RU2467783C2 - Способ хроматографического выделения иммуноглобулина - Google Patents
Способ хроматографического выделения иммуноглобулина Download PDFInfo
- Publication number
- RU2467783C2 RU2467783C2 RU2010132114/05A RU2010132114A RU2467783C2 RU 2467783 C2 RU2467783 C2 RU 2467783C2 RU 2010132114/05 A RU2010132114/05 A RU 2010132114/05A RU 2010132114 A RU2010132114 A RU 2010132114A RU 2467783 C2 RU2467783 C2 RU 2467783C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- immunoglobulin
- exchange resin
- buffer solution
- solution
- sorbent
- Prior art date
Links
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 title claims abstract description 52
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 title claims abstract description 52
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 41
- 238000000605 extraction Methods 0.000 title abstract 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 48
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims abstract description 35
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 26
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims abstract description 24
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 17
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims abstract description 15
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims abstract description 10
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims abstract description 7
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 18
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 claims description 17
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 16
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 claims description 15
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 claims description 15
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 claims description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 15
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 12
- -1 diethylaminoethyl groups Chemical group 0.000 claims description 10
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 claims description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 9
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 9
- STCOOQWBFONSKY-UHFFFAOYSA-N tributyl phosphate Chemical compound CCCCOP(=O)(OCCCC)OCCCC STCOOQWBFONSKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.C=CC1=CC=CC=C1C=C CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 5
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 5
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 4
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N acrylic acid group Chemical group C(C=C)(=O)O NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 3
- 238000007445 Chromatographic isolation Methods 0.000 claims description 2
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 238000000665 Cohn process Methods 0.000 abstract 2
- 108010058237 plasma protein fraction Proteins 0.000 abstract 2
- 229940081857 plasma protein fraction Drugs 0.000 abstract 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 abstract 1
- 239000013058 crude material Substances 0.000 abstract 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 abstract 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 10
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 10
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 8
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 description 3
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 3
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 3
- BYKRNSHANADUFY-UHFFFAOYSA-M sodium octanoate Chemical compound [Na+].CCCCCCCC([O-])=O BYKRNSHANADUFY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 2
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 210000002196 fr. b Anatomy 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004436 sodium atom Chemical group 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области жидкостной хроматографии. Предложен способ хроматографического выделения иммуноглобулина, включающий растворение в буферном растворе белковой фракции плазмы крови, в качестве которой используют осадок А спиртового фракционирования плазмы крови по Кону. Производят предварительную очистку полученного раствора в двух последовательно соединенных колонках, заполненных гидрофобным сорбентом и анионитом, соответственно, с последующим пропусканием через упомянутые две колонки буферного раствора. После сбора предварительно очищенной жидкой фракции, содержащей иммуноглобулин, ее направляют на вирусную сольвент-детергентную инактивацию, а затем на хроматографическую очистку, осуществляемую в системе из трех последовательно соединенных колонок, заполненных анионитом, гидрофобным сорбентом и катионитом, соответственно. Проводят элюирование иммуноглобулина с колонки, заполненной катионитом, а колонки с анионитом и гидрофобным сорбентом направляют на регенерацию. Изобретение обеспечивает возможность выделения иммуноглобулина из необогащенного сырья - осадка А, полученного спиртовым фракционированием плазмы крови по Кону, с высоким выходом и чистотой целевого продукта. 7 з.п. ф-лы, 2 пр.
Description
Изобретение относится к области выделения и очистки веществ методами хроматографии и может быть использовано для получения высокоочищенного иммуноглобулина.
Для разделения смеси белков используют различные физико-химические и химические методы. Общепринятым способом фракционирования белков плазмы крови человека является метод Кона, предусматривающий использование этанола при низкой температуре от -3 до -5°С. В этих условиях белки сохраняют свои нативные свойства. Для дальнейшего выделения и очистки индивидуальных компонентов из полученных фракций наибольшее распространение в последнее время получил метод хроматографии.
Известен способ очистки иммуноглобулина, содержащегося в белковой фракции плазмы крови, включающий ее растворение в буферном растворе, вирусную сольвент-детергентную инактивацию при комнатной температуре и хроматографическую очистку, при которой надосадочная жидкость, содержащая IgG, подвергается, по меньшей мере, одной операции обработки, например, в два этапа, но при необходимости и нескольким этапам анионообменной и катионообменной хроматографии для удаления значительной доли оставшихся загрязняющих примесей. В предпочтительном варианте осуществления изобретения осветленная и, при необходимости, профильтрованная надосадочная жидкость, содержащая IgG, наносится на анионообменную смолу и затем на катионообменную смолу, которыми заполнены две последовательно установленные колонки, уравновешенные одним и тем же буферным раствором. После промывки колонку с анионитом отключают, а колонку с катионитом, на которой сорбирован иммуноглобулин, элюируют буферным раствором с рН и концентрацией, достаточными для эффективного выделения целевого продукта в градиенте хлорида натрия. Элюированную фракцию с IgG концентрируют и обессоливают с помощью ультрафильтрации и обрабатывают Tween-80 и трибутилфосфатом для разрушения вирусов. Полученный раствор снова пропускают через две последовательно соединенные колонки с анионитом и катеонитом аналогично описанному выше. Колонку с анионитом отсоединяют и элюируют фракцию с IgG в градиенте хлорида натрия. Элюированную фракцию с IgG собирают в мальтозе и подвергают концентрированию (RU 2197500, 27.01.2003).
Недостатками способа являются его сложность, многостадийность и низкий выход целевого продукта (менее 73%). При этом в качестве сырья может быть использована только предварительно очищенная фракция, т.е. осадок В по методу Кона, содержащая около 30% иммуноглобулинов.
Известен способ получения иммуноглобулина, включающий фракционирование этиловым спиртом донорской плазмы с получением осадка В по Кону и очистку выделенного иммуноглобулина, при этом осадок В растворяют в 0,9%-ном растворе натрия хлорида при рН 5,15 и смешивают с 2 М ацетатным буферным раствором и 53%-ным этиловым спиртом, центрифугируют, центрифугат смешивают с гидрокарбонатом натрия при рН раствора 5,5, после центрифугирования центрифугат осветляют, смешивают с ацетатным буферным раствором при рН 5,4, 96%-ным (об./об.) этиловым спиртом и бикарбонатом натрия при рН 7,2, центрифугируют при минус (10-12)°С, выделенный осадок растворяют в 0,05 М ацетатном буферном растворе с рН 5,5, добавляют к нему сольвент-детергентную смесь, содержащую 0,05 М ацетатный буферный раствор при рН 5,5, 1 мас.% три-н-бутилфосфата и 1 мас.% полисорбата 80, смесь перемешивают, затем разбавляют 0,05 М ацетатным буферным раствором при рН 5,5, содержащим 1 мас.% октаноата натрия, 0,15 М хлорида натрия и пропиленгликоль в концентрации 0,2 г/л, обработанный таким образом иммуноглобулин иммобилизируют и промывают в две стадии на сульфопропилкатионитном сорбенте с помощью колоночной хроматографии с последующей элюцией, ультрафильтрацией и стерилизующей фильтрацией (RU 2372939, 20.11.2009).
Известен также способ инактивации вирусов при получении иммуноглобулина фракции G, который включает очистку раствора иммуноглобулина, выделенного спиртовым фракционированием по методу Кона, обработку сольвент-детергентной смесью, в качестве которой используют 0,05 М ацетатный буферный раствор при рН 5,5, содержащий 1 мас.% три-н-бутилфосфата и 1 мас.% полисорбата 80 при перемешивании, с последующим разбавлением 0,05 М ацетатным буферным раствором при рН 5,5, содержащим 1 мас.% октаноата натрия, 0,15 М хлорида натрия и пропиленгликоль в концентрации 0,2 г/л, после чего иммуноглобулин иммобилизируют на сульфопропилкатионитном сорбенте и осуществляют промывание в две стадии с помощью колоночной хроматографии с последующей элюцией, причем на первой стадии промывания используют 0,05 М ацетатный буферный раствор при рН 5,5, содержащий 1 мас.% октаноата натрия, 0,15 М хлорида натрия и пропиленгликоль в концентрации 0,2 г/л (RU 2372939, 20.11.2009).
Однако вышеописанные способы не позволяют осуществить экономичную и эффективную очистку иммуноглобулина из необогащенной фракции - осадка А (по Кону) при обеспечении высокого выхода целевого продукта.
Наиболее близким по технической сущности и достигнутому результату является способ выделения и очистки иммуноглобулина, содержащегося в белковой фракции плазмы крови, включающий ее растворение в буферном растворе, вирусную сольвент-детергентную инактивацию и хроматографическую очистку, осуществляемую путем пропускания раствора через систему из трех последовательно соединенных колонок, заполненных анионитом, гидрофобным сорбентом и катионитом, соответственно, с промывкой системы колонок, элюированием иммуноглобулина с катионита буферным раствором, и направлением на регенерацию анионита и гидрофобного сорбента. Способ обеспечивает достижение высокого выхода и высокой чистоты иммуноглобулина, свободного от вирусов при использовании в качестве исходного сырья обогащенной фракции осадка В, содержащей примерно 30% иммуноглобулина (RU 2332247, 01.07.2007).
Однако способ, выбранный за прототип, не позволяет получить высокоочищенный иммуноглобулин из осадка А (по Кону), содержащего значительные количества других белковых примесей, примеси липидов и лишь около 10% иммуноглобулина. Если же предварительно осадок А перевести в осадок В осаждением органическими растворителями и центрифугированием, то эти операции приведут к 30%-ной потере иммуноглобулина. Например, из 170 л плазмы при фракционировании обычно получают около 9 кг осадка А с содержанием иммуноглобулина 1,4-1,5 кг, из этого количества получают около 3,5 кг осадка В с содержанием иммуноглобулина 1,0-1,1 кг, что соответствует выходу 72-73%. Стадия хроматографии обеспечивает выход на уровне 90%. Таким образом, общий выход иммуноглобулина из осадка А с использование способа-прототипа составит только около 65%.
Задачей настоящего изобретения является разработка высокопроизводительного способа хроматографического выделения высокочистого иммуноглобулина из бедного исходного сырья, каким является, в частности, осадок А, получаемый при фракционировании белков плазмы крови по методу Кона.
Поставленная задача решается описываемым способом хроматографического выделения иммуноглобулина, который предусматривает растворение в буферном растворе белковой фракции плазмы крови, в качестве которой используют осадок А спиртового фракционирования плазмы крови по Кону, осуществление предварительной очистки раствора в двух последовательно соединенных колонках, заполненных гидрофобным сорбентом и анионитом, соответственно, с последующим пропусканием через упомянутые две колонки буферного раствора и сбором предварительно очищенной жидкой фракции, которую затем направляют на вирусную сольвент-детергентную инактивацию и хроматографическую очистку путем пропускания через систему из трех последовательно соединенных колонок, заполненных анионитом, гидрофобным сорбентом и катионитом, соответственно, после чего проводят промывку системы колонок, элюирование иммуноглобулина с катионита буферным раствором, имеющим рН и концентрацию, достаточные для его эффективного выделения, и направление на регенерацию анионита и гидрофобного сорбента.
Предпочтительно, в качестве осадка А используют необогащенную фракцию, содержащую около 10% иммуноглобулина, посторонние белки и липиды.
Предпочтительно, в качестве анионита используют полимерный акриловый сорбент с диэтиламиноэтильными группами, в качестве катионита используют полимерный акриловый сорбент с сульфопропильными группами, а в качестве гидрофобного сорбента используют пористый стиролдивинилбензол с размером пор менее 10 нм.
Вирусную сольвент-детергентную инактивацию, преимущественно, осуществляют в растворе, содержащем твин-80 и трибутилфосфат.
В заявленном способе, преимущественно, используют натрий-ацетатный буферный раствор, при этом все колонки предварительно уравновешены этим раствором.
Предпочтительно, перед элюированием катионит промывают вначале раствором, содержащим 2% твин-80, затем раствором, содержащий 1% твин-80 и 20% этанола, а затем буферным раствором.
Возможно, элюирование иммуноглобулина с катеонита проводить натрий-ацетатным буферным раствором, имеющим рН 5,65 и концентрацию 0,35 М.
Возможно также, элюирование иммуноглобулина с катеонита проводить натрий-ацетатным буферным раствором, имеющим рН 6,0, концентрацию 50 мМ и содержащим 300 мМ хлористого натрия.
Ниже приведены конкретные примеры осуществления изобретения.
Пример 1.
9,2 г осадка А растворяют в 250 мл буфера А (0,02 М натрий-ацетатный буфер, рН 5,65) при перемешивании в течение ночи при температуре +5°С, затем в течение 4 ч при комнатной температуре.
Полученный раствор пропускают последовательно через две соединенные хроматографические колонны: первую - объемом 50 мл (2,5×10,2 мм), заполненную гидрофобным сорбентом на основе стиролдивинилбензола с размером частиц 100-250 мкм, и вторую - объемом 35 мл (2,5×7,1 см), заполненную ДЕАЕ-сорбентом на основе акрилового полимера с диэтиламиноэтильными группами с размером частиц 100-250 мкм. Колонны предварительно уравновешены буфером А. Скорость потока 2 мл/мин. Вслед за раствором иммуноглобулина пропускают буфер А до снижения оптической плотности до уровня базовой линии.
На гидрофобном и ДЕАЕ сорбентах сорбируются пирогены, альбумин, гидрофобные белки, липидная фракция и белковые агрегаты.
Объем предварительно очищенной фракции составляет 450 мл.
К 450 мл полученного раствора иммуноглобулина добавляют твин-80 и трибутилфосфат до концентрации 1% каждого и инкубируют 6 ч при перемешивании при комнатной температуре.
Подготовленный таким образом раствор иммуноглобулина пропускают последовательно через соединенные между собой три колонны. Первая - диаметром 2,5 и длиной 3,0 см - заполнена ДЕАЕ-полимерным сорбентом на основе акрилового полимера с диэтиламиноэтильными группами с размером частиц 100-250 мкм, вторая колонна диаметром 2,5 и длиной 3,0 см заполнена гидрофобным сорбентом на основе стиролдивинилбензола с размером частиц 100-250 мкм, третья колонна заполнена сульфокатионитом на основе акрилового полимера с размером частиц 100-250 мкм и имеет размеры: диаметр 2,5 см, длина 10 см. Все колонны предварительно уравновешены буфером А.
На первой колонне (анионит) происходит удаление пирогенов, ДНК-, РНК-примесей, белковых агрегатов.
На второй колонне (гидрофобный сорбент) происходит удаление пирогенов и связывание трибутилфосфата.
На третьей колонне (катионит) осуществляется сорбция иммуноглобулинов.
После окончания процесса сорбции для промывки через все колонны пропускают 100 мл буфера А. Затем колонки с анионитом и с гидрофобным сорбентом отключают и направляют на регенерацию. Колонку с катионитом промывают в три этапа: на первом этапе пропускают раствор, содержащий 2% твин-80 (300 мл), на втором - раствор, содержащий 1% твин-80 и 20% этанола (350 мл), и на третьем колонку промывают 200 мл буфера А. Затем осуществляют элюирование иммуноглобулина 0,35 М натрий-ацетатным буфером с рН 5,65 (буфер Б). Пропускание растворов при элюировании и сорбции осуществляют со скоростью 2 мл/мин, процессы отмывки и регенерации ведут со скоростью 7 мл/мин.
В результате осуществления способа получено 1,2 г иммуноглобулина (50 мл раствора с концентрацией иммуноглобулина порядка 20 г/л).
Выход - 75%, чистота по ВЭЖХ (гель-фильтрация) - более 97,8%.
Пример 2.
9,0 г осадка А растворяют в 250 мл буфера А (0,02 М натрий-ацетатный буфер, рН 5,75) при перемешивании в течение ночи в при температуре +5°С, затем в течение 4 ч при комнатной температуре.
Полученный раствор пропускают последовательно через две соединенные хроматографические колонны: первую - объемом 50 мл (2,5 х 10,2 мм), заполненную гидрофобным сорбентом на основе стиролдивинилбензола с размером частиц 63-200 мкм, и вторую - объемом 35 мл (2,5×7,1 см), заполненную ДЕАЕ-сорбентом на основе агарозы с диэтиламиноэтильными группами с размером частиц 40-60 мкм. Колонны предварительно уравновешены буфером А. Скорость потока 2 мл/мин. Вслед за раствором иммуноглобулина пропускают буфер А до снижения оптической плотности до уровня базовой линии.
Объем предварительно очищенной фракции составляет 440 мл.
К 440 мл полученного раствора иммуноглобулина добавляют твин-80 и трибутилфосфат до концентрации 1% каждого и инкубируют 6 ч при перемешивании при комнатной температуре.
Подготовленный таким образом раствор иммуноглобулина далее пропускают последовательно через соединенные между собой три колонны. Первая - диаметром 2,5 и длиной 3,0 см заполнена ДЕАЕ-полимерным сорбентом на основе агарозы с диэтиламиноэтильными группами с размером частиц 40-60 мкм, вторая колонна диаметром 2,5 и длиной 3,0 см заполнена гидрофобным сорбентом на основе стиролдивинилбензола с размером частиц 63-200 мкм, третья колонна заполнена сульфокатионитом на основе агарозы с размером частиц 40-60 мкм и имеет размеры: диаметр 2,5 см, длина 10 см. Все колонны предварительно уравновешены буфером А.
После окончания процесса сорбции осуществляют промывку. Для промывки через все колонки пропускают 100 мл буфера А. Затем колонки с анионитом и с гидрофобным сорбентом отключают и подвергают регенерации.
Колонку с катионитом промывают в три этапа: на первом этапе пропускают раствор, содержащий 2% твин-80 (300 мл), на втором - раствор, содержащий 1% твин-80 и 20% этанола (350 мл), а затем колонку промывают 200 мл буфера А.
Элюирование иммуноглобулина осуществляют 50 мМ натрий-ацетатным буфером, рН 6,0, содержащим 300 мМ хлористого натрия (буфер Б).
Пропускание растворов при элюировании и сорбции осуществляют со скоростью 3 мл/мин, процессы отмывки и регенерации ведут со скоростью 7 мл/мин.
В результате получено 1,25 г иммуноглобулина (50 мл раствора с концентрацией иммуноглобулина порядка 20 г/л).
Выход -81%, чистота по ВЭЖХ (гель-фильтрация) - более 98,2%.
Заявленный способ был проведен также с другими анионообменниками и катионообменниками, обладающими достаточной емкостью и соответствующей присутствующим белкам пористой структурой. Наилучшим гидрофобным сорбентом для осуществления способа оказался сорбент с диаметром пор менее 10 нм. В способе были применены также другие не денатурирующие кислотные буферные растворы, однако, предпочтительно, оказалось использовать ацетатный буферный раствор с рН от 5 до 6 и концентрацией 0,01-0,5 М.
Таким образом, сущность настоящего изобретения сводится к использованию в голове процесса соединенных между собой двух колонок с гидрофобным сорбентом и ДЕАЕ-сорбентом, что позволяет очистить жидкую фазу, полученную растворением осадка А (по Кону), от липидных примесей и белковых агрегатов без применения органических растворителей и подготовить полученный раствор для эффективной инактивации. Далее использование для хроматографии системы из трех колонок позволяет получить высокоочищенный продукт без дополнительных рехроматографий. Изобретение позволяет использовать единый буферный раствор в качестве элюента для всех пяти колонок, что существенно упрощает процесс. Технический результат изобретения заключается в возможности выделения иммуноглобулина из бедного (необогащенного) сырья при обеспечении высокого выхода и чистота целевого продукта.
Claims (8)
1. Способ хроматографического выделения иммуноглобулина, включающий растворение в буферном растворе белковой фракции плазмы крови, вирусную сольвент-детергентную инактивацию, хроматографическую очистку раствора, содержащего иммуноглобулин, путем его пропускания через систему из трех последовательно соединенных колонок, заполненных анионитом, гидрофобным сорбентом и катионитом соответственно, промывку системы колонок, элюирование иммуноглобулина с катионита буферным раствором, имеющим рН и концентрацию, достаточные для его эффективного выделения, и направление на регенерацию анионита и гидрофобного сорбента, отличающийся тем, что в качестве исходной белковой фракции плазмы крови используют осадок А спиртового фракционирования плазмы крови по Кону, который после растворения подвергают предварительной очистке, осуществляемой в двух последовательно соединенных колонках, заполненных гидрофобным сорбентом и анионитом соответственно, с последующим пропусканием через упомянутые две колонки буферного раствора и сбором предварительно очищенной жидкой фракции, которую затем направляют на сольвент-детергентную инактивацию и хроматографическую очистку.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве осадка А используют необогащенную фракцию, содержащую около 10% иммуноглобулина, посторонние белки и липиды.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве анионита используют полимерный акриловый сорбент с диэтиламиноэтильными группами, в качестве катионита используют полимерный акриловый сорбент с сульфопропильными группами, а в качестве гидрофобного сорбента используют пористый стиролдивинилбензол с размером пор менее 10 нм.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что вирусную сольвент-детергентную инактивацию осуществляют в растворе, содержащем твин-80 и трибутилфосфат.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в процессе используют натрий-ацетатный буферный раствор, причем все колонки предварительно уравновешены этим раствором.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что перед элюированием катионит промывают последовательно раствором, содержащим 2% твин-80, затем раствором, содержащим 1% твин-80 и 20% этанола, а затем буферным раствором.
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что элюирование иммуноглобулина с катионита осуществляют натрий-ацетатным буферным раствором, имеющим рН 5,65 и концентрацию 0,35 М.
8. Способ по п.1, отличающийся тем, что элюирование иммуноглобулина с катионита осуществляют натрий-ацетатным буферным раствором, имеющим рН 6,0, концентрацию 50 мМ и содержащим 300 мМ хлористого натрия.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010132114/05A RU2467783C2 (ru) | 2010-07-30 | 2010-07-30 | Способ хроматографического выделения иммуноглобулина |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2010132114/05A RU2467783C2 (ru) | 2010-07-30 | 2010-07-30 | Способ хроматографического выделения иммуноглобулина |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2010132114A RU2010132114A (ru) | 2012-02-10 |
| RU2467783C2 true RU2467783C2 (ru) | 2012-11-27 |
Family
ID=45853133
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2010132114/05A RU2467783C2 (ru) | 2010-07-30 | 2010-07-30 | Способ хроматографического выделения иммуноглобулина |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2467783C2 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2694620C1 (ru) * | 2018-10-17 | 2019-07-16 | Закрытое акционерное общество "БиоХимМак СТ" | Способ хроматографического выделения и очистки иммуноглобулинов |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4877866A (en) * | 1986-11-27 | 1989-10-31 | Biotest Pharma Gmbh | Method of producing a virus safe, storage-stable, and intravenously tolerable immunoglobulin-G preparation |
| US5593675A (en) * | 1993-12-27 | 1997-01-14 | Rotkreuzstiftung Zentrallaboratorium Blutspendedienst | Method of producing an anti-D immunoglobulin concentrate and a pharmaceutical preparation |
| US5644036A (en) * | 1990-10-17 | 1997-07-01 | Burroughs Wellcome Company | Purified immunoglobulin |
| RU2197500C2 (ru) * | 1998-06-09 | 2003-01-27 | Статенс Серум Институт | Способ получения иммуноглобулинов для внутривенного введения и другие иммуноглобулиновые продукты |
| US7041798B1 (en) * | 1999-07-14 | 2006-05-09 | Biotest Pharma Gmbh | Method for the chromatographic fractionation of plasma or serum, preparations, so obtained, and their use |
| US7138120B2 (en) * | 1998-06-09 | 2006-11-21 | Statens Serum Institut | Process for producing immunoglobulins for intravenous administration and other immunoglobulin products |
| RU2332247C1 (ru) * | 2007-06-01 | 2008-08-27 | Закрытое акционерное общество "БиоХимМак СТ" | Способ очистки иммуноглобулина (варианты) |
| RU2372939C2 (ru) * | 2007-02-27 | 2009-11-20 | Константин Васильевич Курищук | Способ получения иммуноглобулина |
-
2010
- 2010-07-30 RU RU2010132114/05A patent/RU2467783C2/ru active
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4877866A (en) * | 1986-11-27 | 1989-10-31 | Biotest Pharma Gmbh | Method of producing a virus safe, storage-stable, and intravenously tolerable immunoglobulin-G preparation |
| US5644036A (en) * | 1990-10-17 | 1997-07-01 | Burroughs Wellcome Company | Purified immunoglobulin |
| US5593675A (en) * | 1993-12-27 | 1997-01-14 | Rotkreuzstiftung Zentrallaboratorium Blutspendedienst | Method of producing an anti-D immunoglobulin concentrate and a pharmaceutical preparation |
| RU2197500C2 (ru) * | 1998-06-09 | 2003-01-27 | Статенс Серум Институт | Способ получения иммуноглобулинов для внутривенного введения и другие иммуноглобулиновые продукты |
| US7138120B2 (en) * | 1998-06-09 | 2006-11-21 | Statens Serum Institut | Process for producing immunoglobulins for intravenous administration and other immunoglobulin products |
| US7041798B1 (en) * | 1999-07-14 | 2006-05-09 | Biotest Pharma Gmbh | Method for the chromatographic fractionation of plasma or serum, preparations, so obtained, and their use |
| RU2372939C2 (ru) * | 2007-02-27 | 2009-11-20 | Константин Васильевич Курищук | Способ получения иммуноглобулина |
| RU2332247C1 (ru) * | 2007-06-01 | 2008-08-27 | Закрытое акционерное общество "БиоХимМак СТ" | Способ очистки иммуноглобулина (варианты) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2694620C1 (ru) * | 2018-10-17 | 2019-07-16 | Закрытое акционерное общество "БиоХимМак СТ" | Способ хроматографического выделения и очистки иммуноглобулинов |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2010132114A (ru) | 2012-02-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2610667C2 (ru) | Способ очистки белков | |
| AU2011256727B2 (en) | Apparatus and process of purification of proteins | |
| JP6437311B2 (ja) | ビス−トリス緩衝液を用いたタンパク質の精製方法 | |
| CN102762585B (zh) | 单一单元抗体纯化 | |
| CN111876393A (zh) | 一种大规模快速生产高纯度高活性慢病毒载体的方法 | |
| CN112409477B (zh) | IgM纯化方法 | |
| EP1885488A1 (en) | Regeneration of a chromatography matrix | |
| EP1451109A2 (en) | Method for high yield purification of immune globulins from blood plasma and blood plasma intermediates | |
| EP3240798B1 (en) | Novel method for efficient purification of human serum albumin | |
| JP2023145471A (ja) | 容積測定ローディング流量を低減し、そして結合及び溶出クロマトグラフィー精製の生産性を増大するためのインライン生成物濃縮 | |
| RU2467783C2 (ru) | Способ хроматографического выделения иммуноглобулина | |
| WO2013102822A1 (en) | Filtration method | |
| RU2332247C1 (ru) | Способ очистки иммуноглобулина (варианты) | |
| RU2694620C1 (ru) | Способ хроматографического выделения и очистки иммуноглобулинов | |
| Kulothungan | An overview of downstream processing in biologics | |
| CA3203540A1 (en) | Systems and methods for process scale isolation of immunoglobulin g | |
| CN103936846B (zh) | 一种硫酸鱼精蛋白的纯化方法 | |
| CN101948535B (zh) | 一种从鸡血中分离免疫球蛋白IgY的方法 | |
| AU2021355325A1 (en) | Compositions and methods for simplified high efficiency isolation of proteins | |
| US6372510B1 (en) | Method for removing unconventional transmissible agents from a protein solution | |
| EA043526B1 (ru) | Способ получения иммуноглобулина g для внутривенного введения | |
| Safarik et al. | Large scale magnetic separation of Solanum tuberosum tuber lectin from potato starch waste water | |
| JP4154743B2 (ja) | インターロイキン６レセプターの精製方法 | |
| AU2015255316A1 (en) | Apparatus and process of purification of proteins | |
| AU2002316540A1 (en) | Method for high yield purification of immune globulins from blood plasma and blood plasma intermediates |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20141223 |
|
| PC43 | Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions |
Effective date: 20180716 |
|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE FORMERLY AGREED ON 20210917 Effective date: 20210917 |