RU2694620C1 - Способ хроматографического выделения и очистки иммуноглобулинов - Google Patents
Способ хроматографического выделения и очистки иммуноглобулинов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2694620C1 RU2694620C1 RU2018136572A RU2018136572A RU2694620C1 RU 2694620 C1 RU2694620 C1 RU 2694620C1 RU 2018136572 A RU2018136572 A RU 2018136572A RU 2018136572 A RU2018136572 A RU 2018136572A RU 2694620 C1 RU2694620 C1 RU 2694620C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- immunoglobulins
- sorbent
- column
- anion
- purification
- Prior art date
Links
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 title claims abstract description 60
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 title claims abstract description 60
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 title claims abstract description 53
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 39
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 238000000605 extraction Methods 0.000 title description 2
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims abstract description 45
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 38
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 28
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 claims abstract description 24
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 claims abstract description 21
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 claims abstract description 20
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 14
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims abstract description 13
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims abstract description 13
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims abstract description 11
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims abstract description 7
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims abstract description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 3
- 229920001600 hydrophobic polymer Polymers 0.000 claims abstract description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 14
- 239000013049 sediment Substances 0.000 claims description 12
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M Methacrylate Chemical compound CC(=C)C([O-])=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 9
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims description 9
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 9
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 9
- -1 diethylaminoethyl groups Chemical group 0.000 claims description 8
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 7
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 claims description 7
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 claims description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 7
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 claims description 6
- CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.C=CC1=CC=CC=C1C=C CHRJZRDFSQHIFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 3
- STCOOQWBFONSKY-UHFFFAOYSA-N tributyl phosphate Chemical compound CCCCOP(=O)(OCCCC)OCCCC STCOOQWBFONSKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000007445 Chromatographic isolation Methods 0.000 claims description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 2
- 229960004249 sodium acetate Drugs 0.000 claims description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 claims description 2
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 claims 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 abstract description 12
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N octanoic acid Chemical compound CCCCCCCC(O)=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 7
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 5
- 229960002446 octanoic acid Drugs 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 4
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000005635 Caprylic acid (CAS 124-07-2) Substances 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910002012 Aerosil® Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OBETXYAYXDNJHR-UHFFFAOYSA-N alpha-ethylcaproic acid Natural products CCCCC(CC)C(O)=O OBETXYAYXDNJHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 2
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 2
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-M octanoate Chemical compound CCCCCCCC([O-])=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940043515 other immunoglobulins in atc Drugs 0.000 description 1
- 238000001470 plasma protein fractionation Methods 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229950008882 polysorbate Drugs 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/42—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the development mode, e.g. by displacement or by elution
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Способ выделения и очистки иммуноглобулинов включает растворение осадка А в натрий-ацетатном буферном растворе, вирусную сольвент-детергентную инактивацию и хроматографическую очистку в системе из трех последовательно соединенных колонок, первая из которых заполнена частицами гидрофобного полимерного сорбента, вторая - частицами анионообменного полимерного сорбента, третья - частицами сульфокатионита. Отсоединяют от системы первую колонку и направляют ее на регенерацию, а третью - на выделение иммуноглобулина G. Вторую колонку промывают водой и проводят элюирование в два этапа. На первом этапе элюируют примеси балластных белковых и полимерных соединений, на втором этапе элюируют иммуноглобулины А и М натрий-ацетатным буферным раствором, содержащим хлористый натрий. Фракцию, содержащую иммуноглобулины А и М, подвергают ультрафильтрации и дополнительной очистке на колонке с анионообменным сорбентом, осуществляя ступенчатое элюирование. Изобретение позволяет получить высокоочищенные иммуноглобулины с высоким выходом по простой технологической схеме. 4 з.п. ф-лы, 6 пр.
Description
Изобретение относится к области выделения и очистки белков из плазмы крови с использованием жидкостной хроматографии и может быть использовано для получения высокоочищенных иммуноглобулинов и комплексных препаратов на их основе.
Общепринятым способом фракционирования белков плазмы крови человека является метод Кона, основанный на осаждении фракций белков растворами, содержащими этанол при низких температурах. В этих условиях белки сохраняют свои нативные свойства. В результате фракционирования по Кону получают осадок А, а из него осадки Б и В, содержащие иммуноглобулины. Источником всех трех иммуноглобулинов является осадок А, в осадке В преимущественно находится иммуноглобулин G, иммуноглобулины А и М в основном содержатся в осадке Б, который чаще всего и используют в качестве промышленного источника иммуноглобулинов А и М.
Однако, традиционный метод фракционирования белков плазмы крови по Кону не обеспечивает современных требований по вирусной безопасности и степени очистки. В современных технологиях необходимыми стадиями являются стадии вирусной инактивации и хроматографической очистки.
Одним из востребованных коммерческих препаратов является комплексный иммуноглобулиновый препарат, в котором иммуноглобулины представлены в соотношении: IgG (50-70%) IgA (15-25%), IgM (15-25%). В процессе его получения очищенная фракция иммуноглобулинов А и М смешивается с очищенным иммуноглобулином G, при этом в смесевой фракции иммуноглобулинов желательно сохранение этого соотношения.
В этой связи для выделения иммуноглобулинов используют сочетание нескольких видов хроматографической очистки.
Известен способ, согласно которому осадок по Кону Б обрабатывают 2,5%-ной каприловой кислотой. Затем проводят хроматографию на катионообменнике, полученный элюат концентрируют и центрифугируют. Супернатант подвергают гель-хроматографии на колонке с Sephacryl S400 HR. В результате получают препарат с содержанием IgM 85%, IgG - 5% и IgA - 9%. (US 5190752, 1993).
В данном способе выход IgM из плазмы не превышает 30%, а содержание IgA является недостаточным для составления композиции комплексного препарата.
Известен способ выделения иммуноглобулинов из осадка по Кону А, который включает удаление контаминантов белка путем контакта раствора плазмы крови или фракции плазмы, обогащенной иммуноглобулинами с каприловой кислотой, где концентрация каприловой кислоты составляет от 0,5 до 1,5% об. от раствора плазмы крови или фракции плазмы, обогащенной иммуноглобулинами, и последующую хроматографию на анионите в кипящем слое. Способ обеспечивает получение концентрата человеческих поливалентных иммуноглобулинов с выходом больше, чем 4,5 г иммуноглобулинов на литр плазмы крови (US 9718856, 2017), однако выход и содержание иммуноглобулинов А и М очень низкое, что не позволяет приготовить комплексный препарат. Кроме того, указанный выше способ включает стадию экстракции октановой кислотой, что усложняет технологическую схему процесса.
Известен способ получения фракции, содержащей иммуноглобулины всех трех классов из осадка А по Кону. Способ заключается в том, что после спиртового фракционирование плазмы при низких температурах, сырой осадок фракции II+III суспендируют в 0,9% растворе натрия хлорида в весовом соотношении 1:10 и обрабатывают аэросилом А-380, балластный осадок удаляют центрифугированием, затем проводят вирусную инактивацию каприлатом и ультрафильтрацию (RU 2158136, 2000).
Способ позволяет получить хорошую по составу композицию иммуноглобулинов М, А и G. Недостатком способа является невысокий выход и недостаточная вирусная безопасность. Обработка аэросилом при высоких температурах может приводить к падению активности целевых белков в связи с частичной денатурацией последних, а отсутствие стадии хроматографии приводит к высокому содержанию примесных белков в целевом продукте.
Известен способ получения иммуноглобулинов М и А из осадка Б по Кону. Способ включает растворение осадка Б в ацетатном буфере, проведение вирусной инактивациии, хроматографическую очистку на анионите. Для проведения вирусной инактивации к раствору белка добавляют октановую кислоту и фосфат кальция и центрифугируют. Затем проводят ультрафильтрацию и хроматографическую очистку с использованием сорбента ДЕАЕ сефадекса А50. Проводят второй акт вирусной инактивации, фильтруя полученный раствор. Способ обеспечивает требования вирусной безопасности. В результате получают иммуноглобулины А и М с выходом 30% от изначального содержания в плазме, содержанием примесных белков не более 20%, содержанием высокомолекулярный примесей не более 10% (US 5075425, 1991).
Недостатком известного решения является использование осадка Б в качестве сырья, поскольку это требует дополнительной стадии осаждения, что приводит к снижению выхода и увеличению времени процесса. Иммуноглобулин G для комплексного препарата необходимо получать по отдельной схеме из осадка А или В. Кроме того, степень очистки от высокомолекулярных примесей и примесных белков не превышает 10% и 20%, соответственно.
Наиболее близким по технической сущности является способ хроматографического выделения и очистки иммуноглобулина, включающий растворение в буферном растворе белковой фракции плазмы крови, в качестве которой используют осадок А спиртового фракционирования плазмы крови по Кону. Согласно способу, производят предварительную очистку полученного раствора в двух последовательно соединенных колонках, заполненных гидрофобным сорбентом и анионитом, соответственно, с последующим пропусканием через упомянутые две колонки буферного раствора. После сбора предварительно очищенной жидкой фракции, содержащей иммуноглобулин, ее направляют на вирусную сольвент-детергентную инактивацию, а затем на хроматографическую очистку, осуществляемую в системе из трех последовательно соединенных колонок, заполненных анионитом, гидрофобным сорбентом и катионитом, соответственно. Проводят элюирование иммуноглобулина с колонки, заполненной катионитом, а колонки с анионитом и гидрофобным сорбентом направляют на регенерацию. Известный способ обеспечивает возможность выделения иммуноглобулина из необогащенного сырья - осадка А по Кону, достаточный высокий выход и чистоту целевого продукта (RU 2467783, 2012).
К недостаткам известного технического решения можно отнести следующие моменты. Основной задачей этой технологии является получение высокоочищенного вирус-безопасного иммуноглобулина G, а другие иммуноглобулины А и М рассматриваются как отходы технологического процесса и даже не подвергаются сольвент-детергентной обработке. Хотя в этой технологии заложены возможности комплексной переработки всех иммуноглобулинов G, А и М.
Задачей настоящего изобретения является разработка простого способа переработки осадка А по Кону, обеспечивающего получение высокоочищенных и вирус-безопасных иммуноглобулинов G, А и М по единой технологической схеме, в результате чего появится возможность создания комплексных иммуноглобулиновых препаратов.
Поставленная задача решается описываемым способом получения иммуноглобулинов М и А, который предусматривает растворение в натрий-ацетатном буферном растворе осадка А спиртового фракционирования плазмы крови по Кону, который содержит смесь иммуноглобулинов А, М и G, вирусную сольвент-детергентную инактивацию раствора, пропускание раствора через систему из трех последовательно соединенных между собой колонок, уравновешенных натрий-ацетатным буферным раствором, при этом первая из колонок заполнена частицами гидрофобного полимерного сорбента, вторая частицами анионообменного полимерного сорбента, третья частицами сульфокатионита, промывку упомянутых колонок натрий-ацетатным буферным раствором, отсоединение от системы первой колонки, заполненной гидрофобным сорбентом, с дальнейшим направлением ее на регенерацию, отсоединение от системы третьей колонки, заполненной сульфокатионитом, с дальнейшим направлением ее на выделение иммуноглобулина G, промывку второй колонки, заполненной анионообменным сорбентом, элюирование промытого анионообменного сорбента в два этапа, на первом элюируют примеси балластных белковых и полимерных соединений, а на втором элюируют иммуноглобулины А и М натрий-ацетатным буферным раствором с рН 5,6-6,0, содержащим хлористый натрий, полученную фракцию, содержащую иммуноглобулины А и М, подвергают ультрафильтрации и дополнительной очистке на колонке с анионообменным сорбентом при ее ступенчатом элюировании натрий-ацетатным или натрий-фосфатным буферным раствором с рН 5,65-7,4, содержащем хлористый натрий в повышающемся количестве от первой ступени элюирования ко второй ступени, находящемся в интервале от 50 до 300 мМ.
Для повышения степени очистки иммуноглобулина G элюат с сульфокатионита направляют на дополнительную колонку с анионообменным сорбентом и затем возвращают на колонку с сульфокатионитом для концентрирования продукта.
Предпочтительно, в системе из трех последовательно соединенных колонок в качестве гидрофобного сорбента используют пористый стиролдивинилбензол с размером пор менее 10 нм, в качестве анионообменного сорбента используют полимерный метакрилатный сорбент с диэтиламиноэтильными группами, в качестве сульфокатионита используют полимерный сорбент на основе метакрилата.
Вирусную сольвент-детергентную инактивацию, преимущественно, осуществляют в растворе, содержащем твин-80 и трибутилфосфат.
Предпочтительно, на стадии дополнительной очистки иммуноглобулинов А и М в качестве анионообменного сорбента используют сорбент на основе агарозы или метакрилата.
Предпочтительно, на стадии дополнительной очистки иммуноглобулина G в качестве анионообменного сорбента используют сорбент на основе агарозы.
При проведении процесса в объеме вышеуказанной совокупности признаков обеспечивается одновременное получение высокочистых иммуноглобулинов А и М в едином технологическом цикле из осадка А по Кону с возможностью выделения иммуноглобулина G из того же сырья любым известным способом. Кроме того, при введении дополнительной стадии очистки иммуноглобулина G на анионообменной сорбенте достигается степень очистки более 99%.
Ниже приведены конкретные примеры осуществления изобретения.
Пример 1.
10 г осадка А растворяют в 300 мл буфера А (0,02 М натрий-ацетатный буфер, рН 5,65) при перемешивании в течение ночи при температуре +5°С, затем в течение 4 ч при комнатной температуре. К полученному раствору добавляют 150 мл 1% раствора полисорбата (твин-80) и трибутилфосфата. 450 мл полученного раствора инкубируют 6 ч при перемешивании при комнатной температуре.
Подготовленный таким образом раствор иммуноглобулинов пропускают последовательно через соединенные между собой три колонны. Первая - диаметром 2,5 и длиной 3,0 см заполнена гидрофобным сорбентом Диасфер-СТ-75 на основе стиролдивинилбензола с размером частиц 100-150 мкм, вторая колонна диаметром 2,5 и длиной 3,0 см заполнена ДЕАЕ-полимерным сорбентом Диасфер-АК-ДЕАЕ на основе метакрилата с диэтиламиноэтильными группами с размером частиц 100-250 мкм, третья колонна заполнена сульфокатионитом Диасфер-AK-SP на основе метакрилата с размером частиц 40-120 мкм, колонка имеет диаметр 2,5 см, длину 10 см. Все колонны предварительно уравновешены буфером А. После окончания процесса нанесения 450 мл инактивированного раствора осуществляют промывку. Для промывки через все колонки пропускают 100 мл буфера А. Затем колонку с гидрофобным сорбентом отсоединяют и подвергают регенерации. Колонку с катионитом отсоединяют и далее используют для выделения сорбированного иммуноглобулина G.
Колонку с анионитом подвергают промывке в три этапа: на первом этапе пропускают раствор, содержащий 2% твин-80 (100 мл), на втором - раствор, содержащий 1% твин-80 и 20% этанола (150 мл), а затем колонку промывают 200 мл буфера А.
Элюирование иммуноглобулинов М и А осуществляют 50 мМ натрий-ацетатным буфером с рН 5,65 содержащим хлористый натрий (буфер Б).
Элюирование проводят в 2 этапа - вначале балластные белки и полимеры элюируют 100 мл натрий-ацетатного буфера, содержащего 100 мМ хлористого натрия (100 мл), а фракцию, содержащую иммуноглобулины М и А элюируют 150 мл буфера, содержащего 300 мМ хлористого натрия.
Пропускание растворов при элюировании и сорбции осуществляют со скоростью 3 мл/мин, процессы отмывки и регенерации ведут со скоростью 7 мл/мин.
Полученную фракцию концентрируют до содержания 20 г/л белка с помощью ультрафильтрации против 50 мМ натрий ацетатного буфера. Полученный раствор наносят на колонну с анионообменным сорбентом Relisorb-DA-400, 50-150 мкм на основе полиметилметакрилата (размер 25×100 мм). После нанесения пропускают буфер А в количестве 100 мл, а затем проводят ступенчатое элюирование буферами С (50 мМ натрий-ацетатным буфером, рН 5,65, содержащим 100 мМ хлористого натрия) и D (50 мМ натрий-ацетатным буфером, рН 5,65, содержащим 200 мМ хлористого натрия).
В результате хроматографии получают фракцию (элюат D), содержащую 0,20 и 0,12 г иммуноглобулинов А и М соответственно. Выход 45% по IgM, 40% по IgA, что на 45 и 39% выше, чем в известных способах. Количество полимерных примесей не более 5%, содержание сторонних белков плазмы крови не превышает 10%.
Для выделения иммуноглобулина G из ранее отсоединенной колонки с сульфокатионитом ее, также как колонку с анионитом, подвергают промывке в три этапа: на первом этапе пропускают раствор, содержащий 2% твин-80 (100 мл), на втором - раствор, содержащий 1% твин-80 и 20% этанола (150 мл), а затем колонку промывают 200 мл буфера А. Фракцию иммуноглобулина G элюируют 50 мМ натрий-ацетатным буфером, содержащим 300 мМ NaCl, рН 6,0 с выходом 75% и чистотой 97%.
Пример 2.
Выделение и очистку иммуноглобулинов проводят в условиях примера 1, но дополнительную очистку иммуноглобулинов М и А осуществляют на колонке 2,5×10 см с анионообменным сорбентом DEAE Sepharose с размером частиц 65-155 мкм. При нанесении пробу растворяют в 20 мМ натрий-фосфатном буфере и элюируют буфером Е, содержащим 100 мМ хлорида натрия. Данные условия позволяют сорбировать большинство полимеров и сторонних белков плазмы крови на сорбенте, а элюировать иммуноглобулины А и М.
Выход при таком способе очистки составляет 0,17 и 0,11 г или 40 и 35%, что больше на 33 и 17%, чем в известных способах. Содержание примесей не превышает 5%, а сторонних белков плазмы крови 8%.
Пример 3.
Выделение и очистку иммуноглобулинов проводят в условиях примера 2, но используют колонну с анионообменным сорбентом Relisorb-DA-400, 50-150 мкм на основе полиметилметакрилата (размер 25×100 мм), как и в первом примере. В данном варианте происходит связывание полимеров и сторонних белков плазмы крови, а в проскоке находятся иммуноглобулины.
Выход составляет 35% для обоих белков, что на 17% больше, чем в известных способах. Содержание полимеров не превышает 3%, а сторонних белков плазмы крови 10%.
Пример 4.
Выделение и очистку иммуноглобулинов проводят в условиях примера 1, но элюирование осуществляют 20 мМ натрий-ацетатным буферным раствором с рН - 6,8, содержащим 100 мМ хлорида натрия.
Выход составил 35 и 30% для иммуноглобулинов А и М соответственно, что на 17% больше, чем в известных способах. Содержание полимеров не превышает 5%, а сторонних белков плазмы крови 10%.
Пример 5
Выделение и очистку иммуноглобулинов проводят в условиях примера 1, но элюат, содержащий иммуноглобулин G с колонки с сульфокатионитом разбавляют 40 мл 50 мМ натрий-фосфатного буфера, рН 6,8 и добавляют 40-50 мл воды, затем 0,5 М NaOH доводят рН пробы до 6,8. Хроматографическую колонну (20×100 мм), объемом 10 мл, с сорбентом WorkBeads DEAE 40 на основе агарозы с диэтиламиноэтильными группами и размером частиц 40-50 мкм уравновешивают 50 мМ натрий-фосфатным буфером, рН 6,8.
Нанесение пробы проводили со скоростью потока 1,5 мл/мин в течение 1-1,5 часов. Вслед за пробой пропускали еще 30 мл 50 мМ натрий-фосфатного буфера рН 6,8. Собирали проскоковую фракцию, в которую добавляли 0,3 М уксусную кислоту до рН 5,6.
Концентрирование целевого вещества проводили на третьей колонне с катионитом из примера 1. Колонна уравновешена 20 мМ натрий-ацетатным буфером, рН 5,65. Буфер элюирования 0,35 М натрий-ацетатный буфер, рН 5,6. Скорость потока - 2 мл/мин. Целевая фракция составила 10-13 мл.
Выход на дополнительной стадии - 90%. Чистота - 99,3%.
Пример 6
Выделение и очистку иммуноглобулинов проводят в условиях примера 1, но элюат, содержащий иммуноглобулин G с колонки с сульфокатионитом разбавляют 40 мл 20 мМ трисового буфера рН 6,8 и добавляют 40-50 мл воды, затем 0,5 М NaOH доводят рН пробы до 6,8. Хроматографическую колонну (20×100 мм), объемом 10 мл, с сорбентом WorkBeads DEAE 40 на основе агарозы с диэтиламиноэтильными группами и размером частиц 40-50 мкм уравновешивают 20 мМ трисовым буфером, рН 6,8.
Нанесение пробы проводили со скоростью потока 1,5 мл/мин в течение 1-1,5 часов. Вслед за пробой пропускали еще 30 мл 50 мМ трисового буфера, рН 6,8. Собирали проскоковую фракцию, в которую добавляли 0,3 М уксусную кислоту до рН 5,6.
Концентрирование целевого вещества проводили на третьей колонне с катионитом из примера 1. Колонна уравновешена 20 мМ натрий-ацетатным буфером, рН 5,65. Буфер элюирования 0,35 М натрий-ацетатный буфер, рН 5,6. Скорость потока - 2 мл/мин. Целевая фракция составила 10-13 мл.
Выход на стадии - 91%. Степень очистки - 99,5%.
Как видно из представленных примеров реализации изобретения, в объеме заявленной совокупности признаков обеспечена простая технологическая схема переработки осадка А по Кону с возможностью получения всех трех видов высокоочищенных и вирус-безопасных иммуноглобулинов: смеси А и М с выходом от 30 до 45% в расчете на содержание в плазме крови, a G с выходом до 75% и чистотой 97%. Дополнительная стадия очистки иммуноглобулина G повышает степень очистки до 99,0-99,5%.
В этой технологии реализованы все возможности комплексной переработки иммуноглобулинов G, А и М из осадка А по Кону. Кроме того, комбинацией полученных продуктов можно создавать препараты, содержащие все три иммуноглобулина в требуемых соотношениях и с удовлетворительным выходом.
По сравнению с прототипом (RU 2467783), удается помимо иммуноглобулина G получить из того же количества сырья иммуноглобулины А и М, а введение дополнительной стадии очистки элюата с колонки с сульфокатионитом позволяет увеличить степень очистки иммуноглобулина G до 99,0-99,5%.
Claims (5)
1. Способ хроматографического выделения и очистки иммуноглобулинов, включающий растворение в натрий-ацетатном буферном растворе осадка А спиртового фракционирования плазмы крови по Кону, который содержит смесь иммуноглобулинов А, М и G, вирусную сольвент-детергентную инактивацию раствора, пропускание раствора через систему из трех последовательно соединенных между собой колонок, уравновешенных натрий-ацетатным буферным раствором, при этом первая из колонок заполнена частицами гидрофобного полимерного сорбента, вторая - частицами анионообменного полимерного сорбента, третья - частицами сульфокатионита, промывку упомянутых колонок натрий-ацетатным буферным раствором, отсоединение от системы первой колонки, заполненной гидрофобным сорбентом, с дальнейшим направлением ее на регенерацию, отсоединение от системы третьей колонки, заполненной сульфокатионитом, с дальнейшим направлением ее на выделение иммуноглобулина G, промывку второй колонки, заполненной анионообменным сорбентом, элюирование промытого анионообменного сорбента в два этапа, на первом элюируют примеси балластных белковых и полимерных соединений, а на втором элюируют иммуноглобулины А и М натрий-ацетатным буферным раствором с рН 5,6-6,0, содержащим хлористый натрий, полученную фракцию, содержащую иммуноглобулины А и М, подвергают ультрафильтрации и дополнительной очистке на колонке с анионообменным сорбентом на основе агарозы или метакрилата при ее ступенчатом элюировании натрий-ацетатным или натрий-фосфатным буферным раствором с рН 5,65-6,8, содержащим хлористый натрий в количестве, повышающемся от первой ступени элюирования ко второй ступени элюирования и находящемся в интервале от 50 до 200 мМ.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в системе из трех последовательно соединенных колонов в качестве гидрофобного сорбента используют пористый стиролдивинилбензол с размером пор менее 10 нм, в качестве анионообменного сорбента используют полимерный метакрилатный сорбент с диэтиламиноэтильными группами, в качестве сульфокатионита используют полимерный сорбент на основе метакрилата.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что вирусную сольвент-детергентную инактивацию осуществляют в растворе, содержащем твин-80 и трибутилфосфат.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что на стадии дополнительной очистки иммуноглобулинов А и М в качестве анионообменного сорбента используют сорбент на основе агарозы или метакрилата.
5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для повышения степени очистки иммуноглобулина G после очистки его на сульфокатионите проводят дополнительную очистку на анионообменном сорбенте на основе агарозы.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2018136572A RU2694620C1 (ru) | 2018-10-17 | 2018-10-17 | Способ хроматографического выделения и очистки иммуноглобулинов |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2018136572A RU2694620C1 (ru) | 2018-10-17 | 2018-10-17 | Способ хроматографического выделения и очистки иммуноглобулинов |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2694620C1 true RU2694620C1 (ru) | 2019-07-16 |
Family
ID=67309251
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2018136572A RU2694620C1 (ru) | 2018-10-17 | 2018-10-17 | Способ хроматографического выделения и очистки иммуноглобулинов |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2694620C1 (ru) |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2332247C1 (ru) * | 2007-06-01 | 2008-08-27 | Закрытое акционерное общество "БиоХимМак СТ" | Способ очистки иммуноглобулина (варианты) |
RU2372939C2 (ru) * | 2007-02-27 | 2009-11-20 | Константин Васильевич Курищук | Способ получения иммуноглобулина |
RU2467783C2 (ru) * | 2010-07-30 | 2012-11-27 | Закрытое акционерное общество "БиоХимМак СТ" | Способ хроматографического выделения иммуноглобулина |
WO2014144511A1 (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Baxter International Inc. | Methods to produce a human plasma-derived igg preparation enriched in brain disease-related natural iggs |
-
2018
- 2018-10-17 RU RU2018136572A patent/RU2694620C1/ru active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2372939C2 (ru) * | 2007-02-27 | 2009-11-20 | Константин Васильевич Курищук | Способ получения иммуноглобулина |
RU2332247C1 (ru) * | 2007-06-01 | 2008-08-27 | Закрытое акционерное общество "БиоХимМак СТ" | Способ очистки иммуноглобулина (варианты) |
RU2467783C2 (ru) * | 2010-07-30 | 2012-11-27 | Закрытое акционерное общество "БиоХимМак СТ" | Способ хроматографического выделения иммуноглобулина |
WO2014144511A1 (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Baxter International Inc. | Methods to produce a human plasma-derived igg preparation enriched in brain disease-related natural iggs |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
КАЗЬЯНИН А.В. и др. Разработка технологии получения иммуноглобулинов нового поколения для внутривенного введения, Вестник Уральской медицинской академии науки, 2012, N 4, С.203-204. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6437311B2 (ja) | ビス−トリス緩衝液を用いたタンパク質の精製方法 | |
JP3094167B2 (ja) | 免疫血清グロブリンの精製方法 | |
JP6484169B2 (ja) | 生体分子の精製 | |
CN104672328B (zh) | 一种人抗凝血酶ⅲ的生产方法 | |
JP2013519652A (ja) | 単一ユニット抗体精製 | |
KR20130086540A (ko) | 단백질 정제 장치 및 방법 | |
JP2019513119A (ja) | 血液系物質からタンパク質を抽出する方法 | |
JP7073333B2 (ja) | 免疫グロブリン組成物を調製するためのプロセス | |
CN111876393A (zh) | 一种大规模快速生产高纯度高活性慢病毒载体的方法 | |
US20240092828A1 (en) | Systems and methods for process scale isolation of a protein | |
RU2694620C1 (ru) | Способ хроматографического выделения и очистки иммуноглобулинов | |
KR20170035980A (ko) | 항체의 정제 방법 | |
RU2332247C1 (ru) | Способ очистки иммуноглобулина (варианты) | |
CN109705208B (zh) | 一种单步层析制备高纯度血管性血友病因子的工艺 | |
RU2467783C2 (ru) | Способ хроматографического выделения иммуноглобулина | |
CN101698680A (zh) | IgY免疫球蛋白的PEG与凝胶色谱联用纯化方法 | |
CA3043810C (en) | Method for removing fxi when purifying plasma proteins | |
JP5931363B2 (ja) | タンパク質の精製方法 | |
US6372510B1 (en) | Method for removing unconventional transmissible agents from a protein solution | |
Nath et al. | Emerging purification and isolation | |
CN116802206A (zh) | 用于生产规模的免疫球蛋白g分离系统和方法 | |
RU2372097C1 (ru) | Способ получения церулоплазмина | |
EA043526B1 (ru) | Способ получения иммуноглобулина g для внутривенного введения | |
KR20230148961A (ko) | 면역글로불린 정제방법 | |
BRPI0900276B1 (pt) | PROCESSO DE PURIFICAÇÃO DE IMUNOGLOBULINA G (IgG) A PARTIR DO SORO OU PLASMA HUMANO POR CROMATOGRAFIA EM GEL (OMEGA)-AMINOHEXIL-AGAROSE OU (OMEGA)-AMINODECIL- AGAROSE |