CN103642794B - 一种大量制备BCG-CpG-DNA的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种利用Q Sepharose HP离子交换制备卡介菌CpG‑DNA的方法，将卡介菌培养繁殖后裂解，获得卡介菌裂解液，裂解液离心，从离心后的卡介菌裂解液中直接将多糖、蛋白和RNA等杂质除掉以获得纯化的卡介菌CpG‑DNA，该方法制得的卡介菌CpG‑DNA无有机溶剂残留。
Description
技术领域
本发明涉及从卡介菌提取的CpG-DNA(简称BCG-CpG-DNA)及其制备方法，BCG-CpG-DNA可用作治疗和预防用疫苗的佐剂。
背景技术
佐剂是疫苗中不可缺少的成分，在免疫佐剂方面，虽然铝佐剂的应用已有80年历史，其安全性也经过了长期应用的检验，但由于其对细胞免疫作用不明显，尤其对细胞免疫为主的疫苗，如对高纯化的第二代重组疫苗和第三代DNA疫苗，效果甚微，因此人们一直致力于新型佐剂的研究。
近年来，CpG-DNA成为新型免疫佐剂的研究热点。除了人工合成的CpG寡核苷酸(CpG ODN)之外，原核生物的DNA是CpG-DNA的主要来源。BCG-CpG-DNA是从卡介菌(BCG)中提取的菌体DNA片段，其富含未甲基化CpG基序，具有免疫刺激活性，可用作治疗和预防用疫苗中的佐剂。
原有工艺(专利ZL200410033878.1)在制备BCG-CpG-DNA的过程中使用有机溶剂酚、氯仿来除去多糖、蛋白等杂质，酚、氯仿均为有毒试剂，在制药生产中使用有潜在的危险。如果用于生产，不但有安全隐患，产品中有残留量需进行检测，也增加了质量控制检测项目。
发明内容
本发明对BCG-CpG-DNA原制备工艺进行了改进，采用离子交换纯化的方法，从BCG的菌体裂解液中直接将多糖、蛋白和RNA等杂质除掉，以纯化BCG的菌体DNA(BCG-CpG-DNA)，无有机溶剂残留，该方法尤其适合纯化大分子量的BCG-CpG-DNA片段。
本发明基本工艺为：菌体培养、菌体裂解、裂解液澄清、裂解液纯化、纯化液浓缩、浓缩液除菌分装。
本发明对BCG-CpG-DNA的分离纯化可通过如下的方法实现：
在获得卡介菌菌体裂解液之后，利用Q Sepharose HP离子交换柱从卡介菌裂解液分离卡介菌CpG-DNA。
卡介菌CpG-DNA裂解液的Q Sepharose HP离子交换柱分离可以在TE缓冲体系或磷酸钠缓冲体系中进行。
如果在磷酸钠缓冲体系中进行分离，卡介菌CpG-DNA裂解液样品可采用如下的上样缓冲液：0-0.5M氯化钠+50mM磷酸钠缓冲液，pH7.5-8.5，优选上样缓冲液为0.5M氯化钠+50mM磷酸钠缓冲液，pH7.5；如下的洗脱缓冲液：1M氯化钠+50mM磷酸钠缓冲液，pH7.5-8.5，优选洗脱缓冲液为1M氯化钠+50mM磷酸钠缓冲液，pH7.5。优选上样后的洗脱采用梯度洗脱，梯度洗脱的方法为先用50％-65％所述洗脱缓冲液洗脱，之后用100％所述洗脱缓冲液洗脱，根据样品洗脱峰后，电导和紫外检测稳定后就可以停止洗脱；进一步优选为先用50％-65％所述洗脱缓冲液洗脱用量2-7CV，之后用100％所述洗脱缓冲液洗脱用量2-7CV；更优选先用50％所述洗脱缓冲液洗脱用量7CV，之后用100％所述洗脱缓冲液洗脱用量2CV。
如果在TE缓冲体系中进行分离，卡介菌CpG-DNA裂解液样品可采用如下的上样缓冲液：0-0.5M NaCl+50mM Tris+1mM EDTA pH7.5-8.5，优选上样缓冲液为0.5M NaCl+50mMTris+1mM EDTA pH7.5；如下的洗脱缓冲液：1M NaCl+50mM Tris+1mM EDTA pH7.5-8.5，优选洗脱缓冲液为1M NaCl+50mM Tris+1mM EDTA pH7.5。优选上样后的洗脱采用梯度洗脱，梯度洗脱的方法为25-65％所述洗脱缓冲液洗脱，继续100％所述洗脱缓冲液洗脱，根据样品洗脱峰后，电导和紫外检测稳定后就可以停止洗脱；进一步优选为25％-65％所述洗脱缓冲液洗脱用量4-10CV，继续100％所述洗脱缓冲液洗脱用量2-10CV；更优选为30％所述洗脱缓冲液洗脱用量7CV，继续100％所述洗脱缓冲液洗脱用量2CV。
为了得到更好的分离纯化效果，在用Q Sepharose HP离子交换柱纯化前，卡介菌裂解液可以进一步进行澄清化处理。所述的澄清化处理可以是将破碎的菌体裂解液稀释到200mg／ml的浓度，高速冷冻离心机4℃、8000-12000rpm／min离心，10-20min×2次，收集上清，和／或经1.0-1.2μm的滤器过滤。破碎卡介菌菌体以获得菌体裂解液时所用的液体体系和稀释卡介菌裂解液时所用的液体体系，可以是去离子蒸馏水，也可以是合适的缓冲液，为了方便之后的分离纯化操作，优选使用的液体体系是分离纯化操作时所用的上样缓冲液或洗脱缓冲液。
进一步为了得到更好的分离纯化效果，在分离纯化时，上样的卡介菌CpG-DNA裂解液样品中可以含有0-0.5M NaCl，优选含有0.5M NaCl，为达到该目标，可以在菌体破碎裂解和稀释卡介菌菌体裂解液时使用相应的上样缓冲液。如果在菌体破碎裂解和稀释卡介菌菌体裂解液时使用的是去离子蒸馏水，则可以在上样时采用相应的洗脱液稀释上样样品，以达到上样CpG-DNA裂解液样品中含有0-0.5M NaCl的效果。
附图说明
图1A BCG裂解液的Sephaceyl400HR纯化图谱；
图1B BCG裂解液Sephaceyl400HR纯化后的电泳图谱；
图2A BCG裂解液的Sepharose4FF纯化图谱；
图2B BCG裂解液的Sepharose4FF纯化后的电泳图谱；
图2C BCG裂解液的Sepharose4FF纯化后的电泳图谱(续)；
图3A BCG裂解液的Q Sepharose FF纯化图谱；
图3B BCG裂解液的Q Sepharose FF纯化后的电泳图谱；
图4A BCG裂解液的Q Sepharose HP纯化图谱；
图4B BCG裂解液的Q Sepharose HP纯化后的电泳图谱；
图4C BCG裂解液的Q Sepharose HP纯化洗脱组分2的电泳图谱；
图5A BCG裂解液的20ml Q Sepharose HP纯化图谱，0-100％10CV；
图5B BCG裂解液的20ml Q Sepharose HP纯化的电泳图谱，0-100％10CV；
图6A BCG裂解液的20ml Q Sepharose HP纯化图谱，65％4CV100％7CV；
图6B BCG裂解液的20ml Q Sepharose HP纯化的电泳图谱，65％4CV100％7CV；
图7BCG裂解液的400ml Q Sepharose HP纯化的电泳图谱；
图8A洗脱缓冲液1：1M NaCl+50mM Tris+1mM EDTA pH7.5的洗脱图谱：
图8B洗脱缓冲液2：2M NaCl+50mM Tris+1mM EDTA pH7.5的洗脱图谱；
图9A缓冲液调成pH7.5纯化图谱；
图9B缓冲液调成pH8.0纯化图谱；
图9C缓冲液调成pH8.5纯化图谱；
图9D缓冲液调成pH9.0纯化图谱；
图9E缓冲液分别调成pH7.5、8.0、8.5、9.0纯化电泳检测图谱；
图10A BCG裂解液的4000ml Q Sepharose HP纯化图谱，菌体量724g；
图10B BCG裂解液的4000ml Q Sepharose HP纯化图谱，菌体量529g；
图10C BCG裂解液的4000ml Q Sepharose HP纯化图谱，菌体量1382g；
图11 A液稀释样品、线性梯度上升B液浓度洗脱纯化效果电泳图，其中泳道1，11：1kb DNA ladder Marker；2：上样样品过滤前；3：上样样品过滤后；4：流穿峰；5：洗脱峰1；6：洗脱峰2；7：洗脱峰3；8：洗脱峰4；9：洗脱峰5；10：洗脱峰6；
图12A样品B液稀释1倍、线性梯度上升B液浓度洗脱核酸纯化图谱；
图12B样品B液稀释1倍、线性梯度上升B液浓度洗脱核酸纯化后电泳图，其中泳道1，7：1kb DNA ladder Marker；2：上样样品过滤膜前；3：上样样品过滤膜后；4：流穿峰；5：洗脱峰1；6：洗脱峰2；
图12C样品B液稀释1倍、线性梯度上升B液浓度洗脱核酸纯化后CRnase处理电泳图，其中泳道1，8：1000bp DNA Marker；2：上样样品；3：RNase A处理过的上样样品；4：洗脱峰1；5：RNase A处理过的洗脱峰1；6：洗脱峰2；7：RNase A处理过的洗脱峰2；
图13A线性梯度上升B液浓度洗脱核酸的优化纯化图谱；
图13B线性梯度上升B液浓度洗脱核酸的优化后电泳图，其中，泳道1：上样样品；2：洗脱峰2；3：洗脱峰3；4：洗脱峰4；5：1kb DNA ladder Marker；
图14A磷酸钠缓冲体系纯化BCG-CpG-DNA最优条件的纯化图谱；
图14B磷酸钠缓冲体系纯化BCG-CpG-DNA最优条件的纯化电泳图，其中，泳道1：1kbDNA ladder Marker；2：上样样品；3：50％洗脱收集液1；4：50％洗脱收集液2；5：50％洗脱收集液3；6：50％洗脱收集液4；7：100％洗脱收集液；
图15 TE缓冲体系纯化BCG-CpG-DNA的纯化图谱。
具体实施方式
以下通过具体实施例和试验结果详细介绍本发明的创新和应用意义所在，以帮助阅读者更好地理解本发明的精神和实质，但不构成对本发明实施范围的限定。
BCG-CpG-DNA的制备
步骤一、菌体培养：
将卡介菌菌种接种于马铃薯苏通培养基。37℃培养15天后转种于改良的液体苏通培养基，37℃下培养14-20天；
其中，马铃薯苏通培养基的制备方法可以是：
取洗净新鲜土豆(1个)，用穿刺器穿成圆柱，再用刀切成4公分长斜面；
用流动饮用水冲洗土豆斜面1小时；
用纯化水冲洗土豆斜面块；
用苏通培养基冲洗斜面块；
取苏通培养基20ml，加入100ml灭菌大管中；
将冲洗后的土豆斜面放入装有苏通培养基的灭菌大管中；
10磅20分钟灭菌。
改良的液体苏通培养基配方及制备：
天冬素(AR)：4g
柠檬酸(AR)：2g
K2HPO4·3H2O(AR)：0.5g
MgSO4·7H2O(AR)：0.5g
柠檬酸铁铵(CP)：0.05g
甘油(药用)：60ml
蒸馏水：940ml
以NH3·H2O调节pH7.2-7.4之间，
然后加1％(W／V)硫酸锌1ml，10磅20分钟灭菌。
步骤二、菌体收集：
待菌体生长至对数期时，对培养瓶逐瓶检查后，收集菌膜，加入适量去离子蒸馏水洗涤，压干后称重。
步骤三、菌体裂解：
将收集的菌体以去离子蒸馏水或BCG-CpG-DNA离子交换分离用的上样缓冲液按1g／ml混匀，以组织捣碎匀浆机获得菌体裂解液。
步骤四、裂解液澄清：
将破碎的菌体裂解液以去离子蒸馏水或BCG-CpG-DNA离子交换分离用的上样缓冲液稀释到200mg／ml的浓度，高速冷冻离心机4℃、8000-12000rpm／min离心，10-20min×2次，收集上清。上柱前可以再经1.0-1.2μm的滤器过滤。
步骤五、澄清裂解液纯化：
A、纯化柱填料的选择
(一)凝胶过滤
1、凝胶过滤填料：Sephaceyl400HR：分离范围2×104-8×106
空色谱柱：XK16／100(GE产品)
柱床体积：180ml，
柱床高度：90cm
缓冲液：0.01M PBS
流速：1.5ml／min
上样：2ml BCG裂解液
BCG裂解液的纯化图谱见图1A；将各收集产物进行电泳分析，结果见图1B(电泳条件：0.8％凝胶电泳，150V，45min)；电泳结果表明Sephaceyl400HR填料不能将BCG-CpG-DNA有效分离。
2、凝胶过滤填料：Sepharose4FF：分离范围6×104-20×107
色谱柱：XK16／100(GE产品)
柱床体积：180ml，
柱床高度：90cm
缓冲液：2M(NH4)2SO4+10mMEDTA+100mMTris HCl pH7.0
流速：1.5ml／min
上样：2ml BCG裂解液
回收：6mg／150柱体积
BCG裂解液的纯化图谱见图2A；将各收集产物进行电泳分析，结果见图2B、图2C(电泳条件：0.8％凝胶电泳，150V，45min)；电泳结果表明Sepharose4FF填料不能将BCG-CpG-DNA有效分离。
(二)离子交换
1、离子交换介质：Q Sepharose FF，1ml预装柱(GE产品)。
纯化条件
缓冲液：A液：50mM Tris+1mM EDTA pH8.0
B液：1M NaCl+50mM Tris+1mM EDTA pH8.0
样品：1.07mg／ml BCG裂解液
上样量：1ml
BCG裂解液纯化图谱见图3A，根据吸光图谱收集样品，结果显示分别在B液浓度25％、60％、70％有样品洗脱下来，样品做水平核酸电泳，结果见图3B(电泳条件：0.8％凝胶电泳，电压150V，时间45分钟)；电泳结果显示DNA存在于流穿峰中，同时70％B液洗脱液中含有部分大分子量的BCG-CpG-DNA；纯化图谱和电泳结果显示流穿峰中BCG-CpG-DNA的量远超过70％洗脱峰中BCG-CpG-DNA的量，这说明大部分BCG-CpG-DNA流穿，BCG-CpG-DNA不能有效地结合在介质Q Sepharose FF上。
2、离子交换介质：Q Sepharose HP，1ml预装柱(GE产品)。
缓冲液：A液：50mM Tris+1mM EDTA pH8.0
B液：1M NaCl+50mM Tris+1mM EDTA pH8.0
样品：1.07mg／ml BCG裂解液；
上样量：1ml
BCG裂解液纯化图谱见图4A，根据吸光图谱收集样品，结果显示，共有三个洗脱峰，将各洗脱峰进行电泳分析，电泳图谱见图4B(电泳条件：0.8％凝胶电泳，150V，45min)；电泳结果显示，流穿中有少量核酸，洗脱峰1无BCG-CpG-DNA，洗脱峰2为小分子量核酸，洗脱峰3为BCG-CpG-DNA。将洗脱峰2加入RNase37℃处理0.5h与原样一起进行电泳分析，电泳图谱见图4C(电泳条件：3％凝胶电泳)，结果显示加酶处理过的样品无条带显示，表明洗脱峰2为RNA。纯化图谱和电泳结果表明Q Sepharose HP填料能将DNA与RNA分离，因此选用QSepharose HP填料。
纯化填料实验结果：选择Q Sepharose HP填料，Q Sepharose HP能将RNA同目的物DNA区别开来，同时Q Sepharose HP填料颗粒小，分辨率高，线性放大能力较好。
B、纯化填料放大、梯度选择实验
(一)Q Sepharose HP，填料体积20ml，色谱柱：XK16／20.
上样量：12.5ml BCG裂解液
上样缓冲液：50mM Tris+1mM EDTA pH8.0
洗脱缓冲液：1M NaCl+50mM Tris+1mM EDTA pH8.0
梯度0-100％10CV
上样流速：1ml／min
洗脱流速：5ml／min
BCG裂解液的纯化图谱图5A；将各收集峰进行电泳分析，电泳图谱见图5B(电泳条件：0.8％凝胶电泳，电压150V，时间45分钟)，结果显示，流穿峰中无目的DNA，洗脱峰2、3中有少量DNA，但体积少，8为RNA，9为目的DNA；纯化图谱显示B液60-70％可以将目的DNA与其他杂质分离，因此选择65％和100％两个梯度进行洗脱实验。
(二)Q Sepharose HP，填料体积20ml，色谱柱：XK16／20.
上样量：12.5ml BCG裂解液
上样缓冲液：50mM Tris+1mM EDTA pH8.0
洗脱缓冲液：1M NaCl+50mM Tris+1mM EDTA pH8.0
梯度65％4CV100％7CV
上样流速：1ml／min
洗脱流速：5ml／min
BCG裂解液的纯化图谱图6A；将各收集峰进行电泳分析，电泳图谱见图6B(电泳条件：0.8％凝胶电泳，150V，，45min)，结果显示，流穿峰中无目的DNA，65％洗脱为小分子量的RNA，100％洗脱峰中为目的DNA。
同时根据紫外分光检测的结果，如表1所示：100％洗脱峰共26ml，3倍稀释后A260=0.8969，则DNA的回收量为3.5mg／12.5mlBCG裂解液，该产率适合放大。
表1Q Sepharose HP纯化各峰组分含量检测
上述实验结果表明，使用Q Sepharose HP阴离子交换柱能较好的将目的DNA同多糖、蛋白及RNA分离。目前20ml的Q Sepharose HP介质每次可以纯化3.5-5mgDNA，将QSepharose HP介质体积放大，则DNA的产量将扩大。
C、TE缓冲体系纯化条件选择
(一)纯化缓冲液盐浓度的选择
1、上样缓冲液盐离子浓度的选择
Q Sepharose HP，填料体积400ml，色谱柱：XK50／30
样品：200ml
上样缓冲液1：50mM Tris+1mM EDTA pH8.5
上样缓冲液2：0.5M NaCl+50mM Tris+1mM EDTA pH8.5
洗脱缓冲液：1M NaCl+50mM Tris+1mM EDTA pH8.5
梯度洗脱：上样缓冲液1，65％、100％
梯度洗脱：上样缓冲液2，30％、100％
纯化产物检测结果如表2所示；将各收集峰进行电泳分析，电泳图谱见图7，电泳结果表明：(1)两种不同盐浓度的上样缓冲液纯化样品，上样缓冲液1上样，流穿较少，大量的色素吸附，上样后进行洗脱，目的洗脱峰有些许乳光现象，紫外吸收扫描图谱260／230、260／280均低于上样缓冲液2的相应结果；(2)上样缓冲液2含0.5M盐离子，减少了色素的吸附，基本流穿，对介质有益，且其检测指标也优于上样缓冲液1。因此，上样缓冲液选择含0.5M盐离子的缓冲液比较合适。
表2纯化产物检测
2、洗脱缓冲液盐浓度选择
由2种不同盐离子浓度的洗脱缓冲液进行样品纯化，
上样缓冲液：0.5M NaCl+50mM Tris+1mM EDTA pH7.5
洗脱缓冲液1：1M NaCl+50mM Tris+1mM EDTA pH7.5
洗脱缓冲液2：2M NaCl+50mM Tris+1mM EDTA pH7.5
线性洗脱：0-100％
纯化图谱见图8A、图8B，由纯化图谱图8A-B可见，洗脱缓冲液2不能将各洗脱峰有效的分开，因此选择洗脱缓冲液1，同时洗脱缓冲液2图谱也显示当洗脱缓冲液的盐浓度达到2M后，再无产物洗脱下来，也说明洗脱缓冲液的盐浓度达到1M就可将目的产物洗脱下来。
(二)纯化液pH的选择
上样缓冲液：0.5M NaCl+50mM Tris+1mM EDTA
洗脱缓冲液：1M NaCl+50mM Tris+1mM EDTA
线性洗脱：0-100％(XK16／20，填料13ml)
根据Tris盐缓冲范围，将缓冲液分别调成pH7.5、8.0、8.5、9.0进行纯化。结果见图谱图9A、图9B、图9C、图9D，由图谱9A-D可见，pH7.5、8.0、8.5条件分别能收集4个洗脱峰，pH9.0收集3个峰。分别将4个pH条件的流穿峰和各洗脱峰进行电泳实验，电泳图谱见图9E，电泳结果显示pH7.5、8.0、8.5能将DNA与RNA分开，pH9.0不能将二者分开，并且流穿中有产物。再分别将pH7.5、8.0、8.5条件的目的峰进行分光和蛋白含量检测，检测结果见表3，检测结果表明pH7.5、8.0、8.5的纯化结果相接近。将各洗脱峰间隔时间进行计算，最终选择pH7.5最为合适。
电泳图示：1：流穿峰，2：流穿峰，3：洗脱峰1，4：洗脱峰2，5：洗脱峰3，6：洗脱峰4。pH7.5、8.0和8.5图谱类似，无流穿，洗脱峰3、4分别为小分子量RNA和大分子量DNA，pH9.0有流穿，RNA和DNA分不开。
表3洗脱峰4各成分含量检测结果
D、TE缓冲体系放大实验
Q Sepharose HP，填料4000ml，色谱柱：BPG200／500
上样缓冲液：0.5M NaCl+50mM Tris+1mM EDTA pH7.5
洗脱缓冲液：1M NaCl+50mM Tris+1mM EDTA pH7.5
梯度：30％4CV，100％2CV
上样流速：250ml／min
洗脱流速：300ml／min
纯化图谱见图10A、10B、10C，由三次实验结果得知，100％洗脱物中DNA量分别为620mg、396mg、2041mg、DNA纯度指标A260／280的比值均大于1.8，100％洗脱液中未测出蛋白及多糖残留，说明样品的纯度较高。由第三次结果可见，菌体量达到1382g，4000ml填料一次可得DNA初产物2.0g左右。
表4三次放大实验后的检测结果分析表
| 1 | 2 | 3 | |
| 菌体量g | 724 | 529 | 1382 |
| 目的洗脱峰ml | 2000 | 1700 | 4050 |
| DNAug/ml | 310 | 233 | 504 |
| A260/280 | 1.90 | 1.88 | 1.93 |
| DNA量(mg) | 620 | 396 | 2041 |
| 蛋白残量 | 未测出 | 未测出 | 未测出 |
| 多糖残量 | 未测出 | 未测出 | 未测出 |
| 产率mg/g菌 | 0.856 | 0.749 | 1.47 |
E、磷酸钠缓冲体系纯化BCG-CpG-DNA
实验材料：
原料：BCG裂解液(200mg/ml)；
仪器：AKTA(厂家：GE公司；型号：G100)，pH计，搅拌机，分光光度计，核酸电泳仪；
材料：离子交换填料：Q sepharose High performance(Q.H户)(GE公司)，柱子：XK16/20、柱高：6cm、柱体积：20ml，0.22um滤膜、1.2um滤器(直径30mm)；
试剂：磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，氯化钠，盐酸，纯化水。
(一)A液稀释样品、线性梯度上升B液浓度洗脱核酸
1、纯化液体
A液：50mM磷酸钠缓冲液，pH7.5
B液：50mM磷酸钠缓冲液，1M氯化钠pH7.5
2、样品：
以上样缓冲液A液稀释样品，样品溶液中不含氯化钠。
3、纯化步骤
上样体积：17ml；
上样速度：2ml/min；
洗脱速度：2ml/min；
线性洗脱：0-100％B液，60min
收集流穿峰及每个洗脱峰。
4、结果与分析
该纯化条件共有一个流穿峰，6个洗脱峰。分别收集样品进行琼脂糖凝胶电泳，以上样前处理的样品作为对照。琼脂糖凝胶电泳条件：1％琼脂糖凝胶，稳压100V，30min。结果见图11。结果可见，流穿峰中存在大量的目的DNA，洗脱峰1中含少量的目的DNA，洗脱峰2、3、4中无核酸样品，洗脱峰5为小分子量核酸，洗脱峰6中含大量的目的DNA。
5、小结：
上样体积已经超过此柱子的载量，所以流穿峰有很多大片段的核酸片段，从洗脱峰6可以看出，BCG-CpG-DNA在磷酸系统中可以结合到QHP介质中，并且可以用高盐洗脱下来。5-8的洗脱峰中含有的DNA非常少，而且紫外260比较小，而280，尤其是230比较大，说明这些洗脱峰大部分应该是杂蛋白和多糖类物质。从纯化图谱初步了解，B溶液浓度在50％左右的时候会洗脱掉大部分的杂质，而在70％会洗脱下目的核酸，因此，下一步实验可以尝试在上样样品中加入0.5M氯化钠，使大部分杂质结合不到QHP柱上。
(2)上样样品用B液稀释1倍、线性梯度上升B液浓度洗脱核酸
1、纯化液体
A液：50mM磷酸钠缓冲液，pH7.5
B液：50mM磷酸钠缓冲液，1M氯化钠pH7.5
2、样品处理：
处理好的原料，用B液稀释1倍(相当于上样样品中加入了0.5M氯化钠，此处采用这种方式简便实用，如采用A液稀释1倍，稀释完毕后还要进行计算加入固体的氯化钠的量，以使上样样品中含有0.5M氯化钠，比较繁琐和麻烦)，过1.2um滤膜。
3、纯化步骤
上样体积：11.53ml；
上样速度：2ml／min；
洗脱速度：2ml／min；
线性洗脱：0-100％B液，60min
收集流穿峰及每个洗脱峰。
4、结果与分析
该纯化条件共一个流穿峰，2个洗脱峰，见图12A纯化图谱。将收集的样品进行琼脂糖凝胶电泳，以上样前处理的样品作为对照。琼脂糖凝胶电泳：1％琼脂糖凝胶，稳压100V，30min。结果见图12B。由图12B结果可见，流穿峰无目的核酸，洗脱峰1为小分子量核酸，洗脱峰2为大分子量的目的DNA。为了了解洗脱峰1的小分子量核酸是否为RNA，将其进行Rnase处理，再以凝胶电泳了解情况，结果见图12C。RNA酶处理洗脱样品，以确定是否去除RNA的方法：取样品10ul，加入1ul RNase A(5mg／ml)，终浓度是0.5mg／ml，37℃水浴1h。由图12C结果可见洗脱峰1经Rnase处理，含量显著性减少，表明其主要成分为RNA。洗脱峰2经Rnase处理后，其小分子量的核酸减少，说明其中含有少量的RNA。
5、小结：从以上结果知道，载量不过的情况下，BCG-CpG-DNA在磷酸钠缓冲体系中，可以很好地结合在QHP，上样样品中含有0.5M氯化钠，在流穿时，可以去除大部分的杂蛋白和多糖。洗脱峰1中含有的DNA片段比较小，洗脱峰2中含有大量的大片段DNA，分子量集中在5kb-10kb左右。用RNA酶处理样品，洗脱峰1和2后，可以看出，洗脱峰1中含有大量的RNA，而2中也含有少量的RNA。下一步实验，优化纯化条件，使RNA、小片段DNA与大片段DNA分离开来。
(三)线性梯度上升B液浓度洗脱核酸的优化
1、纯化液体：
A液：50mM磷酸钠缓冲液，pH7.5
B液：50mM磷酸钠缓冲液，1M氯化钠pH7.5
2、样品处理：
处理好的原料，用B液稀释1倍，过1.2um滤膜
3、纯化步骤：
上样体积：8.4ml；
上样速度：2ml／min；
洗脱速度：2ml／min；
梯度洗脱：40％B液2CV，45％B液2CV，50％B液2CV，100％B液2CV；
收集每个洗脱峰。
4、结果与分析：
优化洗脱条件的纯化图谱见图13A，图中依据洗脱的梯度有4个洗脱峰。将收集的样品洗脱峰2-4进行琼脂糖凝胶电泳，以上样样品作为对照。琼脂糖凝胶电泳：1％琼脂糖凝胶，稳压100V，30min。结果见图13B。
5、小结：结果表明，40-50％B液洗脱可以使RNA和小片段DNA分离出来，纯化图中洗脱峰3的OD260说明，50％B液洗脱后，所剩的RNA和DNA已经比较少，所以基本上可以确定纯化的步骤为先50％B液洗脱，接着直接用100％B液洗脱。
(四)磷酸钠缓冲体系纯化BCG-CpG-DNA最终条件
1、纯化液体
A液：50mM磷酸钠缓冲液，pH7.5
B液：50mM磷酸钠缓冲液，1M氯化钠pH7.5
2、样品处理：
处理好的原料，用B液稀释1倍，过1.2um滤膜
3、纯化步骤
上样体积：10.08ml；
上样速度：2ml／min；
洗脱速度：2ml／min；
梯度洗脱：50％B液7CV，100％B液2CV；
收集每个洗脱峰。
4、结果与分析
磷酸钠缓冲体系纯化BCG-CpG-DNA最优条件的纯化图谱见图14A，图中共收集5个洗脱峰。将收集的样品洗脱峰1-5进行琼脂糖凝胶电泳，以上样样品作为对照。琼脂糖凝胶电泳：1％琼脂糖凝胶，稳压100V，30min。结果见图14B。各洗脱峰的紫外吸光度值参数检测结果见表5。其中，100％洗脱峰的OD260／280值=1.88，核酸浓度=1.0294＊50＊5=257.35ug／ml，收集的体积为21ml。
表5各洗脱峰紫外吸光度值A260,280,230nm的测定
5、小结：实验结果确认，用50％B液洗脱，可以洗脱大部分的RNA和小片段DNA，从纯化图中可以看出，在体积100ml到120ml(2CV)的时候，没有其他的洗脱峰出来，说明这个洗脱浓度没有问题。而且测定的OD260／280>1.8，说明样品纯度已经符合要求。
F、磷酸钠和TE缓冲体系纯化BCG-CpG-DNA效果的比较
(一)TE缓冲体系
1、纯化液体
A液：50mM Tris，1mM EDTA，0.5M氯化钠，pH7.5
B液：50mM Tris，1mM EDTA，1M氯化钠，pH7.5
2、样品处理：
处理好的原料，用B液稀释1倍，过1.2um滤膜
3、纯化步骤
上样体积：10.58ml；
上样速度：2ml／min；
洗脱速度：2ml／min；
梯度洗脱步骤：30％B液7CV，，100％B液2CV；
收集每个洗脱峰。
4、结果与分析
TE缓冲体系纯化BCG-CpG-DNA的纯化图谱见图15。100％B液洗脱峰的紫外吸光度值参数检测结果见表6。其中，100％洗脱峰的OD260／280值=1.95，核酸浓度=1.5683＊50＊5=392.075ug／ml。
表6各洗脱峰紫外吸光度值A260,280,230nm的测定
(二)TE缓冲体系与PB(磷酸钠)缓冲体系纯化结果比较
PB缓冲体系的结果来源于来自上述的E部分的实验(四)、TE缓冲体系结果来自本部分的(一)，比较结果见下表7，由此可以得到如下结论。
(1)、Tris缓冲体系DNA收率高于PB缓冲体系：Tris缓冲体系DNA收率为7.23mg每g菌，PB缓冲体系DNA收率为5.36mg每g菌。
(2)Tris缓冲体系DNA纯度高于PB缓冲体系：代表多糖残留的指标A260／230，Tris缓冲体系为2.26，高于PB缓冲体系的2.15；代表蛋白残留的指标A260／280，Tris缓冲体系为1.95，高于PB缓冲体系的1.88。
综合考虑，BCG-CpG-DNA纯化体系采用Tris缓冲体系效果更佳。
表7两种缓冲体系纯化效果的比较指标
Claims (14)
1.一种制备卡介菌CpG-DNA的方法，其包括：利用Q Sepharose HP离子交换柱从卡介菌裂解液分离卡介菌CpG-DNA，其中卡介菌CpG-DNA裂解液的离子交换柱分离可以在TE缓冲体系或磷酸钠缓冲体系中进行。
2.如权利要求1所述的制备卡介菌CpG-DNA的方法，其中卡介菌CpG-DNA裂解液的离子交换柱分离在磷酸钠缓冲体系中进行时，洗脱缓冲液为1M氯化钠+50mM磷酸钠缓冲液，pH7.5-8.5。
3.如权利要求2所述的制备卡介菌CpG-DNA的方法，其中所述洗脱缓冲液为pH7.5。
4.如权利要求2或3所述的制备卡介菌CpG-DNA的方法，上样时使用上样缓冲液，上样缓冲液为0-0.5M氯化钠+50mM磷酸钠缓冲液，pH7.5-8.5。
5.如权利要求4所述的制备卡介菌CpG-DNA的方法，所述上样缓冲液为0.5M氯化钠+50mM磷酸钠缓冲液，pH7.5。
6.如权利要求2、3或5所述的制备卡介菌CpG-DNA的方法，其中上样后的洗脱采用梯度洗脱，梯度洗脱的方法为50％-65％所述洗脱缓冲液洗脱，继续100％所述洗脱缓冲液洗脱。
7.如权利要求4所述的制备卡介菌CpG-DNA的方法，其中上样后的洗脱采用梯度洗脱，梯度洗脱的方法为50％-65％所述洗脱缓冲液洗脱，继续100％所述洗脱缓冲液洗脱。
8.如权利要求1所述的制备卡介菌CpG-DNA的方法，其中卡介菌CpG-DNA裂解液的离子交换柱分离在TE缓冲体系中进行时，洗脱缓冲液为1M NaCl+50mM Tris+1mM EDTA pH7.5-8.5。
9.如权利要求8所述的制备卡介菌CpG-DNA的方法，其中所述洗脱缓冲液为pH7.5。
10.如权利要求8或9所述的制备卡介菌CpG-DNA的方法，上样时使用如下的上样缓冲液，上样缓冲液为0-0.5MNaCl+50mM Tris+1mM EDTA pH7.5-8.5。
11.如权利要求10所述的制备卡介菌CpG-DNA的方法，所述上样缓冲液为0.5M NaCl+50mM Tris+1mM EDTA pH7.5。
12.如权利要求8所述的制备卡介菌CpG-DNA的方法，其中上样后的洗脱采用梯度洗脱，梯度洗脱的方法为25-65％所述洗脱缓冲液洗脱，继续100％所述洗脱缓冲液洗脱。
13.如权利要求1、2、3、5、7-9、12任一项所述的制备卡介菌CpG-DNA的方法，其中卡介菌裂解液在Q Sepharose HP离子交换柱分离纯化前进一步进行了澄清化处理。
14.如权利要求13所述的制备卡介菌CpG-DNA的方法，其中所述的卡介菌裂解液澄清化处理方法是将破碎的菌体裂解液稀释到200mg/ml的浓度，高速冷冻离心机4℃、8000-12000rpm/min离心，10-20min×2次，收集上清，和/或经1.0-1.2μm的滤器过滤。
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