CN108779144B - 从血液原料中提取蛋白质的方法 - Google Patents

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Abstract

本文描述了从血液原料产生多种蛋白质产品的方法，包括α‑1‑蛋白酶抑制剂、γ球蛋白、白蛋白和其他蛋白质。本发明方法包括以下步骤：盐析分级分离、层析、超滤、渗滤、溶剂‑去污剂处理和无菌过滤。本发明的方法简单，并且有效地以高产率产生α‑1‑蛋白酶抑制剂、γ球蛋白、白蛋白和其他蛋白质。可以选择处理工艺步骤的顺序以从例如上清液、糊沉淀、层析流穿液和层析洗涤液等各种中间过程材料获得多种产品。

Description

从血液原料中提取蛋白质的方法
相关申请
本申请要求2016年2月3日提交的美国临时专利申请62/290638的优先权。
技术领域
本发明的领域为用于提高α-1-蛋白酶抑制剂(也称为α-1抗胰蛋白酶)、白蛋白、免疫球蛋白或其他蛋白质产品的纯度和产量的改进方法。
背景技术
以下背景技术讨论包括可能有助于理解本发明的信息，并非承认本申请提供的任何信息为现有技术或与当前要求保护的发明相关，或者明确或暗示引用的出版物是现有技术。
Shanbrom的美国专利7,297,716公开了从冷沉淀物中分离血液产品(例如，纤维蛋白胶)的方法。Shanbrom的方法使用盐来增加冷沉淀物的产量。例如，将2-10重量％(“wt％”)柠檬酸钠加入血液或血浆中。该浓度的柠檬酸钠使病原微生物失活和/或抑制病原微生物，防止细胞和蛋白质变性，提高冷沉淀物的产量(即使没有冷冻)，并且有助于去除变性组分。从去冷沉淀血浆中，Shanbrom考虑分离各种凝血因子，包括纤维蛋白原、因子II、因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X和血小板。然而，Shanbrom没有意识到盐可以加入到先前冷冻的血液产品中，浓度高于11wt％。此外，Shanbrom还没有意识到可以从任何上清液中提取蛋白质产品，包括由多个盐析分级分离步骤形成的上清液，其产生具有11-13wt％、21-23wt％、甚至50wt％盐的中间产物。
在美国专利第7,879,331号、第7,879,332号和第8,293,242号中，发明人构想了一种盐析工艺，可在从血液产品中提取蛋白质产品时不使用乙醇。因为乙醇和其他醇类容易使所需的蛋白质变性，因此可能存在问题。
在本发明的主题中，发明人发现了简化的方法：在盐沉淀步骤之前不需要将冷沉淀与去冷沉淀血浆分离。另外，其他血液产品，包括中间过程材料(in-process material)，可以用作盐析分级分离的底物，从而分离出经纯化的蛋白质。另外，在第一糊沉淀和第二糊沉淀中保留很少蛋白质产品的情况下，可以不用重新溶解糊沉淀并进行进一步的纯化而保持较高的蛋白质产品收率。至于α-1-蛋白酶抑制剂，发明人发现在22wt％-34wt％的盐浓度下有非常少的α-1-蛋白酶抑制剂沉淀。鉴于文献教导了α-1-蛋白酶抑制剂在较高的盐浓度下沉淀，因此这个结果令人惊讶。由于糊沉淀中很少有α-1-蛋白酶抑制剂损失，所以可以从第二上清液中获得高收率。因此，工艺可通过除去糊沉淀处理步骤进行改进。本文考虑的方法包括仅提供单个盐析分级分离步骤、渗滤和单个纯化步骤(例如层析法)或这些步骤的多个步骤以纯化蛋白质的方法。
令人惊讶的是，将第二上清液施加到亲和柱上可以进行最低限度的预处理(例如生物负载过滤、溶剂/去污剂处理、渗滤或超滤)，进一步简化蛋白质产品的分离。此外，可以从各种中间过程产物获得其他蛋白质产品，例如白蛋白和免疫球蛋白。
本文讨论的这些和所有其他外部资料通过引用并入本文。在并入的参考文献中的术语的定义或使用与本文所提供的该术语的定义不一致或相悖的情况下，在本文中提供的该术语的定义适用，而参考文献中该术语的定义不适用。
除非上下文指出相反的情况，否则本文阐述的所有范围应被解释为包括它们的端点，并且开放式范围应被解释为包括商业上可行的值。同样，除非上下文指出相反的情况，否则所有值列表均应视为包含中间值。
发明内容
本发明的主题提供了用于从血液原料中生产蛋白质产品的方法。优选的方法包括以下步骤：(1)向血液原料中加入盐以产生第一中间产物，其中盐占该第一中间产物重量的11-20％；(2)分离该第一中间产物以产生第一上清液和第一糊沉淀；(3)向该第一上清液中加入盐以产生第二中间产物，其中盐占该第二中间产物重量的15-30％；(4)分离该第二中间产物以产生第二上清液和第二糊沉淀；(5)通过适当的层析法(例如，亲和层析)从该第二上清液分离第三中间产物；以及(6)通过适当的层析法(例如，离子交换层析)分离该第三中间产物以产生含有蛋白质产品的洗脱液。步骤(1)和(2)的组合或步骤(3)和(4)的组合在本文中有时称为“盐析分级分离”。在本发明主题的范围内，特别是当血液原料经过预先处理时，单个盐析分级分离步骤产生所需蛋白质和/或单个层析步骤产生具有可接受纯度的所需蛋白质。虽然优选通过层析法进行蛋白质纯化，但是也可以将本领域其他已知的蛋白质纯化方法结合到本发明的方法中，用于代替层析法或与层析法结合，以从经盐析分级分离获得的中间产物中分离出一种或多种所需的蛋白质。
可以从单批血液原料中选择性地提取几种类型的蛋白质。应当理解，可以通过盐析分级分离和/或层析法进行进一步处理第一糊沉淀、第二糊沉淀、根据本文中的发明主题产生的任何糊沉淀、来自第一层析纯化步骤(例如亲和层析)的流穿液、来自第二层析纯化步骤(例如离子交换层析)的流穿液，来自根据本文公开的发明主题的任何层析法的任何级分、以及本发明主题的其他中间过程材料。如本文所用，“中间过程材料”是指各处理过程步骤产生的材料。在优选的实施方案中，进一步处理上述材料可从血液原料中分离出蛋白质。本发明主题的中间过程材料可作为其他分级分离和/或纯化处理的起始点(例如，ProMeticLife Sciences Incorporated处理，包括血浆蛋白纯化方案，Therapure BiopharmaIncorporated处理，包括PlasmaCap EBA处理和/或其他已知的分级处理)。
如本文所用，“血液原料”定义为血浆、原料血浆、新鲜冷冻血浆、回收血浆、回输血浆、分级血浆、Cohn级分、Nitschmann和Kistler级分，以及中间过程材料。应当理解，尽管本文所述的方法不一定需要将含有冷冻血浆的产品作为起始材料，但常规的含血浆产品通常是冷冻的，并且在进一步处理或纯化之前通常需要进行解冻。
关于添加到血液原料中的盐，可以使用的盐范围很广，包括例如(但不限于)柠檬酸盐、乙酸盐、葡萄糖酸盐和/或辛酸盐。合适的盐是水溶性的。尽管优选使用水溶性盐，但不排除使用非水溶性盐(例如柠檬酸钙或其它在水中溶解度低的盐)与改善不溶性盐的溶解度的螯合剂(例如EDTA)。通常，盐含量为10.1-25wt％的第一中间产物形成第一沉淀物和第一上清液；更通常地，盐含量为10.1-11wt％、11-13wt％、13-15wt％和15-20wt％。可以通过将pH调节至3-10范围内的特定值和/或通过将混合物的温度调节至0-25℃范围内的特定值来改善蛋白质分离。
在一些实施方案中，将稳定蛋白质(例如减少多聚体形成)的还原剂添加至血液原料、第一中间产物、第一上清液、第一糊沉淀，第二中间产物、第二上清液或第二糊沉淀，和/或其任何组合中(例如三(2-羧乙基)膦(“TCEP”)、二硫苏糖醇(“DTT”)、β-巯基乙醇(“βME”)和/或其盐)。本领域已知的其他蛋白质纯化和/或稳定化的实用方法也可用作本发明主题的间歇步骤。
应当理解，可通过离心和/或过滤来分离第一中间产物以产生第一上清液和第一糊沉淀。当使用离心时，第一沉淀物形成沉淀球(即第一糊沉淀)，第一上清液可以从中倾出、移除或除去。所述沉淀球在本文中也称为糊沉淀。在更大规模的工艺下，过滤优于离心。当使用过滤时，第一上清液为滤液并且第一沉淀物形成滤饼(即第一糊沉淀/沉淀)。术语糊沉淀和沉淀物在本文中可互换使用，糊沉淀通常通过(例如)从上清液中离心分离沉淀物而获得。
关于第二上清液，典型的盐含量为15-50wt％，更通常为15-21wt％、21-23wt％、23-25wt％、25-27wt％、27-30wt％、30-33wt％、33-37wt％、37-40wt％、40-43wt％、43-47wt％和47-50wt％。由于盐被加入到第一上清液中，因此第二中间产物的盐浓度将大于第一中间产物的盐浓度。通过将pH调节至3-10的特定值和/或通过将混合物的温度调节至0-25℃的特定值可以改善蛋白质分离。在分离第一上清液和第一沉淀物时的考虑因素同样适用于第二上清液与第二沉淀物的分离。在涉及单个盐析分级分离步骤的方法中，可以使用如上所述的15-50wt％的典型盐含量。还可以对再溶解的第二糊沉淀进行盐析分级分离，其中盐浓度可以小于或大于第一盐析分级分离步骤的盐浓度。
可以首先通过层析法处理血液原料以产生第一流穿液和第一洗脱液，如图6所示。应当理解，层析法可以产生多种不同的洗脱液，并且每种洗脱液可以独立处理以产生相同或不同的蛋白质。然后以本文中描述的方式将盐添加到第一流穿液中，产生第一中间产物。将第一中间产物分离成第一上清液和第一糊沉淀。如本文中所述，可以使用：单一层析法(例如亲和层析)、按顺序使用一系列相同的层析法(例如两次离子交换层析依次执行)、具有中间过程的一系列相同的层析法(例如，离子交换层析分析后进行盐析分级分离，然后进行离子交换层析分析)、按顺序使用一系列不同的层析法(例如，亲和层析后进行离子交换层析分析)、具有中间过程的一系列不同的层析法(例如，亲和层析后进行盐析分级分离，然后进行离子交换层析分析)，或这些方案的任意组合。应当理解，虽然亲和层析和离子交换层析是优选的，但本发明的主题考虑通过凝胶渗透层析、尺寸排阻层析、阳离子交换层析、阴离子交换层析、疏水相互作用层析、羟基磷灰石层析、氟磷灰石层析、扩张床吸附层析或固定化金属离子亲和层析对血液原料进行处理。
如本文所用，渗滤是指用于交换含有蛋白质产品的溶液/缓冲液的连续过滤。如本文所用，超滤是连续过滤方法，其对蛋白质产品的稀释溶液进行浓缩。对于渗滤和超滤，垂直和切向流型均可考虑。渗滤和/或超滤可较好地除去盐、低分子量物质和/或处理剂。应当理解，可以在盐析分级分离步骤和/或层析步骤之间，和/或在本发明主题的盐析分级分离步骤和层析步骤之间使用渗滤或超滤。在本发明方法的一些实施方案中，在将上清液或再溶解的糊沉淀进行亲和层析之前，可以对上清液或再溶解的糊沉淀进行：过滤以去除生物负载、用溶剂和去污剂处理以灭活上清液/再溶解的糊沉淀中的包膜病毒，和/或进行脱盐处理(例如通过渗滤和/或超滤)。
在一些示例性实施方案中，在通过亲和层析从上清液或再溶解的糊沉淀中分离中间产物的步骤中使用合适的亲和树脂。亲和树脂可以从诸如Bio-Rad、Sigma-Aldrich、GEHealthcare Life Sciences、Thermo Fisher Scientific、Merck Millipore、GenScript和ProMetic Life Sciences等供应商处购买。
在用于生产α-1-蛋白酶抑制剂的一种方法中，例如，使用α-1-蛋白酶抑制剂特异性亲和树脂来产生含有α-1-蛋白酶抑制剂的第三中间产物。类似地，可以使用白蛋白特异性亲和树脂从第二上清液中分离白蛋白。因此，显而易见的是，可以将第二上清液连续用于多种亲和层析柱以提取不同的蛋白质。例如，产生α-1-蛋白酶抑制剂的亲和层析步骤产生流穿液和洗涤液。流穿液和/或洗涤液可以用于白蛋白特异性亲和柱。然后可以将来自白蛋白特异性亲和柱的流穿液和/或洗涤液用于特异于相同或不同蛋白质的第三亲和柱。
为了从蛋白质产品中灭活和/或除去其他病毒，可以用溶剂去污剂、纳米过滤、巴氏杀菌或用其它可灭活或除去病毒的方法处理洗脱液。根据本发明主题的方法特别适用于制备蛋白质产品，包括α-1-蛋白酶抑制剂、γ-球蛋白、白蛋白和/或其他蛋白质。
在其他方面，本发明的方法可以进一步包括从第一糊沉淀或第二糊沉淀中分离第二蛋白质产品。另外，第二蛋白质产品可以从在亲和层析过程中产生的流穿液和/或洗涤液中分离。因此，显而易见的是，第二蛋白质产品可以不同于第一蛋白质产品，并且可以包括α-1-蛋白酶抑制剂、γ-球蛋白、白蛋白和/或其他蛋白质。
在本发明主题的其他方面，产生γ球蛋白的方法可以进一步包括从第二糊沉淀中分离γ球蛋白。因此，IgG特异性亲和树脂可用于从第二糊沉淀中分离IgG。另外，另一种亲和树脂可用于从特定中间产物(例如，包括上清液、沉淀物(糊沉淀)和层析级分)中分离所需蛋白质。
在一些方面，本发明的主题涉及从血液原料生产产品的方法，其包括处理模块，其中每个模块可以接收输入材料并产生至少一种输出材料。每个模块可包括分级分离模块、层析模块、渗滤模块或超滤模块。可以以各种顺序配置各类型模块，以从血液原料产生多种蛋白质产品。一些实施例包括两个模块，但是本发明主题的方法可以包括三个、四个或五个模块，或者包括产生所需产品所需的多个模块。一个工艺过程至少包含盐析分级分离模块和渗滤/超滤模块。
分级分离模块可使用盐析分级分离、Cohn分级分离、Nitschmann和Kistler分级分离、辛酸盐分级分离、聚乙二醇分级分离或其变体将输入材料转化为上清液和糊沉淀。合适的输入材料包括血液原料、分级血浆、层析流穿液、洗脱液、洗涤液或其子级分。一个或多个分级分离模块还可以包括如本文所讨论的盐析分级分离步骤，并且至少产生上清液和糊沉淀。
层析模块采用诸如亲和层析、凝胶渗透、阳离子交换、阴离子交换、疏水相互作用、羟基磷灰石、氟磷灰石、扩张床吸附或固定化金属离子亲和层析等方法。应当理解，层析模块将输入原材料分离成流穿液、洗脱液、洗涤液及其子级分。进一步地，每个模块的输入材料包括血液原料，或包括任何其他模块的流穿液、洗脱液、上清液或糊沉淀。
本发明主题的各种目的、特征、方面和优点将从以下对优选实施例的详细描述以及附图中变得更加明显，附图中相同的附图标记表示相同的部件。
附图说明
图1是从含血浆的血液产品生产蛋白质产品的方法的示意图。
图2是从含血浆的血液产品生产蛋白质产品的另一种方法的示意图。
图3是从血液原料生产蛋白质产品的另一种方法的示意图。
图4是从单批血液原料生产多种蛋白质产品的方法的示意图。
图5是从单批血液原料中生产免疫球蛋白G和其他蛋白质产品的方法的示意图。
图6是从血液原料生产蛋白质产品的另一种方法的示意图。
图7是从血液原料生产蛋白质产品的另一种方法的示意图。
图8是从血液原料生产蛋白质产品的另一种方法的示意图。
图9是从血液原料生产蛋白质产品的另一种方法的示意图。
图10是用于生产蛋白质产品的示例性处理模块的示意图。
图11是用于生产蛋白质产品的三种示例性模块化方法的示意图。
具体实施方式
本发明的主题提供了从含有血浆的产品以高产率生产多种蛋白质产品的改进方法。血浆含有许多可作为有用的治疗剂的蛋白质和凝血因子。例如，α-1-蛋白酶抑制剂缺陷可能会导致肺组织破裂，而α-1-蛋白酶抑制剂则可用于治疗α-1-蛋白酶抑制剂缺陷。另一类血浆蛋白是γ球蛋白，其可用于治疗免疫缺陷和疾病。白蛋白和其他蛋白质(例如纤维蛋白原、凝血酶原、α-1-酸性糖蛋白、α-1-甲胎蛋白、α-2-巨球蛋白、β-2-微球蛋白、触珠蛋白、血浆铜蓝蛋白、补体成分3、补体成分4、C-反应蛋白、转铁蛋白、甘露糖结合凝集素等)也可以通过根据本发明主题的方法从血浆中分离。
在优选的实施方案中，血液原料包含回收血浆或回输血浆，更优选新鲜冷冻血浆，甚至更优选原料血浆。可以使用其他血液原料，例如分级血液、分级血液原料、分级血浆、辛酸盐分级血浆、聚乙二醇分级血浆、Cohn级分、Nitschmann和Kistler级分，以及任何中间过程材料，或通过血浆分级分离获得的其他材料。应当理解，含血浆的产品通常以冷冻状态储存和运输，并在进一步处理或纯化之前解冻。在解冻过程中，血浆可能会分离成冷沉淀和去冷沉淀血浆，即“去冷”血浆。如本文所用，“去冷”血浆是指解冻冷冻血浆并将冷沉淀与血浆分离产生的、并且不包括冷沉淀的液体上清液。优选地，全血浆(即去冷沉淀血浆和冷沉淀)都经过进一步的处理步骤，尽管在随后的处理步骤中不排除仅使用去冷沉淀血浆。任选地，在蛋白质产品生产之前，可以将冷沉淀重新掺入(例如通过混合)去冷沉淀血浆中，或将其作为蛋白质产品生产的一部分。
图1示出了本发明主题的一个实施例的流程图。将新鲜或解冻的含血浆的产品和盐混合，形成第一中间产物，其通常加入的盐为10.1-25wt％，更通常为10.1-11wt％、11-13wt％、13-15wt％和15-20wt％，优选11-13wt％，更优选12wt％。盐浓度的典型容差为±1wt％。用于本发明方法的合适的盐包括但不限于柠檬酸盐、乙酸盐、葡萄糖酸盐和辛酸盐。尽管可以将固体盐加入血浆产品中，但在优选的方法中将浓缩的、经pH调节的盐溶液加入血浆产品中。根据所需的蛋白质产品，盐溶液的pH可以在约pH 3至pH 8的范围调节以优化蛋白质分级分离。
例如，可以通过将500g柠檬酸溶解在600mL水(例如注射用水)中来制备50wt％柠檬酸盐储备溶液。然后用另外的水将溶液的体积调节至1000mL。可以通过将500g柠檬酸钠溶解在600mL水中，制备50％柠檬酸钠溶液。将足够的柠檬酸溶液加入到柠檬酸钠溶液中以获得pH约为7的溶液，然后加入足够的水使体积达到1000mL。
血浆、中间产物和上清液可以在溶液的凝固点和环境温度之间的温度下处理，通常为0-25℃。在一个实施方案中，将血浆产品维持在20℃，并将室温下的柠檬酸/柠檬酸盐溶液加入血浆中，直至柠檬酸/柠檬酸盐占由此获得的第一中间产物重量的11-13％，优选12wt％。加入盐将使第一中间产物分离成第一沉淀物和第一上清液。在另一个实施方案中，将第一中间产物搅拌并冷却至2-8℃，产生沉淀。第一沉淀物含有高分子量蛋白质和大部分脂质。优选地，对第一中间产物搅拌直至沉淀完全(通常60分钟或更长时间)。
如上所述，可以通过离心或过滤将第一上清液和第一沉淀物分离成第一上清液和第一糊沉淀。然后可以将第一糊沉淀溶解并进行进一步的处理，例如如本文所述的盐析分级分离、层析、其他常规蛋白质纯化方法及其组合。
在一个示例性实施方案中，将第一上清液冷却至2-8℃，向第一上清液中另外加入柠檬酸/柠檬酸盐溶液，产生第二中间产物，其包含15-21wt％、21-23wt％、23-25wt％、25-27wt％和27-30wt％的柠檬酸/柠檬酸盐，优选21-23wt％，并且更优选22wt％。除了柠檬酸/柠檬酸盐，也考虑使用盐/缓冲液组合。本领域普通技术人员应了解，第二中间产物中盐的浓度大于第一中间产物中盐的浓度。优选地，对第二中间产物搅拌直至第二沉淀物沉淀完全，例如搅拌过夜。免疫球蛋白可在第二沉淀物中发现。
与第一中间产物类似，可以通过离心和/或过滤将第二中间产物分离成第二上清液和第二糊沉淀。当使用离心时，第二糊沉淀是由第二沉淀物形成的沉淀球，第二上清液可以从中倾出、移除或除去。当使用过滤时，第二糊沉淀是由第二沉淀物形成的滤饼，第二上清液是滤液。
离子交换层析的洗脱液优选包含一种或多种血浆蛋白。在一些实施方案中，洗脱液包含α-1-蛋白酶抑制剂、γ球蛋白、白蛋白、纤维蛋白原、凝血酶原、α-1-酸性糖蛋白、α-1-甲胎蛋白、α-2-巨球蛋白、β-2-微球蛋白、触珠蛋白、血浆铜蓝蛋白、补体成分3、补体成分4、C-反应蛋白、转铁蛋白、甘露糖结合凝集素中的一种。在一些实施方案中，洗脱液包含至少两种上述蛋白质的组合。
可选地，如图2所示，可使用减少生物负载过滤器过滤第二上清液以去除细菌、真菌孢子、菌丝和其他“生物负载”。示例性的减少生物负载过滤器包括Sartorius、Pall和EMDMillipore品牌生产的过滤器(例如，Sartopore 2XLG 0.8/0.2、Supra EK1P/EAV1.5/0.2、
Figure BDA0001753803060000111
Figure BDA0001753803060000112
II、LifegardTM、
Figure BDA0001753803060000113
Figure BDA0001753803060000114
等)。
另一个可选步骤是通过渗滤/超滤(UF/DF)降低柠檬酸盐浓度。可以选择过滤器的尺寸以使流速最大化(例如，3-6L/h)，同时防止目标蛋白质随滤液一起流过过滤器。例如，30kD膜保留α-1-蛋白酶抑制剂，但允许液体相对快速地流过膜。柠檬酸盐浓度的降低可以与电导率降低相关，电导率从约55-60mS/cm降低至约10mS/cm，并且最优选降低至5mS/cm或更低。
可以通过使病毒包膜脂质变性来实现对包膜病毒和一些无包膜病毒的灭活。例如，可以使用溶剂/去污剂(例如磷酸三正丁酯和聚山梨酯80、磷酸三正丁酯和Triton X-100)来处理第二上清液。采用溶剂/去污剂处理也可以有利地杀死细菌和真菌污染物并洗去内毒素。在本发明主题的优选实施方案中，将13.2g的23.09:76.91的磷酸三正丁酯和聚山梨酯80的混合物加入到每千克的第二上清液中。
发明人预期可以使用亲和树脂来分离蛋白质产品的各个组分。例如，ProMeticBioSciences Ltd.和ProMetic BioTherapeutics生产的亲和树脂可特异性结合凝血因子、血纤维蛋白溶酶原、纤维蛋白原、免疫球蛋白、白蛋白、α-1-蛋白酶抑制剂。GE Healthcare生产的交联琼脂糖树脂含有结合α-1-蛋白酶抑制剂的单结构域抗体。所需树脂的用量取决于第二上清液中蛋白质的量和树脂的负载量。通常在施加第二上清液之后，用盐溶液(例如100mM NaCl)洗涤亲和树脂，所述盐溶液通过非特异性静电作用去除吸附到树脂上的蛋白质。然后使用树脂制造商推荐的洗脱液从亲和柱上洗脱所需的蛋白质，但不排除使用其他洗脱方案。至于α-1-蛋白酶抑制剂和GE Healthcare的α-1抗胰蛋白酶选择树脂，可以使用氯化镁缓冲溶液(例如2M MgCl2在50mM Tris·HCl中，pH 7.40)将蛋白质产品从亲和层析柱洗脱。亲和层析步骤后，通常蛋白质产品收率介于70％至98％之间。
通常对第三中间产物进行渗滤/超滤以降低盐浓度。渗滤/超滤后，电导率从约120mS/cm降至低于10mS/cm，并且优选5mS/cm或更低。
本发明人期望在离子交换层析步骤之后，从树脂析出至第三中间产物的亲和配体可以与蛋白质产品分离。合适的树脂由Bio-Rad、Sigma-Aldrich和Asahi Chemical&Industrial Co.Ltd.提供(例如，Asahi Q500阴离子交换树脂显示每毫升树脂具有26.5mgα-1-蛋白酶抑制剂的动态结合能力)。在预期的方法中，将500mLQ500树脂柱与50mM Tris·HCl(pH 7.40)平衡。将第三中间产物装载到柱子上并进行梯度洗脱：NaCl在50mM Tris·HCl(pH 7.40)缓冲液中从0mM至350mM。
本发明的方法可以进一步包括纳米过滤步骤，其中使用20nm孔隙过滤器去除小的无包膜病毒(例如腺病毒、细小病毒、乳多空病毒、人乳头瘤病毒)。然后根据所需的方案可以进一步处理经纳米过滤的蛋白质产品。进一步处理步骤包括超滤/渗滤、制剂、无菌过滤、充填和冻干中的一种或多种。
如图2所示，流穿液、洗涤液和第二沉淀物各自可含有本文提及的一种或多种血浆蛋白组合。在优选的实施方案中，图2的经无菌过滤的蛋白质产品包含单一类型的血浆蛋白质。如图2所示，从第二沉淀物和流穿液和洗涤液中分离其他蛋白质的方法包括如本文所述的盐析分级分离和层析处理。
图3描绘了类似于图1的流程图。然而，图3中的起始材料是血液原料。如本文所述，血液原料包括原料血浆、新鲜冷冻血浆、回收血浆、回输血浆、分级血液、分级血液原料、分级血浆、Cohn级分、Nitschmann和Kistler级分，以及任何分级分离材料的中间过程材料。可以使用来自其他分级分离过程的中间过程材料，例如Cohn级分或Nitschmann和Kistler级分，作为图3的方法的起始材料。此外，来自本发明主题的任何方法的中间过程材料，至少包括图1-8，可以作为图3的方法的起始点。
应注意，图3的第一盐和第二盐可以是本文公开的任何盐。此外，第一盐和第二盐可以是相同的。图3的流程图还包括第一层析法和第二层析法。第一层析法和第二层析法可至少部分地包括亲和层析、凝胶渗透层析、阳离子交换层析、阴离子交换层析、尺寸排阻层析、疏水相互作用层析、羟基磷灰石层析、氟磷灰石层析或固定化金属离子亲和层析。第一层析法和第二层析法可以是填充床或扩张床吸附模式。第一层析法和第二层析法也可包含相同类型的层析。一些处理过程可能需要单个层析，而其他处理过程可能需要两个以上。对使用如本文所述的盐获得的蛋白质级分进行蛋白质纯化，可能需要层析与蛋白质纯化/稳定步骤结合，或者可能需要除层析之外的蛋白质纯化/稳定步骤。
如上所述，应当理解，来自第二层析法处理的洗脱液包含至少一种本文提及的血浆蛋白质。
图4描绘了类似于图3的流程图。然而，图4包括第一沉淀物和第二沉淀物以及第一流穿液和第二流穿液的附加处理，其从单批血液原料产生多种产品。应当理解，可以通过本文中提到的盐析分级分离和/或层析法对第一沉淀物进行溶解并进一步处理。如图所示，优选第二至第六层析法的各产物是如本文所述的分离的血浆蛋白质。在一些实施方案中，第一至第六层析法各自彼此不同。第一至第五蛋白质是彼此不同的血浆蛋白质，但可能某些蛋白质批次至少部分含有相同的蛋白质。
图5描绘了从单批血液原料中分离免疫球蛋白G(“IgG”)和其他蛋白质的流程图。第一中间产物和第二中间产物的制备可以与上文关于图1-4描述的方法相同或类似。如图4的流程图，通过第一层析法进一步处理第二沉淀物以产生IgG。虽然第一层析法包括使用IgG特异性亲和树脂的亲和层析处理，但应理解，第一层析法可完全或部分包含本领域已知的其他类型的层析处理。另外，通过第二层析法进一步处理第一流穿液，以产生其他蛋白质产品，例如本文所述的血浆蛋白质。应当理解，可以随后进行层析和盐析分级分离步骤以产生所需的分离的蛋白质产品和蛋白质组合。
图6描绘了从血液原料获得所需产品的替代方法的流程图。图6的流程图起始点为通过第一层析法处理血液原料。在一些实施方案中，血液原料是来自其他分级分离过程的中间过程材料，或分级血液原料。图6的第一流穿液进行如图1和图3所示的盐析分级分离。通过第二层析法处理第二上清液产生第二洗脱液。应当理解，第一洗脱液和第二洗脱液包含如本文所述的血浆蛋白。在优选的实施方案中，第二洗脱液包含独立类型的血浆蛋白。
图7描绘了类似于图3的流程图。然而，图7公开了包括第三层析法的实施方案。应当理解，第三层析法可包括先前讨论或本领域已知的任何层析步骤。在一些实施方案中，第一至第三层析法包含相同类型的层析。在第三层析法之后或之前还可以考虑另外的层析处理步骤。在一些实施方案中，第三层析法的洗脱液包含至少一种本文所述的血浆蛋白。在一些实施方案中，洗脱液包含独立类型的血浆蛋白。
图8描绘了类似于图3的流程图。然而，图8包括将TCEP添加到第二上清液以产生第三中间产物的额外步骤。TCEP可以减少第二上清液中至少一些蛋白质的多聚体形成。在整个图8的步骤中可以使用另外的或替代的还原剂来减少蛋白质的多聚体形成(例如，DTT和βME)。在一些实施方案中，第二层析法的洗脱液包含至少一种本文所述的血浆蛋白。在一些实施方案中，洗脱液包含独立类型的血浆蛋白。
图9描绘了类似于图3的另一流程图。在图8中，通过向第二上清液中添加沉淀剂以产生第三中间产物来执行另外的沉淀步骤。沉淀剂可包含第一盐或第二盐(例如柠檬酸盐、乙酸盐和葡萄糖酸盐)、不同的盐(例如氯化钠、硫酸铵、辛酸盐等)、聚乙二醇、乙醇或其他沉淀剂。然后可以通过离心和/或过滤分离第三中间产物以产生第三上清液和第三沉淀物。可以对第三上清液和第三沉淀物各自进行任选的纯化步骤(例如，如上所述的层析、溶剂/去污剂处理、生物负载过滤和/或浓缩步骤)以分别产生第一蛋白质和第二蛋白质。应当理解，可以从第三上清液和第三沉淀物中的任一种或两种中纯化多种蛋白质产品。
实施例
美国专利7,879,331中，对人血浆进行连续的12％柠檬酸盐和22％柠檬酸盐蛋白质沉淀步骤。在单独的研究中，22％柠檬酸盐分级分离得到的上清液的柠檬酸盐浓度增加至26％、30％或34％。在搅拌下将所得中间产物冷却至5℃以下，并在该温度下搅拌60分钟。通过离心分离沉淀物(如美国专利7,879,331中所述)，并通过比浊法分析α-1-蛋白酶抑制剂(A1PI)、白蛋白和总蛋白质的级分。结果列于表1中。该值是在每种上清液(super)和沉淀物(ppt)的百分比，归一化至100％(上清液和沉淀物的总和)。
表1
Figure BDA0001753803060000151
有利地，增加柠檬酸盐浓度可从所得上清液中除去另外的蛋白质，同时仅沉淀一小部分α-1-蛋白酶抑制剂和白蛋白。因此，进行第三沉淀步骤可用于从所得上清液中除去非产品蛋白质，同时仅损失一小部分蛋白质产品。在本发明主题的另一些方面，从血液原料产生产品的方法可包括第一模块和第二模块。每个模块配置为接收输入材料并产生至少一种输出材料。第一模块和第二模块可各自包括分级分离模块、层析模块、过滤模块、分离模块或灭菌模块。一个模块的输入可以包括另一个模块的输出。
图10描绘了本发明主题所考虑的几个模块。在分级分离模块中，通过盐析分级分离、Cohn分级分离、或Nitschmann和Kistler分级分离，辛酸盐分级分离或其变体对输入材料进行分级分离。将盐添加到输入材料中，产生中间产物。当模块采用如本文所述的盐析分级分离时，输出材料至少包含上清液和糊沉淀或沉淀物。
关于层析模块，通过层析法将输入材料分离成流穿液、洗涤液以及一种或多种洗脱液。合适的层析方法包括亲和层析、凝胶渗透层析、阳离子交换层析、阴离子交换层析、疏水相互作用层析、羟基磷灰石层析、氟磷灰石层析、扩张床吸附层析或固定化金属离子亲和层析。层析模块的输出材料至少包括流穿液和洗脱液，并且可包括洗涤液。
还可以考虑超滤模块和渗滤模块。应当理解，渗滤模块或超滤模块分别是用于对输入材料进行脱盐和浓缩的合适的过滤方法。另外，还包括病毒减少模块(例如，通过本文描述的纳米过滤或其他)和病毒灭活模块(例如，通过本文描述的溶剂/去污剂处理或其他)。此外，本发明的主题可以包括还原/稳定模块(例如，通过用TCEP、DTT、βME或其他合适的还原剂处理)。
按一定顺序配置模块以从血液原料生产各种产品。关于本发明方法中采用的模块数量，发明人考虑所需模块的数量取决于生产所需产品所需的模块化处理步骤的数量。一些实施例包括一个或两个模块。本发明主题的优选方法包括三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个模块。
图11描绘了本发明主题的多个样本模块化处理，采用图10的模块。应当理解，来自一个模块的输出可用作另一模块的输入。如图11的处理过程A所示，血液原料用作分级分离模块的输入材料。分级分离模块的至少一个输出(上清液和糊沉淀)用作渗滤模块的输入材料。然后，渗滤模块的输出进一步用作下游处理过程中的输入材料。
图11的处理过程B使用血液原料作为分级分离模块中的输入材料。分级分离模块的至少一个输出(上清液和糊沉淀)用作渗滤模块的输入材料。然后将渗滤模块的输出用作层析模块1中的输入材料。层析模块1的至少一个输出(流穿液、洗涤液和洗脱液)用作层析模块2中的输入材料。应理解，层析模块1和层析模块2可以是相同类型的层析，或者可以是不同类型的层析。层析模块2的至少一个输出用作病毒灭活模块中的输入材料。病毒灭活模块的输出用作病毒减少模块中的输入材料。病毒减少模块的输出包括血液蛋白质(例如，α-1-蛋白酶抑制剂、γ球蛋白、免疫球蛋白、白蛋白、因子VIII、因子IX、因子XIII、蛋白C、抗凝血酶III、纤维蛋白原和C1酯酶抑制剂中的至少一种)。
图11的处理过程C使用血浆作为分级分离模块1中的输入材料。分级分离模块1的至少一个输出(上清液和糊沉淀)用作分级分离模块2的输入材料。应当理解，分级分离模块1和分级分离模块2可以是相同类型的分级分离，或者可以是不同类型的分级分离。分级分离模块2的至少一个输出用作病毒灭活模块的输入材料。病毒灭活模块的输出用作渗滤模块的输入材料。然后将渗滤模块的输出用作层析模块1中的输入材料。层析模块1的至少一个输出(流穿液、洗涤液和洗脱液)用作还原模块中的输入材料。然后将还原模块的输出物用作层析模块2的输入材料。应当理解，层析模块1和层析模块2可以是相同类型的层析，或者可以是不同类型的层析。层析模块2的至少一个输出用作病毒减少模块中的输入材料。病毒减少模块的输出包括血液蛋白质(例如，α-1-蛋白酶抑制剂、γ球蛋白、免疫球蛋白、白蛋白、因子VIII、因子IX、因子XIII、蛋白C、抗凝血酶III、纤维蛋白原和C1酯酶抑制剂中的至少一种)。
进一步地，第一模块的输入材料可包括血液原料和来自任何其他模块的输出材料中的至少一种，例如流穿液、洗脱液、上清液、糊沉淀、或溶解的糊沉淀。不排除将输出材料从一个模块回收到同一模块中。
应当理解，本文中性质、成分(如浓度、反应条件等)的数字表示量在一些情况下被术语“约”修饰，用于描述和要求保护本发明的某些实施方式。因此在说明书和所附权利要求书中阐述的数字参数是可根据本发明的实施方案中试图获得的期望性质而改变的近似值。数字参数应根据报告的有效位数并应用普通的四舍五入法来解释。尽管阐述本发明的宽范围的数值范围及参数是近似值，但是在具体实施例中阐述的数值尽可能精确地被报道。然而，任何数值固有地包含由其各自测量中存在的误差而必然导致的某些误差。
如本文中和附加权利要求书中所使用，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一”、“一个”和“所述”、“该”包括复数个指代物。此外，如本文描述中所使用的，除非上下文另外明确指出，否则“在...中”的含义包括“在...中”和“在...上”。
本文对数值范围的描述为速记方法，仅用于指代落入该范围内的每个单独数值。除非本文中另有指示，否则每个单独的值都并入说明书中，如同单独列举一样。本文中描述的所有方法可以以任何合适的顺序执行，除非在本文中另有指示或者与上下文明显矛盾。关于本文的某些实施例提供的任何和所有示例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅意在更好地阐明本发明，而不是对本发明要求保护的范围进行限制。说明书中的任何语言都不应被解释为表示对本发明的实践必不可少的任何非要求保护的要素。
本文公开的本发明的替代元件组或实施例不应被解释为对本发明的限制。每个组件可以单独地或与组中的其他元件或本文中发现的其他元件进行参考和要求保护。出于便利性和/或可专利性的原因，一个组中的一个或多个组员可以被包括在组中或从组中删除。当发生任何这样的包含或删除时，说明书在本文中应当被认为包含由此修改的组，从而满足所附权利要求中使用的所有马库什组的书面描述。
显而易见的是，对于本领域技术人员而言，在不脱离本文的发明构思的情况下，除了已经描述的那些以外，还可以进行更多的修改。因此，本发明的主题不限于所附权利要求的范围。而且，在解释说明书和权利要求书时，所有术语应该以与上下文一致的最宽泛可能的方式来解释。具体而言，术语“包括”和“包含”应该被解释为以非排他性方式引用元件、组件或步骤，指示所提及的元件、组件或步骤可以存在，或被利用，或与未明确引用的其他元素、组件或步骤组合。在说明书权利要求涉及选自A、B、C...和N中的至少一项的情况下，文本应该被解释为只需要来自该组的一个元素，而不是A+N或B+N等等。
本文的讨论提供了本发明主题的许多示例实施例。尽管每个实施例表示发明元件的单个组合，但是本发明主题包括所公开元件的所有可能的组合。因此，如果一个实施例包括元件A、B和C，并且第二实施例包括元件B和D，则本发明主题也包括A、B、C或D的其他剩余组合，即使没有明确披露。

Claims (4)

1.一种从血液原料中生产蛋白质产品的方法，包括：
取多个模块，包括第一分级分离模块、第二分级分离模块、第一层析模块和第二层析模块；所述第一分级分离模块包括第一出口，所述第二分级分离模块包括第二出口并且被配置为接收来自所述第一出口的上清液，所述第一层析模块被配置为接收由所述第二分级分离模块产生的糊沉淀并且包括阴离子交换介质和第三出口，所述第二层析模块被配置为接收来自所述第三出口的第一流穿液级分并且包括所述阴离子交换介质和第四出口，其中所述第四出口被配置为引导来自所述第二层析模块的阴离子交换介质的第二流穿液级分；
使用所述第一分级分离模块将血液原料分级分离以产生所述上清液；
使用所述第二分级分离模块将所述上清液分级分离以产生所述糊沉淀；
使用所述第一层析模块以产生所述第一流穿液级分；和
使用所述第二层析模块以产生所述第二流穿液级分，其中所述第二流穿液级分包含蛋白质产品；
其中在所述第一分级分离模块中分级分离所述血液原料的步骤包括：
（a）向所述血液原料中加入盐以产生第一中间产物，其中所述盐占所述第一中间产物重量的11-20%；以及
（b）分离所述第一中间产物以产生所述上清液；
其中在所述第二分级分离模块中分级分离所述上清液的步骤包括：
（a）向所述上清液中加入盐以产生第二中间产物，其中所述盐占所述第一中间产物重量的15-30%；以及
（b）分离所述第二中间产物以产生糊沉淀。
2.根据权利要求1所述的方法，包括提供过滤模块，所述过滤模块流体连接至所述第二出口和所述第一层析模块。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述血液原料包括原料血浆、新鲜冷冻血浆、回收血浆和回输血浆中的至少一种。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述血液原料包括分级血液、分级血浆、Cohn级分、Nitschmann和Kistler级分、来自Cohn工艺处理过程的中间过程材料、来自Nitschmann和Kistler工艺处理过程的中间过程材料、来自聚乙二醇分级分离的中间过程材料，以及来自辛酸盐分级分离的中间过程材料中的至少一种。
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