CN116802206A - 用于生产规模的免疫球蛋白g分离系统和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了从血浆中分离免疫球蛋白G(IgG)的方法，其中IgG最初通过盐沉淀分级分离，随后是连续的离子交换步骤，其中IgG在离子交换步骤的未结合的流穿液级分中出现。一些实施方案采用连续的阴离子交换步骤。其他实施方案采用阴离子交换步骤，随后将阴离子交换步骤的流穿液应用于阳离子交换步骤，从阳离子交换步骤的流穿液级分中收集IgG。以高收率(通常约75％或更高)和高纯度收集IgG。避免结合和从色谱介质中洗脱简化了处理和放大，而不牺牲IgG质量或收率。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年12月28日提交的第63/131,097号美国临时专利申请、2021年6月9日提交的第63/208,778号美国临时专利申请与2021年10月27日提交的第63/272,605号美国临时专利申请的优先权。这些和所有其他参考的外部材料在此全部引入作为参考。如果通过引用并入本文的参考文献中某术语的定义或使用与本文提供的该术语的定义不一致或相反，则本文提供的该术语的定义应被视为具有约束力。
技术领域
本发明的领域涉及免疫球蛋白G(IgG)的分离，特别是从血清和/或血浆中分离免疫球蛋白G(IgG)。
背景技术
背景说明包括可能有助于理解本发明的信息。这并不是承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关，或者任何具体或隐含引用的出版物是现有技术。
免疫球蛋白G(IgG)是一种从人血浆中制备的蛋白质产物，用于治疗原发性免疫缺陷和各种其他免疫性疾病。此外，IgG还可用于被动免疫传递，加速病原体(如SARS-CoV2)的清除，预防或治疗感染。70多年来，IgG一直采用Cohn工艺生产，即根据血浆蛋白在乙醇中的溶解度差异(温度、pH值、乙醇浓度、离子强度和蛋白浓度的变化)来分离或分级分离血浆蛋白。虽然商用血浆分级分离器一般不公开Cohn工艺的总IgG收率，但普遍认为现代Cohn工艺仅获得原料中存在的IgG的约50-60％的收率。此外，据了解，该过程大约需要7至10天才能完成。
授予Zurlo等人的美国专利No.7,879,331描述了一种分离IgG的方法，该方法利用柠檬酸盐对血浆进行连续分级分离以产生含有IgG的沉淀。溶解和缓冲液交换后，通过离子交换色谱法处理所得富含IgG的溶液，以生成含有IgG的洗脱液。将该洗脱级分进一步进行阴离子交换色谱分析。不幸的是，如果将该技术用于将缓冲液交换到适合离子交换步骤的缓冲液中，该技术会导致渗滤膜快速结垢。这限制了渗滤的应用范围。此外，IgG从离子交换介质中结合和随后洗脱不可避免地会导致蛋白质的损失。
因此，仍需快速、有效和可扩展的方法以高收率和高纯度分离IgG。
发明内容
本发明的主题提供了以高纯度和高收率提供免疫球蛋白G(IgG)或其它蛋白质(例如白蛋白、AAT)的分离的组合物、方法及系统。此类方法利用连续的离子交换步骤，其中IgG保留在流穿液级分中，避免了洗脱步骤的必要性。对常规的结合、洗涤和洗脱步骤的规避，简化了加工和放大过程，同时也提高了收率。此外，可以从该过程的各种废物流中分离非IgG蛋白质(例如，来自离子交换步骤的结合级分)。
本发明构思的一个实施方案是从溶液(如血浆，分离步骤的产物)中分离蛋白质(如IgG)的方法，所述方法通过向溶液中加入盐(如柠檬酸盐或乙酸盐)以产生上清液和沉淀，将沉淀溶解在水溶液中以产生包含蛋白质和至少一种杂质的溶解的沉淀，将溶解的沉淀物施加到阴离子交换介质以产生第一结合级分和第一流穿液(其中第一流穿液包括蛋白质和杂质)，并将第一流穿液施加到可结合蛋白质和杂质两者的阳离子交换介质以产生包括杂质的第二结合级分和包括蛋白质的第二流穿液。在这种方法中，选择阳离子交换介质的容量，使得在阳离子交换步骤中溶液中蛋白质含量的损失小于约3％(已知范围为？？？3-10％)。在一些这样的实施方案中，蛋白质是免疫球蛋白G，并且杂质可以是因子XI或活化的因子XI。在这种方法中，阳离子交换介质可以以颗粒、珠或过滤器的形式提供。在一些这样的实施方案中，将辛酸盐加入到溶解的沉淀中，随后可以包括去除固体的步骤。这种固体去除可以使用深度过滤器来完成，所述深度过滤器被选择用来保留因子XI和/或因子XII，例如包括硅藻土的深度过滤器。这种深度过滤器可以排除珍珠岩。通过这种方法得到的蛋白质收率可以是70％或更高(相对于起始蛋白质溶液中的蛋白质量)。在一些实施方案中，从来自盐添加步骤的上清液中回收一种或多种另外的蛋白质。
本发明构思的另一个实施方案是从溶液(例如血浆或从血浆获得的级分)中分离蛋白质(例如IgG)的系统。这种系统包括分级分离模块，其被配置为接收溶液并进行盐分级分离的过程，产生上清液和沉淀物，将上清液与沉淀物分离，并提供沉淀物作为第一输出。它还包括第一分离模块，所述第一分离模块包括阴离子交换介质并且连接到第一输出，并且具有用于流穿液级分(其包括蛋白质和至少一种杂质)的第二输出。提供第二分离模块，其包括结合杂质(例如，因子XI和/或活化的因子XI)的阳离子交换介质，并且对于包括蛋白质的第二流穿液级分具有第三输出。该第二分离模块包括一定量的阳离子交换介质，所述一定量的阳离子交换介质提供阳离子交换容量，使得在阳离子交换步骤期间血液制品中的蛋白质含量损失小于3％(范围3-10％)。这种系统可以包括在分级分离模块和第一分离模块之间的流体路径内的病毒灭活模块。在一些实施方案中，深度过滤器插入在第一输出和第一分离模块之间。这种深度过滤器可以被选择用来保留XI因子和/或XII因子，并且可以包括硅藻土。在一些这样的实施方案中，深度过滤器可以排除珍珠岩。
本发明构思的另一个实施方案是从溶液(例如血浆或分离步骤的产物)中分离蛋白质(例如IgG、白蛋白、AAT)的方法，所述方法通过向溶液中加入盐(例如柠檬酸盐或乙酸盐)以产生上清液和沉淀(其中上清液包括蛋白质和至少一种杂质)，将所述上清液施加到阴离子交换介质以产生第一结合级分和第一流穿液(其中所述第一流穿液包括所述蛋白质和杂质)，并将所述第一流穿液施加到阳离子交换介质以产生包括所述杂质的第二结合级分和包括所述蛋白质的第二流穿液。选择阳离子交换介质的容量，使得在阳离子交换步骤中溶液中蛋白质含量的损失小于约3％(范围3-10％？？？)。阳离子交换介质可以以颗粒、珠或过滤器的形式提供。在一些这样的实施方案中，将辛酸盐加入到溶解的上清液中，然后从所得溶液中去除固体。可使用包含硅藻土的深度过滤器去除此类固体；在一些实施方案中，珍珠岩被排除在这种深度过滤器之外。通常，蛋白质(例如IgG)的收率为70％或更高(相对于溶液中蛋白质的含量)或更高。在一些实施方案中，可以从沉淀中回收一种或多种另外的蛋白质。
本发明构思的另一个实施方案是用于从溶液(例如血浆或源自血浆的级分)中分离蛋白质(例如IgG、白蛋白、AAT)的系统，该系统包括分级分离模块，所述分级分离模块接收溶液并进行盐分级分离步骤以产生上清液和沉淀，并且还将上清液与沉淀分离并将上清液提供给第一输出。所述系统还包括包含阴离子交换介质的第一分离模块，其中第一分离模块接收第一输出并提供包含流穿液级分(其包含蛋白质和至少一种杂质)的第二输出。第二输出被引导至第二分离模块，所述第二分离模块包括能够结合杂质和蛋白质的阳离子交换介质，并且提供包括含有蛋白质的第二流穿液级分的第三输出。第二分离模块包括一定量的阳离子交换介质，选择所述阳离子交换介质的容量，使得在阳离子交换步骤中第二输出中蛋白质含量的损失小于约3％(范围3-10％？？？)。这种系统可以包括在分级分离模块和第一分离模块之间的流体路径内的病毒灭活模块。
本发明构思的另一个实施方案是分离免疫球蛋白G的方法，所述方法将柠檬酸盐加入到含有存在于两种或多种IgG亚类中的免疫球蛋白G(IgG)的水溶液中，使其浓度达到至少11％(以重量计)，以产生第一上清液和第一沉淀。将第一上清液与第一沉淀分离，并将另外的柠檬酸盐添加到第一上清液中至22-26％(以重量计)的浓度，从而产生第二上清液和第二沉淀。从第二上清液中分离第二沉淀物并溶解。将溶解的第二沉淀的电导率调节至5mS至10mS(例如，约7mS)，以形成稀释的蛋白质溶液。该稀释的蛋白质溶液被施加到包括阴离子交换介质(例如，含有季胺的介质)的第一离子交换柱以产生第一流穿液，其又被施加到包括阴离子交换介质的第二离子交换柱以产生第二流穿液。第一和第二阴离子交换柱可以串联布置。或者，可收集并汇集第一次流穿液，然后将其施加到第二个阴离子交换柱。这种第二流穿液包括IgG，并且还提供两种或更多种免疫球蛋白类别或IgG亚类的至少部分分离。所得IgG的纯度至少约为85％(以重量计)。在一些这样的实施方案中，将脂肪酸(例如，具有4-10个碳的碳链的脂肪酸)加入到溶解的第二沉淀中以形成悬浮液，该悬浮液又可以施加到深度过滤器。选择深度过滤器的组成和大小，以避免溶解的第二沉淀中存在的凝血因子的活化，并降低通过过滤器的材料中凝血因子的浓度。在一些这样的实施方案中，可以通过在IgG结合并保持与阳离子交换介质结合的条件下将第二流穿液级分施加到阳离子交换介质(例如，含有磺酸盐和/或羧酸基团的介质)来进一步处理第二流穿液级分。然后洗涤阳离子交换介质，随后从阳离子交换介质中洗脱IgG。
本发明构思的另一个实施方案是一种药物组合物，其包含浓度至少为40mg/mL的免疫球蛋白G(IgG)和浓度小于2μg/mL的免疫球蛋白A，其中IgG的纯度大于98％，并且尚未从层析介质中洗脱。在一些实施方案中，这种药物组合物含有小于1μU/mL的活化因子XI。在一些实施方案中，这种药物组合物含有小于0.1μg/mL的因子XII。在一些实施方案中，药物组合物的IgG含量从至少2L血浆中分离。
通过下面对优选实施方案的详细描述以及附图，本发明主题的各种目的、特征、方面和优点将变得更加明显。
附图说明
图1：图1示意性地描述了本发明构思的示例性方法，所述方法连续使用两个阴离子交换步骤。
图2：图2示意性地描述了本发明构思的示例性方法，所述方法连续使用两个阴离子交换步骤。
图3：图3示意性地描述了本发明构思的示例性方法，所述方法连续使用两个阴离子交换步骤从血液制品中分离免疫球蛋白G(IgG)。
图4：图4示出了在还原条件下，不同柠檬酸盐浓度下，对第二沉淀步骤中产生的上清液和沉淀进行SDS-PAGE的结果。箭头表示还原条件下IgG的重链(HC)和轻链(LC)。
图5：图5示出了IgG沉淀研究的结果和平均(N＝3)第二沉淀IgG回收率。
图6：图6示出了从Q-SepharoseTM柱穿透(breakthrough)研究中获得的样本的bis-tris SDS-PAGE的典型结果。
图7：图7示出了从不同离子交换柱布置获得的样品的还原bis-Tris SDS-PAGE的结果。从各种离子交换色谱柱配置中获得的IgG产品。
图8：图8示出了在连续2L Q-SepharoseTM色谱柱上进行的2L中试规模方法色谱分析期间获得的典型A280测定值。单独的级分用竖线表示。
图9：图9示出了在本发明构思的2L规模方法的色谱分析期间获得的样品的非还原bis-tris SDS-PAGE的典型结果。泳道标记对应于图8中标记的级分。“最终池”由级分1至5组成。
图10：图10示出了四种市售静脉内IgG产品和通过本发明构思的方法生产的三个2L规模批次的最终产品的非还原bis-tris SDS-PAGE的典型结果。每泳道加载5μg蛋白。
图11：图11示意性地描述了利用阴离子交换和最小阳离子交换的本发明构思的示例性方法。
图12：图12示意性地描述了利用阴离子交换和受限容量阳离子交换的本发明构思的示例性方法。
图13：图13示意性地描述了使用阴离子交换和受限容量阳离子交换从血液制品中分离免疫球蛋白G(IgG)的本发明构思的示例性方法。
具体实施方式
发明人开发了一种可提供约75％至80％或更高的IgG收率，同时满足FDA为商业产品设定的纯化标准的商业可扩展的方法。相比之下，当前Cohn方法的IgG收率为50-60％。该方法还极大地减少了最终产品中XI因子、因子XII和/或IgA造成的污染，并将此类污染降至目前无法检测到的水平。
应当理解，所公开的技术提供了许多有利的技术效果，包括在工艺规模上以高纯度和高收率快速提供免疫球蛋白G。
发明人的方法产生了更天然的IgG，因为该方法避免了醇的使用，并最大限度地减少了变性条件(例如极端的pH值变化等)。此外，在要求保护的方法中，IgG未被结合，随后从色谱介质中洗脱。这有利地既提高了收率又减少了变性的机会，同时还简化了分离过程并大大减少了处理时间。因此，这些方法不同于(且成本效益远高于)当前的IgG分离方法，并且可以提供具有改善的蛋白质稳定性、增加的体内半衰期、更快速的输注速率、改善的患者耐受性和降低的免疫原性的IgG产品。发明人的制造过程大约需要两天完成，而依赖于Cohn方法的过程大约需要7到10天。预计这种新方法的制造工厂的建设和运营成本仅为现有工厂成本的一小部分，同时还能以活性和天然形式生产更高产量的其他治疗性蛋白质。此外，不使用易燃/易爆化学品，减少了资本投资，提高了工人的安全性，并减少了对环境的负面影响。应当理解，尽管本文讨论了免疫球蛋白G(IgG)的分离，但发明人预期可从各种中间工艺流(例如，来自沉淀步骤的上清液或沉淀、结合到色谱介质的材料等)中分离具有商业价值的其它血清蛋白(例如，AAT、白蛋白)。
本发明构思的一些实施方案利用连续的具有相同离子交换效应(例如，阴离子交换)的两个或多个离子交换色谱步骤，其中选择或优化缓冲液条件和柱结合能力以在每个离子交换色谱步骤的流穿液级分中提供目的蛋白(例如，IgG)。这种离子交换步骤可以使用类似容量的介质(例如，相同离子交换介质的类似或相同体积)来执行。或者，在一些实施方案中，可以使用具有相似离子交换功能但不同容量的离子交换介质(例如，相同离子交换介质的两个不同体积)。这种离子交换介质可以被布置成使得离子交换介质的第一体积或量的流穿液级分可以被引导到离子交换介质的第二体积或量的入口。或者，在一些实施方案中，离子交换介质的第一体积或量的全部或部分流穿液级分可在施加到离子交换介质的第二体积或量之前被汇集。
本发明构思的实施方案可利用阴离子或阳离子交换色谱，其中选择或优化缓冲液条件和柱结合能力以在每个色谱步骤的流穿液级分中提供靶蛋白(例如IgG)。
图1中示出了本发明构思的方法的示例。应当理解，在这种情况下，血液制品可以是血清、血浆、贫冷冻沉淀血浆(cryo-poorplasma)、冷冻沉淀物已重新溶解于其中的贫冷冻沉淀血浆、或由施加到这些材料的分离步骤产生的级分(例如，色谱洗脱液、色谱流穿液液、上清液或溶解的沉淀)。还应当理解，虽然具体列举了血液制品，但是这些方法适用于含有目的蛋白的任何溶液(例如，细胞培养基、来自细胞培养物的细胞裂解物、细菌裂解物、溶剂化的包涵体等)。在图1所示的方法中，分级分离过程中的沉淀在施加到离子交换介质之前被溶解。
在一些实施方案中，这种再溶解的物质可以被澄清，例如通过经过一个或多个过滤器，以便除去会污染色谱介质的残留的未溶解或沉淀的物质。在一些实施方案中，这种再溶解的沉淀的缓冲液组成可以在施加到离子交换介质之前进行改变。这可以通过缓冲液交换(即从含蛋白溶液中除去盐的过程)来实现，例如通过尺寸排阻色谱法、透析、渗滤和/或再沉淀(例如使用PEG)，然后再溶解。或者，在一些实施方案中，可稀释这种再溶解的沉淀(其保留了最初存在于再溶解的沉淀中的盐)，直到达到所需的渗透压和/或电导率(例如，2至10mS)。来自第一离子交换步骤的流穿液级分利用具有相似电荷特性(即阴离子交换、阳离子交换)的离子交换介质被转移到第二离子交换步骤，并且在该第二离子交换步骤的流穿液级分中以高收率(例如，相对于起始材料中目的蛋白的含量大于70％、75％、80％、85％、90％或95％)和高纯度(例如，大于80％、85％、90％、95％、98％、或99％)回收目的蛋白。发明人考虑，在一些实施方案中，可以使用单个大离子交换柱代替两个离子交换柱，然而这种方法必然会限制操作的规模。虽然离子交换步骤显示为阴离子交换步骤，但使用阳离子交换介质进行离子交换步骤的实施方案也在考虑之列，并可应用于分离IgG以外的蛋白质。
本发明构思的另一个实施方案在图2中示出，其中对来自分级分离步骤的上清液进行初始离子交换步骤。在一些实施方案中，这样的上清液可以被澄清，例如通过经过一个或多个过滤器，以便除去会污染色谱介质的残留颗粒或沉淀物质。在一些实施方案中，这种上清液的缓冲液组成可以在施加到离子交换介质之前改变。这可以通过缓冲液交换(即从含蛋白溶液中除去盐的过程)来实现，例如通过尺寸排阻色谱法、透析、渗滤和/或沉淀(例如使用PEG)，然后溶解。或者，在一些实施方案中，可稀释此类上清液(其保留最初存在于上清液中的盐)，直至达到所需的渗透压和/或电导率(例如，2至10mS)。来自第一离子交换步骤的流穿液级分利用具有相似电荷特性(即阴离子交换、阳离子交换)的离子交换介质被转移到第二离子交换步骤，并且在该第二离子交换步骤的流穿液级分中以高收率(例如，相对于起始材料中目的蛋白的含量大于70％、75％、80％、85％、90％或95％)和高纯度(例如，大于80％、85％、90％、95％、98％、或99％)回收目的蛋白。
还应当理解，虽然在图1和图2中具体地引用了血液制品，但是这样的方法适用于含有目的蛋白的任何溶液(例如，细胞培养基、来自细胞培养物的细胞的裂解物、细菌裂解物、溶剂化的包涵体等)。尽管离子交换步骤显示为阴离子交换步骤，但是使用阳离子交换介质进行离子交换步骤的实施方案也是可以预期的。例如，此类方法可用于分离IgG以外的蛋白质。
发明人已经发现本发明构思的方法在从血浆分离IgG中特别有用，尽管施加到含有IgG的其它溶液(例如，细胞培养基、细胞裂解物、溶解的包涵体、其它体液等)是可以预期的。在本申请的上下文中，血浆被认为包括新鲜采集的血清、新鲜采集的血浆、重构的冻干血浆、冷藏血浆、冷冻血浆、回收血浆、贫冷冻沉淀血浆、冷冻沉淀物已重新溶解于其中的贫冷冻沉淀血浆，以及这些血浆中的两种或多种的混合物。例如，此类血浆可以作为混合材料从血液或血浆采集中心获得。图3中示出了用于从血浆中分离IgG的本发明构思的方法的示例。
对于前两个步骤，发明人使用用于两个沉淀步骤的盐浓度范围修改和/或优化了碱分级分离过程，以确定最佳浓度(例如，在第一次盐沉淀中约11％，在第二次盐沉淀中约26％)，并使IgG收率最大化，同时使不需要的蛋白质最小化。尽管优选柠檬酸盐或乙酸盐，但是可以使用任何合适的盐。这种盐可以以盐溶液(例如，以50％(以重量计)盐溶液的计算体积)和/或干燥形式(例如，以粉末或结晶固体)快速加入。如图所示，第一个沉淀步骤产生富含IgG的上清液，第二个沉淀步骤产生富含IgG的沉淀物或糊状物。在离子交换步骤之前，将这种富含IgG的沉淀物溶解(如溶于水)。在这样的实施方案中，缓冲液交换步骤(例如透析、渗滤、超滤后稀释、尺寸排阻色谱法等)可以在离子交换步骤之前进行。或者，可稀释再溶解的沉淀物，直至达到所需的电导率(如2至10mS)或离子强度。应了解，沉淀可在缓冲液交换步骤期间发生，且可实施额外的过滤步骤(例如，深度过滤，或随后为澄清或最终过滤步骤的深度过滤)以在初始离子交换步骤之前除去此类沉淀材料。如图3所示，在本发明构思的放大的IgG方法中，IgG可以在来自第二阴离子交换步骤的流穿液(即未结合)级分中回收。
在一些实施方案中，在离子交换步骤之前，对溶解的富含IgG的沉淀进行病毒灭活步骤。例如，可将pH值降至5.7，并加入辛酸盐以灭活包膜病毒。此类步骤似乎不会导致任何显著的IgG损失，辛酸盐可在后续离子交换步骤中有效去除。
在常规的蛋白质纯化过程中，为了最终蛋白质产物的纯度而牺牲了收率。令人惊讶的是，在本文所述的方法中，IgG通常以高收率(大于起始材料中存在的IgG的70％、75％、80％、85％、90％或95％)和高纯度(大于80％、85％、90％、95％、98％或99％)回收。
实施例
在使用柠檬酸钠作为沉淀剂的两个沉淀步骤中，对来自贫冷冻沉淀血浆的IgG进行了多碱分级分离。在中试设施中制备了2升试验批次。在第二沉淀(即第二沉淀步骤产生的沉淀)中获得的IgG收率为90％，在第二上清液(即第二沉淀步骤产生的上清液)中仅3％，而第二次在第二沉淀中获得的收率为95％，在第二上清液中仅3％。第二上清液中均匀存在约3％IgG，表明碱分级分离过程稳健，在血浆产生约95％的起始IgG。
研究了一定范围的柠檬酸钠浓度，以制定通过碱分级分离过程提高IgG收率和纯度的最佳方案。将贫冷冻沉淀血浆进行1小时的初始11％柠檬酸钠(w/v)沉淀步骤，随后以4,500×g离心。在第二次柠檬酸钠沉淀步骤中，以22％至28％(w/v)的柠檬酸钠浓度所得第一上清液1进一步分级分离2小时，随后以4,500×g离心。将来自第一次沉淀步骤(即第一沉淀)和第二次沉淀步骤(即第二沉淀)的糊状物以每克湿糊状物10mL水的浓度溶解于注射用水中。在分级分离过程中，温度(2-8℃)和pH值(7.0+0.1)均保持不变。在环境温度(20-25℃)下，通过添加50％w/v柠檬酸钠调整柠檬酸盐浓度。
总蛋白和IgG含量的分析主要分别通过A280测定和总IgG ELISA(Invitrogen)进行。虽然总IgG ELISA的测定精度在复杂溶液中可能不太准确，例如在贫冷冻沉淀血浆中，但它是在IgG纯度不断提高的工艺步骤中测定相对IgG浓度的合适方法。
通常，在最初的11％(w/v)柠檬酸盐沉淀步骤中发现第一上清液中的IgG回收率为98％(数据未显示)。如表1所示，来自第二沉淀步骤的第二沉淀中的IgG收率随着柠檬酸盐浓度从22％增加到24％(w/v)而增加，然后在26％到28％w/v的柠檬酸盐浓度下趋于稳定(从第一上清液中回收的IgG约为85％)。这些数据在相应的第二上清液中观察到的IgG浓度进一步得到证实，其显示出相反的趋势。
表1
第二沉淀重量增加，而IgG收率没有相应增加，表明超过26％(w/v)柠檬酸盐的沉淀会积累不期望的污染的蛋白。SDS-PAGE证实了这一点(图4)。图4显示了在应用于贫冷冻沉淀血浆的分级分离过程的还原条件下4-12％SDS-PAGE凝胶运行的结果。箭头表示IgG的重链(HC)和轻链(LC)。凝胶每泳道加载20个A280单位的蛋白质。如图所示，IgG在第一上清液(S1)和第二沉淀(沉淀颗粒2)中很明显，在第二次沉淀步骤中，在高(如26％，28％w/v)柠檬酸盐浓度下观察到第二沉淀中的蛋白质杂质增加。
沉淀步骤的稳健性通过用11-13％(w/v)柠檬酸盐，然后用22-26％柠檬酸盐(w/v)分级分离相同混合贫冷冻沉淀血浆的等分试样来表征。通过ELISA分析所得上清液和沉淀中的IgG收率。获得的平均IgG水平如图5所示。图5提供了用不同对的第一沉淀和第二沉淀柠檬酸盐浓度获得的平均结果的直方图(例如，“11-22％”表示第一沉淀步骤中11％w/v柠檬酸盐，第二沉淀步骤中22％w/v柠檬酸盐)。如图所示，第一沉淀步骤中的11％柠檬酸盐(w/v)和第二沉淀步骤中的24％至26％(w/v)柠檬酸盐(11-24％)对于达到最大IgG收率是最佳的。当第二沉淀步骤在不同浓度下进行时，在12或13％(w/v)柠檬酸盐下的初始沉淀似乎具有相对较低的IgG收率。
为了进一步表征初始沉淀步骤的稳健性，处理了四个2L体积的混合贫冷冻沉淀血浆，每个初始沉淀步骤使用11％(w/v)柠檬酸盐浓度，第二沉淀步骤使用26％(w/v)柠檬酸盐浓度。将每种溶液中的第二沉淀物溶于注射用水(10mL/g湿糊状物)中。IgG浓度采用比浊法测定。结果见表2。
表2
如表中所示，比浊法数据非常一致，显示初始11％沉淀步骤后，从初始贫冷冻沉淀血浆中获得的第一份上清液中的IgG平均收率为98.1％。该数据与第一沉淀中缺乏IgG(<1％)的情况一致。P2四个批次的第二沉淀中的最终IgG收率为90.3％IgG，第二上清液中保留的平均值为6.2％IgG。发明人相信，在离心过程中未收集到一些含IgG的沉淀，并且通过更广泛的离心，第二沉淀中IgG的回收率在第二沉淀中可为约95％或更高。
注意到将此类第二沉淀在以10mL/g湿糊状物溶解于注射用水中时，溶液会出现浑浊和/或乳白色。发明人认为混浊可能是悬浮脂质和未溶解的杂质造成的。在小规模研究中，在随后的离子交换步骤之前，使用透析进行缓冲液交换(即从含IgG的溶液中除去盐)。在将透析材料施加到离子交换介质之前，可通过离心或过滤(例如，使用深度过滤器)去除此类沉淀材料，以避免结垢。在使用渗滤过程中观察到了类似的沉淀，这使得渗滤不适用于离子交换色谱之前的缓冲液交换。
本发明人发现，按比例放大时，当使用深度过滤去除从再溶解的第二次沉淀中沉淀的物质时，发现额外的非IgG蛋白被引入离子交换色谱。在小规模下，此类非IgG蛋白在透析/离心过程中被去除，不会增加离子交换柱上的蛋白负荷。
在阴离子交换介质容量研究中，测定Q-SepharoseTM柱被确定在约14A280单位/mL树脂时出现穿透。在5mL Q-SepharoseTM柱上2次进样35A280单位(14A280/mL)后，在62kDa标记物上方的几处位置开始出现高分子量杂质，在第三次进样35A280单位(21A280/mL)后出现显著的白蛋白(～60kDa)穿透。图6中的SDS-PAGE凝胶显示了此类研究的典型结果。
图6显示了从Q-SepharoseTM柱穿透研究中获得的样本的还原bis-tris SDS-PAGE凝胶。在5mL Q-SepharoseTM柱上连续进样3次，每次进样35A280 P2材料，这些材料已分别通过DL10深度过滤器和XLG过滤器。泳道1含有分子量标准品。泳道2含有过滤的第二沉淀。泳道3含有进样1后的流穿液级分(如上所述)。泳道4包含进样2后的流穿液级分。泳道5包含进样3后的流穿液级分。三个深度过滤溶解的第二沉淀批次的平均±SD蛋白载量为23,162±2,000A280单位。这相当于至少约1L/1L起始血浆的Q-Sepharose柱大小，以满足上标准差和10％的安全系数。
通常，使用离子交换色谱法的IgG分离利用阴离子交换作为阴性选择(即IgG未结合)，与阳离子交换作为IgG结合的阳性选择剂，随后杂质从结合的IgG中洗涤后洗脱。阳离子交换色谱中的此类结合、洗涤和洗脱步骤限制了此类方法的可扩展性，也增加了过程中IgG损失的机率。
发明人利用图6所示的关于Q-SepharoseTM柱容量的信息开发了一种不同的色谱框架。经过溶解和深度过滤的第二沉淀材料最初在Q-SepharoseTM(阴离子交换剂)柱(14A280/mL)上进行处理，以生成适用于不同下游色谱方案的材料池。随后，将代表5mL Q-SepharoseTM单次柱流过的一定量此类混合材料分别用于第二个5mL Q-SepharoseTM柱、5mLDEAE SepharoseTM柱、5mL CM-SepharoseTM柱或与5mL CM SepharoseTM柱偶联的5mL DEAESepharoseTM柱。对于偶联的DEAE/CM柱，在洗脱CM SepharoseTM柱之前，将DEAE SepharoseTM柱与CM SepharoseTM柱分离。图7提供了衍生自各种色谱柱方案的IgG产物的bis-Tris SDS-PAGE凝胶。泳道1含有分子量标准品。泳道2包含来自单个Q-SepharoseTM柱的初始流穿液。泳道3含有来自CM SepharoseTM柱的洗脱液。泳道包含从DEAE SepharoseTM柱中流出的物质以及从CM SepharoseTM柱中流出的洗脱液。泳道5包含来自DEAE SepharoseTM柱的流穿液。泳道6含有DEAE SepharoseTM柱的洗脱液。泳道7含有来自第二Q-Sepharose柱的流穿液。泳道8含有来自第二Q-SepharoseTM柱的洗脱液。箭头表示去除了高分子量组分的树脂组合，从而产生了更高纯度的产品。
通过LCMS分析图7中箭头所示的材料，以测定每个柱方案中产生的相对IgG纯度。所有柱排列的产物似乎具有相似的纯度。
使用贫冷冻沉淀血浆以2L规模和连续排列的两个类似大小的2LQ-SepharoseTM柱进行了三次完整运行。色谱在AKTAExplorer FPLCTM系统上实施。这些过程的最终条件如下：2x 2L Q-SepharoseTM柱(1x AxichromeTM 100/300和1xAxichromeTM 140/300)，依次偶联，并在pH 5.7的20mMNaOAC溶液中平衡。以45mL/min的速度加载柱，以50mL/min的速度洗涤，并用2MNaCl步骤(以9500mL进行)洗脱。根据A280读数收集1升级分。在这些条件下，获得了FXIa水平可接受的高纯度IgG，表明该过程是可扩展的。三个批次(D、E和F批)过滤后的物理特性见下表3。
表3
一般而言，所有2L规模的过程在色谱分析中的进行相同操作，在图谱或级分收集之间没有显著差异。出于说明的目的，选择批次E作为代表性示例。当A280达到50mAU时开始收集产物的级分，当吸光度降至125mAU时终止。如图8所示，令人惊讶的是，主要流穿峰(级分1-5)的形状不对称，含有3-4个不同的特征，在900mAU/mL的最大A280处达到顶峰。主峰后观察到两个较小的特征(级分6，双相峰和级分8的单峰)。洗脱峰(洗脱级分)的形状基本对称，有复杂的材料拖尾。在图8所示的色谱图中，各个级分用竖线表示。
图9示出了在每泳道加载10个A280单位的从EQ-SepharoseTM/Q-SepharoseTM批次色谱中收集的相应级分的凝胶上进行的非还原bis-tris SDS-PAGE的结果。泳道标记对应于图8中的标记部分。“最终池”由级分1至5组成，每份级分似乎都是纯IgG(150kDa)，在级分5中可见轻微的额外条带(～200kDa)。该条带显然是级分6中所含物质双相峰的“浸出”，似乎由～200kDa蛋白类与IgG类混合组成。最终池(级分1至5)中IgG含量>95％，无明显杂质存在。
法规要求可能需要在为人类使用而生产的人类衍生产品的任何生物加工中包括两个病毒灭活/去除步骤。为此，本发明构思的方法可包括对第二沉淀应用病毒灭活步骤，和/或在离子交换层析后进行纳滤以除去病毒。
可改变2升规模的方法，以在例如深度过滤前在室温下用20mM辛酸钠处理1小时进行病毒灭活。向溶解的第二沉淀中加入辛酸盐，可形成少量白色沉淀物。表4示出了通过Q-SepharoseTM色谱法处理的样品中辛酸盐的含量。经过Sartoclere TMDL10深度过滤后，在澄清样品中可检测到63％的原始辛酸盐团块。当在P2稀释后深度过滤样品表明在SartoclereTM XLG灭菌过滤样品后，在再过滤的步骤中辛酸盐不会损失。在Q-SepharoseTM色谱过程中，所有剩余的辛酸盐均被去除，在该过程步骤后的任何IgG级分中均未观察到可检测到的辛酸盐水平。
表4
除病毒灭活外，还可应用病毒去除(如通过纳滤)进行病毒的去除。例如，在本发明构思的方法中，纳滤可用作两个病毒灭活/去除步骤中的第二步。病毒去除可使用任何合适的纳滤膜/纳滤设备和/或方法完成。合适的纳滤设备包括但不限于Sartorius VirosartMaxTM 0.1μm预过滤器，然后是Sartorius Virosart HCTM 0.02μm病毒去除过滤器。在典型的病毒去除步骤中，在添加产品材料之前，按照制造商的说明，依次连接预过滤器和病毒去除过滤器并用水冲洗。例如，一组耦合的220cm2 Virosart MaxTM和Virosart HCTM过滤器(Sartorius)可用于处理约2L血浆中的物质。或者，可使用两组或更多组耦合的此类耦合过滤器来减少通过过滤器组件的通量损失并减少处理时间。
在本发明构思的整个方法中使用流穿液级分分离目的蛋白可产生其中靶蛋白的浓度对于临床应用不是最佳的溶液。因此，本发明构思的方法可以包括在目的蛋白纯化后进行的末端蛋白浓缩步骤，并利用本领域已知的技术。这样的浓缩步骤可以例如通过超滤进行，并且可以结合允许将缓冲液交换到药学上可接受的缓冲液组合物中的渗滤步骤。例如，在IgG的分离中，高度纯化的产物材料可以浓缩至约4％(w/v)或更高(例如，约5％w/v)的IgG，在浓缩步骤中用渗滤法用0.2M甘氨酸(pH 4.2至6.5)或任何其它药学上可接受的缓冲液代替现存的缓冲液。例如，这样的浓缩/渗滤步骤可以分三个步骤进行：(1)将纳滤的蛋白质溶液浓缩至约500mL的体积，(2)将约500mL的体积渗滤到制剂缓冲液(例如，8个或更多渗滤体积)中，和(3)将渗滤体积浓缩至蛋白质的目标浓度(例如，约5％w/v IgG)。例如，可以通过280nm处的吸光度来监测蛋白质浓度。
三个批次(E、F、G)的IgG总收率是使用经验证的比浊法测定起始血浆和沉淀步骤的后续级分来确定。一旦纯化效果达到90％以上的IgG纯度，就使用A280测定值和1.3的消光系数来定量IgG。表5示出了每个工艺步骤中存在的所有三个批次的平均总IgG。平均工艺收率为75％，最显著的工艺损失发生在深度过滤(约8％)和Q-SepharoseTM色谱(约9％)步骤中。
表5
使用串联排列的两个阴离子交换柱进行的色谱步骤去除了除IgG以外99％以上的所有蛋白质。令人惊讶的是，发现材料的两个小拖尾峰(图8中的级分6和8)含有IgG类，并且不含可检测到的IgA或IgM(通过ELISA)。这两种级分中的IgG类不成比例地为(约30％)IgG4。发明人认为，Q-SepharoseTM色谱流穿液级分的非典型形状是由于输入柱的样品中发现的四种IgG亚类的差异、瞬时保留所致。IgG亚类ELISA数据表明，IgG1在整个流穿液级分中连续出现，第二个肩部(图10中的级分3)似乎富含2型和3型，而IgG4主要在主UV“峰”(级分5)末端洗脱。这一意外结果可能是由于在所用缓冲液电导率(约7mS)下，与阴离子交换树脂的IgG相互作用有限所致，从而在本质上阻碍了一些IgG亚类在不结合的情况下通过柱。发明人认为，可以优化缓冲条件和阴离子交换介质选择和/或容量，以在从血液制品开始的完整过程中，在来自阴离子交换色谱的流穿液级分中提供IgG亚类分离。
在用于蛋白质分离的现有技术方法中，蛋白质产物的收率和纯度之间通常存在相反的关系。令人惊讶的是，发明人已经发现本发明构思的方法可以提供非常高的收率(超过起始材料的IgG含量的70％)和高纯度。使用本发明构思的方法，使用串联排列的两个Q-SepharoseTM柱，在流穿液级分中收集IgG，进行了全面分析检测，以检查多次IgG产品纯化的安全性和共纯化非IgG蛋白含量。
如图10所示，SDS-PAGE表明产品IgG纯度>98％，与目前市售的人用IgG产品相当或更高。具体而言，与市售静脉注射IgG产品(GammagardTM、GamunexTM、PrivagenTM和BivigamTM)相比，最终产品IgG的HMW杂质更少。
表6示出了采用两种Q-SepharoseTM的本发明方法的IgG产品的分析检测结果。为此，将使用本发明构思的这种方法生产的2L规模批次的IgG产品配制在pH 4.2的0.2M甘氨酸中，目标为约5％的总蛋白质。这与人类使用的治疗性IgG产品的当前实践一致。通过分光光度法测定280nm处的吸光度确定IgG浓度。对最终产品制剂进行了额外的蛋白质含量测定。三种最终制剂的方法的平均浓度(N＝5)分别为41.2、52.9和50.9mg/mL。IgG亚类分布通过IgG亚类ELISA测定，在三种最终制剂中测定为63％IgG 1、28％IgG2、7％IgG3和2％IgG4。相应的贫冷冻沉淀血浆起始材料值为59％IgG 1、29％IgG2、7％IgG3和4％IgG4。对于其他免疫球蛋白种类，仅通过ELISA检测到IgA(3.3μg/mL)，并由LCMS进行确认。然而，IgA含量低于4μg/mL。ELISA法未检测到IgM，LCMS法仅检测到微量的IgM、IgE和IgD肽。
表6
本发明构思的使用串联排列的两个阴离子交换柱的IgG分离方法的产物的特征在于与安全性和有效性相关的含量。因此，针对多种2L规模最终产品制剂，对抗A、B和D抗体、抗补体活性(ACA)、蛋白激酶A(PKA)活性、Fc功能、通过凝血酶生成试验(TGA)测得的活化凝血因子XI(FXIa)活性以及非活化部分凝血活酶时间(NAPTT)活性进行了表征。结果如下：
·抗A、B、D抗体：所有三个批次的检测产品均通过了人用产品的典型可接受标准。
·Fc功能/聚合：在两种试验IgG浓度下，所有三个批次产品的Fc功能>100％，符合或超过人用IgG产品的典型可接受标准。此外，SE-HPLC数据表明>96％的IgG为单体，二聚体<4％，高阶聚合物<0.2％，Ig片段几乎无法检测到。这符合FDA和欧盟对人用IgG产品的要求。
·PKA和ACA活性：PKA和ACA活性是对杂质存在的检测，这些杂质可通过其各自的蛋白水解级联作用导致先天性免疫的激活/失活。PKA活性较低(平均值＝1.3IU/mL)，远低于人用IgG产品的35IU/mL可接受标准。然而，ACA活性高于1.0CH50 U/mg。
·促凝血活性：凝血时间测定固有的促凝血活性(无论来源)，而TGA分析测定FXIa样活性。在最低稀释度下，批次E(141秒)勉强未能达到>150秒的可接受标准，而批次F和G通过。所有三个批次中的FXIa样活性略高(>2.0mU/mL)，表明在纯化过程中的某个时间点激活了凝血接触途径。为了消除FXIa(即活化因子XI)和其他微量杂质，可以使用阳离子交换柱，通过结合Q-SepharoseTM洗脱液中发现的IgG以及随后从阳离子交换介质中洗脱IgG，将阳离子交换柱施加到串联排列的Q-SepharoseTM柱的流出液。在优化该方法的条件的同时，发明人惊奇地发现污染的接触活化因子(例如活化因子XI)以及其它杂质以比IgG更高的亲和力结合到阳离子交换介质。该观察结果用于衡量阳离子交换介质的容量，以匹配杂质的量，从而防止IgG与阳离子交换介质结合。通过这种调节，阳离子交换介质可用于阴性选择模式(即，在流穿液液中收集所需的蛋白质产物)，如下所示。
或者，本发明构思的一些实施方案利用阴离子和阳离子交换色谱，其中选择或优化缓冲条件、差异蛋白亲和力和离子交换色谱介质的结合能力，以在每个色谱步骤的流穿液级分中提供靶蛋白(例如IgG)。为此，可使用不会明显结合目的蛋白的高容量离子交换介质进行初始离子交换步骤(例如，阴离子交换、阳离子交换)。例如，在IgG的分离中，可以进行大/高容量阴离子交换步骤，提供包含IgG的流穿液级分并保留包含污染蛋白的结合级分。然后将流穿液级分(在一些实施方案中，在添加盐以调节离子强度/电导率之后)施加到小容量或低容量阳离子交换介质。应当理解，在利用阴离子和阳离子交换的常规方法中，阳离子介质以与阴离子交换步骤相反的模式使用(其中IgG存在于流穿液级分中)。在常规的IgG分离过程中，靶蛋白(IgG)会保留在阳离子交换介质上，而剩余的蛋白杂质会出现在流穿液级分。洗涤或漂洗阳离子交换介质后，通过洗脱(例如，使用含盐量高的缓冲液)回收IgG。
与典型的方法相反，在本发明构思的该实施方案中，阳离子交换步骤被设计成结合杂质，而目的蛋白(IgG)保留在流穿液级分中。选择这种小或低容量阳离子交换介质的大小，使得其接近或稍微(例如，1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％)大于在阴离子交换介质的流穿液中发现的污染蛋白的穿透量或容量(考虑缓冲条件)。不希望受理论的束缚，发明人相信这允许污染蛋白置换可能暂时结合到阳离子交换介质的任何IgG。仔细选择阳离子交换介质的量/容量可有效去除污染蛋白，同时还可在流穿液级分中提供高收率的IgG。
本发明构思的过程的另一个示例如下面的图11中示出。应当理解，在这种情况下，血液制品可以是血清、血浆、冷藏血浆、冷冻血浆、回收血浆、重构冻干血浆、贫冷冻沉淀血浆、冷冻沉淀物已经重新溶解于其中的贫冷冻沉淀血浆，或者由施加到此类材料的沉淀和/或纯化步骤产生的级分(例如，上清液或溶解的沉淀)。还应当理解，虽然具体列举了血液制品，但是这些方法适用于含有目的蛋白的任何溶液(例如，细胞培养基、来自细胞培养物的细胞的裂解物、细菌裂解物、溶剂化的包涵体等)。通过盐沉淀(例如，用柠檬酸盐或乙酸盐)产生的沉淀被重新溶解并施加到阴离子交换介质。
在一些实施方案中，这种再溶解的物质可以被澄清，例如通过经过一个或多个过滤器，以便除去会污染色谱介质的残留的未溶解或沉淀的物质。在一些实施方案中，这种再溶解的沉淀的缓冲液组成可以在施加到阴离子交换介质之前进行改变。在一些实施方案中，这可以通过缓冲液交换(即，从含蛋白溶液中除去盐的过程)来实现，例如通过尺寸排阻色谱法、透析、渗滤、通过超滤浓缩然后稀释、电渗析和/或再沉淀(例如，使用PEG)然后再溶解。或者，在优选实施方案中，可稀释这种再溶解的沉淀(其保留了最初存在于再溶解的沉淀中的盐)，直到达到所需的渗透压和/或电导率(例如，2至10mS)。使用阳离子交换介质将来自阴离子交换步骤的流穿液级分转移至低容量阳离子交换步骤。与其它方法相反，在该第二阳离子交换步骤的流穿液级分中以高收率(例如，相对于起始材料中目的蛋白的含量大于70％、75％、80％、85％、90％或95％))和高纯度(例如，大于80％、85％、90％、95％、98％、或99％)回收目的蛋白。初始离子交换步骤显示为阴离子交换步骤，然而，也考虑使用高容量阳离子交换介质进行初始离子交换步骤，随后进行低容量阴离子交换步骤(目的蛋白质主要存在于两个离子交换步骤的流穿液体积中)的实施方案，并可施加到分离IgG以外的蛋白质。
本发明构思的另一个实施方案在图12中示出，其中对来自分级分离步骤的上清液进行初始离子交换步骤。还应当理解，虽然具体列举了血液制品，但是这些方法适用于含有目的蛋白的任何溶液(例如，细胞培养基、来自细胞培养物的细胞的裂解物、细菌裂解物、溶剂化的包涵体等)。尽管初始离子交换步骤显示为阴离子交换步骤，但也考虑了使用高容量阳离子交换介质进行初始离子交换步骤和使用低容量阴离子交换介质进行第二离子交换步骤的实施方案。例如，此类方法可用于分离IgG以外的蛋白质。
在一些这样的实施方案中，从盐分级分离获得的上清液可以被澄清，例如通过经过一个或多个过滤器，以便除去会污染色谱介质的残留颗粒或沉淀物质。在一些实施方案中，这种上清液的缓冲液组成可以在施加到阴离子交换介质之前进行改变。这可以通过缓冲液交换(即从含蛋白溶液中除去盐的过程)来实现，例如通过尺寸排阻色谱法、透析、渗滤和/或沉淀(例如使用PEG)，然后溶解。或者，在优选实施方案中，可稀释此类上清液(其保留了最初存在于上清液中的盐)，直至达到所需的渗透压和/或电导率(例如，2至10mS)。利用阳离子离子交换介质(例如，含有羧酸和/或磺酸基团的介质)，将来自阴离子交换步骤的流穿液级分转移至低容量阳离子交换步骤。与现有技术方法相反，目的蛋白在阴离子交换步骤的流穿液级分中被发现，并在第二阳离子交换步骤的流穿液级分中以高收率(例如，相对于起始材料中目的蛋白的含量，大于70％、75％、80％、85％、90％或95％)和高纯度(例如，大于80％、85％、90％、95％、98％，或99％)回收。
尽管图11和12中的初始离子交换步骤显示利用阴离子交换步骤，随后将流穿液级分施加到低容量阳离子交换步骤(随后从阳离子交换流出物中回收目的蛋白)。发明人设想了类似的方法，其利用初始阳离子交换步骤，随后将流穿液级分施加到低容量阴离子交换步骤，并从阴离子交换的流穿液级分中回收目的蛋白。此类方法可用于非IgG蛋白的分离。
发明人已经发现本发明构思的方法特别适用于从血浆中分离IgG，尽管施加到含有IgG的其它溶液(例如，细胞培养基、细胞裂解物、其它体液等)也是可以预期的。在本申请的上下文中，血浆被视为包括新鲜采集的血浆、冷藏血浆、冷冻血浆、贫冷冻沉淀血浆和冷冻沉淀已重新溶解于其中的贫冷冻沉淀血浆。例如，此类血浆可从商业采集中心获得。图13中示出了用于从血浆中分离IgG的本发明构思的方法的示例。
对于图13中所示的前两个步骤，发明人使用用于两个沉淀步骤的盐浓度范围来修改和/或优化碱分级分离过程，以确定最佳浓度(即，在第一次盐沉淀中约11％，在第二次盐沉淀中约26％)，并使IgG收率最大化，同时使不需要的蛋白质最小化。这种盐可以以盐溶液(例如，以5％(以重量计)盐溶液的计算体积)和/或干燥形式(例如，以粉末或结晶固体)快速加入。如图所示，第一个沉淀步骤产生富含IgG的上清液，第二个沉淀步骤产生富含IgG的沉淀物或糊状物。在离子交换步骤之前，将这种富含IgG的沉淀物溶解(如溶于水)。如下所述，在这些方法的优选实施方案中，在离子交换步骤之前不进行缓冲液交换步骤(例如，透析、渗滤、超滤后稀释、尺寸排阻色谱法等)。
要使放大工艺成功，需要避免工艺步骤中使用的介质(如色谱介质)结垢。这种放大工艺可利用约500-600L(例如，用于超免疫)至8000L或更多(例如，用于正常IgG)的血浆或血清。申请人已经发现，在初始分级分离步骤中利用柠檬酸盐沉淀的现有技术方法(例如在美国专利No.7,879,331中描述的那些)在用于放大时是不实用的，在所述放大试验时缓冲液交换的简单袋式透析变得不切实际(例如，约1L或更少)。发明人发现，由于渗滤膜的快速结垢，试图用渗滤代替袋式透析以支持更大规模的应用是不切实际的，即使沉淀的物质在被处理的蛋白质溶液中可能不明显。
为此，发明人发现过滤可用于除去残留的未溶解或悬浮的物质和/或在富含IgG的沉淀溶解后沉淀的物质(例如，在病毒灭活时)。令人惊讶的是，发明人发现在离子交换步骤之前所用过滤介质的选择对IgG的浓度和不希望的杂质(例如，因子XI，因子XII)的浓度都有很大影响。表7示出了用于大规模IgG分离的过滤器筛选研究的典型结果。
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表7
很明显，过滤器组成会影响所需IgG产品在过滤器材料上的保留以及因子XI和因子XII等杂质的保留。特别是使用硅藻土深度过滤器(如Fl)时，IgG保留最小(作为总蛋白的函数)，因子XI和因子XII的污染均显著降低。相比之下，虽然发现二氧化硅(如F9)能有效去除因子XI和因子XII，但蛋白质含量的整体损失会对IgG收率产生负面影响。同样，虽然季胺/PES过滤器保留的蛋白质很少，但保留的污染蛋白质也很少或没有。
因此，在本发明构思的一些实施方案中，在离子交换步骤之前，可以将包括硅藻土的深度过滤器结合到规模IgG分离过程中。在一些这样的实施方案中，硅藻土过滤器可以是深度过滤器。在一些实施方案中，在该方法中使用的硅藻土过滤器可以排除珍珠岩。在一些实施方案中，可以在这样的过滤步骤之后进行另外的颗粒过滤步骤(例如，1μm、0.45μm、0.2μm孔过滤)，以减少后续步骤中色谱介质的结垢。在一些实施方案中，深度过滤器的尺寸可被优化以提供足够的过滤器容量和通量保持，同时最小化可导致因子XI和/或因子XII激活的可用表面积。
如图6所示，在本发明构思的IgG分离方法中，第一离子交换步骤可以使用阴离子交换介质进行。这种阴离子交换介质可以是季胺(Q)介质。这种阴离子交换介质可在各种pH条件下(例如，pH 1至14、pH 2至13、pH 3至12、pH 4至11)保持正电荷。阴离子交换介质可以在任何合适的载体(例如琼脂糖、交联琼脂糖、纤维素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、玻璃或其组合)上并以任何合适的构型(例如多孔珠、非多孔珠、纤维、织物、过滤器等)提供。
在本发明构思的优选实施方案中，来自第二沉淀步骤的再溶解的沉淀物在施加到阴离子交换介质之前不经过缓冲液交换过程。在本申请的上下文中，缓冲液交换过程是指从含有目的蛋白(例如IgG)的溶液中除去盐的过程。此类过程的示例包括但不限于透析、渗滤、超滤浓缩后稀释和尺寸排阻色谱法。此类缓冲液交换过程不包括简单稀释未浓缩的再溶解沉淀，其保留蛋白质溶液中存在的盐。由于在离子交换步骤的流穿液级分中回收目的蛋白(例如IgG)，因此优选的是，如果进行稀释，则使用最小体积(例如，小于原始体积的3倍，约原始体积的1.5倍至2.5倍，约原始体积的2倍，约原始体积的1.5倍，或约为原始体积)的稀释剂进行。
如图6所示，在本发明构思的放大IgG方法中，IgG以流穿液(即未结合)级分的形式从阴离子交换介质中回收。该第一流穿液级分随后被施加到小的或低容量的阳离子交换介质(例如，包括羧酸酯或磺酸酯基团的介质)上，在所述介质中已经选择了尺寸/容量和缓冲条件，使得在IgG(其通常也结合到阳离子交换介质上)在流穿液级分(即，第二流穿液级分)中通过时保留污染的蛋白质。通常，阳离子交换介质的容量或大小选择为等于或略大于(例如，1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、50％、75％或100％)其对第一流穿液级分中存在的杂质的量。不希望受理论的束缚，发明人相信，当如此选择阳离子交换介质和结合条件时，IgG被污染蛋白取代，因此保留在第二流穿液级分，由此与结合IgG然后洗脱的方法相比提高了收率。在优选的实施方案中，IgG在阳离子交换步骤中的损失小于起始材料的IgG含量的约10％、8％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。
这种阳离子交换介质可以在任何合适的载体(例如琼脂糖、交联琼脂糖、纤维素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、玻璃或其组合)上并以任何合适的构型(例如多孔珠、非多孔珠、纤维、织物、过滤器等)提供。发明人已经发现所使用的阳离子交换介质的容量可以非常小，并且在优选的实施方案中可以由具有侧链阳离子交换基团的过滤器提供。这有利地结合了纯化和澄清步骤。
在本发明构思的一些实施方案中，第一流穿液级分的缓冲液组成、电导率和/或pH值可以在施加到阳离子交换介质之前进行改变，以优化对杂质的容量和选择性。在优选的实施方案中，可以加入盐以增加第一流穿液级分的离子强度或电导率，使其落在期望的范围内。
在一些实施方案中，第二流穿液级分可以经受额外的处理步骤。此类额外处理步骤可包括用于去除病毒的纳滤，如使用0.02μm微孔膜的过滤。发明人已经发现，这有效地保留了所有剩余的病毒颗粒，同时使收率损失最小化。
在一些实施方案中，可以通过浓缩和渗滤制备纯化的蛋白质溶液以供使用，从而提供药物产品，所述药物产品在提供稳定性的药理学相容缓冲液中具有可用的浓度。对于IgG，此步骤可在适当的制剂缓冲液(例如，pH 4.2至pH 6.5的0.2M甘氨酸)中提供例如约4％至6％IgG(w/v)或更高的IgG浓度，且损失最小。可以使用已知方法增加或调整浓度。
本发明构思的IgG分离方法的典型IgG收率结果如表8所示。
表8
从表8中所示材料获得的试验结果符合所有商用IgG产品的发布标准。结果见
表9和表10。
表9
表10
除了显著低水平的因子XI杂质外，发明人还发现本发明构思的方法提供了令人惊讶的低水平的IgA杂质。
上述方法是稳健的和商业上可扩展的方法，其在仅24至72小时(优选约48小时)内从起始血浆持续产生约72-85％的IgG收率(相对于起始材料的IgG含量)。最终产物为>99％纯度的IgG产物，具有100％的功能。
应当理解，可以从通过本发明构思的方法产生的各种中间废物流中回收另外的血浆蛋白，例如，在第一分级分离步骤中产生的沉淀、在第二分级分离步骤中产生的上清液、来自阴离子交换步骤的结合部分和/或来自阳离子交换步骤的结合部分。在一些实施方案中，两种或多种这样的中间产物流可以组合作为待分离的非IgG血浆蛋白的来源。可通过任何合适的方法(例如，额外的沉淀步骤、亲和层析、尺寸排阻色谱、疏水相互作用层析、离子交换层析和/或混合模式层析)处理此类中间产物，以促进从起始材料中分离额外的非IgG蛋白。
发明人相信，柠檬酸盐沉淀步骤比现有技术的乙醇沉淀方法更温和，并且使蛋白质变性的风险最小化，因为IgG产品是在没有醇、极端的pH值变化、多次和长时间暴露于极端温度和长时间处理的情况下产生的。避免乙醇和低pH值对改善蛋白质稳定性、体内半衰期、蛋白质治疗剂的免疫原性、患者耐受性和更快的输注速率具有重要意义。
本发明人的方法也是环境友好的(盐与醇)，并且比基于Cohn分级分离的方法更具成本效益。
对本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本文的发明构思的情况下，除了已经描述的那些之外，许多更多的修改是可能的。因此，除了所附权利要求的精神之外，本发明的主题不受限制。此外，在解释说明书和权利要求时，所有术语都应该以与上下文一致的尽可能广泛的方式来解释。特别地，术语“包括”和“包含”应当被解释为以非排他性的方式指代元件、组件或步骤，表明所引用的元件、组件或步骤可以存在、利用或与未明确引用的其他元件、组件或步骤组合。其中说明书权利要求书涉及选自A、B、C....和N中的至少一种，文本应被解释为只需要该组中的一个元素，而不是A和N，或B和N等。
Claims (62)
1.一种从包含靶蛋白质和多种杂质的溶液中分离靶蛋白质的方法，包括：
向溶液中加入盐以产生上清液和沉淀；
将沉淀溶解在水溶液中以产生溶解的沉淀，所述溶解的沉淀包含靶蛋白质和多种杂质的第一部分；
将溶解的沉淀施加到具有第一极性的第一电荷的第一离子交换介质上，以产生包含多种杂质的第二部分的第一结合级分和第一流穿液，其中第一流穿液液包含靶蛋白质和多种杂质的第三部分；以及
将所述第一流穿液施加到具有第二极性的第二电荷的第二离子交换介质上，其中所述第二极性与所述第一极性相反，以产生包含所述多种杂质的第三部分的第二结合级分和包含所述靶蛋白的第二流穿液；
其中选择第二交换介质的容量，使得在使用第二离子交换介质进行离子交换时，溶液中靶蛋白质的含量损失少于10％。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述溶液是血浆。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述溶液是分离步骤的产物。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述盐是柠檬酸盐或乙酸盐。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述第一离子交换介质是阴离子交换介质，所述第二阴离子交换介质是阳离子交换介质，并且所述靶蛋白质是免疫球蛋白G。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述多种杂质包括因子XI或活化的因子XI。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述第一离子交换介质被配置为颗粒或珠。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述第二离子交换介质被配置为过滤器。
9.根据权利要求1到8中任一项所述的方法，进一步包括将辛酸盐添加到所述溶解的沉淀中。
10.根据权利要求9所述的方法，包括添加辛酸盐后去除固体。
11.根据权利要求10所述的方法，其中去除固体包括应用过滤步骤，其中所述过滤器包括硅藻土，包括选择所述过滤器以选择性保留因子XI或因子XII。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述深度过滤器不包括珍珠岩。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述靶蛋白质的收率为至少70％。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，包括从所述上清液中回收至少一种额外的蛋白质。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述溶液的体积为至少500L。
16.一种用于从包含靶蛋白质和多种杂质的溶液中分离靶蛋白质的系统，包括：
分级分离模块，被配置为接收所述溶液并执行盐分级分离步骤，产生上清液和沉淀物，将所述上清液与所述沉淀分离，并提供包含所述靶蛋白质和所述多种杂质的第一部分的沉淀作为第一输出；
第一分离模块，包括具有第一极性的第一电荷的第一离子交换介质，并且流体地连接到第一输出，其中第一分离模块被配置为提供包括流穿液级分的第二输出，并且其中流穿液级分包括靶蛋白质和多种杂质的第二部分；和
第二分离模块，包括具有第二极性的第二电荷的第二交换介质，其中所述第二极性与所述第一极性相反，其中所述第二分离模块被配置为保留所述多种杂质的第三部分并提供包含所述靶蛋白质的第三输出，并且其中所述第二分离模块包含一定量的第二离子交换介质，所述一定量的第二离子交换介质被选择以提供第二离子交换介质的容量，使得通过第二离子交换介质进行色谱分析时，溶液中靶蛋白质的含量损失少于10％。
17.根据权利要求16所述的系统，包括位于所述分级分离模块和所述第一分离模块之间的流体路径内的病毒灭活模块。
18.根据权利要求16或17所述的系统，其中所述第一离子交换介质是阴离子交换剂，所述第二离子交换介质是阳离子交换剂，并且所述靶蛋白质是免疫球蛋白G。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的系统，其中所述多种杂质包括选自因子XI、活化的因子XI、因子XII和活化的因子XII的凝血因子。
20.根据权利要求16至19中任一项所述的系统，其中所述溶液是血浆。
21.根据权利要求16至19中任一项所述的系统，其中所述溶液是来自应用于血浆的沉淀步骤的上清液或沉淀。
22.根据权利要求16至21中任一项所述的系统，还包括插在所述第一输出和所述第一分离模块之间的深度过滤器。
23.根据权利要求22所述的系统，其中所述深度过滤器包括硅藻土，并且被选择以选择性地减少通过所述深度过滤器的物质中的因子XI或因子XII的含量。
24.根据权利要求23所述的系统，其中所述深度过滤器不包括珍珠岩。
25.根据权利要求16至24中任一项所述的系统，其中所述溶液的体积至少为500L。
26.一种从包含靶蛋白质和多种杂质的溶液中分离靶蛋白质的方法，包括：
向溶液中加入盐以产生上清液和沉淀，其中上清液包含靶蛋白质和多种杂质的第一部分；
将上清液施加到具有第一极性的第一电荷的第一离子交换介质上，以产生包含多种杂质的第二部分的第一结合级分和第一流穿液，其中第一流穿液包含靶蛋白质和多种杂质的第三部分；以及
将所述第一流穿液液施加到具有第二极性的第二电荷的第二离子交换介质上，其中所述第二极性与所述第一极性相反，以产生包含所述多种杂质的第三部分的第二结合级分和包含所述靶蛋白质的第二流穿液；
其中选择第二交换介质的容量，使得在使用第二离子交换介质进行离子交换时，溶液中靶蛋白质的含量损失少于10％。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述溶液是血浆。
28.根据权利要求26或27所述的方法，其中所述溶液是分级分离步骤的产物。
29.根据权利要求26至28中任一项所述的方法，其中所述盐是柠檬酸盐或乙酸盐。
30.根据权利要求26至29中任一项所述的方法，其中所述第一交换介质被配置为颗粒、珠或过滤器。
31.根据权利要求26至29中任一项所述的方法，其中所述第二交换介质被配置为过滤器。
32.根据权利要求26到31中任一项所述的方法，进一步包含将辛酸盐添加到所述上清液中。
33.根据权利要求32所述的方法，包括添加辛酸盐后去除固体。
34.根据权利要求33所述的方法，其中去除固体包括使用包含硅藻土的深度过滤器。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述深度过滤器不包括珍珠岩。
36.根据权利要求26到35中任一项所述的方法，其中所述蛋白质的收率为至少70％。
37.根据权利要求26至36中任一项所述的方法，包括从所述沉淀中回收至少一种额外的蛋白质。
38.根据权利要求26至37中任一项所述的方法，其中所述溶液的体积为至少500L。
39.一种用于从包含靶蛋白质和多种杂质的溶液中分离靶蛋白质的系统，包括：
分级分离模块，被配置为接收血液产品并进行盐分级分离步骤，产生上清液和沉淀，从沉淀中分离上清液，并提供上清液作为第一输出，其中上清液包含靶蛋白质和多种杂质的第一部分；
第一分离模块，包括具有第一极性的第一电荷的第一离子交换介质，并且流体地连接到第一输出，其中第一分离模块被配置为提供包括流穿液级分的第二输出，并且其中流穿液级分包括靶蛋白质和多种杂质的第二部分；和
第二分离模块，包括具有第二极性的第二电荷的第二交换介质，其中第二极性与第一极性相反，其中第二分离模块被配置为保留多种杂质的第三部分并提供包含靶蛋白质的第三输出，并且其中第二分离模块包含一定量的第二离子交换介质的量，所述一定量的第二离子交换介质被选择以提供第二种离子交换介质的容量，使得通过第二离子交换介质进行色谱分析时，溶液中靶蛋白质的含量损失少于3％。
40.根据权利要求39所述的系统，包括位于所述分级分离模块和所述第一分离模块之间的流体路径内的病毒灭活模块。
41.根据权利要求39或40所述的系统，其中所述溶液是血浆。
42.根据权利要求39或40所述的系统，其中所述溶液是源自施加到血浆的分级分离步骤的上清液或沉淀。
43.根据权利要求39至42中任一项所述的系统，其中所述溶液的体积为至少500L。
44.一种分离免疫球蛋白G的方法，包括：
向包含免疫球蛋白G(IgG)的水溶液中添加柠檬酸盐至以重量计至少10％的浓度，从而产生第一上清液和第一沉淀，其中所述IgG包含多个IgG亚类；
从第一沉淀中分离第一上清液；
向第一上清液中加入柠檬酸钠至以重量计至少22％的浓度，从而产生第二上清液和第二沉淀；
从第二上清液中分离第二沉淀；
溶解第二沉淀以产生溶解的第二沉淀；
将溶解的第二沉淀的电导率调节至1-10mS(5mS至10mS，而不是7mS),以形成稀释的蛋白质溶液；
将稀释的蛋白质溶液施加到包含阴离子交换介质的第一离子交换柱以产生第一流穿液；以及
将所述第一流穿液施加到包含阴离子交换介质的第二离子交换柱，以产生包含免疫球蛋白G制品的第二流穿液，其中所述第二流穿液提供两种或多种免疫球蛋白G亚类的至少部分分离，并且其中所述免疫球蛋白G制品具有至少85重量％的纯度。
45.根据权利要求44所述的方法，包括向所述溶解的第二沉淀添加脂肪酸以形成悬浮液，其中所述脂肪酸包含具有4至10个碳的碳链。
46.根据权利要求44或45所述的方法，包括将溶解的第二沉淀施加到深度过滤器。
47.根据权利要求46所述的方法，包括选择所述深度过滤器的组成和尺寸，以避免溶解的第二沉淀中存在的凝血因子的活化。
48.根据权利要求44至47中任一项所述的方法，其中调节电导率不是通过缓冲液交换来进行的。
49.根据权利要求44至48中任一项所述的方法，其中所述阴离子交换介质包含季胺。
50.根据权利要求44至49中任一项所述的方法，包括：
在IgG与阳离子交换介质结合的条件下，将含有免疫球蛋白的第二流穿液施加到阳离子交换介质；
洗涤阳离子交换介质；和
从阳离子交换介质中洗脱结合的IgG。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述阳离子交换介质包含羧酸基团。
52.根据权利要求44至51中任一项所述的方法，其中所述第一离子交换柱和所述第二离子交换柱通过流体流动路径彼此串联耦合。
53.根据权利要求44到52中任一项所述的方法，其中在施加到所述第二离子交换柱之前，收集并汇集所述第一流穿液。
54.根据权利要求44至53中任一项所述的方法，其中所述水溶液的体积为至少500L。
55.一种药物组合物，包含：
浓度至少为40mg/mL的免疫球蛋白G(IgG),其中所述IgG的纯度大于95％，并且尚未从色谱介质中洗脱；和
浓度小于10μg/mL的免疫球蛋白A。
56.根据权利要求55所述的药物组合物，其中活化的因子XI的含量小于1mU/mL。
57.根据权利要求55或56所述的药物组合物，其中因子XII的含量小于0.1μg/mL。
58.根据权利要求55到57中任一项所述的药物组合物，其中从至少2L血浆中分离IgG。
59.一种改善治疗性蛋白质的耐受性和增加输注速率的方法，包括：
通过权利要求1至15中任一项所述的方法分离所述治疗性蛋白质，其中所述治疗性蛋白质具有至少95％的纯度，并且尚未经历变性条件；和
提供用于输注的治疗性蛋白质。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述治疗性蛋白质是IgG。
61.一种改善治疗性蛋白质的耐受性和增加输注速率的方法，包括：
通过权利要求26至38中任一项所述的方法分离所述治疗性蛋白质，其中所述治疗性蛋白质具有至少95％的纯度，并且尚未经历变性条件；和
提供用于输注的治疗性蛋白质。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述治疗性蛋白质是IgG。
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