入纯化水1.5L，再加入体积比为1：3的乙酸异丙酯与甲基叔丁醚混合液3L，放入离心机中，3000g离心5分钟，倒出上层有机层，下层水层冻干得到度拉糖肽1.4克，收率为30％，纯度96％。
实施例9
25℃下，25℃,将2L发酵液(表达量2g/L)进行离心，去除发酵液，加入200ml纯化水，加入磁珠，然后采用超声破碎菌体，释放度拉糖肽，然后过0.45微米的滤膜，去除宿主细胞残留包体等其它物质，过滤液备用。
25℃，在200mL过滤液中加入体积比为1：1的乙醇与异丁醇的混合液4L，搅拌15分钟，收集有机层澄清溶液；然后将有机层溶液温度降至12℃，加入纯化水1.5L，再加入体积比为1：3的乙酸异丙酯与甲基叔丁醚混合液3L，放入离心机中，3000g离心5分钟，倒出上层有机层，下层水层冻干得到度拉糖肽1.4克，收率为33％，纯度97％。
实施例10
25℃下，25℃,将2L发酵液(表达量2g/L)进行离心，去除发酵液，加入200ml纯化水，加入磁珠，然后采用超声破碎菌体，释放度拉糖肽，然后过0.45微米的滤膜，去除宿主细胞残留包体等其它物质，过滤液备用。
25℃，在200mL过滤液中加入体积比为1：1的乙醇与叔丁醇的混合液4L，搅拌15分钟，收集有机层澄清溶液；然后将有机层溶液温度降至12℃，加入纯化水1.5L，再加入体积比为1：3的乙酸异丙酯与甲基叔丁醚混合液3L，放入离心机中，3000g离心5分钟，倒出上层有机层，下层水层冻干得到度拉糖肽1.4克，收率为30％，纯度98％。
对比例1
25℃,将2L发酵液(表达量2g/L)进行离心，去除发酵液，加入200ml纯化水，加入磁珠，然后采用超声破碎菌体，释放度拉糖肽，然后过0.45微米的滤膜，去除宿主细胞残留包体等其它物质，过滤液备用。
一步纯化：采用离子交换色谱柱，NanoQ-15L 15μm，流动相A为5mmol/L Tris，pH＝7.3；流动相B：5mmol/L Tris+1mol/LNaCl，pH＝7.3，洗脱梯度为10％B-45％B(35min),收集目标产物，备用。
二步纯化：采用疏水层析柱，Polar MC30-HIC Butyl 30μm填料，流动相A：50mmol/L磷酸氢二钠，pH＝2.5，含5％乙腈，流动相B：5mmol/L磷酸氢二钠pH＝2.5，含50％乙腈，洗脱梯度为25％B-50％B(40min)，收集目标产物，备用。
脱盐纯化：将经过二步纯化的合格馏分过凝胶色谱脱盐，色谱填料为Polar MC30-SEC Polar MC60-SEC，收集主峰部分即为脱盐后的度拉糖肽溶液,冻干得到度拉糖肽0.4g，收率为10％，纯度96％(采用凝胶色谱法检测，对比例1的检测结果见图2)。
以上结果说明，各实施例皆能够达到良好的纯化效果，效果显著优于对比例1，p<0.05。各实施例中，实施例1、3～5的方法纯化后，纯度可达99％，显著的优于其他实施例，p<0.05。在纯度可达99％的实施例中，实施例1、3、5的收率显著性的优于实施例4，p<0.05。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (4)
1.度拉糖肽的纯化方法，其特征在于，包括：
破碎表达度拉糖肽的菌体，经过滤获得滤液；
以萃取剂萃取所述滤液，收集有机层；
所述有机层与水混合后，以反萃取剂萃取，收集水层；
所述水层经冻干获得度拉糖肽；
所述萃取剂为乙醇与正丁醇的组合物，其中乙醇与正丁醇的体积比为1：（1~2）；
所述反萃取剂为乙酸异丙酯与甲基叔丁醚的组合物，其中乙酸异丙酯与甲基叔丁醚的体积比为1:（1~3）。
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，所述滤液与萃取剂的体积比为1：（20~40）；
所述萃取剂与水的体积比为（4~8）:1.5；
所述反萃取剂与水的体积比为2:1。
3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，
对滤液萃取的条件为15℃~35℃，搅拌10~20min；
对有机层萃取的条件为10℃~15℃，3000g离心3~7min。
4.根据权利要求1~3任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述破碎包括：将菌体以水重悬后，加入磁珠以超声破碎。
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