CN118055798A - 改进的纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于从源于血液血浆的白蛋白产品和由其衍生的药物组合物中去除金属阳离子(例如铜)的改进的工业规模方法。白蛋白样品与用于结合或螯合金属阳离子的配体接触，所述配体是螯合剂，最优选可生物降解的螯合剂、或螯合树脂，最优选阳离子交换螯合树脂。

Description

改进的纯化方法
技术领域
本发明涉及用于从源于血液血浆白蛋白和由其衍生的药物组合物中纯化金属阳离子(例如铜)的改进的工业规模方法。
相关申请
本申请要求欧洲专利申请EP 21200554.0的优先权，其全部内容通过援引加入本文。
背景技术
血清白蛋白是血液中最丰富的蛋白之一(35-55g/L；约为总蛋白的60％)。它在血液中功能为作为疏水分子(例如脂肪酸)的载体，以及作为清除剂与一系列分子(包括有机分子和阳离子(例如Ca2+、Na+和K+))结合并螯合这类分子直至将其消除。由于白蛋白含量丰富、相对尺寸小(66.5kDa)以及在生理pH下电荷高，其主要功能是调节血液渗透压以维持血流中的液体并防止渗漏至周围组织中。
第二次世界大战期间，人们认识到人血清白蛋白(hSA)可以配制在生理学上合适的溶液中，其可用于替代因创伤或手术而损失的血量(例如，Cohn et al.(1946),J.Amer.Chem.Soc.68:459-75)。如今，当由于渗透压降低而存在或预期有临床问题或并发症时，和/或作为利尿治疗的辅助，在临床情况中常规地施用hSA。例如，hSA可以用于因急性失血或失血浆而休克的患者的复苏。大面积烧伤后体内水、盐和蛋白的分布通常会发生连续变化，导致低血容量性休克和循环衰竭。因此，已经发现施用hSA有助于烧伤患者的康复。在另一个例子中已显示，在接受腹部手术的患者中，手术后立即静脉(IV)施用白蛋白溶液(20％)可以改善肺顺应性和气体交换。
已经描述了用于制备可注射的hSA溶液的不同方法。白蛋白独特的生理化学性质允许通过沉淀方法进行相对有效的纯化。在主要血浆蛋白中，白蛋白具有最高的溶解度和最低的等电点(不带净电荷的pH值)。因此，调节pH、温度、离子强度、乙醇或盐浓度以及蛋白浓度可以从其他血浆蛋白中分离白蛋白。这些分离方法包括用冷乙醇沉淀，使用例如Cohn或Kistler和Nitschmann等方法用于制药级hSA的工业规模生产。
这些工业规模的冷乙醇分离方法可以从一个血浆源中提取多种血浆蛋白。这类方法通常涉及解冻冷冻血浆(批量大小在1,000-15000kg之间)，以形成富含白蛋白的冷冻上清液和冷沉淀物。冷沉淀物含有宝贵的凝血因子，该凝血因子随后从冷冻上清液分离。在Cohn或Kistler和Nitschmann方法中，冷冻上清液可以可选地暴露于初始低乙醇(通常为8％)沉淀阶段以去除纤维蛋白原。其次，沉淀物(部分I)被去除，并可用于制造其他产品，如纤维蛋白原。还可选地在这两个中间部分之一进行利用离子交换树脂或亲和力的吸附步骤，以提取其他蛋白(例如，凝血酶原复合体；抗凝血酶III；C1酯酶抑制剂)。随后，通过提高乙醇浓度从上清液I中提取白蛋白：在pH 6.9下将乙醇浓度提高至约25％(对于Cohn法)，或在pH约5.85下将乙醇浓度提高至约19％(对于Kistler和Nitschmann法)，免疫球蛋白被沉淀(部分(I+)II+III或沉淀A)，而白蛋白保留在溶液中(上清液(I+)II+III或滤液A)。然后，将hSA与大多数其他血浆污染物(主要是α和β球蛋白)分离，通过进一步添加乙醇至约40％的最终乙醇浓度来沉淀污染物(部分IV)。在最后一步，白蛋白本身在其等电点附近沉淀。沉淀糊(部分V)可以在进一步处理前保持冷冻。重要的是要认识到这些方法具有一定的适应性，并且多年来已经优化以适应每个制造商的产品组合。其一实例为，在Fr(I+)II+II步骤之后，可用于提取α-1-抗胰蛋白酶的额外Cohn分离步骤(Fr IV1)可以存在或不存在。
冷乙醇分离的替代是层析纯化血浆以生产白蛋白。这种方法首次描述于20世纪80年代初。在血浆澄清后，通过柱凝胶过滤或渗滤对血浆进行缓冲液交换，以允许后续离子交换层析。接下来是一个或多个柱层析纯化步骤，然后进一步凝胶过滤层析或缓冲液交换。然而，这类方法尚未被广泛采用，主要因为血浆制造的规模以及因此层析设备的尺寸、复杂性和成本。包括CSL在内的许多制造商已采用组合方法，即层析纯化步骤来补充冷乙醇分离方法(例如方法)。单个或多个柱步骤可以通过方便的缓冲液交换和耗竭痕量蛋白污染物来提高产品纯度。
多年来已经评估了用于纯化的白蛋白的几种其他策略，包括盐沉淀方法，例如US11,028,125中描述的那些。迄今为止，这些方法都还没有被开发成用于制备适合药物用途的hSA的全规模的商业化方法。
由于可以快速获得大量蛋白从而使大量生产成为可能，在转基因动物中重组生产hSA很有吸引力。然而，这类方法成本高且耗时。因此，通常通过分离源于汇集的捐献血液的血浆来获得临床上使用的hSA。
hSA的制造是通过溶解白蛋白、与稳定剂(辛酸钠和/或乙酰色氨酸)配制以及巴氏灭菌来完成的。20世纪40年代，引入了巴氏灭菌方法(60℃，10小时)用于白蛋白药品。该步骤可灭活脂质和非脂质包膜病毒，包括甲、乙、丙型肝炎和HIV。稳定剂的加入确保白蛋白溶液在加热时不会变性。尽管终端散装(bulk)巴氏灭菌已被一些监管机构(例如澳大利亚治疗产品管理局)所接受，但大多数监管机构要求在最终容器中进行这一步骤。
药用hSA组合物以两种浓度生产。4-5％的hSA溶液是一种等渗溶液，特别适用于低血容量症的补液。20-25％的hSA是一种低渗但高膨胀压的溶液，用于治疗电解质或液体负荷禁忌的液体损失。高浓缩的蛋白溶液提供胶体压力，同时最小化额外输注的盐和液体体积。
用于这些目的的理想药用hSA产品应是非常高纯度的单体白蛋白，不受其他血浆蛋白、内毒素、金属离子、白蛋白聚集体和前激肽释放酶激活剂(PKA)的污染。然而，这些纯化方法并不能确保完全去除污染物，其中一些污染物可能会影响终产品的完整性，并可能影响输注hSA的耐受性。
因此，需要用于从血液来源获得白蛋白的改进的纯化工艺和方法。
本说明书中对任何现有技术的引用并不承认或暗示该现有技术构成任何司法管辖区内的公知常识的一部分或者可合理预期该现有技术可被本领域技术人员理解、被视为相关和/或与其他现有技术结合。
发明内容
本发明提供一种方法，其用于减少从源于血液的血浆获得的包含白蛋白的样品中金属阳离子水平，该方法包括：
i)提供从源于血液的血浆获得的包含白蛋白的样品；
ii)使包含白蛋白的样品与用于结合或用于螯合金属阳离子的配体接触，以获得金属阳离子耗竭的包含白蛋白的样品；
iii)回收金属阳离子耗竭的包含白蛋白的样品。
本发明提供一种用于从包含白蛋白的样品制备纯化的白蛋白组合物的方法，所述包含白蛋白的样品从源于血液的血浆获得，该方法包括：
i)提供从源于血液的血浆获得的包含白蛋白的样品；
ii)使包含白蛋白的样品与用于结合或用于螯合金属阳离子的配体接触，以获得金属阳离子耗竭的包含白蛋白的样品；
从而制备纯化的白蛋白组合物。
用于结合或用于螯合金属阳离子的配体可以为螯合剂(chelating agent)或阳离子交换树脂。
优选地，用于结合或用于螯合金属阳离子的配体为螯合剂。因此，在第一方面，本发明提供一种用于从包含白蛋白的样品制备纯化的白蛋白组合物的方法，所述包含白蛋白的样品从源于血液的血浆获得，该方法包括：
i)提供从源于血液的血浆获得的包含白蛋白的样品；
ii)使包含白蛋白的样品与螯合剂接触以获得金属阳离子耗竭的包含白蛋白的样品；
从而制备纯化的白蛋白组合物。
螯合剂可以是能够结合并螯合金属离子的任何试剂。在一实施方案中，螯合剂结合至二价金属离子。在一优选实施方案中，螯合剂结合至铜(II)离子，其中铜可选地以硫化铜(II)存在于白蛋白溶液中。
因此，在本发明第一方面特别优选的实施方案中，提供一种用于从源于血液的血浆获得的包含白蛋白的样品中去除铜(二价铜)离子的方法，其中该方法包括：
i)提供从血液中获得的包含白蛋白的样品；
ii)使包含白蛋白的样品与用于结合二价铜离子的螯合剂接触，以获得二价铜离子耗竭的包含白蛋白的样品；
从而制备纯化的白蛋白组合物。
在任何实施方案中，螯合剂可以选自：乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇双(β-氨基乙基)-N,N,N′,N′-四乙酸(EGTA)、乙二胺-N,N'-二琥珀酸(EDDS)、亚氨基二琥珀酸(IDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、三亚乙基四胺(Trien)、亚氨基二乙酸(IDA)、次氮基三乙酸(NTA)、三聚磷酸盐(TPP)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、二乙基二硫代氨基甲酸钠(DDC)、L-谷氨酸N,N-二乙酸四钠盐(GLDA)和青霉胺，或其任何盐，包括其钙盐或钠盐。
在一实施方案中，螯合剂是可生物降解的螯合剂。
在特别优选的实施方案中，可生物降解的螯合剂选自：乙二胺-N,N'-二琥珀酸(EDDS)、亚氨基二琥珀酸(IDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)和次氮基三乙酸(NTA)，最优选为EDDS，或其盐，包括其钙盐或钠盐。
在一优选实施方案中，可生物降解的螯合剂为(S,S)-EDDS。最优选地，可生物降解的螯合剂为(S,S)-EDDS的三钠盐。
可以以任何适合用于从包含白蛋白的样品中去除金属阳离子的浓度提供螯合剂，可选地，其中螯合剂以约10μM至约100mM的浓度与包含白蛋白的样品接触，螯合剂的浓度优选约25μM至约15mM，更优选约50μM至约1mM，最优选约50μM至约500μM，特别是约50μM。在可替代的实施方案中，螯合剂以约2.5mM至约100mM的浓度与包含白蛋白的样品接触，螯合剂的浓度优选约5mM至约50mM，或在约10mM至约25mM之间，更优选约15mM至约20mM。
在某些实施方案中，在包含白蛋白的样品中白蛋白的浓度为约40g/L至约250g/L，并且其中该样品与浓度为约10μM至约100mM的螯合剂(chelator)接触，螯合剂的浓度优选约25μM至约15mM，更优选约50μM至约1mM，最优选约50μM至约500μM，特别是约50μM。在可替代的实施方案中，螯合剂的浓度为约2.5mM至约100mM，优选约5mM至约50mM，或在约10mM至约25mM之间，更优选约15mM至约20mM。
在某些实施方案中，在包含白蛋白的样品中，白蛋白的浓度为约50g/L至约200g/L，或约100g/L至约170g/L，优选约135g/L至约155g/L，更优选约140g/L至约150g/L，并且其中样品与浓度为约10μM至约100mM的螯合剂接触，螯合剂的浓度优选约25μM至约15mM，更优选约50μM至约1mM，最优选约50μM至约500μM，特别是约50μM。在可替代的实施方案中，螯合剂的浓度为约2.5mM至约100mM，优选约5mM至约50mM，或在约10mM至约25mM之间，更优选约15mM至约20mM。
在某些实施方案中，螯合剂的浓度优选低于100mM螯合剂，更优选低于50mM螯合剂，或低于25mM螯合剂，或低于15mM螯合剂，或低于5mM螯合剂。最优选地，螯合剂的浓度低于1mM，或低于500μM，或低于250μM，或者低于100μM或50μM，或更低。
在某些实施方案中，螯合剂的浓度是相对于包含白蛋白的样品中铜的浓度计算的。因此，在某些实施方案中，螯合剂以一定的量与包含白蛋白的样品接触，该螯合剂的量相当于螯合剂的浓度为铜的约至少2倍、螯合剂的浓度为铜的至少5倍、螯合剂的浓度为铜的至少10倍、螯合剂的浓度为铜的至少15倍、螯合剂的浓度为铜的至少20倍、螯合剂的浓度为铜的至少25倍、螯合剂的浓度为铜的至少50倍、螯合剂的浓度为铜的至少75倍、螯合剂的浓度为铜的至少100倍、螯合剂的浓度为铜的至少125倍、螯合剂的浓度为铜的至少150倍、螯合剂的浓度为铜的至少175倍、或者螯合剂的浓度为铜的至少200倍。
在一优选实施方案中，可生物降解的螯合剂为(S,S)-EDDS，可选其三钠盐，并且其中(S,S)-EDDS以浓度为约10μM至约100mM与包含白蛋白的样品接触，(S,S)-EDDS的浓度优选约25μM至约15mM，更优选约50μM至约1mM，最优选约50μM至约500μM，特别是约50μM。在可替代的实施方案中，(S,S)-EDDS以浓度为约10μM至约20mM与包含白蛋白的样品接触，优选约15mM。
在某些实施方案中，可生物降解的螯合剂为(S,S)-EDDS，可选其三钠盐，并且其中(S,S)-EDDS的浓度低于100mM，优选低于50mM，或低于25mM，或低于15mM，或低于5mM。最优选地，(S,S)-EDDS的浓度低于1mM、或低于500μM、或低于250μM、或低于100μM或者50μM，或更低。
在某些实施方案中，待使用的(S,S)-EDDS的浓度是相对于包含白蛋白的样品中铜的浓度计算的。因此，在某些实施方案中，(S,S)-EDDS以一定的量与包含白蛋白的样品接触，该(S,S)-EDDS的量相当于(S,S)-EDDS的浓度为铜的约至少2倍、(S,S)-EDDS的浓度为铜的至少5倍、(S,S)-EDDS的浓度为铜的至少10倍、(S,S)-EDDS的浓度为铜的至少15倍、(S,S)-EDDS的浓度为铜的至少20倍、(S,S)-EDDS的浓度为铜的至少25倍或(S,S)-EDDS的浓度为铜的至少50倍、(S,S)-EDDS的浓度为铜的至少75倍、(S,S)-EDDS的浓度为铜的至少100倍、(S,S)-EDDS的浓度为铜的至少125倍、(S,S)-EDDS的浓度为铜的至少150倍、(S,S)-EDDS的浓度为铜的至少175倍、或(S,S)-EDDS的浓度为铜的至少200倍，或者更高。
在某些实施方案中，在包含白蛋白的样品中，白蛋白的浓度为约40g/L至约250g/L，并且其中样品与浓度为约10μM至约100mM的(S,S)-EDDS(可选其三钠盐)接触，(S,S)-EDDS(可选其三钠盐)的浓度优选约25μM至约15mM，更优选约50μM至约1mM，最优选约50μM至约500μM，特别是约50μM。在可替代的实施方案中，(S,S)-EDDS(可选其三钠盐)的浓度为约2.5mM至约100mM，优选约5mM至约50mM，或在约10mM至约25mM之间，更优选约15mM至约20mM。
在某些实施方案中，在包含白蛋白的样品中，白蛋白的浓度为约50g/L至约200g/L，或约100g/L至约170g/L，优选约135g/L至约155g/L，更优选约140g/L至约150g/L，并且其中样品与浓度为约10μM至约100mM的(S,S)-EDDS(可选其三钠盐)接触，(S,S)-EDDS(可选其三钠盐)的浓度优选约25μM至约15mM，更优选约50μM至约1mM，最优选约50μM至约500μM，特别是约50μM。在可替代的实施方案中，(S,S)-EDDS(可选其三钠盐)的浓度为约2.5mM至约100mM，优选约5mM至约50mM，或在约10mM至约25mM之间，更优选约15mM至约20mM。
在某些实施方案中，螯合剂为EDTA或其盐，并且其中EDTA以约10μM至约100mM的浓度与包含白蛋白的样品接触，EDTA的浓度优选约25μM至约15mM，更优选约50μM至约1mM，最优选约50μM至约500μM，特别是约50μM。在可替代的实施方案中，EDTA以约10mM至约20mM、优选约15mM的浓度与包含白蛋白的样品接触。
在某些实施方案中，螯合剂为EDTA或其盐，并且其中EDTA浓度低于100mM，优选低于50mM、或低于25mM、或低于15mM、或低于5mM。最优选地，EDTA的浓度低于1mM、或低于500μM、或低于250μM、或低于100μM或者50μM，或更低。
在某些实施方案中，待使用的EDTA的浓度是相对于包含白蛋白的样品中铜的浓度计算的。因此，在某些实施方案中，EDTA以一定的量与包含白蛋白的样品接触，该量相当于EDTA的浓度为铜的约至少2倍、EDTA的浓度为铜的至少5倍、EDTA的浓度为铜的至少10倍、EDTA的浓度为铜的至少15倍、EDTA的浓度为铜的至少20倍、EDTA的浓度为铜的至少25倍、或EDTA的浓度为铜的至少50倍、EDTA的浓度为铜的至少75倍、EDTA的浓度为铜的至少100倍、EDTA的浓度为铜的至少125倍、EDTA的浓度为铜的至少150倍、EDTA的浓度为铜的至少175倍、或EDTA的浓度为铜的至少200倍，或更高。
在某些实施方案中，在包含白蛋白的样品中，白蛋白的浓度为约40g/L至约250g/L，并且其中样品与浓度为约10μM至约100mM的EDTA(或其盐)接触，EDTA(或其盐)的浓度优选约25μM至约15mM，更优选约50μM至约1mM，最优选约50μM至约500μM，特别是约50μM。在可替代的实施方案中，EDTA(或其盐)的浓度为约2.5mM至约100mM，优选约5mM至约50mM，或在约10mM至约25mM之间，更优选约15mM至约20mM。
在某些实施方案中，在包含白蛋白的样品中，白蛋白的浓度为约50g/L至约200g/L，或约100g/L至约170g/L，优选约135g/L至约155g/L，更优选约140g/L至约150g/L，并且其中样品与浓度为约10μM至约100mM的EDTA(或其盐)接触，EDTA(或其盐)的浓度优选约25μM至约15mM，更优选约50μM至约1mM，最优选约50μM至约500μM，特别是约50μM。在可替代的实施方案中，EDTA(或其盐)的浓度为约2.5mM至约100mM，优选约5mM至约50mM，或在约10mM至约25mM之间，更优选约15mM至约20mM。
优选地，所用的螯合剂及其量足以从包含白蛋白的样品中将金属阳离子(优选二价铜离子)耗竭至不超过约5μg金属阳离子/g蛋白、不超过2.5μg金属阳离子/g蛋白、不超过2μg金属阳离子/g蛋白、不超过1μg金属阳离子/g蛋白、优选不超过约0.8μg/g蛋白。例如，当待耗竭的金属阳离子是二价铜时，使用的螯合剂及其量优选耗竭包含白蛋白的部分中的铜，使得包含金属阳离子耗竭的部分中剩余铜的量不超过约5μg铜/g蛋白、不超过2.5μg铜/g蛋白、不超过约2μg铜/g蛋白、不超过1μg铜/g蛋白、优选不超过约0.8μg铜/g蛋白、更优选不超过0.5μg铜/g蛋白。
在第二方面，可以以螯合树脂的形式提供螯合剂。因此，本发明提供了一种用于从包含白蛋白的样品制备纯化的白蛋白组合物的方法，所述包含白蛋白的样品从源于血液的血浆获得，该方法包括：
i)提供从源于血液的血浆获得的包含白蛋白的样品；
ii)使包含白蛋白的样品与用于螯合金属阳离子的螯合树脂接触，以获得金属阳离子耗竭的包含白蛋白的样品；
从而制备纯化的白蛋白组合物。
在第二方面的另一实施方案中，提供一种用于从包含白蛋白的样品制备纯化的白蛋白组合物的方法，所述包含白蛋白的样品从源于血液的血浆获得，该方法包括：
i)提供从源于血液的血浆获得的包含白蛋白的样品；
ii)在允许金属阳离子但不允许白蛋白结合树脂的条件下，使包含白蛋白的样品与用于螯合金属阳离子的螯合树脂接触，
iii)回收金属阳离子耗竭的包含白蛋白的部分；
从而制备纯化的白蛋白组合物。
在本发明第二方面的优选实施方案中，螯合树为阳离子交换树脂。
阳离子交换树脂可以是强阳离子交换剂(即，强酸性)或弱阳离子交换剂(即，弱酸性)。优选地，阳离子交换树脂包含酸性部分，所述酸性部分包括磺酸或羧酸基团。
应当理解，树脂包含的孔径阻止或防止白蛋白与阳离子交换树脂上的带负电基团接触(并且因此使得树脂不被白蛋白结合)，特别是当pH低于白蛋白等电点时(其为约pH4.8)。
本发明使用的合适的螯合树脂的非限制性实例包括：螯合树脂A-1，也称为Chelex 100，其基于苯乙烯-二乙烯基苯基质中的亚氨基二乙酸。与螯合树脂结合的其他官能团包括氨基膦酸、硫脲和2-氨甲基吡啶。
在其他实例中，阳离子树脂可以是具有不同交联程度的(或/>)50W阳离子交换树脂，(例如，分别具有2％、4％、8％或12％交联度的/>50W-X2、/>50W-X4、50W-X8和/>50W-X12、/>50W-X16)。
在某些优选实施方案中，阳离子交换树脂可以包含连接至苯乙烯二乙烯基苯共聚物晶格的磺酸官能团。
在本发明的第一或第二方面的任何实施方案中，可以使用基于柱层析方法或利用分批法将包含白蛋白的样品与用于结合或用于螯合金属阳离子的配体进行接触。
应当理解，在本发明的任何方法中，使用的包含白蛋白的血浆样品可以是任何血浆样品，所述任何血浆样品是从血液(或血液衍生物，例如血清或血浆)获得的，并且其含有白蛋白。
术语“源于血液的血浆”是指从一名或多名献血者中获得的稻草色/浅黄色血液成分。从捐献者获得血浆的方法对于技术人员来说是显而易见的，和/或如本文所述。在实施方案中，通过从捐献的血液中去除红细胞来获得源于血液的血浆。在可替代的实施方案中，通过血浆分离来获得源于血液的血浆。在一些实施方案中，通过从捐献的血液中去除红细胞和/或血浆分离来获得源于血液的血浆。
包含白蛋白的样品可以是从任何血浆分离方法获得的任何中间体或衍生物。在某些实施方案中，包含白蛋白的样品可以是从血浆盐沉淀方法获得的中间体。或者，包含白蛋白的样品可以是通过源于血液的血浆的酒精分离获得的中间体或部分。
在本发明第一或第二方面的优选实施方案中，包含白蛋白的样品是从源于血液的血浆的冷乙醇分离获得的Cohn部分或者Kistler-Nitschmann部分或类似物。在实施方案中，包含白蛋白的样品选自冷冻上清液、Cohn上清液I、Cohn上清液(I+)II+III、滤液A、部分IV滤液、部分IV1滤液或部分IV4滤液。在特别优选的实施方案中，包含白蛋白的样品是Cohn部分V或Kistler-Nitschmann沉淀物C，或者其悬浮液、滤液或浓缩液。在本文中，沉淀C或部分V的悬浮液、滤液或浓缩液的实例可称为滤液D。在可替代的实施方案中，包含白蛋白的样品是层析纯化的部分。这类部分的实例如图1所示。
在优选实施方案中，包含白蛋白的样品的pH在约4.6至约4.8之间，特别是当包含白蛋白的样品是Cohn部分V或Kistler-Nitschmann沉淀C时。
或者，包含白蛋白的样品的pH可以在中性范围内，优选在约6.8至约7.2之间，更优选在约7.0至约7.2之间，特别是当包含白蛋白的样品包含Cohn部分V或Kistler-Nitschmann沉淀C的层析纯化的部分的滤液时。
在本发明的任何方面，方法包括在将样品与用于结合或用于螯合金属阳离子的配体接触之前，重悬包括包含白蛋白的血液样品的沉淀。可选地，在注射用水(WFI)中重悬。
在任何方面，和在与用于结合或用于螯合金属阳离子的配体接触之前从血液中获得的包含白蛋白的样品相比，金属阳离子耗竭的包含白蛋白的样品含有的金属阳离子少至少10％、20％、30％、40％或50％。换言之，在与用于结合或用于螯合金属阳离子的配体接触之前从血液中获得的包含白蛋白的样品相比，金属阳离子耗竭的包含白蛋白的样品中金属阳离子的水平降低至少约10％、20％、30％、40％或50％。
在本发明的第一或第二方面的具体实施方案中，该方法还可包括可选的酸化步骤。酸化可以在包含白蛋白的样品与用于结合或用于螯合金属阳离子的配体接触之前或之后发生。当配体是螯合剂时，优选在包含白蛋白的样品与螯合剂接触的步骤之后进行酸化步骤。当配体是阳离子交换树脂时，优选在包含白蛋白的样品与阳离子交换树脂接触之前进行酸化步骤。
优选地，通过使包含白蛋白的样品(或耗竭金属阳离子的包含白蛋白的样品)与无机酸接触来进行酸化，所述无机酸可选地选自硫酸(H2SO4)、柠檬酸(C6H8O7)、盐酸(HCl)、磷酸(H3PO4)、草酸(C2H2O4)和甲酸(CH2O2)。在一优选实施方案中，使用硫酸或盐酸进行酸化。
优选地，并且特别是在包含白蛋白的样品是Cohn部分V或Kistler-Nitschmann沉淀C的实施方案中，在添加螯合剂之前，样品的pH通常可以在约4.6至约5.0之间的范围。在这类实施方案中，可在添加螯合剂后进行可选的酸化步骤，导致包含白蛋白的样品的pH降低至pH为约3.0至4.5，优选至pH为约3.5至约4.5之间，或约3.6至约4.4之间，或约3.7至约4.3之间，或约3.8至约4.2之间，最优选约3.9至约4.2之间。在一优选实施方案中，酸化步骤导致包含白蛋白的样品的pH降低至pH为约3.9、约4.0、约4.1或约4.2。
在优选实施方案中，耗竭金属阳离子的包含白蛋白的样品在酸化后的pH不低于约4.5、不低于约4.2或不低于约4.0。
在包含白蛋白的样品是Cohn部分V或Kistler-Nitschmann沉淀C的滤液(例如滤液D)的实施方案中，在添加螯合剂之前，样品的pH可以处于中性范围内。因此，在这类实施方案中，在添加螯合剂之前，方法包括酸化步骤以将pH调节为约5.6至约6.0，更优选为约5.8或约5.9。
在本发明的任何方面，方法进一步包括对耗竭金属阳离子的包含白蛋白的样品(或酸化的耗竭金属阳离子的包含白蛋白的样品)进行额外的纯化步骤。在一些实施方案中，方法因此包含对耗竭金属阳离子的包含白蛋白的样品(或酸化的耗竭金属阳离子的包含白蛋白的样品)进行预过滤步骤(例如，澄清深度过滤)、超滤(例如，渗滤和/或浓缩)及其组合。
在本发明第一方面的特别优选的实施方案中，提供一种从包含白蛋白的样品制备纯化的白蛋白组合物的方法，所述包含白蛋白的样品从源于血液的血浆获得，该方法包括：
i)提供从源于血液的血浆获得的包含白蛋白的样品；优选其中样品为Cohn部分V或Kistler-Nitschmann沉淀C，或者其悬浮液、滤液或浓缩液；
ii)使包含白蛋白的样品与可生物降解的螯合剂接触，以获得金属阳离子耗竭的包含白蛋白的样品；其中可生物降解的螯合剂优选为(S,S)-EDDS或其盐；
iii)可选地，在样品与螯合剂接触之前或之后，立即调节样品的pH；
iv)回收金属阳离子耗竭的包含白蛋白的样品,
从而制备纯化的白蛋白组合物。优选地，方法还包含随后的渗滤步骤，以从样品中去除或基本耗竭任何剩余的螯合剂。优选地，添加(S,S)-EDDS或其盐至终浓度，所述终浓度为样品中铜的浓度的至少约2倍、至少约5倍或至少约10倍、至少约50倍、至少约100倍或至少约200倍的浓度；可选地，其中添加(S,S)-EDDS至浓度为约25μM至约20mM、优选约50μM至约15mM、更优选约50μM至约500μM、最优选约50μM。
在本发明第一方面的特别优选的实施方案中，本发明涉及一种方法，其包括：
i)提供从源于血液的血浆获得的包含白蛋白的样品；优选其中样品为Cohn部分V或Kistler-Nitschmann沉淀C，或者其悬浮液、滤液或浓缩液；
ii)使包含白蛋白的样品与可生物降解的螯合剂接触以获得金属阳离子耗竭的包含白蛋白的样品；其中可生物降解的螯合剂优选为(S,S)-EDDS，或其盐；
iii)可选地，在样品与螯合剂接触之后调节样品的pH，其中优选地，将pH调节至pH为约3.9至约4.3，更优选约4.1至4.2；
iv)回收金属阳离子耗竭的包含白蛋白的样品,
从而制备纯化的白蛋白组合物。优选地，方法还包含随后的深度过滤步骤，以及pH调节至pH为约7.0至约7.4、优选约7.2至约7.3、优选约7.2，接着进行渗滤以从样品中去除或基本耗竭任何剩余的螯合剂。优选地，添加(S,S)-EDDS或其盐至终浓度，所述终浓度为样品中铜的浓度的至少约2倍、至少约5倍或至少约10倍、至少约50倍、至少约100倍或至少约200倍的浓度；可选地，其中添加(S,S)-EDDS至浓度为约25μM至约20mM、优选约50μM至约15mM、更优选约50μM至约500μM、最优选约50μM。
此外，在本发明第一方面的另一优选实施方案中，本发明涉及一种方法，其包括：
i)提供从源于血液的血浆获得的包含白蛋白的样品；优选其中样品为Cohn部分V或Kistler-Nitschmann沉淀C的滤液(例如，滤液D)；
ii)可选地，调节样品的pH，其中优选地，pH调节至pH为约5.6-6.0，更优选约5.8或约5.9；
iii)使包含白蛋白的样品与可生物降解的螯合剂接触以获得金属阳离子耗竭的包含白蛋白的样品；其中可生物降解的螯合剂优选为(S,S)-EDDS，或其盐；
iv)回收金属阳离子耗竭的包含白蛋白的样品，
从而制备纯化的白蛋白组合物。优选地，方法还包含随后的渗滤步骤以从样品中去除或基本耗竭任何剩余的螯合剂。优选地，添加(S,S)-EDDS或其盐至终浓度，所述终浓度为样品中铜的浓度的至少约2倍、至少约5倍或至少约10倍、至少约50倍、至少约100倍或至少约200倍的浓度；可选地，其中添加(S,S)-EDDS至浓度为约25μM至约20mM、优选约50μM至约15mM、更优选约50μM至约500μM、最优选约50μM。
在本发明第一方面的另一实施方案中，提供一种从包含白蛋白的样品制备纯化的白蛋白组合物的方法，所述包含白蛋白的样品从源于血液的血浆获得，该方法包括：
i)提供从源于血液的血浆获得的包含白蛋白的样品；优选其中样品为Cohn部分V或Kistler-Nitschmann沉淀C，或者其悬浮液、滤液或浓缩液；
ii)使包含白蛋白的样品与螯合剂接触，以获得金属阳离子耗竭的包含白蛋白的样品；其中螯合剂优选为EDTA或其盐；
iii)可选地，在样品与螯合剂接触之前或之后，立即调节样品的pH；
iv)回收金属阳离子耗竭的包含白蛋白的样品，
从而制备纯化的白蛋白组合物。优选地，方法还包含随后渗滤步骤以从样品中去除或基本耗竭任何剩余的螯合剂。优选地，添加EDTA或其盐至终浓度，所述终浓度为样品中铜的浓度的至少约2倍、至少约5倍或至少约10倍、至少约50倍、至少约100倍或至少约200倍的浓度；可选地，其中添加EDTA至浓度为约25μM至约20mM、优选约50μM至约15mM、更优选约50μM至约500μM、最优选约50μM。
在本发明第一方面的一个实施方案中，本发明涉及一种方法，其包括：
i)提供从源于血液的血浆获得的包含白蛋白的样品；优选其中样品为Cohn部分V或Kistler-Nitschmann沉淀C，或者其悬浮液、滤液或浓缩液；
ii)使包含白蛋白的样品与螯合剂接触，以获得金属阳离子耗竭的包含白蛋白的样品；其中螯合剂优选为EDTA或其盐；
iii)可选地，在样品与螯合剂接触之后调节样品的pH，其中优选地，将pH调节至pH为约3.9至约4.3，更优选约4.1至4.2；
iv)回收金属阳离子耗竭的包含白蛋白的样品，
从而制备纯化的白蛋白组合物。优选地，方法还包含随后的深度过滤步骤，以及pH调节至pH为约7.0至约7.4、优选约7.2至约7.3、优选约7.2，接着进行渗滤以从样品中去除或基本耗竭任何剩余的螯合剂。优选地，添加EDTA或其盐至终浓度，所述终浓度为样品中铜的浓度的至少约2倍、至少约5倍或至少约10倍、至少约50倍、至少约100倍或至少约200倍的浓度；可选地，其中添加EDTA至浓度为约25μM至约20mM、优选约50μM至约15mM、更优选约50μM至约500μM、最优选约50μM。
此外，在本发明第一方面的另一实施方案中，本发明涉及一种方法，其包括：
i)提供从源于血液的血浆获得的包含白蛋白的样品；优选其中样品为Cohn部分V或Kistler-Nitschmann沉淀C的滤液(例如，滤液D)；
ii)可选地，调节样品的pH，其中优选地，pH调节至pH为约5.6-6.0，更优选约5.8或约5.9；
iii)使包含白蛋白的样品与螯合剂接触，以获得金属阳离子耗竭的包含白蛋白的样品；其中螯合剂优选为EDTA或其盐；
iv)回收金属阳离子耗竭的包含白蛋白的样品，
从而制备纯化的白蛋白组合物。优选地，方法还包含随后的渗滤步骤以从样品中去除或基本耗竭任何剩余的螯合剂。优选地，添加EDTA或其盐至终浓度，所述终浓度为样品中铜的浓度的至少约2倍、至少约5倍或至少约10倍、至少约50倍、至少约100倍或至少约200倍的浓度；可选地，其中添加EDTA至浓度为约25μM至约20mM、优选约50μM至约15mM、更优选约50μM至约500μM、最优选约50μM。
本发明还提供一种纯化的白蛋白产品，其包含的铜的浓度不超过约2.0μg/g蛋白、不超过约1.5μg/g蛋白、不超过约1μg/g蛋白、不超过约0.8μg/g蛋白、不超过约0.5μg/g蛋白或不超过约0.2μg/g蛋白。
本发明还提供一种纯化的白蛋白产品，其通过本文描述的任何方法获得或可获得。在优选实施方案中，纯化的白蛋白产品包含的铜的浓度不超过约2.0μg/g蛋白、不超过约1.5μg/g蛋白、不超过约1μg/g蛋白、不超过约0.8μg/g蛋白、不超过约0.5μg/g蛋白或不超过约0.2μg/g蛋白，或者不超过约0.6μg/g白蛋白、不超过约0.5μg/g白蛋白，或者不超过约0.2μg/g白蛋白。
如本文所用，提及适合于药物用途的纯化的白蛋白组合物是指满足药典标准(例如Ph.Eur或USP或如本文另外定义)的组合物。优选地，适合用于药物用途的纯化的白蛋白组合物满足药典标准(例如Ph.Eur或USP)，并且为施用于人而特别配制的。
根据药典标准(例如Ph.Eur或USP)，本文所述的纯化的白蛋白产品可以配制为hSA药品或药物组合物，并且含有适量的白蛋白作为活性成分。可以包括以下辅料：N-乙酰基色氨酸钠(稳定剂)；辛酸钠(稳定剂)；氯化钠(张度剂)；注射用水(溶剂)。可根据需要调整蛋白含量以制造4％、5％、20％和25％人白蛋白溶液(hSA)。
在具体实施方案中，最终的hSA制剂选自：
i)蛋白(4％w/v)，对于4％w/v hSA，钠(140mM)和辛酸盐(6.4mM)；ii)蛋白(5％w/v)，对于5％w/v的hSA，钠(140mM)和辛酸盐(8mM)；iii)蛋白(20％w/v)，和，对于20％的w/vhSA，辛酸盐(32mM)；iv)蛋白(25％w/v)，和，对于25％w/v的hSA，辛酸盐(40mM)。
在另外的实施方案中，最终的hSA制剂可以选自：i)蛋白(4％w/v)，对于4％w/v的hSA，3.2mM的N-乙酰色氨酸钠和3.2mM的辛酸钠；ii)蛋白(5％w/v)，对于5％w/v的hSA，4mM的N-乙酰色氨酸钠和4mM的辛酸钠；iii)蛋白(20％w/v)，对于20％w/v hSA，0.016M的N-乙酰色氨酸钠和0.016M的辛酸钠；iv)蛋白(25％w/v)，对于25％的w/v hSA，0.02M的N-乙酰色氨酸钠和0.02M的辛酸钠。
hSA制剂优选不包含防腐剂。
本发明的hSA药物组合物(药品)优选满足适当的药典标准。例如，如欧洲药典10.6版中所述的以下针对人白蛋白溶液测试：hSA制剂是无菌的；无热原；对于50g/L以下的溶液，内毒素水平在0.5IU/mL以下；或对于50g/L至200g/L的溶液，内毒素水平在1.3IU/mL以下；或对于200g/L以上的溶液，内毒素水平在1.7IU/mL以下；铝含量上限为200μg/L；前激肽释放酶激活剂(PKA)最大为35IU/mL；血红素含量不大于0.15；每克蛋白的钾上限为0.05mmol；钠上限为160mmol/L，且为标签上标明的钠含量的95％至105％；聚合物和聚集体(aggregate)上限为10％；通过区带电泳，不超过5％的蛋白具有与主要条带不同的迁移率；pH为6.7至7.3，总蛋白不少于标明含量的9％且不超过标明含量的10％。
在本发明的任何方面，从人血液中获得包含白蛋白的样品。
如本文所用，除非上下文另有要求，否则本文使用的术语“包含(comprise)”和该术语的变体，(例如“包含有(comprising)”、“包括(comprises)”和“包含的(comprised)”)，并不旨在排除另外的添加剂、组分、整体或步骤。
本发明的另外的方面以及前面段落所描述的方面的另外的实施方案，将从以下通过举例并参考附图给出的描述中变得显而易见。
附图说明
图1:以工业规模从源于血液的血浆制备血浆蛋白部分和人白蛋白溶液的各种方法的比较示意流程图(来自Br J Anaesth,Volume 85,Issue 6,1December 2000,Pages887–895)。
图2:白蛋白制剂中发现的深色沉积物的实例。
图3:向滤液D添加50mM螯合剂后的铜浓度(μg/g蛋白)。
图4:向滤液D添加50mM螯合剂后的铜浓度(μg/g蛋白)，随后将pH调节至5.8-5.9。
图5:向重悬沉淀C(Res C)中添加各种螯合剂(5-50mM)后的铜浓度(mg/kg蛋白)。Cont(对照)；15mM的(S,S)-EDDS，5mM的EDTA，15mM和50mM的IDS，15mM的NTA。
图6:相对于白蛋白浓度归一化的铜浓度(μg铜/g白蛋白)。示出糊状重悬液、滤液D和截留物(UF/DF后)中，相对于重悬液中的(S,S)-EDDS浓度(0mM至15mM)的铜浓度。
图7:相对于白蛋白浓度归一化的铜浓度(μg铜/g白蛋白)。示出糊状重悬液、滤液D和截留物(UF/DF后)中，相对于重悬液中的(S,S)-EDDS浓度(0.05mM至1mM)的铜浓度。
图8:对重悬沉淀C或滤液D使用酸化和Dowex阳离子交换层析来减少铜。
图9:通过各种方法(包括酸化+阳离子交换或添加螯合剂)获得的白蛋白制剂的加速稳定性研究。所示为白蛋白样品：未进行螯合剂处理或阳离子交换(对照，在8个月的时间点)；进行酸化+阳离子交换(柱法和分批法)，在7个月的时间点；用EDTA进行处理(在8个月的时间点)；以及用(S,S)-EDDS进行处理(在8个月的时间点)。
图10:通过添加螯合剂获得的白蛋白制剂的加速稳定性研究。所示为白蛋白样品：未进行螯合剂处理(对照；长达12个月)；或用EDTA进行处理(5μl pH 4.2或15mM pH4.7；长达12个月)；以及用(S,S)-EDDS进行处理(15mM，pH 4.2；长达12个月)。斜线＝无深色沉积物；无阴影＝深色沉积物非常少；深色阴影＝深色沉积物清晰可见。进行螯合剂处理的样品在螯合剂处理后12个月仅示出低水平的深色沉积物形成。相比之下，未用螯合剂处理的样品在约5个月内示出明显的深色沉积物的证据。
具体实施方式
应当理解，本说明书中公开和定义的本发明扩展至从文本或附图中提及或显而易见的两个或更多个单独特征的所有可替代的组合。所有这些不同的组合构成了本发明的各种可替代的方面。
本发明的另外的方面以及前面段落所描述的方面的另外的实施方案，将从以下通过举例并参考附图给出的描述中变得显而易见。
现在将详细参考本发明的某些实施方案。虽然将在与实施方案的结合中描述本发明，但是应当理解，本发明并非将本发明限制于这些实施方案。相反，本发明旨在覆盖可包括在由权利要求限定的本发明的范围内的所有替代、修改和等同物。
几十年来，人血浆已被工业化应用于生产广泛建立和接受的血浆蛋白产品，例如人白蛋白(hSA)、免疫球蛋白(IgG)、凝血因子浓缩物(凝血因子VIII、凝血因子IX、凝血酶原复合物等)和抑制剂(抗凝血酶、C1抑制剂等)。在这类血浆衍生药物的开发过程中，已经建立了血浆分离方法，以产生富含某些蛋白部分的中间产品，然后将其用作血浆蛋白产品的起始成分。典型的方法综述于例如“Molecular Biology of Human Proteins”中(SchultzeH.E.,Heremans J.F.；Volume I:Nature and Metabolism of Extracellular Proteins1966,Elsevier Publishing Company；p.236-317)。
在临床上，当因渗透压降低而存在或预期临床问题或并发症时，和/或作为利尿治疗的辅助，常规地施用hSA。然而，在不同的血清白蛋白制剂中观察到深色沉积物和聚集体的形成。本申请发明人已经确认了用于从血清中纯化的白蛋白的改进的方法，包括最小化这类沉积物和聚集体的产生的方法。
不受理论的束缚，发明人认为深色沉积物是由与白蛋白和其他蛋白(例如，铜蓝蛋白)结合的金属阳离子引起的，其通常存在于白蛋白制剂中。具体地，本发明基于发明人的发现：深色沉积物可能是由白蛋白制剂中铜(以CuS，硫化铜(II)的形式)的存在引起的，污染蛋白酶的蛋白水解活性也会导致聚集。因此，本发明寻求解决用于制备血清白蛋白产品的现有技术方法的一些局限性。
通用描述
在整个说明书中，除非另有具体说明或上下文另有要求，否则提及的单个步骤、物质组合物、步骤组或物质组合物的组应被视为涵盖一个和多个(即，一个或多个)那些步骤、物质组合物、步骤组或物质组合物的组。因此，除非上下文另外明确指出，如本文所使用的单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数方面，反之亦然。例如，提及“一”包括单个以及两个或多个；提及“一个”包括单个以及两个或多个；提及“该(the)”包括单个以及两个或多个，诸如此类。
本领域技术人员会理解，除了具体描述的那些之外，本发明易于进行变化和修改。应当理解，本发明包括所有这类变化和修改。本发明还包括本说明书中单独或共同提及或表明的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征中的任何和所有组合或任何两个或多个。
本领域技术人员将认识到与本文描述的那些相似或等同的许多方法和材料可以用于本发明的实践。本发明决不限于所描述的方法和材料。
本文提及的所有专利和出版物通过整体援引加入本文。
本发明的范围不受限于本文描述的具体实施方案，具体实施方案仅旨在用于举例说明的目的。功能等同的产品、组合物和方法显然在本发明的范围内。
除非另有具体说明，否则本文中本发明的任何实施例或实施方案应被视为比照适用于本发明的任何其他实施例或实施方案。
除非另有明确定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语应被视为具有与本领域技术人员通常理解的相同含义。
术语“和/或”，例如“X和/或Y”应理解为意指“X和Y”或“X或Y”中任一，并且应被视为对两种含义或任一含义提供明确支持。
与百分比、pH、量或时间段或其他参考的给定数值相关的“约”或“大约”意味着包括在指定值的10％以内的数值。
起始材料：包含白蛋白的部分或沉淀物
应当理解，本发明的方法可应用于从任何包含白蛋白的血液样品中去除污染金属阳离子。因此，用于本文所述的任何方法中的起始材料可以是任何源于血浆的包含白蛋白的组合物。
技术人员熟悉用于从血液中获得白蛋白的各种分离方法。本文中的图1提供用于以工业规模从源于血液的血浆获得白蛋白药物组合物的各种分离方法的概述。为了从血浆(或血清)中获得白蛋白，通常对血浆或血清进行酒精分离，这可以与其他纯化技术(如层析、吸附或沉淀)相结合。然而，也可以使用其他方法。例如，包含白蛋白的沉淀物可以是根据Cohn方法(例如方法6：Cohn et.al.J.Am；Chem.Soc.,68(3),459-475(1946)、方法9：Oncley et al.J.Am；Chem.Soc.,71,541-550(1946))获得的沉淀V，或者Nitschmann和Kistler(Vox Sang 7,414-424(1962)；Helv.Chim.Acta 37,866-873(1954))的沉淀C。包含白蛋白的可替代沉淀物包括但不限于，包含白蛋白的Oncley部分、Cohn部分、硫酸铵沉淀，并且如Schulze et al.in U.S.patent 3,301,842,Curling et al.,(1977)VocSaguinis,33:97-107；Tanaka et al.,(1998)Braz.J.Med.Bio.Res,31:1383-1388,Raouifinia et al.,(2016)Adv.Pharm.Bull,6:495-507所述的其他层析方法通过援引加入本文。
“正常血浆”、“超免疫血浆(hyperimmune plasma)”(例如超免疫抗-D、破伤风或肝炎B血浆)或其任何血浆等同物可以用作本文所述的冷乙醇分离方法中的起始材料。
包含白蛋白的组合物或样品可以是冷冻上清液(cryosupernatant)。术语“冷冻上清液”(也称为贫冷沉淀血浆(cryo-poor plasma)、冷沉淀耗竭的血浆(cryoprecipitatedepleted plasma)等)是指已去除冷沉淀的血浆(源自捐献的全血或血浆分离任一)。冷沉淀是当今使用的大多数血浆蛋白分离方法的第一步，用于大规模生产血浆蛋白治疗剂。该方法通常涉及汇集在受控条件(例如，在6℃或以下)下解冻的冷冻血浆，然后通过过滤或离心收集沉淀。通常保留上清液部分(本领域技术人员已知为“冷冻上清液”)以供使用。由此产生的贫冷沉淀血浆中因子VIII(FVIII)、血管性血友病因子(VWF)、因子XIII(FXIII)、纤连蛋白和纤维蛋白原的水平降低。虽然FVIII的水平大大降低，但纤维蛋白原的水平可多达原始水平的70％。冷冻上清液提供了用于制造一系列治疗性蛋白(包括白蛋白)的常用原料。
包含白蛋白组合物或样品可以是乙醇沉淀。8％乙醇沉淀物的上清液(Cohn等人的方法；Schultze等人的方法(见上文)，第251页)、沉淀V(Oncley等人的方法；Schultze等人的方法(见上文)，第253页)或沉淀C(Kistler和Nitschmann的方法；Schultze等人的方法(见上文Schultze)，第253页)是与工业规模血浆分离相容的白蛋白来源的实例。白蛋白来源还可以是沉淀V或沉淀C的任何滤液、浓缩液或悬浮液(例如，通过对沉淀C进行澄清深度过滤而获得的滤液D)。
优选地，起始材料的总蛋白浓度为约10-350g/L、约50-300g/L、约60至约250g/L、约75-150g/L、最优选约50-100g/L之间。
螯合剂
在本发明的具体实施方案中，用于结合或用于螯合包含白蛋白的样品中的金属阳离子的配体为螯合剂。优选地，螯合剂用于耗竭包含白蛋白的样品的铜离子，但应当理解，螯合剂可用于耗竭蛋白部分中可能导致最终组合物中沉积物形成的其他金属阳离子。
技术人员会理解，可以使用任何合适的螯合剂以耗竭含包含白蛋白的样品的金属阳离子。在一实施方案中，螯合剂结合二价金属阳离子。在一优选的实施方案中，螯合剂结合铜(II)离子，其中铜可选地以硫化铜(II)存在于白蛋白溶液中。
本发明使用的合适的螯合剂的非限制性实例包括：乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇双(β-氨基乙基)-N,N,N′,N′-四乙酸(EGTA)、乙二胺-N,N'-二琥珀酸(EDDS)、亚氨基二琥珀酸(IDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、三亚乙基四胺(Trien)、亚氨基二乙酸(IDA)、次氮基三乙酸(NTA)、三聚磷酸盐(TPP)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、二乙基二硫代氨基甲酸钠(DDC)、L-谷氨酸N,N-二乙酸四钠盐(GLDA)和青霉胺、或其任何盐，包括其钙盐或钠盐。
在特别优选的实施方案中，螯合剂选自：乙二胺-N,N'-二琥珀酸(EDDS)、亚氨基二琥珀酸(IDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)和次氮基三乙酸(NTA)，最优选为EDDS(特别是(S,S)-EDDS))，或者其盐，包括其钙盐或钠盐。
如本文所用，乙二胺四乙酸(EDTA，也称为2,2′,2″,2″′-(乙烷-1,2-二酰二腈)四乙酸、N,N'-乙烷-1,2-二基双[N(羧甲基)甘氨酸]、二氨基乙烷-四乙酸和乙酸二钠；CAS号：60-00-4)是一种六齿配体，可与金属离子(包括Cu2+、Ca2+、Mg2+和Fe3+)结合。可以游离酸形式或盐形式提供EDTA，例如脱水二钠。
如本文所用，乙二醇双(β-氨基乙基)-N,N,N′,N′-四乙酸(EGTA，也称为依他酸、乙二醇双(2-氨基乙基醚)-N,N,N′,N′-四乙酸、乙二醇四乙酸和三乙二醇二胺四乙酸；CAS号：67-42-5)是一种六齿配体，可与金属离子(包括Cu2+、Ca2+、Mg2+和Fe3+)结合。
如本文所用，乙二胺-N,N'-二琥珀酸(EDDS，CAS号：20846-91-7)是氨基多羧酸。其为无色固体，用作螯合剂，可以提供目前大规模用于众多应用中的EDTA的可生物降解替代品。EDDS具有两个手性中心，因此有三种立体异构体。它们是对映体(R,R)和(S,S)异构体以及非手性内消旋(R,S)异构体。作为EDTA的可生物降解替代品，优选(S,S)立体异构体。因此，在一个优选的实施方案中，螯合剂为(S,S)-EDDS。在特别优选的实施方案中，螯合剂为(S,S)-EDDS的三钠盐。
如本文所用，IDS是指亚氨基二琥珀酸或其盐，例如亚氨基二琥珀酸四钠(也称为N-(1,2-二羧乙基)天冬氨酸；CAS号：144538-83-0)。亚氨基二琥珀酸四钠是一种螯合剂，可形成中等稳定性的络合物，其包括在八面体结构中的(作为五齿配体)碱土金属和多价重金属离子与一个水分子。根据OECD方法，亚氨基二琥珀酸四钠归类为易于可生物降解。
通常以盐形式提供本文所用的甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)：N-(1-羧基乙基)亚氨基二乙酸三钠、甲基甘氨酸二乙酸三钠盐(MGDA-NaS)或α-DL-丙氨酸二乙酸三钠(α-ADA)，为N-(1-羧乙基)亚氨基二乙酸的三钠阴离子和四齿络合剂。它与电荷数至少为+2的阳离子形成稳定的1:1螯合物，例如“形成硬水”的阳离子Ca2+或Mg2+。该螯合剂也称为α-ADA，与异构β-丙氨酸二乙酸的区别在于具有更好的生物降解性，因此改善了环境相容性。
如本文所用，三亚乙基四胺(Trien或TETA，CAS号：112-24-3)，也称三乙撑四胺(INN)，是一种螯合剂，通常以盐酸盐提供。
如本文所用，亚氨基二乙酸(IDA；CAS号：142-73-4)是一种二羧酸胺，其中二价阴离子是三齿配体，通过形成两个五元螯合稠环来形成金属络合物。氮原子上的质子可以被聚合物的碳原子取代，以形成离子交换树脂，例如chelex 100。
如本文所用，次氮基三乙酸(NTA，也称为N,N-Bis(羧甲基)甘氨酸2-[双(羧甲基)氨基]乙酸；三甘氨酸，CAS号：139-13-9)，是一种无色固体，作为螯合剂使用，与金属离子(例如Ca2+、Co2+、Cu2+、和Fe3+)形成配位化合物(螯合物)。NTA是三足四齿三阴离子配体。
如本文所用，三聚磷酸盐(TPP)，也称为三磷酸钠(STP)、三聚磷酸钠(STPP)或三磷酸五钠(CAS号：7758-29-4)，是一种无机化合物，化学式为Na5P3O10。它是多聚磷酸五阴离子的钠盐，是三磷酸的共轭碱。它作为许多国内和工业产品(特别是洗涤剂)的成分而被大规模生产。作为二齿和三齿螯合剂，它与金属阳离子牢固结合。
如本文所用，二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)或喷替酸(CAS号：67-43-6)是一种氨基多羧酸，由带有五个羧甲基基团的二亚乙基三胺主链组成。该分子可以被视为EDTA的扩展版本，并且被类似地使用。它是一种白色固体，在水中的溶解度有限。
如本文所用，二乙基二硫代氨基甲酸钠(DDC)(也称为二乙基二硫代氨基甲酸钠；CAS号：148-18-5)通过两个硫原子与许多“较软”的金属配位。已知其他更复杂的成键模式，包括作为单齿配体结合和桥连配体，使用一个或两个硫原子结合。
如本文所用，L-谷氨酸N,N-二乙酸四钠盐(GLDA)也称为谷氨酸二乙酸四钠(CAS号：51981-21-6)。
在任何实施方案中，可以以盐的形式提供螯合剂，包括其钙盐、盐酸盐或单钠盐、二钠盐、三钠盐。
在某些实施方案中，螯合剂以样品中铜浓度的至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约25倍、至少约50倍、至少约100倍或至少约200倍的浓度，与包含白蛋白的样品结合；可选地，其中添加螯合剂至浓度为约25μM至约20mM之间，优选约50μM至约15mM之间，更优选约50μM至约500μM之间，最优选约50μM。
在一优选实施方案中，可生物降解的螯合剂为(S,S)-EDDS，且(S,S)-EDDS以样品中铜浓度的至少约2倍、或至少约5倍、至少约10倍、至少约25倍、至少约50倍、至少约100倍或至少约200倍的浓度，与包含白蛋白的样品结合；可选地，其中添加(S,S)-EDDS至浓度为约25μM至约20mM之间，优选约50μM至约15mM之间，更优选约50μM至约500μM之间，最优选约50μM。
在某些实施方案中，螯合剂以样品中铜的浓度的至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍或至少200倍的浓度，与包含白蛋白的样品结合；可选地，其中添加螯合剂至浓度为25μM至20mM之间，优选50μM至15mM之间，更优选50μM至500μM之间，最优选50μM。
在一优选实施方案中，可生物降解的螯合剂为(S,S)-EDDS，且(S,S)-EDDS以样品中铜的浓度的至少2倍、或至少5倍、至少10倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍或至少200倍的浓度，与包含白蛋白的样品结合；可选地，其中添加(S,S)-EDDS至浓度为25μM至20mM之间，优选50μM至15mM之间，更优选50μM至500μM之间，最优选50μM。
用于螯合和阳离子交换的树脂
带电分子例如蛋白、肽和/或氨基酸以及其他溶质可以通过离子交换的方法从组合物中分离。离子交换材料，例如离子交换树脂，通常包含两种类型的离子：结合在树脂内或树脂上的离子，以及带相反电荷的反离子。当树脂与组合物接触时，组合物中的带电分子可以置换反离子并与树脂结合。在分离过程中，通过提高样品中反离子的浓度，与树脂结合的带电分子可以以与带电分子的结合亲和力成反相关的顺序竞争性地且顺序地从树脂中置换或洗脱。有关离子交换的更详细讨论，参见Moore,et al.,“Chromatography of aminoacids on sulfonated polystyrene resins,”1958,Analytical Chemistry,30:1185-1190。
通常，离子交换树脂或介质有四种主要类型。强阳离子交换树脂/介质是强酸性的，并且通常含有完全电离的酸性基团，例如磺酸基团或相应的盐。这些交换剂带负电，并且非常牢固地结合阳离子。强酸或强碱树脂的交换容量通常与接触树脂的样品的pH值无关。强阳离子交换剂的实例包括：磺酸、Trisacryl、磺丙基等。
弱阳离子交换树脂/介质含有弱酸，例如羧酸基团或相应的盐(例如，羧甲基(CM)纤维素、Chelex-100等)。由于弱酸树脂的解离程度受pH影响，树脂容量部分取决于溶液pH。例如，典型的弱酸性树脂在pH低于6.0时容量非常有限。因此，弱阳离子交换剂在窄的pH范围内(约6和7之间)工作。因此，“弱阳离子交换树脂”或“弱阳离子交换材料”是指交换剂是弱酸，当pH高于交换剂的pKa时，其将带负电。弱阳离子交换剂的实例包括羧甲基(CM)、膦酰基和聚天冬氨酸等。
离子交换树脂可以包含多种带电基团。例如，阳离子交换树脂可包含带电基团，例如羧甲基(CM)、磺丙基(SP)和/或磺酸甲酯(S)。这些带电基团可以连接至各种核心材料，包括琼脂糖基(例如，SEPHAROSE CL-BB、SEPHAROSE FAST FLOW和SEPHAROSE HIGHPERFORMANCE)、纤维素基(例如，DEAE SPHACEL)、葡聚糖基(例如，SEPHADEX)、二氧化硅基和合成聚合物基。
尽管根据本文所述的方法可以使用多种离子交换剂中的任何一种来结合可溶性带电蛋白、肽、氨基酸和/或其他带电分子，但优选离子交换剂是强阳离子交换剂(即，强酸性树脂)。在一实施方案中，本文使用的阳离子交换树脂优选包含磺酸基阳离子交换树脂，例如包含与基质苯乙烯二乙烯基苯结合的磺酸(-SO3H)。在其他实施方案中，阳离子交换树脂可包含亚氨基二乙酸螯合阳离子交换树脂。
尽管本文主要就自由流动树脂进行了讨论，但应当理解，本文所述方法中使用的阳离子交换材料(即，用于结合或用于螯合金属阳离子的配体)可以是各种形式。例如，阳离子交换剂可以涂覆在珠子上，可以是膜离子交换树脂的形式，可以涂覆在其中进行分离的容器的内表面或部分内表面上，和/或可以涂覆在存在于其中进行分离的容器中的物体上，例如磁力搅拌棒或杆。在其他实施方案中，阳离子交换材料可以是聚乙烯基质中的强酸阳离子交换树脂(H-型)或螯合离子交换树脂(氨基磷酸盐)的形式。这类基质的实例包括Metal Ion Purifiers过滤器滤芯和滤盘。更进一步的实施方案考虑使用亚氨基二乙酸盐官能化的聚[苯乙烯二乙烯基苯]树脂，例如Empore/>提取盘。离子交换剂的其他适用形式对于本领域技术人员而言是显而易见的。
通常，阳离子交换树脂包含的孔径阻止白蛋白与树脂的带负电阳离子交换基团/配体接触(优选使得树脂不与存在于包含白蛋白的溶液中的白蛋白结合，特别是当pH低于白蛋白等电点时(其为约pH 4.8))。例如，优选地，阳离子交换树脂是用于精细化学和制药柱制备中的细网树脂。
在任何实施方案例，阳离子交换树脂的网孔尺寸在50-400、优选50-200或50-100之间的范围内(即，μm直径当量在300和38μm之间，优选在300和75μm，或最优选在300和150μm之间，基于1μm＝0.001msm)(即，300μm至38μm之间、优选300μm至75μm之间、或最优选地在300μm和150μm之间的直径当量，基于1μm＝0.001msm)。
因为本文所述的水性分散体(例如，包含含有白蛋白和其他蛋白、离子交换树脂和可选的缓冲液或其他pH调节剂的组合物)可能会被搅拌，以更好地促进白蛋白和蛋白的分离，在一实施方案中，本文所用的树脂相对于分散体的其余部分能够自由流动。例如，在这一实施方案中，树脂颗粒优选能够相对于其他树脂颗粒和相对于其他分散体组分独立移动。因此，与填充在容器中的树脂的相对固定状态相比，包含自由流动树脂的水性分散体可以易于搅拌。
在本发明的某些实施方案中，用于结合或用于螯合金属阳离子的配体可包含阳离子交换树脂。合适的树脂的特别优选的实例包括：包含磺酸基阳离子交换树脂的阳离子交换树脂，例如包含与基质苯乙烯二乙烯基苯结合的磺酸(-SO3H)。这类树脂的市售实例是本领域技术人员已知的，并且包括或/>细网球形强酸阳离子交换树脂，特别是50W系列，并且具有不同程度的树脂交联。在某些实例中，树脂可以是50W X2、50WX4、50W X8、50W X12或50W X16，在树脂共聚物中分别具有2％、4％、8％、12％或16％的二乙烯基苯。
根据本发明可适用的市售螯合树脂的其他实例包括具有亚氨基二乙酸盐官能团的树脂，例如Amberlite IRC 748、Lewatit TP 207、Lewatit TP 208、Purolite S 930、Lewatit MonoPlus TP 207、亚氨基二乙酸纤维Ionex IDA-Na和Dowex M 4195。
对于本领域技术人员来说其他合适的树脂是显而易见的，并且例如描述于Edebali and Pehlivan(2016)Powder Technology,301:520-525，其通过援引加入本文。
酸化
本发明的方法还可以包括酸化步骤(pH变化)以进一步提高包含白蛋白的样品的纯度，并最小化污染蛋白酶的影响。
根据本发明的第一方面，酸化步骤可以在包含白蛋白的样品与螯合剂接触之前或之后。可选地，其中包含白蛋白的样品是Cohn部分V或KistlerNitschmann沉淀C，首先将螯合剂添加到样品中，然后进行酸化步骤。或者，当使用沉淀C或部分V的滤液(例如，滤液D)时，可以首先进行酸化步骤，然后添加螯合剂。
优选地，酸化步骤包括使包含白蛋白的样品(或耗竭金属阳离子的包含白蛋白的样品)与无机酸接触，无机酸可选地选自：硫酸(H2SO4)、柠檬酸(C6H8O7)、盐酸(HCl)、磷酸(H3PO4)、草酸(C2H2O4)和甲酸(CH2O2)。在一优选实施方案中，使用硫酸或盐酸进行酸化。
优选地，当酸化步骤在添加螯合剂之后发生时，酸化步骤导致包含白蛋白的样品的pH降低至pH为约3.0至4.8，优选至pH为约4.0至约4.8之间，或约4.0至4.4之间，最优选约3.9至约4.2之间。
最优选地，当酸化步骤在添加螯合剂之后发生时，酸化步骤导致包含白蛋白的样品的pH降低至pH为约3.8、约3.9、约4.0、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4、约4.5、约4.6、约4.7或约3.8，特别是至pH为约3.9、约4.0、约4.1或约4.2。
或者，当酸化步骤发生在添加螯合剂之前时(例如，当含有白蛋白的样品是Cohn部分V或Kistler-Nitschmann沉淀C的滤液时，其可具有约7.0至7.5范围内的pH)，酸化步骤导致包含白蛋白的样品的pH降低至pH为约5.6-6.0，优选至pH为约5.8至约5.9之间。
根据本发明的任何方面或实施方案，酸化可选地导致包含白蛋白的样品的pH降低至pH为约4.6至约4.8之间。
优选地，将无机酸以约0.01M至约5.0M(摩尔)之间、约0.1M至约2.5M之间、约0.2M至约2.0M之间、约0.2M至约1.0M之间，更优选以浓度为约0.25M至约0.5M之间的浓度，添加至包含白蛋白的样品中。
在特别优选的实施方案中，无机酸是硫酸或盐酸，并且其以约0.01M至约5.0M(摩尔)之间、约0.1M至约2.5M之间、约0.2M至约2.0M之间、约0.2M至约1.0M之间，更优选以浓度为约0.25M至约0.5M之间的浓度，添加至包含白蛋白的样品中。
应当理解，在配制hSA药物组合物之前，应优选除去包含白蛋白的部分中存在的任何螯合剂。因此，在优选的实施方案中，本发明提供根据本发明的任何方面回收金属阳离子耗竭的包含白蛋白的部分的步骤之后的各种附加过滤方法。
在优选实施方案中，随后的过滤步骤可以包括渗滤步骤以除去任何螯合剂，可选地包括渗滤之前和/或之后的浓缩步骤。技术人员熟悉用于去除蛋白产品中不需要的成分的合适的渗滤方法。例如，技术人员能够确定除去螯合剂所需的渗滤轮数(例如渗滤体积)。渗滤步骤也可用于去除其他污染物，包括铝、其他低分子盐和乙醇。
通常，对金属阳离子耗竭的白蛋白产品进行进一步加工以制备适合施用于受试者的hSA组合物。例如，可以对金属阳离子耗竭的白蛋白样品进行浓缩、调整钠含量(例如，通过添加氯化钠至药典标准可接受的水平)。还可以添加注射用水(WFI)来调节最终药物组合物的总蛋白浓度(例如，可以根据需要来调节蛋白含量来制造4％、5％、20％和25％的人白蛋白溶液(hSA))。
还可以包括以下辅料：N-乙酰基色氨酸钠(稳定剂)；辛酸钠(稳定剂)；氯化钠(张度剂)；注射用水(溶剂)
在分配和巴氏灭菌之前，还优选无菌过滤最终的白蛋白产品。
在具体实施方案中，最终的hSA制剂选自：i)蛋白(4％w/v)，对于4％w/v的hSA，钠(140mM)和辛酸盐(6.4mM)；ii)蛋白(5％w/v)，对于5％w/v的hSA，钠(140mM)和辛酸盐(8mM)；iii)蛋白(20％w/v)，和，对于20％w/v的hSA，辛酸盐(32mM)；iv)蛋白(25％w/v)，和，对于25％的w/v hSA，辛酸盐(40mM)。
在另外的实施方案中，最终的hSA制剂可以选自：i)蛋白(4％w/v)，对于4％w/v的hSA，3.2mM的N-乙酰色氨酸钠和3.2mM的辛酸钠；ii)蛋白(5％w/v)，对于5％w/v的hSA，4mM的N-乙酰色氨酸钠和4mM的辛酸钠；iii)蛋白(20％w/v)，对于20％w/v的hSA，0.016M的N-乙酰色氨酸钠和0.016M的辛酸钠；iv)蛋白(25％w/v)，对于25％w/v的hSA，0.02M的N-乙酰色氨酸钠和0.02M的辛酸钠。hSA制剂优选不包含防腐剂。
本发明的hSA药物组合物(药品)优选满足适当的药典标准。例如，如欧洲药典10.6版中所述的以下针对人白蛋白溶液测试程序：hSA制剂是无菌的；无热原；对于50g/L以下的溶液，内毒素水平在0.5IU/mL以下；或对于50g/L至200g/L的溶液，内毒素水平在1.3IU/mL以下；或对于200g/L以上的溶液，内毒素水平在1.7IU/mL以下；铝含量上限为200μg/L；前激肽释放酶激活剂(PKA)最大为35IU/mL；血红素含量不大于0.15；每克蛋白的钾上限为0.05mmol；钠上限为160mmol/L，且为标签上标明的钠含量的95％至105％；聚合物和聚集体上限为10％；通过区带电泳，不超过5％的蛋白具有与主要条带不同的迁移率；pH为6.7至7.3，总蛋白不少于标明含量的9％且不超过标明含量的10％
还应当理解，进行本发明方法的温度是维持白蛋白产品完整性的温度。优选地，在0℃至约20℃之间的温度进行方法；优选在0℃至约10℃之间，更优选在2℃至约8℃之间，最优选在2℃至约4℃之间。
实施例
实施例1：白蛋白产品中深色沉积物的表征
白蛋白中的深色沉积物是已知现象；实例如图2所示。本研究的目的是研究导致沉积物形成的潜在机制，通过以下表征：
(i)从白蛋白中分离的深色沉积物，和
(ii)保质期结束时含或不含沉积物的25％的白蛋白全溶液，以及新鲜白蛋白溶液的样品。
某些白蛋白制剂中发现由六边形颗粒组成的深色沉积物，并通过扫描电子显微镜(SEM)结合能量色散X射线光谱(EDX)进行分析。EDX分析表明，颗粒由铜和硫组成，原子比例约为1:1。CuS(硫化铜)是在30℃下储存一段时间后所形成的。
铜存在于血液血浆中，并且通过纯化方法未完全去除。在血液血浆中发现的铜的很大一部分与血浆蛋白铜蓝蛋白和白蛋白结合，因此得出结论，蛋白结合的铜可能是白蛋白制剂中发现的深色沉积物的成因。
实施例2：使用螯合步骤降低白蛋白制剂中的铜水平
根据Kistler Nitschmann方法从血液血浆获得含有白蛋白的部分。简言之：
解冻冷冻血浆，然后在不锈钢罐中用醋酸盐缓冲液(pH 4)将血浆的pH调节至pH5.7至6.0。连续添加96％乙醇至浓度19％(V/V)，且同时搅拌并冷却至温度为-5.5℃±1.0℃。然后调节pH为5.70至5.90。在聚丙烯片材上添加珍珠岩(助滤剂)后，通过过滤除去悬浮的沉淀A。将沉淀A的滤液收集在另一个不锈钢罐中以进一步加工成白蛋白。将温度降至7±0.5℃，且同时添加96％乙醇至40％终浓度(V/V)。如果需要，将该溶液的pH调节为5.95至6.00。部分IV发生沉淀，然后通过使用助滤剂(珍珠岩和硅藻土)，通过过滤基质支持物过滤以除去沉淀。
在乙醇浓度恒定为40％并冷却至温度为7±1℃下，用1.1M乙酸将滤液IV的pH值调节至4.8±0.1。沉淀C发生沉淀，然后通过用硅藻土过滤将其与乙醇溶液分离。
沉淀C几乎只含有白蛋白和助滤剂。为了进一步处理，首先将来自一个或多个分离批次的沉淀C重悬于注射用水(1kg糊+1.7kg注射用水)中，然后在pH 4.7±0.1下通过无石棉深度过滤器过滤以获得滤液D。通过1M NaOH将滤液D的pH调节至为7.2±0.1。
初始的一系列实验选择了几种螯合剂，以确定在包含白蛋白的血浆衍生物中添加螯合剂是否有助于耗竭铜离子。
当以50mM的浓度添加时，初始测试螯合剂EDTA、EDDS(其(S,S)异构体)、EGTA、IDS、DS、MGDA和NTA。这些络合剂中的一些作为EDTA的替代品已广泛用于不同领域(例如水软化或洗涤剂和清洁剂)，例如MGDA、DTPA和(S,S)-EDDS。
采用两种不同的方法表征每种螯合剂的性质。在初始筛选期间，将单独的螯合剂添加到滤液D中。进行此操作时，进行或不进行随后的将pH调节至pH为5.8-5.9。
在每个中间体阶段取样并分析相关参数，即铜、蛋白水解活性和聚集体形成。
初始实验结果如图3所示，表明添加任何螯合剂都导致滤液D产品中铜水平的降低。特别是，(S,S)-EDDS、EDTA、EGTA和NTA显著降低铜浓度，其中用(S,S)-EDDS、EDTA和EGTA降低的铜水平接近或低于0.8μg铜/蛋白的目标。
评估添加螯合剂后的蛋白水解活性。这些值在超滤处理步骤的预期范围内(数据未显示)。初始筛选的结果表明，螯合剂的添加导致pH变化。因此，决定重复实验，在添加螯合剂后将滤液D的pH调节至5.8-5.9。用硫酸调节pH。结果如图3所示，表明几种螯合剂在此pH值下保留了耗竭铜离子的能力。
实施例3：从白蛋白制剂中除去铜离子需要螯合步骤
为了证明从白蛋白制剂中去除铜离子需要螯合，而不仅仅是改变pH，进行一系列进一步的实验。
简言之，根据实施例2中描述的方法获得含白蛋白的样品，得到滤液D。取滤液D的等分，并将pH调节至4.0至7.2之间。然后将等分的样品通过10kDa膜(Amicon)过滤并以2000rpm离心110分钟。
为了排除铜与膜相互作用的可能性，还进行了阳性对照，使用含有0.5mg/L铜的硫酸铜五水化合物溶液，将其也应用于10kDa膜并在2000rpm下离心。
分析离心后的截留物和渗透物以评估总蛋白浓度(g/L)和铜浓度(mg/kg)。
结果表明，当对包含白蛋白的样品(以滤液D的形式)进行一系列不同的pH条件(特别是在pH 4.0至7.2的范围内)，然后通过10kDa膜进行过滤时，在渗透物中未检测到铜离子。铜离子被发现保留在截留物中(与滤液中的蛋白结合)。结果表明，单独改变pH不适合耗竭白蛋白制剂中存在的铜，并且需要使用螯合剂(如实施例2中)来耗竭铜离子。
实施例4：在白蛋白产品的放大生产中使用螯合剂
在第二系列实验中，以商业规模(即在大罐中)将螯合剂添加到重悬沉淀C或沉淀V中。根据需要，用1M HCl将pH调节至约4.0-4.8。
因为实施例2的结果表明在较低pH值下可能需要减少的螯合剂的量，所以以15mM(对于EDTA为5mM)的浓度添加螯合剂。
使用最有希望的候选物(S,S)-EDDS、IDS和NTA进行随后的实验，包括EDTA作为阳性对照。
与滤液D筛选实验相类似，当在沉淀物重悬步骤中将pH值调整至4.2时被添加到罐中时，(S,S)-EDDS被确定为最有希望的可生物降解的螯合剂(图5)。
实施例2和3中概述的实验的关键发现是，EDDS在所研究的整个pH范围内表现出优异的铜耗竭特性。这一结果在关于pH值的一定灵活性方面很有希望，这意味着EDDS不仅在测量的最低pH时有效，而且在达到4.8的较高pH值下也有效。
实施例5：在白蛋白产品的制备中使用不同浓度的螯合剂
使用浓度在1mM和15mM之间的生物可降解螯合剂(S,S)-EDDS，进行与实施例4中进行的那些类似的系列实验。
简言之，将(S,S)-EDDS(作为Na3EDDS的溶液)添加到重悬沉淀C(从KN分离方法获得)中，并根据需要用1M HCl将pH调节至约4.6-4.8。然后通过深度过滤和超滤步骤处理混合物以获得滤液D。
在超滤前将滤液D的pH重新调节至pH为7.2-7.3，然后浓缩至135±5g蛋白/kg，并进行渗滤。
为了了解不同浓度的EDDS对铜耗竭的影响，在整个方法中测量这一金属的浓度。
如图6所示，在整个纯化方法中观察到铜持续耗竭。这证实实施例4中的观察结果。
如下表所示，铜耗竭的程度范围从71％(使用15mM的(S,S)-EDDS)到79％(使用1mM的(S,S)-EDDS)。
(S,S)-EDDS的浓度不影响终产品的蛋白水解活性，所有结果等于或低于3nkat/L。
在整个方法中，不同浓度的(S,S)-EDDS对白蛋白的分子大小分布(例如对于单体和聚集体含量)没有影响。
总体而言，结果表明，当使用较低浓度(从15mM至1mM)的(S,S)-EDDS时，溶液中(包括在重悬的滤液C及其滤液中)的铜水平仍然显著降低。相较于没有螯合剂时铜的浓度降低18％，当存在(S,S)-EDDS时，铜的浓度(相对于白蛋白浓度归一化)在研究范围内降低71％至79％。
该研究表明，与实施例4中讨论的结果相比，添加到悬浮液中的螯合剂浓度降低15倍，获得类似的关于铜耗竭的结果。
在一系列类似的实验中，(S,S)-EDDS的浓度保持恒定在15mM，同时改变重悬液的pH和乙醇浓度。结果没有观察到显著变化。
实施例6：制备白蛋白产品时螯合剂的可替代浓度的进一步研究
使用浓度在0.05mM和1mM之间的可生物降解的螯合剂(S,S)-EDDS，进行与实施例4和5中进行的那些类似的系列实验。
简言之，将(S,S)-EDDS(作为Na3EDDS的溶液)添加到重悬沉淀C(从KN分离方法获得)中，并根据需要用1M HCl将pH调节至约4.6-4.8。然后通过深度过滤和超滤步骤处理混合物以获得滤液D。
在超滤前将滤液D的pH重新调节至pH为7.2-7.3，然后浓缩至135±5g蛋白/kg，并进行渗滤。
为了了解不同浓度的(S,S)-EDDS对铜耗竭的影响，在整个方法中测量这一金属的浓度。
如图7所示，在整个纯化方法中观察到铜持续耗竭。这证实了实施例4和5中的观察结果。
如下表所示，铜耗竭程度范围从73％(使用1mM的(S,S)-EDDS)到82％(使用0.05mM的(S,S)-EDDS)
(S,S)-EDDS的浓度不影响终产品的蛋白水解活性，所有结果等于或低于3nkat/L。
在整个过程中，不同浓度的(S,S)-EDDS对白蛋白的分子大小分布(例如对于单体和聚集体含量)没有影响。
总体而言，结果表明，当使用较低浓度(从0.05mM至1mM)的(S,S)-EDDS时，溶液中(包括在重悬的滤液C及其滤液中)的铜水平仍然显著降低。相较于没有螯合剂时铜的浓度降低18％，当存在(S,S)-EDDS时，铜的浓度(相对于白蛋白浓度归一化)在研究范围内降低73％至82％。
初始实验使用15mM螯合剂(实施例4)实现了70-80％范围内的铜耗竭，进一步实验使用在1和15mM之间的(S,S)-EDDS得到在相同的范围的值(实施例5)。因此，本研究获得的结果表明，用15mM或0.05mM(即添加到悬浮液中的量减少了300倍)螯合剂去除铜同样有效。可能的解释是，糊状悬浮液中铜的初始浓度约为0.4mg/kg，对应于6μM的铜浓度，这意味着悬浮液中50μM螯合剂与铜相比仍过量约10倍。
实施例7：使用阳离子交换层析降低白蛋白制剂中的铜水平
在该实施例中，发明人研究了重悬沉淀C的阳离子交换层析对阳离子交换层析是否也会耗竭白蛋白制剂中的铜。
研究使用阳离子交换树脂柱进行，柱床高度为21.5cm，填充有50％Dowex200-400目的树脂和50％ />100-200目的树脂的混合物(/>5OWX2)。对于所有pH设定点，在进样期间和进样后洗涤期间以10分钟的恒定停留时间运行柱。这项研究的结果如图8所示。观察到的明显趋势是铜耗竭随pH设定点而减少。在pH为3.9时达到最高耗竭，而在pH为4.2时观察到最低耗竭(略高于≤0.8μg铜/g白蛋白的目标)。
实施例8：评估沉积物形成的稳定性研究
对各种白蛋白制剂进行为期数月的评估，以确定螯合剂或阳离子交换方法对延缓沉积物形成的影响。
初步结果如图9所示，表明与未经处理的对照相比，包含白蛋白的样品与阳离子交换树脂(在分批法或柱层析法中)或者与螯合剂EDTA或(S,S)-EDDS接触至少8个月后，没有沉积物形成的证据。
类似的结果如图10所示，对应于在有酸化和没有酸化的情况下，与螯合剂EDTA或(S,S)-EDDS接触12个月后的含有白蛋白的样品。简言之，在制造含有25％(w/v)的白蛋白产品的过程中，通过使沉淀C与螯合剂EDTA(5mM，pH 4.2或15mM，pH 4.7)或EDDS(15mM，pH4.2)接触以获得白蛋白样品。样品在40℃、≤25％相对湿度下储存长达12个月，并通过目视评估沉积物形成的程度并拍摄照片。
稳定性研究的目视读数总结并示于图10。进行螯合剂处理的样品在螯合剂处理后11-12个月仅显示出低水平的深色沉积物形成。相比之下，所有未进行螯合剂处理的样品在大约5个月内显示出明显的深色沉积物证据。
实施例9：最终产品配方
如实施例2和3中所述，在使用螯合剂耗竭金属阳离子之后，对包含白蛋白的样品进行下游制造方法。在起始材料为沉淀C的情况下，对含有白蛋白的样品进行如实施例2所述的澄清深度过滤，以获得金属阳离子耗竭的滤液D。
通过超滤，将中和的滤液D溶液浓缩至约130至140g/kg白蛋白，然后首先用至少5倍实际体积的0.1M至0.3M的氯化钠渗滤，然后用至少2.5倍量的注射用水渗滤。通过该过程，螯合剂与结合的任何金属阳离子一起被去除。还去除了铝、其他低分子盐和乙醇。
然后配制白蛋白溶液。其通过添加氯化钠至140mmol/L的浓度来调节钠含量来获得。然后将稳定剂辛酸钠和N-乙酰色氨酸钠添加到白蛋白溶液中，对应于25％白蛋白为20mmol/L，20％白蛋白为16mmol/L，5％白蛋白为4mmol/L。添加注射用水以稀释白蛋白溶液至目标蛋白浓度，并根据需要分别用盐酸或氢氧化钠溶液调节pH。
最终的白蛋白产品在配药之前进行无菌过滤，然后进行巴氏灭菌。
应当理解，本说明书中公开和定义的本发明扩展至从文本或附图中提及或显而易见的两个或更多个单独特征的所有可替代的组合。所有这些不同的组合构成了本发明的各种可替代的方面。

Claims (32)

1.一种用于从包含白蛋白的样品制备适合于药物用途的纯化的白蛋白组合物的方法，所述包含白蛋白的样品从源于血液的血浆获得，所述方法包括：
i)提供从源于血液的血浆获得的包含白蛋白的样品；
ii)使所述包含白蛋白的样品与用于结合或用于螯合金属阳离子的配体接触，以获得金属阳离子耗竭的包含白蛋白的样品；
从而制备纯化的白蛋白组合物。
2.权利要求1的方法，其中
所述用于结合或用于螯合金属阳离子的配体为螯合剂。
3.权利要求2的方法，其中
所述螯合剂选自：乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇双(β-氨基乙基)-N,N,N′,N′-四乙酸(EGTA)、乙二胺-N,N'-二琥珀酸(EDDS)，包括(S,S)-EDDS、亚氨基二琥珀酸(IDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、三亚乙基四胺(Trien)、亚氨基二乙酸(IDA)、次氮基三乙酸(NTA)、三聚磷酸盐(TPP)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、二乙基二硫代氨基甲酸钠(DDC)、L-谷氨酸N,N-二乙酸四钠盐(GLDA)和青霉胺、或其任何盐，
优选地，其中所述螯合剂是可生物降解的螯合剂，例如EDDS、IDS、MGDA和NTA、或者其任何异构体或盐。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中
所述用于结合或用于螯合金属阳离子的配体为EDTA或其盐。
5.权利要求1-3中任一项的方法，其中
所述用于结合或用于螯合金属阳离子的配体为(S,S)-EDDS或其盐，优选其三钠盐。
6.权利要求1的方法，其中
所述用于结合或用于螯合金属阳离子的配体为螯合树脂。
7.权利要求6的方法，其中
所述螯合树脂为阳离子交换树脂。
8.权利要求7的方法，其中
所述阳离子交换树脂包含强酸交换基团。
9.权利要求8的方法，其中
所述阳离子交换树脂包含磺酸交换基团。
10.权利要求6-9中任一项的方法，其中
使用柱层析使所述包含白蛋白的样品与所述用于结合或用于螯合金属阳离子的配体接触。
11.权利要求1-10中任一项的方法，其中
所述用于结合或用于螯合金属阳离子的配体是能够结合或螯合铜离子的配体。
12.权利要求1-11中任一项的方法，其中
所述包含白蛋白的样品选自：从源于血液的血浆获得的Cohn部分、Kistler-Nitschmann部分或硫酸铵沉淀。
13.权利要求12的方法，其中
所述包含白蛋白的样品为Cohn部分V或Kistler-Nitschmann沉淀C，或者其悬浮液、滤液或浓缩液。
14.权利要求12的方法，其中
所述包含白蛋白的样品为部分V或沉淀C的滤液。
15.权利要求1-14中任一项的方法，其中
所述方法包括：在使所述样品与所述用于结合或用于螯合金属阳离子的配体接触之前，重悬包含白蛋白的血液样品的沉淀。
16.权利要求1-15中任一项的方法，其中
所述包含白蛋白的样品与一定量的螯合剂接触，所述螯合剂的量相当于螯合剂的浓度是样品中所含铜的至少2倍。
17.权利要求16的方法，其中
所述包含白蛋白的样品与一定量的螯合剂接触，所述螯合剂的量相当于螯合剂的浓度是样品中所含铜的至少5倍，
优选地，螯合剂的浓度是样品中所含铜的至少10倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍、至少200倍。
18.权利要求1-17中任一项的方法，其中
所述包含白蛋白的样品与浓度为约10μM至约100mM螯合剂的螯合剂接触，
优选约25μM至约50mM螯合剂，更优选约50μM至约15mM螯合剂，最优选约50μM至约500μM螯合剂，特别是约50μM的螯合剂。
19.权利要求1-17中任一项的方法，其中
所述包含白蛋白的样品与浓度低于约100mM螯合剂的螯合剂接触，
更优选低于约50mM螯合剂，或低于约25mM螯合剂，或低于约15mM螯合剂，或低于约5mM螯合剂；
最优选低于约1mM螯合剂或低于500μM螯合剂，或者低于约250μM螯合剂或低于约100μM螯合剂，特别是约50μM或更低。
20.权利要求1-19中任一项的方法，其中
所述方法进一步包括酸化步骤。
21.权利要求20的方法，其中
所述酸化在所述包含白蛋白的样品与所述用于结合或用于螯合金属阳离子的配体接触之前发生。
22.权利要求21的方法，其中
所述配体为螯合剂，并且在所述包含白蛋白的样品与所述螯合剂接触的步骤之后进行所述酸化步骤。
23.权利要求21的方法，其中
所述配体为阳离子交换树脂，并且在所述包含白蛋白的样品与所述阳离子交换树脂接触之前进行所述酸化步骤。
24.权利要求20-23中任一项的方法，其中
所述酸化步骤包括使所述包含白蛋白的样品或所述耗竭金属阳离子的包含白蛋白的样品与无机酸接触。
25.权利要求24的方法，其中
所述无机酸选自：硫酸(H2SO4)、柠檬酸(C6H8O7)、盐酸(HCl)、磷酸(H3PO4)、草酸(C2H2O4)和甲酸(CH2O2)，
优选地，其中所述无机酸为硫酸或盐酸。
26.权利要求20-25中任一项的方法，其中
所述酸化步骤导致所述包含白蛋白的部分的pH降低至pH为约3.0-4.5，
优选至pH为约3.5-约4.5之间，或约3.6-4.4之间，或约3.7-约4.3之间，或约3.8-约4.2之间，最优选约3.9-约4.2之间。
27.权利要求26的方法，其中
所述耗竭金属阳离子的包含白蛋白的样品的pH不低于约4.2。
28.权利要求20-26中任一项的方法，其中
所述酸化步骤导致包含白蛋白的部分的pH降低至pH为约5.6-6.0，
优选至约5.8或约5.9之间。
29.权利要求1-28中任一项的方法，其进一步包括
对所述耗竭金属阳离子的包含白蛋白的样品进行额外的纯化步骤，
所述纯化步骤选自：预过滤步骤(例如，澄清深度过滤)、超滤(例如，渗滤和/或浓缩)及其组合。
30.权利要求1-29中任一项的方法，其中
所述源于血液的血浆是源于人血液的血浆，
可选地，其中所述血浆批量大小为1,000-15,000kg。
31.一种纯化的白蛋白药物组合物，其通过权利要求1-30中任一项方法获得。
32.一种纯化的白蛋白药物组合物，
可选地通过权利要求1-30中任一项方法获得，其中
所述组合物包含的铜的浓度不超过约2.0μg/g蛋白、不超过约1.5μg/g蛋白、不超过约1μg/g蛋白、不超过约0.8μg/g蛋白、不超过约0.5μg/g蛋白或不超过约0.2μg/g蛋白；
优选地，其中所述组合物包含的铜的浓度不超过约2.0μg/g白蛋白、不超过约1.5μg/g白蛋白、不超过约1μg/g白蛋白、不超过约0.8μg/g白蛋白、不超过约0.5μg/g白蛋白或不超过约0.2μg/g白蛋白。
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