JP2023502389A - ウィルソン病患者における神経損傷を低下させるための方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、概して、銅代謝関連疾患又は障害において観察される銅誘発性神経損傷を処置するための方法に関する。本開示は、ウィルソン病（ＷＤ）における銅誘発性神経損傷を低下させることに関する。【選択図】図１Ｂ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１１月２１日に提出された米国仮特許出願第６２／９３８，５８５号及び２０２０年１０月２日に提出された米国仮特許出願第６３／０８６，７６８号の優先権の利益を主張し、これらはともに、全体が参照によって援用される。

開示の背景
発明の分野
本開示は、概して、銅代謝関連疾患又は障害において観察される銅誘発性神経損傷を処置するための方法に関する。本開示は、詳細には、ウィルソン病（ＷＤ）における銅誘発性神経損傷を低下させることに関する。

技術背景
１９１２年、サミュエル・アレクサンダー・キニア・ウィルソンは、加えて肝硬変とも関連する、レンズ核の進行性の変性によって特徴づけられる致死的神経疾患を報告した。今日では、ＷＤは、主に肝臓に存在している銅輸送ＡＴＰアーゼＡＴＰ７Ｂの欠損に関係していることが知られている。ＡＴＰ７Ｂ異常は、血液循環中にあふれ出すかもしれない大量の肝銅蓄積を引き起こし得るということで、現在、意見が一致している。ＷＤ患者において、過剰銅は、銅運搬血漿タンパク質セルロプラスミンへの組み込みがしっかりとしておらず、可能性として、脳などの周辺の器官に蓄積されやすい。ＷＤ患者において、蓄積から数年後又はさらに数十年後、脳の銅濃度は、最高４５０μｇ／ｇ乾燥重量に達するかもしれず（コントロールにおける７～６０μｇ／ｇ乾燥重量に対して）、脳病変及び神経症状（例えば構音障害及びパーキンソニズム）を引き起こし得る、最重視すべき毒性状態と見なされる。それにもかかわらず、神経型ＷＤの病態生理の多くの側面は、今もなお、状況に基づくものであったり、知られていないものであったりする。とりわけ、非セルロプラスミン結合銅（ＮＣＣ）がどうやって脳に入って、蓄積するかが問題とされている。

ＷＤ患者において、血中の銅は、主にアルブミン及びアミノ酸に結合する。血漿タンパク質が豊富だと（３５～５０ｇ／Ｌ；５００～７５０μＭ）、アルブミンの銅結合能は非常に高く、ｐＨ７．４で最高５つの銅イオンに結合するかもしれない。そういうわけで、第１の銅イオンは、Ｎ末端にかなりしっかりと結合し（Ｋ_ｄ＝０．９×１０^－１２Ｍ～６．７×１０^－１７Ｍ）、第２の銅イオンは、中程度の親和性で多重金属結合部位（ＭＢＳ）に結合し（Ｋ_ｄ＝１．９１×１０^－７Ｍ）、残りの３つの銅イオンは、今のところ特徴づけられていない部位に比較的ゆるく結びつけられる（Ｋ_ｄ＝６．２５×１０^－６Ｍ）。この点で、アミノ酸ヒスチジンが果たす役割は、その比較的低い血漿濃度（≒１００μＭ）及び中程度の銅親和性（Ｋ_ｄ≒１０^－９）のために、小さいかもしれない。このように、血漿には、銅に対するいくつかの結合パートナーが存在しており、高い受容力及び／又は高い親和性を有している。ＷＤ患者において、総血中銅濃度は、０．５～１６．６μＭと決定されており、そのうち、交換可能であるかもしれない銅は、ＥＤＴＡ（Ｋ_ｄ＝１．２６×１０^－１６Ｍ）キレート化実験によって決定されるように、濃度が比較的低く、１～５μＭである。

これにより、過剰な脳銅蓄積がどうやって起こり得るかといった問題が持ち上がる。１つメカニズムは、銅に対する一定の競合及びおそらくＡＴＰ７Ｂ異常による血液中への銅再排出不良に関連づけられる、高親和性輸送体ＣＴＲ１（Ｋ_ｄ≒１０^－１４Ｍ）を介した脳への銅の取込みであるかもしれない。ＣＴＲ１及びＡＴＰ７Ｂは、星状細胞及び周皮細胞と一緒に血液脳関門（ＢＢＢ）を形成する内皮細胞の血液に面している膜に存在する。比較的低い血中銅でのこのような競合は、神経型ＷＤ患者において観察される数十年もの長い臨床上の沈黙を説明するかもしれない。さらなる、相互排他的でない可能性として、銅誘発性の肝臓組織の死の時期に、激しい「血中銅の急変」が引き起こされ、それによって、脳の銅蓄積及び損傷を引き起こすかもしれないということがある。実際に、神経症状の重症度がよく変動し、時には同じ日に変動すること及び症状が、ストレス、合併している病気、又は医薬品によって増悪するかもしれないことが、臨床的に重要であると認められている。このような脳損傷は、ＢＢＢでスタートするかもしれず、これは、次いで、脳へのさらなる無秩序な銅流入を助長するかもしれない。同じような考えで、Stuerenburgは、脳脊髄液中に存在するアルブミン対血清中に存在するアルブミンの比の増加によって示される、神経型ウィルソン病患者におけるＢＢＢの乱れについて記載した。

ＷＤのための現在の処置は、Ｃｕをキレート化し、尿Ｃｕ排出を促進する一般的なキレート剤による療法Ｄ－ペニシラミン（ＤＰＡ）及びトリエンチン並びに腸管メタロチオネインのアップレギュレーションを通してＣｕの食事による摂取をブロックする亜鉛（Ｚｎ）である。ＤＰＡによる神経型ＷＤ患者の処置は、処置を開始してすぐなど、患者の１９～５２％において報告されるように、結果として、劇的な症状の悪化につながり得る。このような神経症状の悪化は、テトラチオモリブデート（ＴＴＭ）処置患者においてほとんど報告されない。ＤＰＡは、ＴＴＭ（Ｋ_ｄ＝２．３×１０^－２０Ｍ）よりも銅親和性が低い（Ｋ_ｄ＝２．４×１０^－１６Ｍ）ので、そのしっかりとした結合により、血液中の銅に対する競合は、ＴＴＭによって減弱するかもしれず、おそらく、結果として、より小さなＢＢＢ及び／又は脳の損傷につながる。

そのため、すでに存在している銅誘発性神経損傷を逆転させるためだけでなく、今後の銅誘発性神経損傷からの永続的な保護を提供するための、銅代謝関連疾患又は障害と関連する銅誘発性神経損傷の有効な処置の必要性が残っている。

本開示の概要
本開示は、概して、対象における銅誘発性神経損傷を処置するのに有用な方法を提供する。例えば、銅誘発性神経損傷は、ウィルソン病などの特異的疾患又は障害と関連していてもよい。

本開示の一態様は、銅誘発性神経損傷を処置するための方法を提供する。このような方法は、本明細書において記載されるビスコリンテトラチオモリブデートの治療有効量を対象に投与することを含む。この態様のある実施形態において、方法は、銅誘発性神経損傷を低下させる。

ある実施形態において、銅誘発性神経損傷は、以下の１つ以上を含む：銅誘発性細胞毒性、銅誘発性血液脳関門損傷、及び銅誘発性ミトコンドリア損傷。このように、ある態様において、本開示はまた、それを必要とする対象において、銅誘発性細胞毒性を低下させるための方法をも提供する。このような方法は、本明細書において記載されるビスコリンテトラチオモリブデートの治療有効量を対象に投与することを含む。

本開示の別の態様は、それを必要とする対象において、銅誘発性血液脳関門損傷を低下させるための方法を提供する。このような方法は、本明細書において記載されるビスコリンテトラチオモリブデートの治療有効量を対象に投与することを含む。

本開示の別の態様は、それを必要とする対象において、銅誘発性ミトコンドリア損傷を低下させるための方法を提供する。このような方法は、本明細書において記載されるビスコリンテトラチオモリブデートの治療有効量を対象に投与することを含む。

本開示の別の態様は、それを必要とする対象において、細胞銅含有量を低下させるための方法を提供する。このような方法は、本明細書において記載されるビスコリンテトラチオモリブデートの治療有効量を対象に投与することを含む。

本開示の別の態様は、本明細書において記載される方法において使用するための、治療有効量のビスコリンテトラチオモリブデートを含む組成物を提供する。

本開示のさらなる態様は、本明細書における本開示から明瞭になるであろう。

図面の簡単な説明
添付の図面は、本開示の方法のさらなる理解を提供するために含まれ、本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する。図面は、本開示の１つ以上の実施形態を例示し、説明と共に、本開示の原理及び実施の説明を果たす。

図１Ａ～１Ｅは、ＡＬＸＮ１８４０及びＤＰＡが血中銅レベルを増加させることを示す。図１Ａ及び１Ｅは、^６４Ｃｕをｉ．ｖ．又はｉ．ｐ．注射した野生型ラットのＰＥＴスキャンを示す。静脈内注射は、脳の付近で高いシグナル強度をもたらしたのに対して、ｉ．ｐ．注射したラットにおいて検出可能な^６４Ｃｕシグナルはなかった。図１Ｂは、４日間連続のＡＬＸＮ１８４０によるＡｔｐ７ｂ^－／－の処置が、屠殺後、血清銅レベルの増加をもたらしたのに対して、血清銅レベルは、ＤＰＡによる処置後に変化していなかった（Ｎ＝３）ことを示す。図１Ｃは、ＤＰＡによるＡｔｐ７ｂ^－／－ラットの処置が、処置の間に、尿銅排出における有意な増加をもたらしたことを示す（Ｎ＝３）。図１Ｄは、糞便銅排出が、処置の間に、ＡＬＸＮ１８４０及びＤＰＡ処置動物において変化していなかったことを示す（Ｎ＝３）。ダネットの多重比較検定ありの一元配置ＡＮＯＶＡを、統計解析のために使用した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 図２Ａ～２Ｃは、ＡＬＸＮ１８４０がアルブミン及び銅と安定した複合体を形成することを示す。図２Ａは、銅－アルブミン複合体の形成及び非結合銅に相当する第２の銅のピークを実証する、７５０μＭの銅及び２５０μＭアルブミンのサイズ排除クロマトグラフィーを示す。ＡＬＸＮ１８４０の存在下において、アルブミン、モリブデン、及び銅は、同じ画分中に存在した。ＡＬＸＮ１８４０ではなくＤＰＡの存在下において、銅の分布は、変化していなかった（Ｎ＝２）。図２Ｂは、アルブミンの構造におけるＳｕｄｌｏｗ部位Ｉ（ＳｓＩ）の内容物の解析を示す。図２Ｂ、左のパネルは、示されるＳｕｄｌｏｗ部位Ｉを有するアルブミンの全体的な構造を示す。図２Ｂ、右上のパネルは、精密化の前の、算出した差マップ（difference map）を有するＳｓＩのクローズアップ画像を示す。差マップは、この領域におけるさらなる分子の存在を示す。図２Ｂ、右下のパネルは、精密化の後のＳｓＩの同じ部位を示す。ＡＬＸＮ１８４０及び銅原子は、算出した２Ｆ_ｏｂｓ－Ｆ_ｃａｌｃマップによっておおわれており、ＳｓＩ内部にこれらの分子が存在することを示す。図２Ｃは、電子常磁性共鳴による測定が、アルブミン、銅、及びＡＬＸＮ１８４０からなる三部複合体における銅の部分的な還元を明らかにしたことを示す。しかしながら、銅の完全な還元は、過剰な亜二チオン酸ナトリウム（Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_４）によってのみ、達成された。 図３Ａ～３Ｄは、ＡＬＸＮ１８４０が、ＨｅｐＧ２、ＥＡ．ｈｙ９２６、Ｕ８７ＭＧ、及びＳＨＳＹ５Ｙ細胞を銅毒性から防いだことを示す。すべての調査した細胞株は、２５０μＭアルブミン及び２５０～２５００μＭの範囲の増加性の量の銅による処置によって、CellTiterGlo（登録商標）により評価した細胞生存率において、用量依存的な減少を示した。７５０μＭ ＤＰＡの存在下において、この細胞毒性の影響は、Ｃｕ－アルブミンのみと比較して、有意に増加しなかった。対照的に、７５０μＭ ＡＬＸＮ１８４０の存在は、主にＨｅｐＧ２、ＥＡ．ｈｙ９２６、及びＵ８７ＭＧ細胞を細胞死から保護した（Ｎ＝３～５、ｎ＝６～１０）。ダネットの多重比較検定ありの二元配置ＡＮＯＶＡを、統計解析のために使用した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。図３Ｅ～３Ｈは、低用量のＡＬＸＮ１８４０が、銅毒性から部分的に救ったことを示す。低用量のＡＬＸＮ１８４０（２５０μＭ）は、CellTiterGlo（登録商標）アッセイによって評価したＨｅｐＧ２及びＥＡ．ｈｙ９２６細胞においてＣｕ－アルブミン誘発性の細胞毒性から部分的に救った。対照的に、低用量のＤＰＡは、銅及びＢＳＡのみにより処置した細胞と比較して、細胞生存率に対する効果がないことを示した（Ｎ＝３～５、ｎ＝６～１０）。ダネットの多重比較検定ありの二元配置ＡＮＯＶＡを、統計解析のために使用した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 図４Ａ～４Ｂは、高親和性キレート剤が細胞の除銅によって細胞生存率を低下させたことを示す。図４Ａは、すべての調査した細胞株が、高親和性キレート剤ＡＬＸＮ１８４０の存在下において、CellTiterGlo（登録商標）によって評価される細胞生存率の用量依存的な低下を示したことを示し、これは、ＤＰＡの存在下において観察されない（Ｎ＝３、ｎ＝６）。図４Ｂは、複合体ＩＶ活性が、すべての細胞株において無毒性ＡＬＸＮ１８４０濃度（２００μＭ）ですでに低下していたのに対して、２００μＭ ＤＰＡは、複合体ＩＶ活性に対して影響を有していなかったことを示す（Ｎ＝３～４、ｎ＝６～１０）。 図５は、ＡＬＸＮ１８４０が、結果として、ＥＡ．ｈｙ９２６細胞及びＵ８７ＭＧ細胞において細胞銅含有量の減少につながったことを示す。図５、左のパネルは、７５０μＭ銅及び２５０μＭアルブミンとのインキュベーションが、結果として、すべて調査された細胞株において大量の金属の蓄積につながったことを示す。ＡＬＸＮ１８４０の存在下において、Ｕ８７ＭＧ細胞及びＥＡ．ｈｙ９２６細胞は、Ｃｕ－アルブミンのみと比較して、（有意に）低い銅含有量を示した。しかしながら、この効果は、ＨｅｐＧ２細胞及びＳＨＳＹ５Ｙ細胞にはなかった。対照的に、ＤＰＡの存在は、すべての細胞株において、銅取込みの量を変化させなかった（Ｎ＝４～１２）。ダネットの多重比較検定ありの一元配置ＡＮＯＶＡを、統計解析のために使用した。図５、右のパネルは、ＨｅｐＧ２、ＥＡ．ｈｙ９２６、Ｕ８７ＭＧ、及びＳＨＳＹ５Ｙのトリパンブルーにより評価した細胞生存率が、７５０μＭ銅及び２５０μＭアルブミンの存在下において有意に減少したことを示す。ＤＰＡではなく、７５０μＭ ＡＬＸＮ１８４０が、銅関連性の細胞毒性からすべての細胞株を保護した（Ｎ＝４～１２）。シダックの多重比較検定ありの一元配置ＡＮＯＶＡを、統計解析のために使用した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 図６Ａ～６Ｂは、高精度呼吸測定法にかけたＥＡ．ｈｙ９２６細胞及びＵ８７ＭＧ細胞の細胞パラメーターを示す。図６Ａは、トリパンブルーによって評価した細胞生存率（Ｎ＝５～１３）、細胞サイズ（Ｎ＝５～１３）、及び細胞タンパク質（Ｎ＝３、ｎ＝９）含有量は、ＥＡ．ｈｙ９２６細胞及びＵ８７ＭＧ細胞について、それぞれ、ＡＬＸＮ１８４０又はＤＰＡの非存在下又は存在下において、未処置及びＣｕ－アルブミン処置細胞において変化していなかったことを示す。対照的に、細胞銅含有量は、Ｃｕ－アルブミンのみにより処置した細胞と比較して、ＡＬＸＮ１８４０の存在下におけるＣｕ－アルブミン処置ＥＡ．ｈｙ９２６細胞及びＵ８７ＭＧ細胞において有意に低かった（Ｎ＝５～１３）。図６Ｂは、ミトコンドリア呼吸量が、Ｃｕ－アルブミンの存在下において、ＥＡ．ｈｙ９２６細胞及びＵ８７ＭＧ細胞において減少し、ＥＡ．ｈｙ９２６細胞においてＡＬＸＮ１８４０の存在下において有意に増加したことを示す（Ｎ＝４～７；ＥＴＳ、電子伝達系の能力）。ダネットの多重比較検定ありの二元配置ＡＮＯＶＡを、統計解析のために使用した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 図７Ａ～７Ｂは、銅誘発性のミトコンドリアの変化を、ＤＰＡではなく、ＡＬＸＮ１８４０によって保護することができることを示す。図７Ａは、ＥＡ．ｈｙ９２６細胞及びＵ８７ＭＧ細胞のミトコンドリアの構造が、Ｃｕ－アルブミンの存在下において変化したことを示す。ＡＬＸＮ１８４０の存在下において、これらの変化は、部分的に逆転したのに対して、ＤＰＡは、両方の細胞株においてミトコンドリアの構造に対するプラスの効果を有していなかった。スケールバーは、５００ｎｍに等しい。図７Ｂは、ルーチン対リーク呼吸（Ｒ／Ｌ）又はＥＴＳ対リーク呼吸（Ｅ／Ｌ）として定義される呼吸調節比（ＲＣＲ）を示す。ＥＡ．ｈｙ９２６において、Ｅ／Ｌ比は、Ｃｕ－アルブミン処置細胞と比較して、ＡＬＸＮ１８４０処置細胞において有意に増加した。この効果は、Ｕ８７ＭＧ細胞において、それほどはっきりしていなかった（Ｎ＝４～７）。ダネットの多重比較検定ありの二元配置ＡＮＯＶＡを、統計解析のために使用した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 図８Ａ～８Ｃは、無毒性の銅濃度が、結果として、ＰＢＣＥＣ単層のＴＥＥＲ値の低下につながったことを示す。図８Ａは、増加性のＣｕ－アルブミン（１：３の銅：アルブミン比）の存在下におけるブタ脳大脳内皮細胞（ＰＢＣＥＣ）単層の経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）及び電気容量の変化の例証的な曲線を示す。ＴＥＥＲは、用量依存的に減少したのに対して、電気容量における増加は、最も高いＣｕ－アルブミン濃度でのみ検出可能であった。図８Ｂは、ＰＢＣＥＣのニュートラルレッドアッセイが、４８時間後、２５０μＭ銅（及び８３．３μＭアルブミン）未満で毒性がないことを示す。しかしながら、７５０μＭ銅（及び２５０μＭアルブミン）は、結果として、細胞生存率の劇的な低下につながり、これは、７５０μＭ ＡＬＸＮ１８４０の存在によって救うことができた（Ｎ＝３、ｎ＝１２）。図８Ｃは、ＰＢＣＥＣ単層の電気容量値が、ＡＬＸＮ１８４０又はＤＰＡの非存在下又は存在下において、Ｃｕ－アルブミン処置による影響を受けなかったことを示す（Ｎ＝２、ｎ＝４）。 図９Ａ～９Ｂは、銅誘発性血液脳関門損傷を、ＤＰＡではなく、ＡＬＸＮ１８４０によって救うことができることを示す。図９Ａは、Ｃｕ－アルブミン（２５０μＭ銅及び８３．３μＭアルブミン）が、結果として、初代ブタ脳毛細血管内皮細胞（ＰＢＣＥＣ）単層の経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）の低下につながったことを示す。これは、それぞれ、２５０μＭ ＡＬＸＮ１８４０によって救うことができたのに対して、ＤＰＡの存在が、結果として、ＴＥＥＲの低下につながることがあり、これは、Ｃｕ－アルブミン処置のみと同等であった（Ｎ＝２、ｎ＝４）。図９Ｂは、側底コンパートメント（脳実質に似ている）における銅の定量により、４８時間後、高親和性キレート剤ＡＬＸＮ１８４０の存在下において、このコンパートメントにおける銅の量が有意に低いことが示されたことを示す（Ｎ＝２、ｎ＝４）。ダネットの多重比較検定ありの二元配置ＡＮＯＶＡを、統計解析のために使用した。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 図１０は、Ｃｕ－アルブミンが、結果として、ＰＢＣＥＣ単層における密着結合の破壊につながったことを示す。密着結合タンパク質クローディン－５に対する免疫細胞化学染色は、コントロール細胞において、細胞周縁部の切れ目のない染色を示した。このパターンは、Ｃｕ－アルブミン（２５０μＭ銅及び８３．３μＭアルブミン）により処置した初代ブタ脳毛細血管内皮細胞（ＰＢＣＥＣ）において破壊された。２５０μＭ ＡＬＸＮ１８４０の存在下において、これらの形態学的変化は、それほどはっきりしていなかったのに対して、ＤＰＡの存在は、銅誘発性の間隙の形成を防がなかった。密着結合関連タンパク質Zonula occludens-1（ＺＯ－１）に対する染色は、コントロールとＣｕ－アルブミン処置細胞との間の差がそれほど鮮明ではないことを明らかにし、Ｃｕ－アルブミン処置細胞は、ＺＯ－１の不規則な細胞質分布によって特徴づけられた。これは、ＡＬＸＮ１８４０によって防がれたが、ＤＰＡ処置ＰＢＣＥＣ単層においてなお存在した。スケールバーは、１０μｍに等しい。銅処置ＰＢＣＥＣの電子顕微鏡写真は、ＤＰＡではなく、ＡＬＸＮ１８４０によって防ぐことができる細胞間の境界での高電子密度タンパク質複合体の損失によって示されるように、密着結合完全性に対する金属の影響を明らかにした。スケールバーは、２５０ｎｍに等しい。

詳細な説明
開示されるプロセス及び材料について記載する前に、本明細書において記載される態様は、特定の実施形態に限定されず、よって、当然、変えることができることが理解されるべきである。本明細書において使用される専門用語は、特定の態様を説明するためだけのものであり、本明細書において特に定義されない限り、限定することを意図するものではないこともまた、理解されるべきである。

本開示を考慮し、本明細書において記載される方法及び組成物は、所望の必要性を満たすように当業者によって構成することができる。全般的に、開示される方法は、銅代謝関連疾患又は障害において観察される銅誘発性神経損傷の処置における改善を提供する。

このように、本開示の一態様は、それを必要とする対象において銅誘発性神経損傷を低下させるための方法を提供する。

ある実施形態において、銅誘発性神経損傷を低下させることは、１つ以上の神経学的症状又は精神症状を改善する、低下させる、又は排除する。例えば、改善されてもよい、低下させてもよい、又は排除されてもよい神経学的症状は、振戦、構音障害、異緊張症、及び歩行障害を含むが、これらに限定されない。改善されてもよい、低下させてもよい、又は排除されてもよい精神症状は、うつ、社会不安障害、パニック障害、外傷後ストレス障害、前頭葉実行機能能力及び／又は視空間処理の欠損、並びに記憶喪失を含むが、これらに限定されない。

銅誘発性神経損傷の低下は、投与後０日目～２４週目の範囲にわたる時間間隔の範囲内で生じてもよい。例えば、１つ以上の神経学的症状又は精神症状の改善、低下、又は排除は、投与後０日目～２４週目の範囲にわたる時間間隔の範囲内で生じてもよい。ある実施形態において、銅誘発性神経損傷の低下の最も高いレベルは、投与後０日目～７週目の範囲にわたる時間間隔の範囲内であってもよい。

銅誘発性神経損傷は、以下の１つ以上として示されてもよい：銅誘発性細胞毒性、銅誘発性血液脳関門損傷、及び銅誘発性ミトコンドリア損傷。このように、ある実施形態において、銅誘発性神経損傷を低下させることは、銅誘発性細胞毒性、銅誘発性血液脳関門損傷、及び／又は銅誘発性ミトコンドリア損傷を低下させることによるものである。

本開示の方法のある実施形態は、銅誘発性細胞毒性を低下させることを含む。例えば、銅誘発性細胞毒性は、肝細胞、内皮細胞、ニューロン、及び星状細胞の少なくとも１つにおいて低下させてもよい。銅誘発性細胞毒性は、ビスコリンテトラチオモリブデートの投与を伴わない銅誘発性細胞毒性に比べて、少なくとも１０％、例えば、少なくとも１５％又は少なくとも２０％又は少なくとも２５％又は少なくとも３０％又は少なくとも３５％又は少なくとも４０％又は少なくとも４５％又は少なくとも５０％又はさらに少なくとも１００％、低下させてもよい。

ある実施形態において、銅誘発性細胞毒性を低下させることは、ビスコリンテトラチオモリブデートの投与を伴わない細胞生存率と比較して、細胞生存率を改善する。例えば、細胞生存率は、少なくとも１０％、例えば、少なくとも１５％又は少なくとも２０％又は少なくとも２５％又は少なくとも３０％又は少なくとも３５％又は少なくとも４０％又は少なくとも４５％又は少なくとも５０％又はさらに少なくとも１００％、改善されてもよい。

本開示の方法のある実施形態において、銅誘発性血液脳関門損傷を低下させることを含む。銅誘発性血液脳関門損傷は、ビスコリンテトラチオモリブデートの投与を伴わない銅誘発性血液脳関門損傷に比べて、少なくとも１０％、例えば、少なくとも１５％又は少なくとも２０％又は少なくとも２５％又は少なくとも３０％又は少なくとも３５％又は少なくとも４０％又は少なくとも４５％又は少なくとも５０％又はさらに少なくとも１００％、低下させてもよい。

ある実施形態において、銅誘発性血液脳関門損傷は、以下の１つ以上によって低下させてもよい：（ａ）経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を維持すること、（ｂ）電気容量を維持すること、及び（ｃ）銅誘発性形態学的変化を低下させること。例えば、ある実施形態において、ＴＥＥＲは、健康な対象と同じレベルに維持される。同様に、ある実施形態において、電気容量は、健康な対象と同じレベルに維持される。ある実施形態において、例えば、銅誘発性形態学的変化は、以下の通りである：ミトコンドリアクリステの損失若しくは構造上の方向性の欠落並びに／又は膜状の封入体（membranous inclusion）並びに／又は脳毛細血管内皮細胞の細胞境界でのクローディン－５の継続的で絶え間ない存在及び／若しくはZonula Occludens-1の存在。

本開示の方法のある実施形態は、銅誘発性神経損傷を低下させることが、銅誘発性ミトコンドリア損傷を低下させることによるものであることを含む。例えば、ある実施形態において、銅誘発性ミトコンドリア損傷の低下は、すべて未処置の対象と比較した、以下の１つ以上を含む：（ａ）銅誘発性膜封入体（membrane inclusion）の存在を低下させること、（ｂ）クリステの組織化を増加させること又は維持すること、（ｃ）高電子密度マトリックスを増加させること又は維持すること、及び（ｄ）ミトコンドリア呼吸量を増加させること又は維持すること。

本明細書において記載される本開示の方法のある実施形態において、銅誘発性神経損傷は、ウィルソン病と関連する。例えば、ある実施形態において、対象は、ウィルソン病に罹患している。

本開示の銅誘発性神経損傷は、別の銅代謝関連疾患又は障害に起因してもよい。このように、ある実施形態において、銅代謝関連疾患又は障害は、銅毒性である（例えば、硫酸銅殺菌剤への高度な曝露、銅が高度な飲料水を取り入れること、銅サプリメントの取り過ぎ等に由来する）。ある実施形態において、銅代謝関連疾患又は障害は、銅欠乏症、メンケス病、又は無セルロプラスミン血症である。ある実施形態において、銅代謝関連疾患又は障害は、学業不振、ざ瘡、注意欠陥多動性障害、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アテローム性動脈硬化症、自閉症、アルツハイマー病、カンジダの異常増殖、慢性疲労、肝硬変、うつ、アドレナリン活性上昇、銅タンパク質（cuproprotein）上昇、ノルエピネフリン活性上昇、情動性の崩壊、線維筋痛、頻繁に怒る、老人関連性銅排出不良、不安が大きい、脱毛、肝疾患、多動、甲状腺機能低下症、エストロゲンに対する不耐性、経口避妊薬に対する不耐性、カイザー－フライシャー輪、学習障害、低ドーパミン活性、多発性硬化症、神経学的な問題、酸化ストレス、パーキンソン病、集中力低下、集注力の低下、免疫機能低下、耳鳴り、アレルギー、食用色素に対する過敏性、甲殻類に対する過敏性、皮膚金属不耐性、皮膚過敏性、睡眠の問題、及び指の爪の白斑から選択される少なくとも１つである。

上記に提供される通りに、ビスコリンテトラチオモリブデート（ＡＬＸＮ１８４０、ＢＣ－ＴＴＭ、チオモリブデン酸コリン、チオモリブデン酸（tiomolibdic acid）としても知られており、以前はＷＴＸ１０１として知られていた）は、本開示の方法において投与される。ビスコリンテトラチオモリブデートは、以下の構造を有する：

ＡＬＸＮ１８４０は、ＷＤの処置のために開発中である、ファースト・イン・クラスのＣｕタンパク質結合剤であり、国際公開第２０１９／１１０６１９号（全体が本明細書において参照によって援用される）において詳細に記載された。先の研究は、ＡＬＸＮ１８４０が、Ｃｕ－テトラチオモリブデート－アルブミン三部複合体（ＴＰＣ）の速やかで不可逆的な形成により、Ｃｕのコントロールを改善することを示唆した。ＡＬＸＮ１８４０単独療法は、ＷＤを有する２８人の患者において判定され、ＡＬＸＮ１８４０が、ベースラインと比較して、平均血清非セルロプラスミン結合Ｃｕ（ＮＣＣ）を２４週目に７２％低下させることが示された。ＡＬＸＮ１８４０による処置は、概して、忍容性良好であり、最も報告された有害事象（ＡＥ）は、軽度（グレード１）～中等度（グレード２）であった。最も頻繁に報告された薬剤関連性のＡＥは、血液学的パラメーターにおける変化、疲労、硫黄臭のするおくび（sulphur eructation）、及び他の胃腸症状であった。可逆的な肝機能検査の上昇が、患者の３９％において観察された；これらの上昇は、軽度～中等度で、無症状であり、ビリルビンにおける目立った増加を伴わず、用量低下又は処置中断により、常態に戻った。奇異な神経症状の悪化は、ＡＬＸＮ１８４０による処置開始の際に観察されなかった。

ある実施形態において、銅誘発性神経損傷の低下は、ＡＬＸＮ１８４０による安定したＣｕ－テトラチオモリブデートアルブミン三部複合体（ＴＰＣ）の形成によるものである。ある実施形態において、ＴＰＣは、輸送及び／又は排除のために、対象における体循環において役に立つ。

ＡＬＸＮ１８４０の治療有効量は、以前に確立された。例えば、ある実施形態において、ＡＬＸＮ１８４０は、１日当たり約１５～６０ｍｇの範囲で投与されてもよい。ある実施形態において、ＡＬＸＮ１８４０は、毎日約１５ｍｇの量で投与される。ある実施形態において、ＡＬＸＮ１８４０は、毎日約３０ｍｇの量で投与される（例えば、１日２回約１５ｍｇを服用又は毎日１回１５ｍｇ錠剤を２錠服用）。ある実施形態において、ＡＬＸＮ１８４０は、毎日約４５ｍｇの量で投与される（例えば、１日２回約１５ｍｇを服用又は毎日１回１５ｍｇ錠剤を３錠服用）。ある実施形態において、ＡＬＸＮ１８４０は、毎日約６０ｍｇの量で投与される（例えば、毎日４回約１５ｍｇを服用又は毎日１回１５ｍｇ錠剤を４錠服用）。

ある他の実施形態において、ＡＬＸＮ１８４０は、隔日で約１５～６０ｍｇの範囲で投与されてもよい。ある実施形態において、ＡＬＸＮ１８４０は、隔日で約６０ｍｇの量で投与されるある実施形態において、ＡＬＸＮ１８４０は、隔日で約１５ｍｇの量で投与される。ある実施形態において、ＡＬＸＮ１８４０は、隔日で約３０ｍｇの量で投与される。ある実施形態において、ＡＬＸＮ１８４０は、隔日で約４５ｍｇの量で投与される。ある実施形態において、ＡＬＸＮ１８４０は、隔日で約６０ｍｇの量で投与される。

本開示のある実施形態において、処置の間にＡＬＸＮ１８４０の治療有効量を増加させることは、さらなる利益を提供してもよい。このように、ある実施形態において、ＡＬＸＮ１８４０の治療有効量は、処置の６週間後に（すなわち４２日後に）増加させる。例えば、ある実施形態において、ＡＬＸＮ１８４０の初期の治療有効量（すなわち１～４２日目）は、毎日約１５ｍｇである。ＡＬＸＮ１８４０の増加させた、続く治療有効量（すなわち、４３日目などのように、４２日目の後）は、ある実施形態において、毎日約３０ｍｇである。ある実施形態において、ＡＬＸＮ１８４０の増加させた、続く治療有効量は、毎日約４５ｍｇである。ある実施形態において、ＡＬＸＮ１８４０の増加させた、続く治療有効量は、毎日約６０ｍｇである。例えば、ある他実施形態において、ＡＬＸＮ１８４０の初期の治療有効量は、毎日約３０ｍｇである。ＡＬＸＮ１８４０の増加させた、続く治療有効量は、ある実施形態において、毎日約４５ｍｇである。ある実施形態において、ＡＬＸＮ１８４０の増加させた、続く治療有効量は、毎日約６０ｍｇである。

本開示のある実施形態において、処置の間にＡＬＸＮ１８４０の治療有効量を減少させることは、さらなる利益を提供してもよい。このように、ある実施形態において、ＡＬＸＮ１８４０の治療有効量は、処置の６週間後に（すなわち４２日後に）減少させる。例えば、ある実施形態において、ＡＬＸＮ１８４０の初期の治療有効量（すなわち１～４２日目）は、毎日約６０ｍｇである。ＡＬＸＮ１８４０の減少させた、続く治療有効量（すなわち、４３日目などのように、４２日目の後）は、ある実施形態において、毎日約４５ｍｇである。ある実施形態において、ＡＬＸＮ１８４０の減少させた、続く治療有効量は、毎日約３０ｍｇである。ある実施形態において、ＡＬＸＮ１８４０の減少させた、続く治療有効量は、毎日約１５ｍｇである。例えば、ある他実施形態において、ＡＬＸＮ１８４０の初期の治療有効量は、毎日約３０ｍｇである。ＡＬＸＮ１８４０の減少させた、続く治療有効量は、ある実施形態において、毎日約１５ｍｇである。

本開示の方法は、一次治療として有用である。このように、本開示の方法のある実施形態において、対象は、ウィルソン病のための処置を以前に受けていない（すなわち、処置未経験の対象）。

本開示の方法はまた、ＷＤの二次治療及び／又は一次維持療法として有用である。このように、本開示の方法のある実施形態において、対象は、ＷＤのための標準治療（ＳｏＣ）による処置を以前に受けたことがある。例えば、ある実施形態において、対象は、トリエンチンを以前に受けたことがある（トリエチレンテトラアミン；Ｎ’－［２－（２－アミノエチルアミノ）エチル］エタン－１，２－ジアミンとしても知られている）。トリエンチンは、CUPRIOR（登録商標）（GMP-Orphan United Kingdom Ltd）、SYPRINE（登録商標）（Aton Pharma,Inc.）、又はCufence（Univar,Inc．）という名称で販売されていてもよい。ある実施形態において、対象は、Ｄ－ペニシラミンを以前に受けたことがある（ペニシラミン；（２Ｓ）－２－アミノ－３－メチル－３－スルファニルブタン酸としても知られている）。Ｄ－ペニシラミンは、CUPRIMINE（登録商標）（Valeant Pharmaceuticals）又はDEPEN（登録商標）（Meda Pharmaceuticals）という名称で販売されていてもよい。ある実施形態において、対象は、亜鉛を以前に受けたことがある。ある実施形態において、対象は、トリエンチン、Ｄ－ペニシラミン、及び／又は亜鉛を以前に受けたことがある。ある他の実施形態において、対象は、トリエンチン及び／又はＤ－ペニシラミンを以前に受けたことがある。

本開示の方法のある実施形態において、対象は、２４週間以下の間、ＷＤのための標準治療による処置を受けたことがある。ある実施形態において、標準治療による処置は、１２週間以下又は６週間以下又は４週間以下であった。標準治療による処置は、継続的である必要はない。例えば、対象は、合計して２４週間以下（例えば１２週間以下又は６週間以下又は４週間以下）の処置になる断続的な処置を受けてもよい。しかしながら、ある実施形態において、標準治療による処置は、継続的である。

本開示の方法のある実施形態において、対象は、４週間以下の間、ＷＤのための標準治療による処置を受けたことがある。

本開示の方法のある実施形態において、対象は、少なくとも４週間の間、ＷＤのための標準治療による処置を受けたことがある。ある実施形態において、標準治療による処置は、少なくとも６週間又は少なくとも１２週間又は少なくとも２４週間又は少なくとも３６週間又は少なくとも４８週間又は少なくとも５２週間の長さであった。標準治療による処置は、継続的である必要はない。例えば、対象は、合計して少なくとも４週間（例えば少なくとも６又は少なくとも１２又は少なくとも２４又は少なくとも３６又は少なくとも４８又は少なくとも５０又は少なくとも５２週間又は少なくとも１０３週間）の処置になる断続的な処置を受けてもよい。しかしながら、ある実施形態において、標準治療による処置は、継続的である。

本開示の方法のある実施形態において、対象は、処置を以前に受けていない又は対象は、ウィルソン病のためなどの、銅代謝関連疾患若しくは障害のための４週間以下の標準治療による処置を以前に受けた。

本明細書において記載される本開示の方法において、対象は、ビスコリンテトラチオモリブデートを投与する少なくとも２週間前に、標準治療による処置を終了した。ある実施形態において、対象は、ビスコリンテトラチオモリブデートを投与する少なくとも３週間、少なくとも４週間、又は少なくとも６週間前に、標準治療による処置を終了した。

本明細書において使用されるように、用語「個人」、「患者」、又は「対象」は、区別なく使用され、哺乳動物を含む任意の動物、少なくとも１つの実施形態においてヒトを指す。ある実施形態において、対象は、健康な対象である。ある実施形態において、対象は、ＷＤに罹患している。本明細書において記載される本開示の方法のある実施形態において、対象は、肝硬変を有する。ある他の実施形態において、対象は、肝硬変を有していない。

ある実施形態において、「約」を前に使用することによって、値が近似値として表される場合、特定の値が、１つの可能な実施形態を形成し、与えられた値を変動させることが可能であることが理解されるであろう（例えば、約８０は、８０±１０％を含んでいてもよい）。それぞれの範囲の端点は、他方の終点と関連して及び他方の終点とは無関係に両方で有効であることがさらに理解されるであろう。

本明細書において使用されるように、「総銅」は、血中の（例えば血清又は血漿中の）すべての銅種の合計を指す。総銅は、セルロプラスミン（Ｃｐ）結合銅及びすべての種の非セルロプラスミン結合銅の両方を含む。全般的に、総銅は、誘導結合プラズマ－マススペクトロメトリー（ＩＣＰ－ＭＳ）などのように、質量分析によって高い感度及び特異性で、直接測定されてもよい。

用語「ＮＣＣ」は、セルロプラスミンに結合しておらず（すなわち「非セルロプラスミン結合銅」）、血液（例えば血清又は血漿など）中の総銅及びＣｐの直接的な測定並びに以下の式を使用して推定される総銅のうちの画分を指す。

計算は、６つの銅原子が、常に単一のＣｐ分子に結合している並びにＮＣＣ及びセルロプラスミンの濃度が、直接相関しているという仮定を前提とする。現実には、Ｃｐは、Ｃｐ１分子当たりに結合する銅原子の数においてかなりの不均一性を示すかもしれない。この式は、６つの銅原子が、Ｃｐ１分子当たりに結合することを仮定するが、銅／Ｃｐ比は、疾患の状態により変動する。実際に、６～８個の銅原子が、実際のところＣｐと結合することができ、ＷＤでは、普通、６つよりも少ない銅原子が、Ｃｐ１分子当たりに結合する。

非セルロプラスミン結合銅は、アルブミン、トランスキュプレイン（transcuprein）、及び他のそれほど豊富ではない血漿タンパク質に結合した又はテトラチオモリブデート－Ｃｕ－アルブミン三部複合体（ＴＰＣ）における、総銅のうちの画分を含む。ＴＰＣの濃度は、直接測定することができないが、ある実施形態において、ＴＰＣの濃度は、代わりにモリブデン濃度を使用して推定されてもよい。

本開示の方法は、以下の実施例によってさらに例示され、これらの実施例は、本開示を、範囲又は精神において、実施例において記載される特定の手順及び化合物に限定するものとして解釈されるべきではない。

材料及び方法
ＭｉｃｒｏＰＥＴ／ＭＲＩ
野生型ラットは、解剖学的磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）１Ｔ及びダイナミック陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）（Mediso Medical Imaging Systems、Budapest、Hungary）を受けた。イソフルランによる麻酔を始め、ラットをアクリルガラスチャンバー中に置き、スキャンの間、マスクで呼吸を維持した。１回分の^６４Ｃｕ（≒１０ＭＢｑ／動物）を、尾静脈カテーテルを介して又は腹腔内に注射した。ＰＥＴスキャニングを、注射後最初の１２０分に実行し、その後、２５分のＴ１強調ＭＲＩスキャンを続けた。

ＰＥＴ画像は、三次元ordered subset expectationアルゴリズム（Tera-Tomo 3D；Mediso Medical Imaging Systems、Budapest、Hungary）により、繰り返し（iteration）４及びサブセット６並びに０．６×０．６×０．６ｍｍ^３のvoxelサイズで再構成した。データは、遅延同時計数窓（delayed coincidence window）を使用して、不感時間、減衰、及び偶発同時計数（random）について補正し、減弱及び散乱については補正しなかった。１２０分のダイナミックＰＥＴスキャンを、１５分の８フレームとして再構成した。

コントロールＡｔｐ７ｂ^＋／－及びＷＤ Ａｔｐ７ｂ^－／－ラットに、通常の固形飼料（１３１４；１３．８９ｍｇ Ｃｕ／ｋｇ；Altromin Spezialfutter GmbH、Seelenkamp、Germany）及び水道水を適宜与えた。ラットはすべて、処置スタート時に健康で、急性肝障害のサインを示さなかった（血清ＡＳＴ＜２００Ｕ／Ｌ及び血清ビリルビン＜０．５ｍｇ／ｄｌ）。Ａｔｐ７ｂ^－／－ラット（年齢：７９～９６日）を、毎日１回２．５ｍｇ／ｋｇ体重（ｂｗ）ビス－コリンＴＴＭ（ＡＬＸＮ１８４０）又は毎日１回１００ｍｇ／ｋｇ ｂｗ Ｄ－ペニシラミン（ＤＰＡ）により、４日間連続で腹腔内処置した。未処置Ａｔｐ７ｂ^＋／－及びＡｔｐ７ｂ^－／－ラットは、コントロールとして果たした。尿及び糞便を、２４時間間隔で収集し、このために、ラットを、４日間、代謝ケージ中に個々に収容した。通常のケージにおいてグループで収容した、処置を止めた２日間の静止期の後、ラットを、血清収集のために屠殺した。尿、血清、及び糞便中の銅レベルを、誘導結合プラズマ発光分析（ICP-OES、ARCOS、SPECTRO Analytical Instruments、Kleve、Germany）によって、以前に記載される通りに（Zischka,H.,et al.,J Clin Invest,2011.121(4):p.1508-18）、分析した。

ゲルろ過クロマトグラフィー
１０ｍｇの脂肪酸不含ウシ血清アルブミン（以降アルブミンと称される、Carl Roth、Karlsruhe、Germany）を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．４）中に再懸濁し、４５μＬの１０ｍＭ塩化銅と混合した。記載がある場合は、４５μＬの１０ｍＭ ＡＬＸＮ１８４０又はＤＰＡを、Superdex 75 10/300 GLカラム（GE Healthcare、Chicago、USA）にサンプルをロードする前に、Ｃｕ－アルブミン複合体に追加した。１ｍＬ画分を、Bradfordアッセイによって、タンパク質含有量を（Bradford,M.M.,Anal Biochem,1976.72:p.248-54）、ICP-OESによってモリブデン及び銅レベルを（Zischka,H.,et al.,J Clin Invest,2011.121(4):p.1508-18）、並びに１，２－ナフトキノン－４－スルホナート（ＮＱＳ）を使用してＤＰＡ含有量を、少し変更したが、以前に記載される通りに（Elbashir,A.,PharmacoVigilance Review,Vol.01:2.2013）、分析した。手短に言えば、５０μＬの各画分を、透明な９６－ウェルプレートにおいて、１０μＬ ０．２％ＮＱＳ、１０μＬの０．２Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ１２．０）、及び３０μＬ ｄｄＨ_２Ｏと混合した。サンプルを２０分間インキュベートし、吸光度を４５２ｎｍで測定した。ＤＰＡの絶対的レベルを、等しく処置したＤＰＡ標準溶液（２５μＭ～２５０μＭ）を使用して算出した。

三部複合体アルブミン－銅－ＡＬＸＮ１８４０（ＴＰＣ）のＸ線結晶解析
１００ｍｇアルブミンを、５０ｍＭリン酸カリウム及び１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ７．５）を含有するバッファー中に懸濁した。塩化銅及びＡＬＸＮ１８４０を、２倍のモル過剰で追加し、混合物を、３７℃で３０分間インキュベートした。Ｃｕ－アルブミン－ＡＬＸＮ１８４０混合物を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）により平衡にしたＳ２００ゲルろ過カラムにロードした。モノマーの状態のＣｕ－アルブミン－ＡＬＸＮ１８４０（ＴＰＣ）タンパク質に相当する画分をプールし、タンパク質を、１００ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。結晶化条件のスクリーニングは、０．２μＬのタンパク質複合体溶液及び０．２μＬの緩衝液を混合することによって、シッティングドロップ蒸気拡散法で、市販されているバッファーセットを使用して実行した。結晶は、０．１Ｍ ＳＰＧバッファー（ｐＨ７．０）及び０．２５％ ＰＥＧ１５００を含有する溶液から室温で得られた。結晶は、母液中３０％グリセロールにおいて凍結保護し、液体窒素において瞬間冷却した。回折データは、ＥＳＲＦ（Grenoble、France）でＩＤ２３－２ビームラインで収集した。データは、ＸＤを使用して指数付けして、積分し（Krug,M.,et al.,Journal of Applied Crystallography,2012.45(3):p.568-572;Kabsch,W.,Acta Crystallogr D Biol Crystallogr,2010.66(Pt 2):p.125-32）、Ｓｃａｌａを使用してスケーリングして、マージした（Evans,P.Acta Crystallogr D Biol Crystallogr,2006.62(Pt 1):p.72-82）。初期位相は、Phaser（McCoy,A.J.,Methods Mol Biol,2017.1607:p.421-453）並びに検索モデルとしてアルブミン構造（PDB 4F5S及び（Bujacz,A.,Acta Crystallogr D Biol Crystallogr,2012.68(Pt 10):p.1278-89）を使用して算出される分子置換によって得た。初期モデルは、Cootを使用して、結果として生じる電子密度マップにより手動で再構築した（Emsley,P.,et al.,Acta Crystallogr D Biol Crystallogr,2010.66(Pt 4):p.486-501）。低解像度のデータのために、精密化した構造は、０．４０未満のＲ_ｆｒｅｅ値に達しなかった。それにもかかわらず、ＡＬＸＮ１８４０の存在に関する最終的なモデルは、強い検出可能なシグナルをもたらすモリブデン錯体の大きな散乱因子により、分析することが可能であった。

電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）
ＥＰＲ測定のために、Ｃｕ－アルブミン（２ｍＭ／１ｍＭ）、Ｃｕ－アルブミン－ＡＬＸＮ１８４０（ＴＰＣ、２ｍＭ／１ｍＭ／１ｍＭ）、及びアルブミン－ＡＬＸＮ１８４０（１ｍＭ／１ｍＭ）の複合体を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）バッファーにおいて調製し、記載がある場合は、測定の直前に、過剰量の亜二チオン酸ナトリウムにより還元した（Merck、Darmstadt、Germany）。ＥＰＲスペクトルは、約９．５ＧＨｚのＸバンドで作動するＥＣＳ１０６スペクトロメーター（Brucker BioSpin、Karlsruhe、Germany）を使用して、７７Ｋで記録した。

細胞培養
ＳＨＳＹ５Ｙ（ヒト神経芽細胞腫）細胞、Ｕ８７ＭＧ（ヒト星状細胞腫）細胞、ＥＡ．ｈｙ９２６（ヒト内皮）細胞、及びＨｅｐＧ２（ヒト肝細胞癌）細胞は、ＡＴＣＣ（Wesel、Germany）から購入し、１０％ＦＣＳ（Biochrom、Berlin、Germany）及び１％抗生物質－抗真菌剤（Life Technologies、Carlsbad、USA）を補足したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）において培養した。細胞はすべて、５％ＣＯ_２を有する湿潤雰囲気において３７℃に維持した。

細胞毒性アッセイ
２×１０^４細胞を、９６－ウェルプレートの各ウェルに播種し、一晩インキュベートした。翌日、細胞を、増加性の銅濃度（０～２５００μＭ）及び２５０μＭアルブミン（１：１、２：１、３：１、４：１、及び１０：１のＣｕ－アルブミンモル比をもたらす）により、ＤＭＥＭ（２％ＦＣＳ）中７５０μＭ ＡＬＸＮ１８４０又はＤＰＡの非存在下又は存在下において、２４時間処置した。細胞毒性は、CellTiter-Glo（登録商標）アッセイ（Promega、Madison、USA）又はトリパンブルー色素排除法によって決定した。

細胞銅含有量
２×１０^６細胞を、７５０μＭ銅及び２５０μＭアルブミンと共に（すなわち、３：１のＣｕ－アルブミンモル比で）、ＤＭＥＭ（２％ＦＣＳ）中それぞれ７５０μＭ ＡＬＸＮ１８４０又はＤＰＡの非存在下又は存在下において、２４時間インキュベートした。その後、細胞を、トリプシン処理し、カウントした。細胞生存率を、トリパンブルー色素排除法によって決定した。細胞の銅及びモリブデン含有量を、ICP-OES（Ciros Vision、SPECTRO Analytical Instruments、Kleve、Germany）によって、以前に記載される通りに（Zischka,H.,et al.,J Clin Invest,2011.121(4):p.1508-18）、分析した。

電子顕微鏡法
細胞の電子顕微鏡法は、以前に記載される通りに（Einer,C.,et al.,Cell Mol Gastroenterol Hepatol,2018.7(3):p.571-596）、１２００ＥＸ電子顕微鏡（JEOL、Akishima、Japan）により、６０ｋｖで行った。画像は、KeenView IIデジタルカメラ（Olympus、Hamburg、Germany）により撮影し、iTEMソフトウェアパッケージ（analySIS FIVE、Olympus、Hamburg、Germany）によって処理した。

ミトコンドリア機能
Ｕ８７ＭＧ細胞及びＥＡ．ｈｙ９２６細胞は、ＤＭＥＭ（２％ＦＣＳ）のみにより又は７５０μＭ塩化銅及び２５０μＭアルブミンを含有するＤＭＥＭ（２％ＦＣＳ）により、７５０μＭ ＡＬＸＮ１８４０又はＤＰＡの非存在下又は存在下において、２４時間、前処置した。酸素消費量は、高精度呼吸測定（ＨＲＲ）によって、Oxygraph-2k及びDatLab 7.0（Oroboros Instruments GmbH、Innsbruck、Austria）を使用して、以前に記載される通りに（Pesta,D.and E.Gnaiger,Methods Mol Biol,2012.810:p.25-58）、評価した。チャンバーごとに、１．５～２×１０^６生細胞を、２ｍＬのMiR05バッファー（０．５ｍＭ ＥＧＴＡ、３ｍＭ ＭｇＣｌ_２、６０ｍＭラクトビオン酸、２０ｍＭタウリン、１０ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１１０ｍＭスクロース、１ｇ／Ｌアルブミン、ｐＨ７．１）において供給し、ルーチン呼吸を、測定した。２．５μＭオリゴマイシン（Ｆ_ＯＦ_１－ＡＴＰアーゼの阻害剤）の追加は、リーク呼吸の測定を可能にし、ＣＣＣＰの少しずつの追加（１ｍＭ原液から１μＬずつ）は、最大酸素流量、それによって電子伝達系（ＥＴ）の能力の定量を可能にした。酸素流量は、２．５μＭの複合体ＩＩＩ－阻害剤アンチマイシンＡの追加によって、非ミトコンドリア酸素消費プロセス（ＲＯＸ）に対してベースライン補正した。

複合体ＩＶ活性測定のために、細胞を、ＤＭＥＭ（２％ＦＣＳ）のみにより又は７５０μＭ塩化銅及び２５０μＭアルブミンを含有するＤＭＥＭ（２％ＦＣＳ）により、７５０μＭ ＡＬＸＮ１８４０又はＤＰＡの非存在下又は存在下において、２４時間、前処置した。複合体ＩＶ活性を、以前に記載される通りに測定した（Spinazzi,M.,et al.,Nat Protoc,2012.7(6):p.1235-46）。手短に言えば、約２．５×１０^６細胞を、剥離し、遠心分離によってＰＢＳにより２回洗浄し、細胞ペレットを、２００μＬの２０ｍＭ低張カリウムバッファー中に再懸濁した。３回の凍結融解サイクルの後に、複合体ＩＶ活性は、１０μＬのサンプルを、０．３ｍＭ ＫＣＮを有する又は有していない５０μＭ還元型シトクロムｃを含有する９０μＬの５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に追加することによって、測定した。吸光度は、プレートリーダーにおいて１０分間５５０ｎｍで測定し（Synergy 2、BioTek Instruments, Inc.、Bad Friedrichshall、Germany）、複合体ＩＶ活性は、非特異的活性（ＫＣＮの存在下における）について補正した初速度の直線の傾きから算出し、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイによって決定されるタンパク質含有量に対して標準化した。

内皮血液脳関門モデル
経上皮抵抗（ＴＥＥＲ）実験のために（Srinivasan,B.,et al.,J Lab Autom,2015.20(2):p.107-26）、凍結保存した初代ブタ脳毛細血管内皮細胞（ＰＢＣＥＣ）を、解凍し、ニュートラルレッドアッセイを使用する細胞毒性試験のために、ラット尾コラーゲンコーティング９６－ウェルプレート（Repetto,G.,A.del Peso,and J.L.Zurita,Nat Protoc,2008.3(7):p.1125-31）又は関門の完全性についての研究のためにTranswell（登録商標）インサート（面積：１．１２ｃｍ^２、孔径：０．４μｍ；Corning、New York、USA）に接種した。細胞は、１０％ＦＣＳ、５０Ｕペニシリン／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１００μｇ／ｍＬゲンタマイシン、及び０．７ｍＭ ｌ－グルタミンを補足したＥａｒｌｅ培地１９９において４８時間培養し、５％ＣＯ_２を有する湿潤雰囲気において３７℃に維持した。続いて、培地を、５０Ｕペニシリン／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１００μｇ／ｍＬゲンタマイシン、及び４．１ｍＭ Ｌ－グルタミン並びに５５０ｎＭヒドロコルチゾンを含有するＤＭＥＭ／ハムＦ１２（１：１）に変え、さらに４８時間して、培地を、それぞれ２５０μＭ ＤＰＡ又はＡＬＸＮ１８４０の非存在下又は存在下において、２５０μＭ銅（及び８３．３μＭアルブミン、Ｃｕ－アルブミンモル比３：１）を含有する処置溶液に変えた。ＴＥＥＲ及び電気容量値は、CellZscope装置を使用して、４８時間にわたって継続的にモニターした（nanoAnalytics、Munster、Germany）。初期ＴＥＥＲ値＞６００Ωｃｍ^２及び０．４５～０．６μＦ／ｃｍ^２の間の電気容量値を有するＰＢＣＥＣ単層のみを、透過性の研究に使用した（Bornhorst,J.,et al.,J Biol Chem,2012.287(21):p.17140-51）。関門の完全性は、ＴＥＥＲ値をそれぞれのスタート値に対して標準化することによって算出した。

処置スタート時、試験物質への曝露のおよそ２４及び４８時間後、２０μＬの頂端培地及び４０μＬの側底培地を、続く銅の定量のために収集した。総銅は、ＩＣＰ－ＭＳ／ＭＳによって、以前に記載される通りに決定した（Kopp,J.F.,et al.,J Trace Elem Med Biol,2019.54:p.221-225）。密着結合タンパク質の免疫細胞化学的染色のために、Transwell（登録商標）膜インサート上で培養したコンフルエントなＰＢＣＥＣを、以前に記載される通りに処理した（Muller,S.M.,et al.,Archives of Toxicology 2018.92(2):p.823-832）。手短に言えば、ＰＢＣＥＣを、ホルムアルデヒドにより固定し、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を使用して透過化処理した。アルブミンによる非特異的結合部位のブロッキングの後に、細胞を、抗クローディン５又は抗ＺＯ－１抗体（Zytomed Systems GmbH、Berlin、Germany）と共にインキュベートした。第２のブロッキングステップ後に、細胞を、二次抗体にコンジュゲートされたAlexa Fluor（登録商標）488（Invitrogen、Molecular Probes Inc.、Eugene、USA）により処置した。Hoechst33258（Merck、Darmstadt、Germany）を、細胞核を染色するために使用した。続いて、膜を、インサートから切り離し、Aqua Poly/Mount中に封入した（Polysciences Inc.、Washington、USA）。２４時間の固化期間の後、サンプルを、Leica Application Suite Xと組み合わせたLeica Microsystems CMS GmbH（Wetzlar、Germany）のDM6 B蛍光顕微鏡を使用して判定した。

Transwell（登録商標）インサート上で成長させたＰＢＣＥＣの電子顕微鏡法は、少し変更したが、以前に記載される通りに実行した（Ye,D.,K.A.Dawson,and I.Lynch,Analyst,2015.140(1):p.83-97）。手短に言えば、２．５％グルタルアルデヒドによる固定後、細胞単層を、３０分間、１％四酸化オスミウムにより後固定し、エタノールによって脱水した。細胞単層を、エタノール中エポキシ樹脂（１：２、１：１、２：１、各２０分）に段階的に包埋し、最終的に、カッティング及び画像獲得の前の前包埋標識（pre-embedding）なしで、６０℃で４８時間、１００％エポキシ樹脂に包埋した。

その他／統計
細胞タンパク質レベルは、ＢＣＡアッセイによって決定した（Smith,P.K.,et al.,Anal Biochem,1985.150(1):p.76-85）。細胞サイズは、LUNA-II（商標）Automated Cell Counter（Logos biosystems、Anyang、South Korea）を使用して決定した。

本開示の全体にわたって、「Ｎ」は、生物学的反復の数を示し、「ｎ」は、技術的反復の数を示す。データは、標準偏差（ＳＤ）と平均値とする。統計的有意差は、GraphPad Prism 7を使用して、図面の説明において示されるそれぞれの検定により解析した（GraphPad Software Inc.、La Jolla、USA）。

実施例１：銅キレート剤は血中銅を特異に上昇させる
キレート化は、ウィルソン病（ＷＤ）において治療法となる。過剰な銅の流動化が、キレート化された銅の腎クリアランスに必要であるかもしれないが、それにもかかわらず、流動化は、結果として、可能性として望ましくない全身性の銅の影響、例えば「神経症状の悪化」につながり得る。実際に、静脈内^６４Ｃｕ注射の際に、数分以内に、金属は、野生型ラットにおける脳を支える血管において、ＰＥＴによって多量にトレースすることができる（図１Ａ）。対照的に、腹腔内^６４Ｃｕ注射は、栄養としての銅の摂取を模倣しており、数時間後でさえ、脳を支える血管において、ほとんど銅を増加させない（図１Ａ及び１Ｅ）。

どの程度の銅が、未処置Ａｔｐ７ｂ^＋／－コントロール及びＡｔｐ７ｂ^－／－ラット（その代わりにＷＤラットと称される）における、さらにまた、ＤＰＡ又はＡＬＸＮ１８４０により処置したＡｔｐ７ｂ^－／－ラットにおける血清中に現れるのかを調査した（図１Ｂ）。ＷＤ患者のように、ＷＤラットは、セルロプラスミンへの銅の組み込みを欠き、そのため、未処置Ａｔｐ７ｂ^－／－動物は、非常に低い血清銅レベルを有する。しかしながら、ＡＬＸＮ１８４０による処置に際して、ＷＤラットの血清銅レベルは、有意に増加した（ＡＬＸＮ１８４０－Ｃｕ－アルブミン三部複合体の形成によるものと考えるのが妥当である、下記を参照）が、ＤＰＡによる処置の際は増加しなかった（図１Ｂ）。ＤＰＡによって増加しなかったのは、素速い腎銅クリアランスによるものかもしれないので、尿（図１Ｃ）、さらにまた糞便を介した銅の排出について調査した（図１Ｄ）。未処置Ａｔｐ７ｂ^＋／－及びＡｔｐ７ｂ^－／－ラットは、２４時間にわたって収集した尿又は糞便において低い銅レベルを有したが、ＷＤラットのＤＰＡによる処置は、結果として、尿への銅排出の有意な増加につながり、ＷＤ患者における典型的な診断所見と一致した。対照的に、正味の銅排出の著しい上昇は、選んだ条件（すなわち、９６時間の観察期間）下でのＡＬＸＮ１８４０処置に際して示されなかった。このように、これらのキレート剤は、血中銅レベルを様々な程度に上昇させるかもしれない。ＤＰＡの場合、速やかな腎クリアランス（投薬後１～３時間の間の血中ピーク）は、その検出を阻止したかもしれないが、銅血清レベルの有意な上昇が、ＷＤラットにおけるＡＬＸＮ１８４０処置の際に観察された。

実施例２：ＡＬＸＮ１８４０は銅及びアルブミンと安定した複合体を形成する
ＷＤ患者において、銅は、アルブミンへの結合がゆるいかもしれない。実際に、７５０μＭ銅を２５０μＭアルブミンと（すなわちモル比３：１）混合した際に、続くゲルろ過によって、アルブミンから、約半分～２／３の銅が分離した（図２Ａ上のパネル）。ＤＰＡと共にインキュベートした場合（モル比３：１：３のＣｕ－アルブミン－ＤＰＡで）、銅の一部は、アルブミンと共にとどまり、これは、高親和性アルブミン結合部位と比較して、ＤＰＡの低い銅親和性によると考えるのが妥当であり（Ｋ_ｄ（ＤＰＡ）＝２．４×１０^－１６Ｍ対Ｋ_ｄ（アルブミンのＮ末端）＝６．７×１０^－１７Ｍ）、それに対してその残りの銅は、ＤＰＡと一緒に移動した（図２Ａ下のパネル）。このように、ＤＰＡが、アルブミンから銅を解離させる能力は、適用されたモル比でゆるく結合した銅に限られるかもしれないように思われる。

興味深いことに、高親和性キレート剤ＡＬＸＮ１８４０（Ｋ_ｄ＝２．３×１０^－２０Ｍ）と共にコインキュベートした場合、アルブミンから銅が完全には解離せず、むしろ、タンパク質及び大部分の銅並びにＡＬＸＮ１８４０（モリブデンとして検出される）を含む１つの顕著なゲルろ過ピークが現れた（図２Ａ中央のパネル）。この特徴は、ＴＴＭについて記載されており（ＴＴＭは、ＡＬＸＮ１８４０中の活性分子である）、以前に「三部複合体」（ＴＰＣ）と称されたＣｕ－アルブミン－ＡＬＸＮ１８４０／ＴＴＭ複合体の形成によるものである。

単一のＴＰＣゲルろ過ピークは、ＴＰＣタンパク質への銅のしっかりとした結合を示した。従って、ＴＰＣのＸ線結晶解析を用い（図２Ｂ）、データ精密化に際して、ＡＬＸＮ１８４０について調べると、Ｈｉｓ２４１、Ｔｙｒ１４９、Ａｒｇ２５６、Ｌｙｓ２３７、Ａｌａ２９０によって形成されるアルブミンにおける深いくぼみである、いわゆるＳｕｄｌｏｗ部位１に２つの銅イオンが結合していた（図２Ｂ）。このように、アルブミン、銅、及びＡＬＸＮ１８４０が同時に存在した際に、キレート剤に結合した銅が、タンパク質の中に深く埋め込まれた。腎アルブミンクリアランスが非常にわずかであるので、この発見は、ＡＬＸＮ１８４０処置ＷＤラットにおいて尿による銅の排出がないことを説明するかもしれない（図１Ｃ）。加えて、電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）研究は、ＴＰＣ対Ｃｕ－アルブミンにおいて銅レドックスステータスにおける変化を実証した（図２Ｃ）。Ｃｕ－アルブミンは、典型的な第二銅Ｃｕ（ＩＩ）シグナルを示すが、ＡＬＸＮ１８４０の存在下において、ＥＰＲアクティブ第二銅銅シグナル強度は、約５０％下落し、一方の第二銅銅イオンのＥＰＲサイレント第一銅Ｃｕ（Ｉ）への還元を示唆した（図２Ｃ第２のトレース）。実際、Ｃｕ（ＩＩ）をＣｕ（Ｉ）に完全に還元する亜二チオン酸ナトリウムの追加により、ＥＰＲシグナルは、Ｃｕ－アルブミン及びＴＰＣにおいて検出されなかった（図２Ｃ、下のトレース）。

要約すると、上記のモル比を使用すると、しっかりと結合した銅のみが、アルブミンと共にとどまったのに対して、ゆるく結合した銅は、ゲルろ過に際して遊離し、ＤＰＡに結合した又はＡＬＸＮ１８４０によってアルブミンのＳｕｄｌｏｗ部位に移転し、ＴＰＣを形成した。

実施例３：高親和性キレート化はＣｕ－アルブミン誘発性の細胞毒性を妨げる
ＥＡ．ｈｙ９２６（ヒト内皮）細胞、Ｕ８７ＭＧ（ヒト星状細胞腫）細胞、及びＳＨＳＹ５Ｙ（ヒト神経芽細胞腫）細胞などの代用の脳細胞型並びに加えて、ＨｅｐＧ２細胞（ヒト肝細胞癌）を、Ｃｕ－アルブミンに対するそれらの脆弱性について試験した（図３）。アルブミンは、２５０μＭの濃度とし、Ｃｕ対アルブミンの増加性のモル比（１：１～１０：１）を、進行性の銅負荷を模倣するために用いた。１：１のモル比では、銅はアルブミンにかなりしっかりと結合したが、高い比では（≧３：１の場合など）、ゆるく結合した銅の量が、増加した（３：１の比については、図２Ａ上のパネルにおいて例証的に示される）。

すべての試験した細胞株は、２４時間のインキュベーションに際してCellTiterGlo（登録商標）アッセイによって評価されるように、ゆるくアルブミンに結合したＣｕの用量依存的な増加に対する細胞毒性を実証した（図３）。７５０μＭの濃度の高親和性キレート剤ＡＬＸＮ１８４０は、４：１のＣｕ－アルブミン比まで、このような毒性を完全に回避した（図３）。対照的に、ＤＰＡは、有効性がはるかに低かった。ＨｅｐＧ２細胞においてのみ、また、７５０μＭの高用量でのみ、中程度の救出効果が、ＤＰＡ追加の際に観察された（図３）が、それは、例えば内皮ＥＡ．ｈｙ９２６細胞において、全く不在であった。これは、とりわけ内皮細胞が、Ｃｕ－アルブミンに対して脆弱であるかもしれないこと及びＤＰＡが、このＣｕ毒性をブロックすることができないことを示す。注意すべきことに、銅がない設定において、２ｍＭに及ぶＤＰＡ濃度でさえ、無毒性であるとわかったので、ＤＰＡによる救出がないことは、ＤＰＡ自体の毒性によるものではない（図４）。このような設定で、すなわち、外因的なＣｕ－アルブミンの追加なしでは、むしろ、高親和性キレート剤ＡＬＸＮ１８４０が、おそらく、シトクロムｃオキシダーゼなどの銅を含有する不可欠な酵素に対する干渉により（図４Ｂ）、高濃度で毒性になる（図４Ａ）。

実施例４：ＡＬＸＮ１８４０はその桁はずれの銅親和性によって銅毒性を妨げる
図５から分かるように、高用量のＣｕ－アルブミン（ここでは３：１の比）は、すべての試験した細胞型において、細胞銅含有量を１００倍超、増加させ（図５、左のパネル）、大量の細胞死が平行し、ＳＨＳＹ５Ｙ細胞は受けた影響が最も小さく、ＥＡ．ｈｙ９２６細胞及びＨｅｐＧ２細胞は最も影響を受けた（図５、右のパネル）。この銅毒性は、高用量の、すなわち銅と等モルのＤＰＡによってでさえ、回避することができなかった（図３及び図５、右のパネル）。そのうえ、細胞株のいずれにおいても、ＥＡ．ｈｙ９２６細胞及びＳＨＳＹ５Ｙ細胞においていくらかの低銅含有量の傾向があったにもかかわらず、有意な除銅は、ＤＰＡの併用処置の際に、示されなかった（図５、左のパネル）。対照的に、高親和性キレート剤ＡＬＸＮ１８４０による併用処置は、ＥＡ．ｈｙ９２６細胞及びＵ８７ＭＧ細胞において、銅含有量を有意に減少させ、細胞生存度は、有意に維持された（図５、右のパネル）。それにもかかわらず、これらのデータは、高親和性キレート剤によって発動される細胞生存率の保護が、しかしながら、部分的に、細胞銅含有量を下げるその能力によるものであることにすぎないことを示す。ＨｅｐＧ２細胞において、例えば、非常に類似した細胞銅含有量が、ＡＬＸＮ１８４０、ＤＰＡによって併用処置した又はＣｕ－アルブミンのみによって処置した細胞において見出された（図５、左上のパネル）。この等しい銅負荷量にもかかわらず、ＡＬＸＮ１８４０は、ＨｅｐＧ２細胞を救ったのに対して、ＤＰＡはそうではなかった（図５、右上のパネル）。そのため、細胞の外部か内部かにかかわらず、そのしっかりとした結合によって銅毒性を回避したのは、ＡＬＸＮ１８４０の桁はずれの銅親和性（Ｋ_ｄ≒１０^－２０）であることが、はるかに妥当と思われる。実際、可能性として考えられる細胞結合パートナーの最も高い既知の銅親和性でさえ、桁が小さい（Ｋ_ｄ≒１０^－１６）。対照的に、その解離定数がちょうどこの後者の範囲にあるので、これはまた、ＤＰＡが、細胞生存度を確保することができなかった又は細胞生存度の増加の傾向があっただけであった理由を説明するかもしれない。

実施例５：ＡＬＸＮ１８４０はＣｕ－アルブミン誘発性のミトコンドリア損傷を軽減する
本実施例は、Ｃｕ－アルブミンが、血液脳関門（ＢＢＢ）を構成する細胞、すなわち内皮細胞及び星状細胞中のミトコンドリアに対して構造上の及び／又は機能的な損傷を負わせ得るのかどうかについて調査した。銅誘発性の細胞の死の第２の影響としてのミトコンドリア欠損を除外するために、Ｃｕ－アルブミン濃度（比３：１）は、細胞生存率が未処置コントロールと同等となるように調整した（図６Ａ）。この他、細胞タンパク質含有量も細胞サイズも、このような設定によって影響を受けなかったが、未処置コントロールと比較して細胞銅含有量における桁はずれの増加を引き起こした（図６Ａ）。

Ｃｕ－アルブミン対未処置細胞の電子顕微鏡写真は、ＥＡ．ｈｙ９２６細胞における顕著なミトコンドリア構造の変化及びＵ８７ＭＧ細胞における存在するが、より中程度の変化を実証した（図７Ａ）。ミトコンドリアクリステの損失又は構造上の方向性の欠落及び膜状の封入体が、観察された（図７Ａの矢印）。ＡＬＸＮ１８４０併用処置は、これらの構造上の異常を部分的に回避し、ミトコンドリアが、未処置コントロール細胞と同様の高電子密度マトリックス及び明確な構造をもつクリステを有することを実証する。対照的に、ＤＰＡは、ミトコンドリアが、短く、明確な構造をもたないクリステ並びに膜状の封入体を示したので、効果がなかった／わずかであった（図７Ａ）。

これらの構造上の欠乏は、機能的なミトコンドリアの欠損が平行し（図７Ｂ）、これらは、完全非共役条件下（すなわち、ミトコンドリアの呼吸量を最大に引き上げる、ＥＴＳ、図６Ｂ）での、処置細胞の高精度呼吸測定法において明らかであった。「ルーチン」（Ｒ、すなわちＡＤＰの存在下）又は完全非共役状態（ＥＴＳ、すなわちＦＣＣＰ滴定）酸素消費速度を、いわゆるリーク状態（Ｌ、すなわちＡＤＰなしの呼吸）によって割ることによって、呼吸調節比（ミトコンドリアの完全性及び機能性についての典型的なマーカー）を算出する場合、Ｅ／Ｌ比は、明らかなミトコンドリア生物エネルギー論的欠乏を実証し、これは、ここでも、ＥＡ．ｈｙ９２６細胞の場合は有意に又はＵ８７ＭＧ細胞の場合は傾向として、ＤＰＡによってではなく、ＡＬＸＮ１８４０の存在下において回避することができた（図７Ｂ）。
実施例６：Ｃｕ－アルブミンによる血液脳関門のしっかりとした内皮細胞層の破壊はＤＰＡによってではなくＡＬＸＮ１８４０によって妨げられる

ヒトＥＡ．ｈｙ９２６内皮（及びＵ８７ＭＧ星状細胞腫）細胞は、増加性のＣｕ－アルブミン暴露に対して非常に脆弱であり（図３Ｂ）、顕著なミトコンドリアの構造上の及び機能的な欠乏を実証した（図７）。

Transwell（登録商標）インサート上で培養した初代ブタ脳毛細血管内皮細胞（ＰＢＣＥＣ）を使用する内皮ＢＢＢの十分に特徴づけられたインビトロモデル（Muller,S.M.,et al.,Arch Toxicol,2018.92(2):p.823-832;Hoheisel,D.,et al.,Biochem Biophys Res Commun,1998.244(1):p.312-6）を使用した。ＢＢＢでのように、これらの初代細胞は、細胞の完全性についての判断基準としてのそれらの経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）及びそれらの単層電気容量の継続的な測定によって評価することができるように、単細胞性のしっかりとした上皮性関門を形成する。

Ｃｕ－アルブミン濃度を増加させることにより（すべて３：１のモル比）、ＴＥＥＲが次第に減少した（図８Ａ）ことについて立証した。注意すべきことに、用いた最大のＣｕ－アルブミン濃度（３００μＭ銅／１００μＭアルブミン）のみが、３６時間のインキュベーションの後に、大量の電気容量の増加、すなわち細胞死を引き起こし（図８Ａ）、これは、加えて、ニュートラルレッドアッセイを介して立証された（図８Ｂ）。このように、低Ｃｕ－アルブミン濃度によって誘発されるＢＢＢの内皮細胞層の漏れやすさは、単なる細胞死の誘発によるものではなく、内皮細胞ストレスの明らかなサインである。

次に、このようなＣｕ－アルブミン誘発性の内皮ＢＢＢ損傷を妨げる銅キレート剤ＡＬＸＮ１８４０及びＤＰＡの能力を、決定した（図９）。ＢＢＢを直ちに漏出性にした（すなわち、ＴＥＥＲを減少させる、図９Ａ）が、ＰＢＣＥＣ単層の時間的に安定した電気容量（図８Ｃ）によって証明されるように、観察された時間枠内で細胞死を誘発しなかったＣｕ－アルブミン濃度（２５０μＭ Ｃｕ／８３．３μＭアルブミン、３：１のモル比）を、選んだ。ＤＰＡ併用処置は、銅誘発性ＴＥＥＲ損失を妨げることが可能ではなかった（図９Ａ）。対照的に、ＡＬＸＮ１８４０の存在下においてＣｕ－アルブミンにより処置したＰＢＣＥＣ単層は、４８時間、安定したＴＥＥＲ値を実証し、未処置の単層と区別がつかなかった（図９Ａ）。これは、しっかりとしたＰＢＣＥＣ単層（図９Ｂのコントロール）において直接到達できない、Transwell（登録商標）システムの側底コンパートメントへの銅の流入を決定することによって、さらに立証した。実際に、銅の流入は、Ｃｕ－アルブミン処置に際して次第に生じ、ＤＰＡによって回避することはできなかったが、ＡＬＸＮ１８４０併用処置によって完全に回避された（図９Ｂ）。このように、Ｃｕ－アルブミンの上昇は、そうでなければ遮蔽されているコンパートメントへの銅の流入に関連する内皮細胞死の非存在下において早くも内皮ＢＢＢ層の漏れやすさを引き起こし、これは、ＤＰＡによってではなく、ＡＬＸＮ１８４０の存在下において回避することができる。

最後になるが、Ｃｕ－アルブミン誘発性のＰＢＣＥＣ単層損傷は、免疫細胞化学又は電子顕微鏡法によって視覚化することができる（図１０）。第１に、密着結合ストランドの膜内在性タンパク質であるクローディン－５は、未処置コントロール細胞における細胞周縁部で継続的で絶え間ない分布を実証した。対照的に、Ｃｕ－アルブミン処置ＰＢＣＥＣは、細胞間での間隙形成並びにギザギザした、散在性のクローディン－５の存在を示した。注意すべきことに、核構造の損失／変化は、観察できず、これらの実験において細胞死がなかったことを立証した。ＡＬＸＮ１８４０の存在下において、クローディン－５発現は、継続的で絶え間なかったのに対して、ＤＰＡの存在は、銅誘発性の間隙形成を妨げることができなかった（図１０、左のパネル）。第２に、細胞内密着結合関連タンパク質であるZonula occludens-1（ＺＯ－１）は、未処置コントロールＰＢＣＥＣ単層において、細胞境界で継続的に存在し、絶え間ないように思われた（図１０、中央のパネル）。Ｃｕ－アルブミン処置に際して、ＺＯ－１のはっきりした散在性の染色が生じ、ＤＰＡによってではなく、ＡＬＸＮ１８４０併用処置によって完全に保護することができた（図１０、中央のパネル）。密着結合でのこのようなタンパク質損失はまた、３番目の電子顕微鏡写真から明らかであった。コントロールＰＢＣＥＣ単層において、タンパク質が豊富な部分でのコントラスト剤の沈着により、これらの構造は、高電子密度であるように思われる。しかしながら、Ｃｕ－アルブミン処置に際して、これらの構造は、はるかに電子許容的（electron permissive）となり、ＤＰＡによって保護されなかったが、ＡＬＸＮ１８４０によって保護された（図１０、右のパネル）。

実施例７：考察
本開示は、静脈内に存在する銅が、脳を支える血管に到達し得ること（図１）及び増加に際して、銅が、次第に、アルブミンにゆるく結合するようになるかもしれないこと（図２）を実証する。Ｃｕ－アルブミンは、細胞毒性となり得（図３、５）、脳を保護するためにしっかりとした関門を構成する内皮細胞は、とりわけ脆弱である。しかし、早くも、細胞死をすぐには発動しないようなＣｕ－アルブミン量で、ミトコンドリアは、脆弱な標的となり（図７）、内皮関門の影響を受けた細胞は、漏出性の密着結合を実証し、進行性の銅の横断移行をもたらす（図９、１０）。これらの特徴はすべて、ＤＰＡではなく、高親和性銅キレート剤ＡＬＸＮ１８４０による併用処置によって、大いに回避された（図２～１０）。

推定では、１８～６８％のＷＤ患者が、神経学的症状、例えば振戦、構音障害、及び異緊張症に罹患していると報告されている。銅の脳レベルが、ＷＤ患者において大幅に上昇していることが決定された。銅が脳にどうやって蓄積し得るのか（時には数十年間にわたって）についての１つの可能な説明は、例えば部分的な突然の肝臓の死に際して、銅の激しい急変が繰り返され、高い結合力の（affine）血漿結合部位を一時的に圧倒して、脳への銅の取込みを可能にするといったものとすることができるかもしれない。実際、Ａｔｐ７ｂ^－／－ラット肝臓において、銅は、均一に分布しておらず、むしろ、周囲の肝臓組織よりも銅濃度が３．５倍高い「銅ホットスポット」中に存在する。このようなホットスポットの死は、おそらく、一時的な銅の急変をもたらし得る。さらに、ＡＴＰ７Ｂは、脳内皮の血液に面している膜に存在するので、突然変異は、結果として、過剰な銅の血液中への差し迫った再輸送の低下／ブロックにつながり、それによって、脳実質への金属の一方向の移入を引き起こし得る。ここでは、ＣＳＦを介して体循環に戻すＡＴＰ７Ａ媒介性の銅輸送のみが、脳銅を下げることを可能にすると思われる。

発明者らは、様々な銅対アルブミン比を試験することによって、ゆるくアルブミンに結合した銅をもたらすと思われる、このような銅の急変を模倣しようとした。実際に、低い比（１：１）を用いた場合、試験した細胞型のいずれにおいても細胞毒性はみられなかった。しかしながら、このＣｕ対アルブミン比を上げた場合、細胞生存率は下がり、内皮細胞はとりわけ脆弱であった。ミトコンドリア欠損の増加及びＢＢＢの第１の関門に似ている内皮細胞層の細胞結合性の破壊は、このようなＣｕ－アルブミン毒性の初期のサインとして、すなわち細胞死が始まることなく、現れる。さらに、このような初期の損傷は、早くも、進行性の経上皮／傍上皮の（para-epithelial）銅通過を可能にした。内皮ＢＢＢ損傷は、ゆるくタンパク質に結合した銅の上昇に際して、神経型ＷＤにおける可能性として考えられる１つの初期の損傷メカニズムとして、続いて銅の脳への移入の促進を可能にすることが示唆される。

神経症状の悪化は、ＤＰＡ処置の際に頻繁に生じることが報告されている。高親和性銅キレート剤ＡＬＸＮ１８４０は、ゆるく結合した銅のアルブミンからの分離及びタンパク質自体の深部のくぼみへのその埋め込み（三部複合体ＴＰＣと称される）を引き起こした。従って、Ｃｕ－アルブミン毒性のサインは、ＴＰＣ形成に際して、本研究においてほとんどみられなかった。これは、低細胞銅レベルをもたらす低い細胞ＴＰＣ取込み対ゆるく結合した銅によるもの又は１～２日間の研究した時間枠における細胞内でも、銅及びＡＬＸＮ１８４０が強い継続的な結合をしていることによるものであるかもしれない。対照的に、ＤＰＡは、銅を尿に送り、血液中へのその通過及び腎クリアランスを実証した。しかしながら、このようなＤＰＡによって始められる銅の尿による排出は、Ａｔｐ７ｂ^－／－ラットの正味の銅摂取量の１０％しか、このようなＤＰＡ処置に際して尿中に見つけられないので、量的に限られたものであった（すなわち、３．９５μモル／２４時間の正味の総取込みのうち０．４μモル／２４時間、未公開の観察）。それにもかかわらず、ＤＰＡによる腎銅クリアランスは、素速く生じ、処置停止の３日後であり、血中銅の上昇は、観察されなかった。Ｃｕ－アルブミンのみと同様に、有益な効果は、ＤＰＡの存在に際してほとんどみられなかった。

神経損傷は、ＷＤ患者において頻繁に生じる。初めの頃の研究は、ネコの脳において、さらにまた他の種でも、直接的な銅毒性を実証した。銅は、これらの患者において最重視すべき、原因となっている神経毒であるということで、現在、意見が一致している。実際、代用の神経細胞及びアストロサイト細胞を含むすべての試験した細胞株は、手が空いている銅に対して非常に脆弱である。以前に報告されたように、ニューロンは、比較的非常に低い、保護的メタロチオネインしか有しておらず、これらの細胞は、銅の攻撃に対して比較的無防備であるように思われる。この点で、本研究において実証されるように、保護的関門細胞に対する銅誘発性の損傷は、脳への比較的野放図な銅の移入を引き起こし得る。ＤＰＡ処置下で神経症状の増悪を示す４人の神経型ＷＤ患者における血液脳関門の関与は、ＢＢＢ損傷の増加が平行した。ＤＰＡ併用処置による内皮ＢＢＢの救出が観察されなかったので、これは、２つの不利益な結果を招き得るかもしれない。第１に、以前に損傷を受けたＢＢＢを有する神経型ＷＤ患者は、ＤＰＡ処置下で非常に脆弱になり得るかもしれず、第２に、ＤＰＡ処置は、既存のＢＢＢ損傷を悪化させ得るかもしれない。これは、神経型の患者を、ＤＰＡ処置を始める前に、ＢＢＢ損傷について試験することができるかもしれないことを示唆する（例えば、血中のＳ１００Ｂレベル又は脳脊髄液／血清のアルブミン比の定量によって）。このような損傷又は漏れやすさは、早くも無毒性の用量で生じ、内皮細胞のミトコンドリアを１つの脆弱な標的として特定したことが分かった。ミトコンドリアは、ＢＢＢ透過性において鍵となるプレイヤーとして以前に記載された。本研究と一致して、ミトコンドリア呼吸量の操作は、ＢＢＢ透過性における速やかな増加及び密着結合の破壊と平行した。

血液脳関門は、銅過負荷に対して非常に感受性の構造である。加えて、ＤＰＡ併用処置に際しての神経症状の悪化の発生は、ＤＰＡがこのような損傷から救うことができないことに関連づけられた。対照的に、高親和性キレート剤は、この点で、はるかに保護的であるように見える。実際、ＡＬＸＮ１８４０は、ゆるく結びついたアルブミン銅に有効に結合することがわかり（この場合、三部複合体を形成する）、血液脳関門銅毒性を大いに回避した。

本明細書において記載される実施例及び実施形態は、例示的な目的のみのためのものであり、それを考慮した様々な修飾又は変更は、当業者らに示唆され、本出願の精神及び範囲並びに添付される請求項の範囲内に組み込まれることが理解される。本明細書において引用されるすべての刊行物、特許、及び特許出願は、これによって、あらゆる目的において、参照によって、本明細書に援用される。

Claims (38)

1. それを必要とする対象において銅誘発性神経損傷を低下させるための方法であって、治療有効量のビスコリンテトラチオモリブデートを前記対象に投与することを含む方法。
2. 前記対象は、ウィルソン病を有する、請求項１に記載の方法。
3. 銅誘発性神経損傷を低下させることは、対象における１つ以上の神経学的症状又は精神症状を改善する、低下させる、又は排除する、請求項１又は請求項２に記載の方法。
4. 前記１つ以上の神経学的症状又は精神症状は、以下：振戦、構音障害、異緊張症、歩行障害、うつ、社会不安障害、パニック障害、外傷後ストレス障害、前頭葉実行機能能力及び／又は視空間処理の欠損、並びに記憶喪失から選択される、請求項３に記載の方法。
5. 銅誘発性神経損傷を低下させることは、安定したＣｕ－テトラチオモリブデートアルブミン三部複合体の形成によるものである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記Ｃｕ－テトラチオモリブデートアルブミン三部複合体は、輸送及び／又は排除のために、前記対象における体循環において役に立つ、請求項５に記載の方法。
7. 前記銅誘発性神経損傷は、以下：銅誘発性細胞毒性、銅誘発性血液脳関門損傷、及び銅誘発性ミトコンドリア損傷の１つ以上を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 銅誘発性神経損傷を低下させることは、銅誘発性細胞毒性を低下させることによるものである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記銅誘発性細胞毒性は、肝細胞、内皮細胞、ニューロン、及び星状細胞の少なくとも１つにおいて低下する、請求項８に記載の方法。
10. 銅誘発性細胞毒性を低下させることは、細胞生存率を改善する（ビスコリンテトラチオモリブデートの投与を伴わない前記細胞生存率と比較して）、請求項８又は請求項９に記載の方法。
11. 銅誘発性神経損傷を低下させることは、銅誘発性血液脳関門損傷を低下させることによるものである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記銅誘発性血液脳関門損傷の低下は、以下：（ａ）経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を維持すること、（ｂ）電気容量を維持すること、及び（ｃ）銅誘発性形態学的変化を低下させることの１つ以上を含む、請求項１１に記載の方法。
13. ＴＥＥＲは、健康な対象と同じレベルに維持される、請求項１２に記載の方法。
14. 電気容量は、健康な対象と同じレベルに維持される、請求項１２又は請求項１３に記載の方法。
15. 前記銅誘発性形態学的変化は、ミトコンドリアクリステの損失若しくは構造上の方向性の欠落及び／又は膜状の封入体である、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 銅誘発性形態学的変化を低下させることは、脳毛細血管内皮細胞の細胞境界でのクローディン－５の継続的で絶え間ない存在及び／又はＺｏｎｕｌａ Ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ－１の存在をもたらす、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 銅誘発性神経損傷を低下させることは、銅誘発性ミトコンドリア損傷を低下させることによるものである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記銅誘発性ミトコンドリア損傷の低下は、すべて未処置の対象と比較した、以下：（ａ）銅誘発性膜封入体の存在を低下させること、（ｂ）クリステの組織化を増加させること又は維持すること、（ｃ）高電子密度マトリックスを増加させること又は維持すること、及び（ｄ）ミトコンドリア呼吸を増加させること又は維持することの１つ以上を含む、請求項１７に記載の方法。
19. 銅誘発性神経損傷を低下させることは、投与後０日目～２４週目の範囲にわたる時間間隔の範囲内で生じる、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
20. 最も高いレベルの低下は、投与後０日目～７週目の範囲にわたる時間間隔の範囲内にある、請求項１９に記載の方法。
21. 前記対象は、ウィルソン病のためなどの、銅代謝関連疾患又は障害のための処置を以前に受けていない（すなわち、処置未経験の対象）、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記対象は、ウィルソン病のためなどの、銅代謝関連疾患又は障害のための標準治療による処置を以前に受けた、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記標準治療による処置は、トリエンチン、Ｄ－ペニシラミン、及び／又は亜鉛を含む、請求項２２に記載の方法。
24. 前記標準治療による処置は、Ｄ－ペニシラミンを含む、請求項２２に記載の方法。
25. ビスコリンテトラチオモリブデートの前記治療有効量は、１日当たり約１５ｍｇ～約６０ｍｇの範囲にある、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
26. ビスコリンテトラチオモリブデートの前記治療有効量は、毎日約１５ｍｇである、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
27. ビスコリンテトラチオモリブデートの前記治療有効量は、毎日約３０ｍｇである、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
28. ビスコリンテトラチオモリブデートの前記治療有効量は、隔日で約１５ｍｇである、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
29. ビスコリンテトラチオモリブデートの前記治療有効量は、隔日で約３０ｍｇである、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
30. １つ以上の神経学的症状又は精神症状における変化に基づいて、ビスコリンテトラチオモリブデートの前記治療有効量を、ビスコリンテトラチオモリブデートの第２の治療有効量に調整することをさらに含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。
31. ビスコリンテトラチオモリブデートの前記第２の治療有効量は、ビスコリンテトラチオモリブデートの第１の治療有効量よりも低い、請求項３０に記載の方法。
32. ビスコリンテトラチオモリブデートの前記第２の治療有効量は、ビスコリンテトラチオモリブデートの前記第１の治療有効量よりも高い、請求項３０に記載の方法。
33. 請求項１～２４及び３０～３２のいずれか一項に記載の方法において使用するための、ビスコリンテトラチオモリブデートの治療有効量を含む組成物。
34. ビスコリンテトラチオモリブデートの前記治療有効量は、１日当たり約１５ｍｇ～約６０ｍｇの範囲にある、請求項３３に記載の組成物。
35. ビスコリンテトラチオモリブデートの前記治療有効量は、毎日約１５ｍｇである、請求項３３に記載の組成物。
36. ビスコリンテトラチオモリブデートの前記治療有効量は、毎日約３０ｍｇである、請求項３３に記載の組成物。
37. ビスコリンテトラチオモリブデートの前記治療有効量は、隔日で約１５ｍｇである、請求項３３に記載の組成物。
38. ビスコリンテトラチオモリブデートの前記治療有効量は、隔日で約３０ｍｇである、請求項３３に記載の組成物。
    

Images