KR20240051240A - 응집체 분리 방법 - Google Patents

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KR20240051240A
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cellulose acetate
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KR1020247010468A
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올리버 윌리엄 스테릿
마이클 폴 휘트크로프트
Original Assignee
테릭스 파마슈티컬스 (이노베이션스) 피티와이 엘티디
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Abstract

본 개시는 단백질, 단백질의 응집체 및 액체 담체를 포함하는 조성물로부터 응집체를 제거하는 방법을 제공한다. 방법은 조성물을 셀룰로오스 아세테이트 막에 통과시켜 단백질이 막을 실질적으로 통과하게 하면서 막 상에 응집체의 적어도 일부를 선택적으로 흡착시키는 단계를 포함하는 하나 이상의 필터링 단계에 조성물을 적용하는 단계를 수반한다. 응집체 제거를 위한 바람직한 단백질 조성물은 킬레이트 리간드에 접합된 항체를 포함한다.

Description

응집체 분리 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 호주 가출원 번호 2021902839(2021년 9월 1일 제출)에 대한 우선권을 주장하며, 그 전체가 참조로 본원에 포함된다.
발명의 기술분야
본 발명은 조성물로부터 단백질 응집체를 선택적으로 제거하는 방법에 관한 것이다.
단백질 응집은 본래 환경 외부에서 단백질을 취급할 때 발생하는 일반적인 문제이다. 응집은 단백질 샘플의 단계를 취급하는 동안 또는 저장 시 발생할 수 있다. 전형적으로 응집체는 비응집된 단백질과 동일한 기능을 갖지 않으므로 응집은 단백질 샘플의 기능 손실에 대한 한 가지 경로를 제시한다.
응집이 문제가 되는 단백질의 한 부류는 단백질 접합체이다. 예를 들어, 킬레이트 리간드가 있는 단백질 접합체는 예를 들어 치료적, 진단적 또는 치료진단적 제제로서의 잠재적인 용도로 인해 지속적인 관심을 받고 있다.
킬레이트 리간드는 전형적으로 다중자리이며 바람직하게는 치료적 또는 진단적 가능성이 있는 핵종에 대해 선택적이다.
특히 상업적 규모의 단백질 접합체 제조에서 발생하는 한 가지 문제는 다양한 제조 단계에 요구되는 상대적으로 가혹한 합성 조건으로 인한 응집체의 형성이다. 단백질 응집체는 고체 응집체일 수도 있고 가용성 응집체일 수도 있다.
응집체 완화 전략에는 응집체 형성을 저감하기 위한 접합체에 대한 제조 절차 또는 단백질 접합체로부터 응집된 단백질을 분리하기 위한 정제 절차를 적응시키는 단계가 포함된다.
따라서 낮은 수준의 응집체로 의미 있는 수율의 원하는 단백질을 제공할 수 있는 킬레이트 리간드가 있는 단백질 접합체를 포함하여 단백질을 제조하기 위한 적어도 대안적인 공정을 제공할 지속적인 필요성 있다.
명세서에서 임의의 선행 기술에 대한 참조는 이 선행 기술이 임의의 관할권에서 통상적인 일반 지식의 일부를 형성하거나 이 선행 기술이 당업계의 숙련자에게 이해되고, 관련된 것으로 간주되고/간주되거나 다른 선행 기술과 조합될 것으로 합리적으로 추측될 수 있음을 인정하거나 암시하는 것은 아니다.
일 양태에서, 본 발명은 액체 담체 내 단백질 및 단백질의 응집체를 포함하는 조성물로부터 단백질의 응집체를 제거하는 방법을 제공한다. 이 방법은 조성물을 셀룰로오스 아세테이트 막에 통과시켜 단백질이 막을 실질적으로 통과하게 하면서 막 상에 응집체를 선택적으로 흡착시키는 단계를 포함하는 하나 이상의 필터링 단계에 조성물을 적용하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 단백질을 정제하는 방법을 제공한다. 방법은 조성물을 셀룰로오스 아세테이트 막에 통과시켜 단백질이 막을 실질적으로 통과하게 하면서 막 상에 응집체를 선택적으로 흡착시키는 단계를 포함하는 하나 이상의 필터링 단계에 액체 담체 내 단백질 및 단백질의 응집체를 포함하는 조성물을 적용하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 설명된 방법에 의해 얻을 수 있거나 얻은 단백질, 및 본원에 설명된 방법에 의해 얻을 수 있거나 얻은 단백질을 포함하는 조성물을 제공한다.
선택된 정의
용어 "알킬"은 포화 직쇄 및 분지쇄 탄화수소 기를 포함하도록 의도된다. 일부 구현예에서, 알킬 기는 1개 내지 12개, 1개 내지 10개, 1개 내지 8개, 1개 내지 6개, 또는 1개 내지 4개의 탄소 원자를 갖는다. 일부 구현예에서, 알킬 기는 5-21개, 9-21개 또는 11-21개의 탄소 원자, 예컨대 11개, 13개, 15개, 17개 또는 19개의 탄소 원자를 갖는다. 직쇄 알킬 기의 예에는 메틸, 에틸, n-프로필, n-부틸, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸 및 n-옥틸이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 분지형 알킬 기의 예에는 이소프로필, 이소-부틸, sec-부틸, tert-부틸, 네오펜틸, 이소펜틸 및 2,2-디메틸프로필이 포함되나 이에 제한되지 않는다.
용어 "할로"는 클로로(-Cl), 브로모(-Br), 플루오로(-F) 및 요오도(-I) 기를 포함하도록 의도된다. 일부 구현예에서, 할로는 클로로, 브로모 및 플루오로, 바람직하게는 플루오로로부터 선택될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료진단적"은 진단뿐만 아니라 요법에도 사용되는 화합물/재료의 능력을 지칭한다. 용어 "치료진단적 시약"은 환자의 질병 또는 병태의 검출, 진단 및/또는 치료에 적합한 임의의 시약과 관련된다. 치료진단적 화합물/재료의 목적은 별개의 진단적 및 치료적 제제 사이에 존재할 수 있는 생체분포 및 선택성에 있어 바람직하지 않은 차이를 극복하는 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "및/또는"은 "및" 또는 "또는" 또는 둘 모두를 의미한다.
명사 뒤에 오는 용어 "(s)"는 단수형과 복수형 또는 둘 모두를 고려한다.
본원에 사용된 바와 같이, 문맥상 달리 요구되는 경우를 제외하고, 용어 "포함하다" 및 용어의 변형, 예컨대 "포함하는", "포함한다" 및 "포함되는"은 추가의 첨가제, 성분, 정수 또는 단계를 배제하려는 의도가 아니다.
본원에 개시된 숫자의 범위(예를 들어, 1 내지 10)에 대한 참조는 또한 그 범위 내의 모든 유리수(예를 들어, 1, 1.1, 2, 3, 3.9, 4, 5, 6, 6.5, 7, 8, 9 및 10) 및 또한 그 범위 내의 임의의 유리수 범위(예를 들어, 2 내지 8, 1.5 내지 5.5 및 3.1 내지 4.7)에 대한 참조를 포괄하는 것으로 의도되므로, 명시적으로 본원에 개시된 모든 범위의 모든 하위 범위는 본원에 명시적으로 개시된다. 이들은 구체적으로 의도된 것의 예일뿐이며 열거된 최저 값과 최고 값 사이의 수치 값의 모든 가능한 조합은 유사한 방식으로 본 출원에서 명시적으로 언급되는 것으로 간주된다.
본 발명의 다양한 특성은 특정 값 또는 값의 범위를 참조하여 설명된다. 이들 값은 다양한 적절한 측정 기법의 결과와 관련되도록 의도되었으므로, 임의의 특정 측정 기법에 내재된 오차 한계를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 본원에 언급된 값 중 일부는 이러한 가변성을 적어도 부분적으로 설명하기 위해 용어 "약"으로 표시된다. 값을 설명하는 경우에 사용되는 용어 "약"은 해당 값의 ±10%, ±5%, ±1% 또는 ±0.1% 이내의 양을 의미할 수 있다.
본 발명의 추가 양태와 이전 단락에 설명된 양태의 추가 구현예는 첨부 도면을 참조하여 예로서 주어진 다음의 설명으로부터 명백해질 것이다.
도 1. 사전 접선 유동 여과(TFF) 조건 하에서 다양한 셀룰로오스 아세테이트 필터 크기의 예상 결합 용량을 예시하는 그래프.
도 2. 사후 TFF 조건 하에서 다양한 셀룰로오스 아세테이트 필터 크기의 예상 결합 용량을 예시하는 그래프.
도 3. 공정 중 크기 배제 크로마토그래피 - 사전 TFF 및 사후 TFF 셀룰로오스 아세테이트 여과 단계를 포함하는 4개의 우수 제조 관리 기준(GMP) 지렌툭시맙-N-숙시닐-데스페리옥사민 접합체(GmAb-DFO) 공정 배치에 대한 고성능 액체 크로마토그래피(SEC-HPLC) 데이터를 예시하는 그래프.
본 발명은 단백질 및 단백질의 응집체를 포함하는 조성물로부터 단백질의 응집체를 제거하는 방법에 관한 것이다. 방법은 다음을 포함한다:
- 조성물을 셀룰로오스 아세테이트 막에 통과시키는 단계를 포함하는 하나 이상의 필터링 단계에 액체 담체 내 단백질 및 단백질의 응집체를 포함하는 조성물을 적용하는 단계.
본 발명자들은 놀랍게도 셀룰로오스 아세테이트 막(셀룰로오스 아세테이트 필터로도 지칭됨)이 전형적으로 단백질 용액으로부터 미립자 물질 및 바이오버든을 살균하고 제거하기 위해 사용되지만, 단백질과 단백질의 응집체를 함유하는 액체 혼합물로부터 응집체를 효과적으로 제거할 수도 있다는 것을 밝혔다.
막은 셀룰로오스 아세테이트를 포함한다. 이론에 얽매임 없이, 본원에 설명된 공정은 응집체 크기를 기반으로 한 여과보다는 막의 셀룰로오스 아세테이트와 응집체의 상호작용을 포함할 수 있는 것으로 여겨진다. 이 상호작용은 기공 크기는 유사하나 상이한 재료의 막이 단백질로부터 응집체를 제거할 수는 없었던 셀룰로오스 아세테이트 필터가 또한 단량체 단백질을 포함하는 조성물로부터 단백질 응집체를 선택적으로 제거할 수 있었다는 놀라운 결과에 기여할 수 있다. 응집체와 셀룰로오스 아세테이트의 상호작용은 적어도 주로 셀룰로오스 아세테이트에 대한 단백질 응집체의 흡착인 것으로 여겨진다. 따라서, 공정은 단백질이 막을 통과하게 하면서 응집체의 적어도 일부를 막 상에 선택적으로 흡착시키는 셀룰로오스 아세테이트 막에 의해 단백질 및 응집체를 포함하는 조성물로부터 응집체를 제거할 수 있다.
단백질 및 단백질의 응집체를 포함하는 조성물로부터 단백질의 응집체를 제거하는 방법이 본원에 또한 설명되어 있으며, 방법은 다음을 포함한다:
- 조성물을 셀룰로오스 아세테이트 막에 통과시키고, 이에 의해 조성물로부터 응집체의 적어도 일부를 제거하는 단계를 포함하는 하나 이상의 필터링 단계에 액체 담체 내 단백질 및 단백질의 응집체를 포함하는 조성물을 적용하는 단계.
본 발명은 미립자 물질 및 바이오버든을 제거하기 위한 통상적인 용도와 별개인, 착물 단백질 샘플로부터 응집체를 제거하기 위한 셀룰로오스 아세테이트 막의 능력에 관한 것으로 인지될 것이다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에 설명된 방법 및 공정은 미립자 물질 및/또는 바이오버든의 제거를 위한 것이 아니다.
셀룰로오스 아세테이트 막은 임의의 적합한 크기일 수 있다. 일부 구현예에서, 셀룰로오스 아세테이트 막은 약 0.015m2 내지 약 0.60m2의 크기(여과 면적으로도 지칭됨), 예를 들어 약 0.015m2, 약 0.03m2, 약 0.05m2, 약 0.10m2, 약 0.15m2, 약 0.20m2, 약 0.25m2, 약 0.30m2, 약 0.35m2, 약 0.40m2, 약 0.45m2, 약 0.50m2, 약 0.55m2 또는 약 0.6m2의 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 크기는 이들 값 내지 임의의 다른 값의 임의의 크기, 예를 들어 약 0.015m2 내지 약 0.1m2의 크기 또는 약 0.03m2 내지 약 0.10m2의 크기일 수 있다. 일부 구현예에서, 셀룰로오스 아세테이트 막은 0.05m2의 크기를 갖는다. 본원에 설명된 셀룰로오스 아세테이트 막은 전형적으로 단백질 샘플로부터 바이오버든 및 미립자 물질의 제거를 위해 통상적으로 사용되는 것들보다 더 큰 크기를 갖는다는 것이 인지될 것이다.
셀룰로오스 아세테이트 막은 임의의 적합한 형태로 제공될 수 있다. 예를 들자면, 셀룰로오스 아세테이트 막은 원심분리 필터, 주사기 필터 또는 캡슐 필터의 형태일 수 있으며, 이들 중 임의의 것이 공정(그램) 규모에 적합할 수 있다.
셀룰로오스 아세테이트 막은 유동(지속) 방법 또는 공정의 용도에 적합할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 하나 이상의 필터링 단계 각각은 유동 방식으로 독립적으로 수행된다. 실시예에 보여진 바와 같이, 이는 본원에 설명된 셀룰로오스 아세테이트 막이 대규모 단백질 제작 공정에 사용되는 것을 유리하게할 수 있다.
일부 구현예에서, 셀룰로오스 아세테이트 막은 셀룰로오스 아세테이트 나노입자를 포함하지 않거나 실질적으로 없다. Bee 외(Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol 98, No 9, 3218-3238)는 이전에 단백질 응집체가 셀룰로오스 아세테이트 나노입자에 대한 친화성을 나타낸다고 보고하였다. 유리하게는, 실시예에 보여진 바와 같이, 셀룰로오스 아세테이트 나노입자보다 비교적 더 낮은 상대 표면적을 가짐에도 불구하고, 본원에 설명된 셀룰로오스 아세테이트 막은 응집체 함량을 허용 가능한 품질 수준으로 저감시킬 수 있다.
셀룰로오스 아세테이트 막은 임의의 적합한 크기의 기공을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 셀룰로오스 아세테이트 막은 약 0.2μm 내지 약 0.8μm, 예를 들어 약 0.2μm, 약 0.25μm, 약 0.3μm, 약 0.35, 약 0.4μm, 약 0.45μm, 약 5.0μm, 약 5.5μm, 약 6.0μm, 약 6.5μm, 약 7.0μm, 약 7.5μm 또는 약 8.0μm의 평균 직경(기공 크기라고도 지칭됨)을 갖는 기공을 포함한다. 일부 구현예에서, 평균 직경은 이들 값 내지 임의의 다른 값, 예를 들어 0.2μm 내지 약 0.45μm의 임의의 평균 직경일 수 있다. 일부 구현예에서, 셀룰로오스 아세테이트 막은 약 0.2μm의 평균 직경을 갖는 기공을 포함한다.
각각의 필터링 단계에서 액체 담체(액체 혼합물로도 지칭됨)는 독립적으로 약 4.0 내지 약 8.0의 pH, 예를 들어 약 4.0, 약 4.1, 약 4.2, 약 4.3, 약 4.4, 약 4.5, 약 4.6, 약 4.7, 약 4.8, 약 4.9, 약 5.0, 약 5.1. 약 5.2, 약 5.3, 약 5.4, 약 5.5, 약 5.6, 약 5.7, 약 5.8, 약 5.9, 약 6.0, 약 6.1, 약 6.2, 약 6.3, 약 6.4, 약 6.5, 약 6.6, 약 6.7, 약 6.8, 약 6.9, 약 7.0, 약 7.1, 약 7.2, 약 7.3, 약 7.4 약 7.5, 약 7.6, 약 7.7, 약 7.8, 약 7.9 또는 약 8.0의 pH를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, pH는 이들 값 내지 임의의 다른 값, 예를 들어 약 4.4 내지 약 7.4의 pH 또는 약 4.4 내지 약 5.9의 pH 중 임의의 pH일 수 있다. 유리하게는, 단백질 응집체를 제거하기 위해 전형적으로 사용되는 다른 기법, 예컨대 크로마토그래피 수지와 달리, 본원에 설명된 셀룰로오스 아세테이트 막의 사용은 다양한 pH 조건에서 응집체의 제거를 가능 하게할 수 있다.
조성물은 단백질, 단백질의 응집체 및 액체 담체를 포함한다. 조성물은 액체 담체 내 단백질 및 응집체의 용액일 수 있거나, 조성물은 액체 담체 내 단백질 및/또는 응집체의 현탁액 또는 에멀젼일 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질은 액체 담체가 있는 용액으로 존재하고, 응집체는 액체 담체 내 현탁액으로 존재한다. 전형적으로, 조성물은 액체 담체 내 단백질과 응집체의 균질한 혼합물이다. 조성물은 셀룰로오스 아세테이트 막을 통과할 수 있는 임의의 형태일 수 있으며, 전형적으로 액체 조성물이다.
각 필터링 단계의 액체 담체는 독립적으로 수용액, 예를 들어 소듐 클로라이드 용액 또는 완충 용액일 수 있다. 일부 구현예에서, 액체 담체는 완충 용액을 포함한다. 단백질과 상용성인 임의의 적합한 완충 용액, 예를 들어 포스페이트 완충 식염수(PBS), 2-(N-모르폴리노)에탄술폰산(MES-NaOH), 디소듐 하이드로즌 포스페이트, 3-(N-모르폴리노)프로판술폰산(MOPS-KOH), 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 하이드로클로라이드(Tris-HCl) 및 N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N'-(2-에탄술폰산)(HEPES)이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 완충 용액은 PBS이다. 유리하게는, 단백질 응집체(예를 들어, 특정 완충 조건을 요구하는 크로마토그래피 수지)를 제거하기 위해 전형적으로 사용되는 다른 기법과 달리, 본원에 설명된 셀룰로오스 아세테이트 막의 사용은 다양한 조건에서 응집체의 제거를 가능 하게할 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 필터링 단계는 2개 이상의 필터링 단계, 예를 들어 2개, 3개, 4개, 5개 이상의 필터링 단계를 포함한다. 필터링 단계의 수는, 예를 들어 출발 조성물 내 응집체의 양 및/또는 셀룰로오스 아세테이트 막의 크기에 따라 적합하게 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 필터링 단계는 두 개의 필터링 단계를 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 하나 이상의 필터링 단계는 다음을 포함한다:
- 조성물을 셀룰로오스 아세테이트 막에 통과시키는 단계를 포함하는 제1 필터링 단계; 및
- 조성물을 셀룰로오스 아세테이트 막에 통과시키는 단계를 포함하는 제2 필터링 단계.
또 다른 방식으로 설명하면, 일부 구현예에서, 방법은 다음을 포함한다:
- 액체 내 단백질 및 단백질의 응집체를 포함하는 조성물을 제공하는 단계;
- 조성물을 셀룰로오스 아세테이트 막에 통과시키는 단계를 포함하는 제1 필터링 단계에 조성물을 적용하여 셀룰로오스 아세테이트 막을 통과시키기 전의 조성물에 비해 응집체 대비 단백질이 풍부한 제1 여과물을 제공하는 단계; 및
- 제1 여과물을 셀룰로오스 아세테이트 막에 통과시키는 단계를 포함하는 제2 필터링 단계에 제1 여과물을 적용하여 제1 여과물에 비해 응집체 대비 단백질이 풍부한 제2 여과물을 제공하는 단계.
제1 여과물의 pH는 제1 필터링 단계 전의 조성물의 pH와 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 여과물은 약 5.6 내지 약 5.9의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 방법은 제2 필터링 단계 전에 제1 여과물의 pH를 조정하는 단계를 추가로 포함한다.
본원에 설명된 방법은 당업계에 알려진 바람직하지 않은 응집체를 형성할 잠재성을 가진 임의의 단백질(전형적으로 단량체)에 응용될 수 있음이 인지될 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "응집체"는 단백질의 고분자량(HMW) 응집체, 전형적으로 이량체보다 큰 다량체를 포함하는 것으로 이해될 것이다. 응집체는 미립자를 형성하고 이들이 형성된 용액으로부터 침전될 수 있는 불용성 응집체일 수 있거나, 응집체는 가용성 응집체일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단백질"은 단백질 접합체, 예를 들어 또 다른 (비-단백질) 화학적 모이어티가 전형적으로 공유 결합에 의해 연결된 단백질을 포괄하는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 일부 구현예에서, 단백질은 단백질 접합체이다. 다른 방식으로 설명하면, 일부 구현예에서, 단백질은 접합된 화학적 모이어티, 예를 들어 단백질에 연결된 (비-단백질) 화학적 모이어티를 포함한다. 화학적 모이어티(보결 기로도 지칭됨)는 당업계에 알려진 임의의 적합한 화학적 모이어티일 수 있다. 일부 구현예에서, 화학적 모이어티는 킬레이트 모이어티일 수 있다.
일부 구현예에서, 단백질 및 접합된 화학적 모이어티는 공유 결합을 통해 직접 연결된다. 일부 구현예에서, 단백질 및 접합된 화학적 모이어티는 연결 기를 통해 연결된다.
일부 구현예에서, 연결 기는 이작용성 링커이다. 이작용성 링커는 화학적 모이어티와 단백질을 함께 공유적으로 연결할 수 있는 임의의 2가 라디칼 종일 수 있다. 적합한 이작용성 링커에는 브로모아세틸, 티올, 숙신이미드 에스테르(예를 들어, 숙시닐), 테트라플루오로페닐(TFP) 에스테르, 말레이미드, 아미노산(천연 및 비천연 아미노산 포함), 니코틴아미드, 니코틴아미드 유도체 또는 당업계에 알려진 임의의 아민 또는 티올-변경 화학을 이용하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 이작용성 링커는 숙시닐이다.
일부 구현예에서, 이작용성 링커는 접합된 화학적 모이어티와 단백질 사이에 2-10개 원자의 가장 긴 선형 경로를 정의하는 원자 쇄를 포함한다.
일부 구현예에서, 이작용성 링커는 다음으로부터 선택된 하나 이상의 기에 의해 선택적으로 개재된 C1-10알킬 또는 할로C1-10알킬일 수 있다: -O-, -NR-, -S-, -C(O)-, -C(O)O-, -C(O)NR-, -OC(O)-, -NRC(O)-, -OC(O)O-, -NRC(O)O-, -OC(O)NR-, -NRC(O)NR-, 여기서 R은 H 및 C1-4알킬로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 단백질(또는 접합된 화학적 모이어티)은 킬레이트 리간드, 즉 단백질에 연결된 킬레이트 리간드를 포함한다. 킬레이트 리간드는 당업계에 알려진 금속 이온을 킬레이트할 수 있는 임의의 적합한 킬레이터일 수 있다.
일부 구현예에서, 킬레이트 리간드는 방사성 핵종을 킬레이트할 수 있다. 적합한 킬레이트 리간드의 예에는 TMT(6,6"-비스[N,N'',N'''-테트라(카르복시메틸)아미노메틸)-4'-(3-아미노-4-메톡시페닐)-2,2':6',2''-테르피리딘 DOTA(1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-N,N',N'',N'''-테트라아세트산, 테트라세탄으로도 알려짐), TCMC(DOTA의 테트라-1차 아미드), DO3A(1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7-트리스(아세트산)-10-(2-티오에틸)아세트아미드), CB-DO2A(4,10-비스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자비시클로[5.5.2]테트라데칸), NOTA(1,4,7-트리아자시클로노난-트리아세트산) 디암사르(3,6,10,13,16,19-헥사아자비시클로[6.6.6]에이코산)-1,8-디아민), DTPA(펜테산 또는 디에틸렌트리아민펜타아세트산), CHX-A''-DTPA([(R)-2-아미노-3-(4-이소티오시아나토페닐)프로필]-트랜스-(S,S)-시클로헥산-1,2-디아민-펜타아세트산), EDTA(에틸렌디아민 테트라아세트산), TETA(1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸-1,4,8,11-테트라아세트산), Te2A(4,11-비스(카르복시메틸)-1,4,8,11-테트라아자비시클로[6.6.2]헥사데칸), HBED(N,N-비스(2-하이드록시벤질)에틸렌디아민-N,N-디아세트산), DFO(데스페리옥사민) 및 이의 유사체 또는 유도체, 예컨대 DFO* 및 DFOsq(DFO-스쿠아르아미드), HYNIC(6-히드라지노니코틴아미드) 및 HOPO(3,4,3-(LI-1,2-HOPO) 또는 본원에 설명된 다른 리간드, 또는 이의 유도체가 포함된다. 적합한 유도체에는 분자의 비배위 부분에 대한 변경이 포함되며, 작용 기 상호전환, 예컨대 카르복실 기 대신에 아미드의 존재를 포함될 수 있다.
일부 구현예에서, 킬레이트 리간드는 DFO 또는 이의 유사체이다. DFO 및 그의 유사체(DFO*, DFOsq, DFONCS, DFO*sq 및 DFO*NCS 포함)는 치료적, 진단적 및/또는 치료진단적 잠재성이 있는 원하는 핵종에 대한 선택적 킬레이트 리간드이다. 특히, DFO와 그의 유사체는 89Zr에 대한 선택적 킬레이터이다. 89Zr은 반감기가 3.3일까지 연장되는 베타 양성 방출체(av)(0.396MeV)이다. 89Zr은 양전자 방출 단층 촬영(PET) 이미징에 잠재적인 응용을 갖고 있으며, 단백질 접합체(예컨대 본 발명의 방법에 의해 생산된 것들)에 포함될 때 항체의 순환 반감기와 일치하는 확장된 3.3일의 반감기로 인해 면역학적 PET(면역 PET) 이미징에서 특히 흥미롭다. 면역 PET 이미징에서는, 적절한 항체에 접합된 방사성 핵종 착물의 사용을 통하여 종양 세포에서 종양 관련 항원의 발현을 기반으로 종양이 이미지화 된다.
일부 구현예에서, 킬레이트 리간드는 방사성 핵종을 킬레이트한다. 방사성 핵종은 바람직하게는 치료적 또는 진단적 잠재성이 있는 방사성 핵종이다. 적합한 동위원소의 예는 다음을 포함한다: 악티늄-225(225Ac), 아스타틴-211(211At), 비스무트-212 및 비스무트-213(212Bi, 213Bi), 구리-64 및 구리-67(64Cu, 67Cu), 갈륨-67 및 갈륨-68(67Ga and 68Ga), 인듐-111(111In), 요오드-123, -124, -125 또는 -131(123I, 124I, 125I, 131I) (123 I), 납-212 (212Pb), 루테튬-177 (177Lu), 라듐-223 (223Ra), 사마륨-153 (153Sm), 스칸듐-44 및 스칸듐-47 (44Sc, 47Sc), 스트론튬-90(90Sr), 테크네튬-99(99mTc), 이트륨-86 및 이트륨-90(86Y, 90Y), 지르코늄-89(89Zr).
특히 관심 있는 단백질 접합체의 한 부류는 예를 들어 PET, SPECT 또는 다른 적합한 이미징 기법에 의한 이미징을 돕기 위해 투여 후 단백질 모이어티가 대상체 내에서 접합체를 국소화할 수 있는 것들이다. 따라서, 일부 구현예에서, 단백질은 단백질 표적화제를 포함하거나 단백질 표적화제이다.
본원에 사용된 바와 같이, "단백질 표적화제"는 다음을 할 수 있는 임의의 단백질을 지칭한다:
1. 접합된 킬레이트 기와 안정한 접합(자유 형태 및 핵종, 예컨대 방사성 핵종을 킬레이트하는 경우 모두),
2. 취급 중 유해한 응집체 형성, 및
3. 투여 후 대상체 내에 국소화(예를 들어, 단백질 표적화제는 하나 이상의 기관, 소기관, 세포 유형 또는 수용체 유형에서 국소화될 수 있음).
단백질 표적화제는 특정 생물학적 표적에 결합할 수 있거나 특정 대사 활성을 발현할 수 있는 폴리펩티드, 단백질(예를 들어, 항체 및 그의 유도체, 예컨대 나노바디, 디아바디, 항체 단편)일 수 있다.
적합한 표적화제의 비제한적인 예에는 VEGF 수용체를 표적으로 하는 분자, 봄베신 유사체 또는 GRP 수용체 표적화 분자, 소마토스타틴 수용체를 표적으로 하는 분자, avp3 및 avP5를 표적으로 하는 RGD 펩티드 또는 분자, 세포자살 공정을 표적으로 하는 아넥신 V 또는 분자, 에스트로겐 수용체를 표적으로 하는 분자, 플라크를 표적으로 하는 생체분자, 전립선 특이 막 항원(PSMA)을 표적으로 하는 분자, 탄산 탈수효소(예컨대, 탄산 탈수효소 IX, CAIX)를 표적으로 하는 분자를 포함한다.
일부 구현예에서, 단백질은 나노바디, 디아바디, 항체 단편 등을 포함하는 항체 또는 이의 유도체를 포함하거나 항체 또는 이의 유도체이다.
임의의 구현예에서, 단백질은 탄산 탈수효소 IX(CAIX)에 결합하기 위한 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 특히 바람직한 항체는 cG250, 바람직하게는 본원에 GmAb로도 지칭되는 지렌툭시맙(INN)이다. 또 다른 특히 바람직한 구현예는 하이브리도마 세포주 DSM ACC 2526에 의해 생산된 단일클론 항체 G250이다. 항체 cG250은 본래 쥐과 단일클론 항체 cG250의 IgG1 카파 경쇄 키메라 버전이다. 그의 항원 결합 단편의 항체는 또한 지렌툭시맙의 인간화 형태일 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서, CAIX에 결합하기 위한 항체는 WO 2021/000017에 설명된 것이고, 그 내용은 본원에 참조로 포함된다.
임의의 구현예에서, 단백질은 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 예컨대 J591 또는 huJ591에 결합하기 위한 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 항체 J591은 Liu 외, Cancer Res 1997; 57: 3629-34에 설명되어 있다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 다음의 적어도 1개, 2개 및 바람직하게는 3개의 CDR을 가질 수 있다: 쥐과 J591의 중쇄 가변 영역(서열 번호 1, 2 및 3으로 정의되고 본원에 참조로 포함된 US20060088539의 도 1a에 묘사된 바와 같음); 및 쥐과 J591의 경쇄 가변 영역(본원에 참고로 포함된 US20060088539의 도 1b에 도시된 서열 번호 4, 5 및 6 참조). 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 US20060088539, 도 1a 및 1b에 설명된 바와 같이 J591 항체의 중가변 및 경쇄 또는 이의 임의의 변경된 형태를 가질 수 있다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 US20060088539, 도 2a 및 2b에 설명된 바와 같이 탈면역화된 J591 항체의 중가변 및 경쇄 또는 이의 임의의 변경된 형태를 가질 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서, PSMA에 결합하기 위한 항체는 WO 2021/000017에 설명된 것이며, 그 내용은 본원에 참조로 포함된다.
일부 구현예에서, 단백질은 CAIX 또는 PSMA를 표적화할 수 있는 항체 또는 이의 유도체이다. 일부 구현예에서, 단백질은 지렌툭시맙 및 HuJ591로부터 선택되며, 여기서 단백질은 선택적으로 킬레이트 리간드와 접합된다. 일부 구현예에서, 단백질은 지렌툭시맙(GmAb)을 포함하거나 지렌툭시맙(GmAb)이다. GmAb는 CAIX에 대한 단일클론 항체이다. 일부 구현예에서, 단백질은 HuJ591을 포함하거나 HuJ591이다. HuJ591은 PSMA의 단일클론 항체이다.
일부 구현예에서, 단백질은 폴리펩티드를 포함하거나 폴리펩티드이다. 폴리펩티드는 적어도 약 20개, 25개 또는 30개의 아미노산 잔기의 최소 서열을 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 최고 약 35개, 40개, 45개 또는 50개의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 예를 들어 약 20개 내지 약 50개의 아미노산 잔기를 포함하여 이들 최소값 중 임의의 값 내지 임의의 최대값의 아미노산 서열 길이를 포함할 수 있다. 펩티드의 응집은 전체가 본원에 참조로 포함된 Zapadka KL, Becher FJ, Gomes dos Santos AL, Jackson SE. 2017 Factors affecting the physical stability (Aggregation) of peptide therapeutics. Interface Focus 7: 20170030. http://dx.doi.org/10.1098/rsfs.2017.0030에서 검토되었다.
일부 구현예에서, 단백질은 천연 단백질을 포함하거나 천연 단백질이고 그 공급원으로부터 단리된다. 일부 구현예에서, 단백질은 합성 또는 반합성 잔기를 포함하거나, 단백질 자체가 합성 또는 반합성이다. 단백질(또는 단백질 접합체의 경우 단백질 모이어티)은 직접적인 아미노산 합성, 재조합 기술 및 원하는 단백질을 형성하기 위한 단편의 결찰을 포함하여 당업계에 알려진 임의의 수단에 의해 제조될 수 있다.
일부 구현예에서, 단백질 및 응집체를 포함하는 조성물은 바람직하지 않은 응집체가 형성되는 단백질 접합체(예를 들어, 단백질에 연결된 킬레이트 리간드의 접합체)를 제조하기 위한 공정으로부터 얻어진다. 이러한 공정의 한 예는 실시예에서 DFO-GmAb 접합체의 제조에 대해 설명되어 있다.
일부 구현예에서, 조성물은 이량체 단백질, 즉 단백질의 이량체를 추가로 포함한다.
하나 이상의 필터링 단계 전의 단백질을 포함하는 조성물(출발 조성물이라고도 지칭됨)은 단백질 농도 대비 또는 조성물 내 단백질 종의 전체 함량(예를 들어, 단백질, 응집체 및 존재하는 경우 이량체) 대비 적어도 약 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30% 초과 농도의 응칩체를 포함할 수 있다. 단백질을 포함하는 조성물은 이들 백분율 중 임의의 하나 내지 임의의 다른 백분율, 예를 들어 약 10% 내지 약 25% 또는 약 11% 내지 약 19%의 응집체를 포함할 수 있다. 단백질(또는 전체 단백질 종) 대비 응집체의 농도는 SEC-HPLC 및 단량체 단백질(및 존재하는 경우 다른 단백질 종)에 대한 피크 아래 면적에 비해 응집체 종에 기인하는 피크 아래 면적의 비교에 의해 결정될 수 있다.
하나 이상의 필터링 단계 전에 단백질을 포함하는 조성물은 응집체 대비 또는 조성물 내 단백질 종의 전체 함량(예를 들어, 단백질, 응집체 및 존재하는 경우 이량체) 대비 적어도 약 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90% 초과 농도의 단백질의 농도로 단백질을 포함할 수 있다. 단백질은 이들 백분율 중 임의의 하나 내지 임의의 다른 백분율, 예를 들어 약 80% 내지 약 90%의 농도로 존재할 수 있다. 단백질의 농도는, 예를 들어 SEC-HPLC 및 각각의 관련 피크에 대한 피크 아래 면적의 비교에 의해 응집체 종의 농도와 유사한 방식으로 결정될 수 있다.
하나 이상의 필터링 단계 전에 단백질을 포함하는 조성물은 이량체 단백질을 추가로 포함할 수 있다. 전형적으로 이량체는 약 15%, 12.5%, 10%, 8%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 미만 농도의 이량체 농도로 존재한다. 이량체는 이들 백분율 중 임의의 하나 내지 임의의 다른 백분율, 예를 들어 약 2% 내지 약 12.5% 또는 약 3% 내지 약 6%의 농도로 존재할 수 있다. 이량체의 농도는 응집체 종의 농도와 유사한 방식으로, 예를 들어 SEC-HPLC 및 각각의 관련 피크에 대한 피크 아래 면적의 비교에 의해 결정될 수 있다.
방법은 임의의 하나 이상의 필터링 단계 이전에, 조성물을 완충액 교환에 적용하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, 일부 구현예에서, 필터링 단계 중 임의의 하나 이상 이전에 완충액 교환을 적용하는 단계는 수행되지 않는다. 유리하게는, 단백질 응집체, 예컨대 크로마토그래피 수지를 제거하기 위해 전형적으로 사용되는 다른 기법과 달리, 본원에 설명된 셀룰로오스 아세테이트 막의 사용은 완충액 교환 단계를 요구하지 않다.
일부 구현예에서, 각각의 필터링 단계는 독립적으로 단백질 대비 또는 조성물 내 단백질 종의 전체 함량(예를 들어, 단백질, 응집체 및 존재하는 경우 이량체) 대비 약 25% 이하, 예를 들어 약 20%, 15%, 12.5%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.05%, 0.01%, 0.005%, 0.001%, 0.0005%, 0.0001% 미만의 응집체 농도로 조성물 내 응집체 합량을 저감시킨다. 응집체 함량은 이들 백분율 중 임의의 하나 내지 임의의 다른 백분율, 예를 들어 약 0.001 내지 약 15% 또는 약 0.1% 내지 약 5%로 독립적으로 저감될 수 있다. 일부 구현예에서, 각각의 필터링 단계는 독립적으로 조성물 내 응집체 함량을 약 5% 이하로 저감시킨다. 단백질(또는 전체 단백질 종) 대비 응집체의 농도는 SEC-HPLC 및 단량체 단백질(및 존재하는 경우 다른 단백질 종)에 대한 피크 아래 면적에 비해 응집체 종에 기인하는 피크 아래 면적의 비교에 의해 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은 단백질의 응집체를 출발 용액 내 존재하는 응집체의 중량을 기준으로 적어도 약 5wt%, 10wt%, 15wt%, 20wt%, 25wt%, 30wt%, 35wt%, 40wt% 45wt%, 50wt%, 60wt%, 70wt%, 80wt%, 90wt%, 95wt% 초과로 저감시킬 수 있다. 방법은 이들 백분율 중 임의의 백분율 내지 이들 백분율 중 임의의 다른 백분율로 응집체를 저감시킬 수 있으며, 예를 들어 방법은 출발 용액으로부터 응집체를 출발 용액 내 존재하는 응집체의 중량을 기준으로 약 5wt% 내지 약 95wt% 또는 약 10wt% 내지 약 40wt%만큼 저감 시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 각각의 필터링 단계는 조성물 내 응집체 함량을 셀룰로오스 아세테이트 막의 크기 대비 약 0.02mg/cm2 내지 약 0.15mg/cm2, 예를 들어 약 0.02mg/cm2, 약 0.03mg/cm2, 약 0.04mg/cm2, 약 0.05mg/cm2, 약 0.06mg/cm2, 약 0.07mg/cm2, 약 0.08mg/cm2, 약 0.09mg/cm2, 약 0.10mg/cm2, 약 0.11mg/cm2, 약 0.12mg/cm2, 약 0.13mg/cm2, 약 0.14mg/cm2 또는 약 0.15mg/cm2만큼 독립적으로 저감시킨다. 응집체 함량은 셀룰로오스 아세테이트 막의 크기 대비 이들 값 중 임의의 하나 내지 임의의 다른 값, 예를 들어 약 0.03mg/cm2 내지 약 0.13mg/cm2 또는 약 0.05mg/cm2 내지 약 0.10mg/cm2으로 독립적으로 저감될 수 있다.
일부 구현예에서, 각각의 필터링 단계는 조성물 내 응집체 함량을 평균적으로 셀룰로오스 아세테이트 막의 크기 대비 약 0.05mg/cm2 내지 약 0.10mg/cm2, 예를 들어 약 0.05mg/cm2, 0.06mg/cm2, 0.07mg/cm2, 0.08mg/cm2, 0.09mg/cm2 또는 0.10mg/cm2 만큼 독립적으로 저감시킨다. 응집체 함량은 셀룰로오스 아세테이트 막의 크기 대비 평균적으로 이들 값 중 임의의 하나 내지 임의의 다른 값, 예를 들어 약 0.06mg/cm2 내지 약 0.09mg/cm2로 독립적으로 저감될 수 있다.
일부 구현예에서, 셀룰로오스 아세테이트 막은 최고 약 80%의 상대 보유 시간(RRT)/cm2에서 약 0.05mg 응집체 내지 최고 약 80% RRT/cm2에서의 약 0.10mg 응집체, 예를 들어 최고 약 80% RRT/cm2에서의 약 0.05mg, 0.06mg, 0.07mg, 0.08mg, 0.09mg 또는 0.10mg 응집체의 평균 제거 효율(평균 결합 또는 필터링 용량으로도 지칭됨)을 갖고, 여기서 RRT는 단량체 단백질에 기인하는 SEC-HPLC 피크에 상대적이다(즉, 응집체 피크는 단량체 단백질 피크의 그것의 최고 약 80%의 대략적인 보유 시간을 갖는다). 평균 제거 효율은 이들 값 중 임의의 하나 내지 임의의 다른 값, 예를 들어 최고 약 80% RRT/cm2에서 약 0.06mg 응집체 내지 최고 약 80% RRT/cm2에서 약 0.09mg 응집체일 수 있다. RRT는 최고 약 80%의 임의의 값, 예를 들어 약 80%, 70%, 60%, 50%, 40% 또는 그 미만의 RRT일 수 있다. RRT는 이들 값 중 임의의 하나 내지 임의의 다른 값, 예를 들어 약 40% 내지 약 80%, 또는 약 60% 내지 약 80%일 수 있다. 일부 구현예에서, RRT는 약 70% RRT이다. 이량체 단백질 피크는 전형적으로 약 85%의 RRT를 갖는다는 것이 인지될 것이다.
또 다른 양태는 단백질을 정제하는 방법을 제공하고, 방법은 다음을 포함한다:
- 액체 담체 내 단백질 및 단백질의 응집체를 포함하는 조성물을 셀룰로오스 아세테이트 막에 통과시켜 단백질이 막을 통과하게 하면서 응집체의 적어도 일부를 막 상에 선택적으로 흡착시키는 단계를 포함하는 하나 이상의 필터링 단계에 적용하는 단계.
또한, 단백질을 정제하는 방법을 본원에 제공하며, 방법은 다음을 포함한다:
- 조성물을 셀룰로오스 아세테이트 막에 통과시키고, 이에 의해 응집체의 적어도 일부를 제거하는 단계를 포함하는 하나 이상의 필터링 단계에 액체 담체 내 단백질 및 단백질의 응집체를 포함하는 조성물을 적용하는 단계.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "정제하는"은 방법을 수행하기 전의 응집체 함량 대비 조성물 내 응집체 함량이 저감되는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
또 다른 양태는 본원에 설명된 방법에 의해 얻을 수 있거나 얻은 단백질(정제된 단백질이라고도 지칭됨)에 관한 것이다.
또 다른 양태는 본원에 설명된 방법에 의해 얻을 수 있거나 얻은 단백질(또는 정제된 단백질)을 포함하는 조성물을 제공한다.
본원에 설명된 방법에 의해 얻거나 얻을 수 있는 단백질을 포함하는 조성물(최종 또는 정제된 조성물이라고도 지칭됨)은 단백질 농도 대비 또는 조성물 내 단백질 종의 총 함량(예를 들어 단백질, 응집체 및 존재하는 경우 이량체) 대비 약 20%, 15%, 12.5%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.05%, 0.01%, 0.005%, 0.001%, 0.0005%, 0.0001% 미만의 농도 이하의 응집체를 포함할 수 있다. 단백질을 포함하는 조성물은 이들 백분율 중 임의의 것 내지 임의의 다른 백분율, 예를 들어 약 0.01% 내지 약 5%의 응집체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 약 5% 이하의 응집체 함량을 포함한다. 단백질(또는 전체 단백질 종) 대비 응집체의 농도는 SEC-HPLC 및 단량체 단백질(및 존재하는 경우 다른 단백질 종)에 대한 피크 아래 면적에 비해 응집체 종에 기인하는 피크 아래 면적의 비교에 의해 결정될 수 있다.
본원에 설명된 방법에 의해 얻거나 얻을 수 있는 조성물은 응집체 농도 대비 또는 조성물 내 단백질 종의 총 함량 대비(예를 들어, 단백질, 응집체 및 존재하는 경우 이량체) 적어도 90%, 예를 들어 적어도 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 농도로 단백질을 포함할 수 있다. 단백질은 이들 농도 중 임의의 농도 사이, 예를 들어 약 90% 내지 약 100% 또는 약 95% 내지 약 100%로 존재할 수 있다. 단백질의 농도는 예를 들어 SEC-HPLC 및 각각의 관련 피크에 대한 피크 아래 면적의 비교에 의해 응집체 종의 농도와 유사한 방식으로 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 설명된 방법에 의해 얻어지거나 얻을 수 있는 조성물은 이량체 단백질을 추가로 포함할 수 있다. 전형적으로 이량체는 약 1.5%, 1.4%, 1.3%, 1.2%, 1.1%, 1%, 0.9%, 0.8% 또는 0.7% 이하의 농도로 존재한다. 이량체는 이들 농도 중 임의의 농도 사이, 예를 들어 약 0.7% 내지 약 1%로 존재할 수 있다. 이량체의 농도는 응집체 종의 농도와 유사한 방식, 예를 들어 SEC-HPLC 및 각각의 관련 피크에 대한 피크 아래 면적의 비교에 의해 결정될 수 있다.
단백질을 포함하는 조성물은 전형적으로 액체 담체를 포함한다. 액체 담체는 본원에 설명된 임의의 액체 담체일 수 있다. 일부 구현예에서, 액체 담체는 수용액, 예를 들어 소듐 클로라이드 용액 또는 완충 용액이다. 바람직한 구현예에서, 액체 담체는 완충 용액, 예컨대 본원에 설명된 것들을 포함한다.
또 다른 양태는 단백질과 연결된 킬레이트 리간드의 접합체를 제조하기 위한 공정에 관한 것이며, 공정은 다음을 포함한다:
- 단백질의 응집체 형성을 유도하는 조건 하에서, 단백질과 연결된 금속에 착물화된 킬레이트 리간드를 포함하는 금속 착물화된 접합체로부터 금속을 제거하고, 이에 의해 킬레이트된 금속 이온 및 응집체가 실질적으로 없는 단백질과 연결된 킬레이트 리간드의 접합체의 조성물을 제공하는 단계; 및
- 조성물을 셀룰로오스 아세테이트 막에 통과시키는 단계를 포함하는 하나 이상의 필터링 단계에 조성물을 적용하여 단백질과 연결된 킬레이트 리간드의 접합체가 막을 통과하게 하면서 응집체의 적어도 일부를 막 상에 선택적으로 흡착시키고/흡착시키거나 이에 의해 조성물로부터 응집체의 적어도 일부를 제거하는 단계.
단백질 및 킬레이트 리간드는 본원에 설명된 것들 중 임의의 것일 수 있다.
일 구현예에서, 공정은 단백질과 연결된 데스페리옥사민 킬레이트 리간드의 접합체를 제조하기 위한 것이며, 공정은 다음을 포함한다:
- 단백질의 응집체 형성을 유도하는 조건 하에서, 단백질과 연결된 철과 착물화된 데스페리옥사민 킬레이트 리간드를 포함하는 철 착물화된 접합체로부터 철을 제거하고, 이에 의해 킬레이트된 철 및 응집체가 실질적으로 없는 단백질과 연결된 데스페리옥사민 킬레이트 리간드의 접합체를 포함하는 조성물을 제공하는 단계; 및
- 조성물을 셀룰로오스 아세테이트 막에 통과시키는 단계를 포함하는 하나 이상의 필터링 단계에 조성물을 적용하여 단백질과 연결된 데스페리옥사민 킬레이트 리간드의 접합체가 막을 통과하게 하면서 응집체의 적어도 일부를 막 상에 선택적으로 흡착시키고/흡착시키거나 이에 의해 조성물로부터 응집체의 적어도 일부를 제거하는 단계.
하나 이상의 필터링 단계는 본원에 설명된 바와 같이 각각의 필터링 단계 전의 응집체 함량 대비 응집체 함량이 저감된 조성물을 독립적으로 제공한다. 일부 구현예에서, 공정은 이들 필터링 단계 중 2개 이상, 예를 들어 2개, 3개, 4개, 5개 이상의 필터링 단계를 포함한다.
공정은 단백질과 연결된 금속에 착물화된 킬레이트 리간드를 포함하는 금속 착물화된 접합체를 형성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 형성 단계는 금속 이온에 착물화된 킬레이트 리간드를 단백질과 커플링시키는 단계를 포함할 수 있다. 이 단계는 당업계에 알려진 임의의 알려진 접합 기법에 의해 실행될 수 있다. 금속 킬레이트된 킬레이트 리간드는 단백질과 직접 연결될 수 있거나, 이들 모이어티는 본원에 설명된 바와 같이 연결 기를 통해 연결될 수 있다.
공정은 예를 들어 TFF 시스템을 사용하여 조성물을 한외여과 및 희석여과(UFDF)에 적용하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이들 구현예에서, 하나 이상의 필터링 단계 각각은 UFDF 이전, UFDF 이후, 또는 둘 모두 독립적으로 수행될 수 있다(이 경우 공정은 필터링 단계 중 2개 또는 2개 이상을 포함한다). 따라서, 일부 구현예에서, 하나 이상의 필터링 단계 중 적어도 하나는 조성물을 UFDF에 적용하기 전에 수행된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 일부 구현예에서, 하나 이상의 필터링 단계 중 적어도 하나는 조성물을 UFDF에 적용한 후에 수행된다. 바람직한 구현예에서, 공정은 2개(또는 2개 이상)의 필터링 단계를 포함하고, 필터링 단계 중 적어도 하나는 조성물을 UFDF에 적용하기 전에 수행되고, 하나 이상의 필터링 단계 중 적어도 다른 하나는 조성물을 UFDF에 적용한 후에 수행된다.
따라서, 일부 구현예에서, 공정은 다음을 포함한다:
- 단백질의 응집체 형성을 유도하는 조건 하에서, 단백질과 연결된 철과 착물화된 데스페리옥사민 킬레이트 리간드를 포함하는 철 착물화된 접합체로부터 철을 제거하고, 이에 의해 킬레이트된 철 및 응집체가 실질적으로 없는 단백질과 연결된 데스페리옥사민 킬레이트 리간드의 접합체를 포함하는 조성물을 제공하는 단계;
- 조성물을 셀룰로오스 아세테이트 막에 통과시키는 단계를 포함하는 제1 필터링 단계에 조성물을 적용하여 단백질과 연결된 데스페리옥사민 킬레이트 리간드의 접합체가 막을 통과하게 하면서 응집체의 적어도 일부를 막 상에 선택적으로 흡착시키고/흡착시키거나 이에 의해 조성물로부터 응집체의 적어도 일부를 제거하는 단계;
- 조성물을 한외여과 및 희석여과에 적용하는 단계; 및
- 조성물을 셀룰로오스 아세테이트 막에 통과시키는 단계를 포함하는 제2 필터링 단계에 조성물을 적용하여 단백질과 연결된 데스페리옥사민 킬레이트 리간드의 접합체가 막을 통과하게 하면서 응집체의 적어도 일부를 막 상에 선택적으로 흡착시키고/흡착시키거나 이에 의해 조성물로부터 응집체의 적어도 일부를 제거하는 단계.
이들 공정에서 UFDF에 적용된 조성물은 제1 필터링 단계의 여과물이고, 제2 필터링 단계에 적용된 조성물은 UFDF의 여과물이다.
단백질과 연결된 데스페리옥사민 킬레이트 리간드의 접합체는 벌크 약물 물질(BDS)로 제조될 수 있다. 전형적으로, BDS를 제조하는 최종 단계는 멸균 등급 여과, 제형화 및 충전을 수반한다. 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 필터링 단계는 최종 멸균 등급 여과 단계 이전에 수행된다. 다른 방식으로 설명하면, 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 필터링 단계는 공정에서 중간 정제 단계이다.
또 다른 양태는 본원에 설명된 공정에 의해 얻을 수 있거나 얻은 단백질과 연결된 킬레이트 리간드의 접합체 (단백질과 연결된 킬레이트 리간드의 정제된 접합체라고도 지칭됨)에 관한 것이다.
또 다른 양태는 본원에 설명된 공정에 의해 얻을 수 있거나 얻은 단백질과 연결된 킬레이트 리간드의 접합체(또는 단백질과 연결된 킬레이트 리간드의 정제된 접합체)를 포함하는 제형을 제공한다.
또한, 단백질, 단백질의 응집체 및 액체 담체를 포함하는 조성물로부터 단백질의 응집체를 제거하기 위한 셀룰로오스 아세테이트 막이 본원에 제공된다.
단백질, 단백질의 응집체 및 액체 담체를 포함하는 조성물로부터 단백질의 응집체를 제거하는 용도를 위한 셀룰로오스 아세테이트 막이 본원에 추가로 제공된다.
단백질, 단백질의 응집체 및 액체 담체를 포함하는 조성물로부터 단백질의 응집체를 제거하기 위해 사용되는 경우 셀룰로오스 아세테이트 막이 본원에 추가로 제공된다.
단백질, 단백질의 응집체 및 액체 담체를 포함하는 조성물로부터 단백질의 응집체를 제거하기 위한 셀룰로오스 아세테이트 막의 용도가 본원에 추가로 제공된다.
또한 단백질, 단백질의 응집체 및 액체 담체를 포함하는 조성물로부터 단백질의 응집체를 선택적으로 흡착하기 위한 셀룰로오스 아세테이트 막이 본원에서 제공된다.
단백질, 단백질의 응집체 및 액체 담체를 포함하는 조성물로부터 단백질의 응집체를 선택적으로 흡착하는 용도를 위한 셀룰로오스 아세테이트 막이 본원에 추가로 제공된다.
단백질, 단백질의 응집체 및 액체 담체를 포함하는 조성물로부터 단백질의 응집체를 선택적으로 흡착하기 위해 사용되는 경우 셀룰로오스 아세테이트 막이 본원에 추가로 제공된다.
단백질, 단백질의 응집체 및 액체 담체를 포함하는 조성물로부터 단백질의 응집체를 선택적으로 흡착하기 위한 셀룰로오스 아세테이트 막의 용도가 본원에 추가로 제공된다.
이들 셀룰로오스 아세테이트 막은 본원에 설명된 셀룰로오스 아세테이트 막 중 임의의 하나 이상의 특성을 가질 수 있다.
이들 셀룰로오스 아세테이트 막은 본원에 설명된 공정의 임의의 양태 또는 구현예를 위한, 이에서의 용도를 위한 것일 수 있고/있거나 이를 위해 사용될 경우 일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 설명된 셀룰로오스 아세테이트 막은 유동 방법 또는 공정에 사용된다. 일부 구현예에서, 셀룰로오스 아세테이트 막은 조성물로부터 미립자 물질 및/또는 바이오버든의 제거를 위해 사용되지 않는다.
본 발명은 다음 장점 중 하나 이상을 제공할 수 있다:
● 방법은 응집체 함량을 허용 가능한 품질 수준으로 유리하게 저감시킨다.
● 방법은 높은(>85%-95%) 단백질 단량체 회수를 유리하게 가능하게 한다.
● 방법은 유리하게 확장 가능하다.
● 방법은 대규모(그램 규모) 산업 공정에 응용될 수 있다.
● 방법은 자동화될 수 있다.
본 명세서에 개시되고 정의된 발명은 언급되거나 본문 또는 도면으로부터 명백한 개별 특성 중 2개 이상의 모든 대안적인 조합으로 확장된다는 것이 이해될 것이다. 이들 상이한 조합 모두는 본 발명의 다양한 대안적인 양태를 구성한다.
실시예
본 발명은 비제한적인 실시예를 통해 추가로 설명될 것이다. 본 발명의 기술분야의 당업자는 본 발명의 사상 및 범위로부터 벗어남 없이 많은 변경이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.
실시예 1. 필터 평가 - 소규모
필터 막 재료가 샘플로부터 HMW 응집체를 필터링할 수 있는지 평가하기 위해, 두 가지 상이한 필터 유형을 테스트하고 분석 전에 샘플을 필터링하지 않았을 때 얻은 결과와 비교하였다. 다양한 상이한 로트의 GmAb-DFO 샘플을 90%:10% 샘플:희석제로 희석하였다. 최소 250μL의 각 샘플 유형이 각 필터 막을 통과하였다.
다음 필터를 평가하였다:
셀룰로오스 아세테이트 막이 있는 필터, 기공 크기 0.2μm(Millipore Sigma, 제품 번호 CLS8161-100EA)
폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 막이 있는 필터, 기공 크기 0.2μm
Yarra SEC-300(3μm, 290Å, 7.8 x 300mm) SEC-HPLC 컬럼이 장착된 Agilent 1200 시리즈 HPLC 시스템을 사용하여 SEC-HPLC로 샘플을 평가하였다. 각 단백질 종의 면적을 검출된 전체 면적과 비교하여 데이터를 분석하였다.
결과는 표 1에 제공된다. 결과는 셀룰로오스 아세테이트 막으로 샘플을 필터링하는 것이 필터링되지 않은 샘플과 PVDF 필터로 필터링된 샘플 모두에 비해 여과물에서 더 낮은 백분율의 고분자량 응집체 종(%HMW)과 더 높은 백분율의 단량체 단백질을 제공하였다는 것을 보여준다. 이 결과는 셀룰로오스 아세테이트 막의 독특한 화학적 성질이 단량체 단백질보다 응집체의 선택적 제거를 초래한다는 것을 시사한다. 이는 셀룰로오스 아세테이트 필터가 착물 단백질 샘플에서 단백질 응집체를 제거하는 데 유용할 수 있다는 암시를 제공한다.
표 1. 필터 평가
비교를 위해, 응집체 제거에 전형적으로 사용되는 다른 기법, 즉 크로마토그래피 수지 Eshmuno HCX, Toyopearl 헥실, Toyopearl NH2-750F, POROS 50 HS 및 Capto Adhere, Sartobind 페닐 막 및 암모늄 술페이트 분할이 또한 평가되었다. 표 2는 기법과 그들 각각의 완충액을 기술한다. 샘플을 지시된 완충액으로 교환하였다. 각각의 수지에 로딩하기 전에 샘플을 280nm(A280)에서의 흡광도 및 SEC-HPLC로 분석하였다. 그런 다음 샘플을 사전 평형화된 각 수지 또는 막에 로드하고 주변 온도에서 인큐베이션하였다. 수지와 막을 세척하고 유동을 수집하였다. 그런 다음 유동을 A280 및 SEC-HPLC로 분석하여 %단량체 회수 및 %%HMW 응집체 제거를 결정하였다.
표 2. 응집체 제거를 위한 다른 기법의 평가
결과는 표 2에 제공된다. 일반적으로 다양한 기법은 낮은 응집체 제거와 함께 높은 단량체 회수를 나타낸다. 일부 기법은 또한 이량체 단백질의 유의미한 증가를 나타낸다. 암모늄 술페이트 분별은 양호한 결과를 나타내었지만, 이 기법은 1M 암모늄 술페이트의 첨가를 요하며 이는 허용되지 않는 것으로 간주될 수 있으며 공정 위험일 수 있다. Sartobind 페닐 막은 양호한 단량체 회수와 높은 응집 제거를 나타내지만 이량체에서 유의미한 증가가 있었다. 이와 다른 크로마토그래피 수지의 또 다른 단점은 샘플을 "크로마토그래피" 완충액에 넣기 위해 추가적인 완충액 교환 단계가 필요하다는 것이다. 크로마토그래피 수지는 단백질 조성물로부터 HMW 응집체를 결합하고 제거할 수 있도록 정확한 조건을 요하는데, 즉, 완충액 교환 단계를 필요로 하는 작동 완충 조건의 좁은 윈도우를 갖는다. 추가적인 단계는 공정 시간과 재료 손실 또한 더한다(낮은 수율).
실시예 2. 셀룰로오스 아세테이트 필터 평가 - 대규모
셀룰로오스 아세테이트 필터(Cellulose Acetate 0.2μm 필터 Sartobran, Sartorius, Cat:11107--25------N)는 항체와 데스페리옥사민(DFO)의 접합체를 제조하기 위한 공정 동안 생산된 응집체, 즉 지렌툭시맙-N-숙시닐데스페리옥사민(GmAb-DFO)을 제거하기 위하여 평가하였다. GmAb-DFO를 제조하기 위한 전형적인 공정의 한 예는 다음 단계를 수반한다: N-숙시닐데스페랄: Fe(III) 테트라플루오로페닐 에스테르, (TFP-N-sucDf-Fe, syn: DFOTFP)를 항체 표면에 노출된 무작위 라이신 잔기의 아미드화를 통해 키메라 지렌툭시맙(GmAb)에 접합시켰다. 온화한 온도(35℃) 및 pH 4.4에서 과량의 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 사용한 트랜스킬레이트에 의해 킬레이트된 철을 제거하였다. 미반응 링커 및 다른 소분자는 TFF에 의해 제거되어 접합된 GmAb-DFO를 초래하였다. 이들 절차적 단계는 고분자량 응집체 종의 형성을 유도하였다.
결합 용량 연구
샘플 준비
표 3은 연구를 위해 제조된 샘플을 간략하게 설명한다. 샘플은 0.2μm 셀룰로오스 아세테이트 필터에 로딩하기 전에 투명하고 미립자 물질이 없었다. 4개의 상이한 제작 로트의 GmAb-DFO 재료를 평가하였다: 로트 #1; 로트 #2; 로트 #3; 로트 #4. 각 로트의 재료를 해동하고 총 4개의 초기 샘플에 대해 배치별로 별도로 모았고, 각 실험 실행 전에 폴리에테르술폰(PES) 막(Acrodisc)에 의해 0.2μm 필터링하였다. 로트 #3과 로트 #4의 1:1 혼합물을 제조하고 균질화하여 중간점 샘플을 제조하였다. 결합 용량 연구를 위해 선택된 수준이 표 3에 나와있다.
표 3. 샘플 제조
사전 TFF 샘플
사전 TFF 샘플을 생성하기 위해, GmAb-DFO 재료(로트 #1 및 로트 #2)를 사전 TFF 샘플 완충액으로 완충액 교환하였다. GmAb 출발 재료 대신 PBS pH 7.1을 사용하여 블랭크 접합 실행을 수행하여 사전 TFF 샘플 완충액을 제조하였다. 가열 단계는 사전 TFF 샘플 완충액 생성에 포함되지 않았는데, 단계가 완충액 구성에 영향을 주지 않기 때문이다. PBS를 pH 9.6으로 조정한 다음, 용액을 3:1의 몰비로 링커와 조합하고 실온에서 부드러운 혼합 하에 30분 동안 유지하였다. 그런 다음, 산을 사용하여 용기의 pH를 pH 4.4로 만들었다. 최종 단계로, EDTA 디소듐을 첨가하고 완충액을 인큐베이션하여 최종 pH를 7.0으로 조정하였다.
샘플 완충액 교환을 PD-10 탈염 컬럼을 사용하여 수행하였다. 완충액 교환은 다음의 표준 절차를 사용하여 이루어졌다. 용출 단계에서는, 각 샘플을 수집하기 위해 용기를 컬럼 아래에 배치하였다. 각 샘플의 용출은 3.5mL의 사전 TFF 샘플 완충액을 사용하여 수행하고 수집하였다.
결합 용량 실험 절차
표 3의 샘플을 0.2μm 셀룰로오스 아세테이트 필터를 사용하여 필터링하였다. 유동 재료의 특성화는 SEC-HPLC 및 A280에 의해 수행되었다. 각 유동 재료로부터 2개의 부분 표본을 채취하였다. 제1 부분 표본은 특성화를 위해 2-8℃에 저장하였고, 제2 부분 표본은 -80℃ 냉동고에 24시간 동안 배치한 다음 추가 특성화 때까지 -20℃ 냉동고로 옮겼다.
결합 용량 실험 동안 다음의 프로토콜이 실행되었다. 단백질 용액 모음은 샘플 제조 섹션에 설명된 절차에 따라 제조되었다. 로트 #1, 로트 #4 및 로트 #3/로트 #4 혼합물의 해당 부피를 추가 특성화를 위해 필터링된 단백질 용액을 수집하는 Sartorious 0.2μm 필터(Cat: 11107--25------N)에 통과시켰다. 셀룰로오스 아세테이트 필터를 PBS pH 7.1로 미리 습윤시키고 샘플을 통과시킨 다음 필터를 PBS pH 7.1(1.5 X 시스템 필터 보존 부피, 공기 퍼지 없이 시스템 및 필터에 보유된 부피)을 흘려 결합되지 않은 종의 완전한 회수가 이루어지도록 하였다.
결합 용량 연구 결과
사전 TFF 여과 단계
%HMW 및 이량체 저감
사전 TFF 샘플에 대한 유동 재료의 SEC-HPLC 및 A280 특성화가 표 4에 나타나 있다. 70% RRT에서의 HMW 및 이량체에 대한 퍼센트 저감은 SEC-HPLC HMW 응집체 및 이량체 데이터를 기반으로 한 백분율 저감으로 정규화되었다. 표 4에서, 로딩 용량은 70% RRT/cm2에서 mg의 GmAb-DFO/m2 내지 mg의 HMW로 변환되었는데, 이는 이것이 셀룰로오스 아세테이트 막과 상호작용하는 주요 종이기 때문이고, 여기서 70% RRT는 HMW 응집체 피크가 단량체 피크의 그것의 대략 70%의 보유 시간을 갖는다는 것을 의미한다.
표 4. 사전 TFF 샘플에 대한 HMW 및 이량체 저감 결과
표 4에 보여진 바와 같이, 상이한 배치의 샘플 사이에 70% RRT에서의 HMW의 저감에서 차이가 관찰되었으며, 이는 주로 공급 조성(즉, 샘플 조성, 샘플 농도, HMW 응집체 함량)의 차이로 인함이었다. 로트 #1 샘플에 대한 70% RRT에서의 HMW 저감은 70% RRT/cm2에서의 HMW 0.185와 0.488mg 사이의 로딩 조건에 대하여 10.8% 내지 17.6% 범위였다. 로트 #2 재료의 경우, 70% RRT/cm2에서 HMW 0.078과 0.214mg 사이의 로딩 용량에 대해 12.8% 내지 30.6% 범위로 70% RRT에서의 더 높은 HMW 저감이 관찰되었다.
관찰된 차이에도 불구하고, 70 % RRT/cm2에서의 유사한 양의 HMW가 막에 로딩되었을 때 로트 #1과 로트 #2 샘플 모두에서 70% RRT에서의 %HMW에 있어 비교할만한 저감이 관찰되었다(즉, 70% RRT(로트 #1)/cm2의 0.185mg HMW 및 70% RRT(로트 #2)/cm2의 0.177mg HMW에 대해 70% RRT에서의 HMW 13% 저감이 관찰되었다).
로트 #2 샘플에 대해 70% RRT/cm2에서 0.078mg HMW의 로딩 용량을 사용하여 수행된 실험에 대하여 70% RRT에서 HMW의 가장 높은 퍼센트 저감이 관찰되었고, 이는 70% RRT에서의 31% HMW의 저감을 초래하였다.
연구된 모든 조건에 걸쳐 이량체 함량에서 유의미한 차이는 관찰되지 않았다. 사전 및 사후 여과 샘플 사이에서 관찰된 이량체에서의 차이는 셀룰로오스 아세테이트 필터에 의한 HMW 응집체의 제거로 인해 이 종의 약간의 농축으로 인한 것일 수 있다.
전체 회수 및 단량체 회수
표 5는 평가된 각 사전 TFF 조건에 대해 얻은 전체 회수와 단량체 회수를 간략하게 설명한다. 단량체 퍼센트 회수를 SEC-HPLC 단량체 판독의 순도 결과를 사용하여 사전 여과 및 사후 여과에서 얻은 단량체의 mg을 기준으로 계산하였다.
표 5. 사전 TFF 샘플의 회수 결과
셀룰로오스 아세테이트 여과에 대해 평가된 각 로딩 조건 사이에는 단량체 회수의 측면에서 유의미한 차이가 관찰되지 않았다. 퍼센트 회수는 87.73% 내지 94.45% 범위였으며, 단량체 % 회수는 90.15% 내지 95.54% 범위였다. 평가된 모든 로드 조건에 대해 높은 단량체 회수가 관찰되었으며, 이는 단량체 GmAb-DFO가 임의의 유의미한 수준에서 셀룰로오스 아세테이트 막에 결합하지 않았음을 암시한다. 이는 셀룰로오스 아세테이트 막 여과와 연관된 손실이 작업대 규모 필터의 시스템 보존 부피(공기 퍼지 없이 시스템 및 필터에 보유되는 부피)와 관련될 수 있다는 암시를 제공할 수 있다.
결합 용량 결과
본 연구에 사용된 셀룰로오스 아세테이트 막의 70% RRT에서 HMW에 대한 전체 결합 용량은 배치 방식으로 측정되었으며 평가된 공급 및 완충 조건 하에서 막에 결합된 70% RRT에서 HMW의 최대량으로 지칭되었다. 전체 결합 용량의 크기는 막에 로딩된 공급 조건에 따라 달라질 수 있다.
표 6은 사전 TFF 여과 조건에 대한 셀룰로오스 아세테이트 필터의 결합 용량 결과를 나타낸다.
표 6. 사전 TFF 샘플의 결합 용량 결과
70% RRT에서의 HMW에 대해 연구된 로딩 용량은 70% RRT/cm2에서의 0.078mg과 0.488mg HMW 사이였다. 표 6의 데이터는 연구된 상이한 공급 재료 사이의 약간의 변동성을 보여준다. 70% RRT/cm2에서 대략 0.488mg의 HMW가 로딩되었을 때 0.134mg HMW 70% RRT/cm2의 결합 용량으로 로트 #1 샘플에서 가장 높은 결합 용량이 관찰되었다. 결합 용량의 증분은 셀룰로오스 아세테이트 필터에 로딩된 로트 #1 및 로트 #2 샘플 모두에서 관찰되었으며, 로딩된 70% RRT에서의 HMW의 증가가 관찰되었다. 결합 용량 데이터는 셀룰로오스 아세테이트 막에 결합된 70% RRT에서의 전체 HMW에 대한 경향을 보여주며, 이는 70% RRT 로드에서 HMW의 증분적 증가에 따라 증가하였다. 평가된 로딩 조건은 막 포화 용량에 도달하지 않았다는 암시를 제공한다.
셀룰로오스 아세테이트 막에 결합된 70% RRT에서의 HMW의 평균 mg을 계산하여 사전 TFF 조건 하에서 HMW 응집체에 대한 결합 용량을 예상하였다. 사전 TFF 재료에 대한 실험적 데이터로부터의 평균 결합 용량은 70% RRT/cm2에서 0.0605mg HMW였다. 이 평균 결합 용량은 사전 TFF 완충 조건에서 GMP 배치에 대한 필터 요구를 예상하는 데 사용되었다. 도 1은 선형성을 가정하여 계산된 평균 결합 용량을 기반으로 다양한 사용 가능한 셀룰로오스 아세테이트 필터 크기에 대한 예상 결합 용량을 예시하는 그래프이다. 일부 작동 매개변수(예를 들어, 배압, 액체 흐름 경로, 흐름 속도, 공급 번동성)는 실험실 규모에서 공정 규모로 확장할 때 막 결합 용량에 영향을 미칠 수 있다는 것이 주목된다.
사후 TFF 여과 단계
%HMW 및 이량체 저감
사후 TFF(즉, 제형 완충액; 0.9% NaCl 용액) 샘플에 대한 유동 재료의 SEC-HPLC 및 A280 특성화를 표 7에 나타내었다. 70% RRT 및 이량체에서의 HMW 퍼센트 저감은 SEC-HPLC HMW 응집체 및 이량체 데이터를 기반으로 한 백분율 저감으로 정규화되었다. 로딩 용량은 70% RRT/cm2에서 HMW의 mg으로 제공된다.
표 7. 사후 TFF 샘플에 대한 HMW 및 이량체 저감 결과
상이한 배치의 샘플 사이의 70% RRT에서 HMW 저감의 차이가 관찰되었으며, 이는 공급 조성(즉, 샘플 조성, 샘플 농도 및 HMW 응집체 함량)에서의 차이로 인한 것일 수 있다. 로트 #1 샘플에 대한 70% RRT에서의 HMW 저감은 70% RRT/cm2에서 0.224와 0.551mg 사이의 HMW 로딩 속도에 대해 7.4% 내지 23.4% 범위였다. 로트 #4 샘플의 경우, 70% RRT/cm2에서의 0.113와 0.296mg 사이의 HMW 로딩 속도에 대해 27.8% 내지 69.8% 범위로 70% RRT에서 HMW의 더 높은 저감이 관찰되었다. 로트 #3/로트 #4 1:1 혼합물 샘플의 경우, 70% RRT/cm2에서 0.204mg의 HMW를 막에 로딩했을 때 35%의 저감이 관찰되었다. 비슷한 양을 로딩하였을때 70% RRT에서 HMW의 23%-35% 저감이 관찰되었다. 로트 #4 샘플에 대해 70% RRT/cm2에서 0.113mg HMW의 로딩 속도로 수행된 실험에 대해 70% RRT에서 HMW의 가장 높은 저감이 관찰되었으며, 이는 70% RRT에서 HMW의 70% 저감을 초래하였다.
연구된 조건 전체에서 이량체 함량에 있어 유의미한 차이는 관찰되지 않았다. 사전 및 사후 여과 샘플 사이에 관찰된 이량체에 있어서의 차이는 셀룰로오스 아세테이트 필터에 의한 HMW 응집체 제거로 인해 이 종의 약간의 농축으로 인한 것일 수 있다.
회수
표 8은 평가된 각 사후 TFF 조건에 대해 얻은 생성물 회수 및 단량체 회수를 간략하게 설명한다. 단량체 회수를 SEC-HPLC 데이터로부터의 순도 값을 사용하여 사전 여과 및 사후 여과에서 얻은 단량체의 mg을 기준으로 계산하였다.
표 8. 사후 TFF 샘플에 대한 회수 결과
셀룰로오스 아세테이트 필터에 대해 평가된 각 로딩 조건 사이의 단량체 회수의 측면에서 유의미한 차이는 관찰되지 않았다. 전체 퍼센트 회수는 87.81% 내지 94.25% 범위였고; 샘플을 함유하는 HMW 응집체에서 HMW 응집체의 제거로 인하여 전체 회수가 낮아질 것으로 추측된다. 단량체 회수는 94.15% 내지 98.67% 범위였다. 평가된 모든 로드 조건과 재료에 대해 높은 단량체 회수가 관찰되었다. 회수 손실은 셀룰로오스 아세테이트 필터를 통과한 사후 TFF 샘플에 대한 벤치 규모의 시스템 보존 부피(공기 퍼지 없이 시스템 및 필터에 보유되는 부피)로 인한 것일 수 있다. 단량체의 유의미한 손실은 관찰되지 않았으며, 이는 단량체와 셀룰로오스 아세테이트 막 사이에 유의미한 상호작용이 없음을 암시한다. 이들 결과에 기반하여, 공정 규모에 대한 셀룰로오스 아세테이트 여과 단계를 위한 흘림을 최적화하는 것이 그러므로 유익할 수 있다.
결합 용량 결과
셀룰로오스 아세테이트 막에 대한 전체 HMW 응집체 결합 용량은 배치 방식에서 예상되었으며 평가된 공급 및 완충 조건 하에서 막 매질에 결합할 수 있는 70% RRT에서 HMW의 최대량으로 고려된다.
표 9는 사후 TFF 여과 조건에 대한 셀룰로오스 아세테이트 필터의 결합 용량 결과를 나타낸다.
표 9. 사후 TFF 샘플에 대한 결합 용량 결과
HMW 응집체에 대해 관찰된 로딩 용량은 70% RRT/cm2에서 0.113mg과 0.551mg HMW 사이였다. 로트 #1 재료에 대한 표 9의 데이터는 이 샘플에 대해 연구된 조건 하에 70% RRT/cm2에서 약 0.085mg의 HMW 필터 포화를 암시할 수 있다. 그러나, 로트 #4 샘플의 경우, 70% RRT/cm2에서 0.121mg의 HMW의 더 높은 결합 용량이 관찰되었다. 이는 막의 포화점이 공급 재료에 따라 달라질 수 있다는 암시를 제공할 수 있다. 로트 #4 샘플에 대해 평가된 로딩 조건은 막 포화 용량에 도달하지 않았다는 암시를 제공한다.
막에 결합된 70% RRT의 HMW의 평균 mg을 계산하여 이전 GMP 경험을 기반으로 공정 규모에서의 용도에 적합한 필터 크기를 예상하는 관점에서 사후 TFF 조건에 대한 필터의 결합 용량을 예상하였다. 사후 TFF 재료에 대한 실험적 데이터로부터의 평균 결합 용량은 70% RRT/cm2에서 0.0849mg HMW였다. 도 2는 선형성을 가정하여 계산된 평균 결합 용량을 기반으로 다양한 사용 가능한 셀룰로오스 아세테이트 필터 크기에 대한 예상 결합 용량을 예시하는 그래프이다. 일부 작동 매개변수(예를 들어, 배압, 액체 흐름 경로, 흐름 속도, 공급 변동성)는 실험실 규모에서 공정 규모로 확장할 때 막 결합 용량에 영향을 미칠 수 있음이 주목된다.
특성화
샘플을 Nanodrop 장비를 사용하여 SEC-HPLC 및 A280으로 특성화하였다. 각 샘플의 부분 표본을 -80℃ 냉동고에 24시간 동안 배치한 후 필요한 경우 추가 특성화 때까지 -20℃ 냉동고로 옮겼다.
A280
샘플의 농도를 280nm에서의 흡광도에 의해 결정하였다. 소 혈청 알부민(BSA) 표준을 사용하여 Nanodrop에서 시스템 적합성 측정을 수행하였다. 시스템 적합성 측정은 각 실행의 시작과 끝에서 0.95-1.05mg/mL 범위 내의 BSA 농도의 모든 허용 기준을 통과하여 NanoDrop 장치가 적합하게 수행하고 있음을 확인하였다. PBS 완충액, pH 7.1을 사용하여 Nanodrop을 블랭킹하였다. GmAb-DFO 샘플의 농도를 1.35(mg/mL)-1cm-1의 흡광 계수와 다음 방정식(1)을 사용하여 계산하였다.
표 10은 A280에 의한 단백질 농도의 결과를 간략하게 설명한다.
표 10. A280에 의한 단백질 농도
SEC-HPLC
Yarra SEC-300(3μm, 290Å, 7.8 x 300mm) SE-HPLC 컬럼이 장착된 Agilent 1200 시리즈 HPLC 시스템을 사용하여 샘플을 분석하였다. 각 단백질 종의 면적을 검출된 전체 면적과 비교하여 데이터를 분석하였다. 단량체, 70% RRT에서의 HMW, HMW 및 이량체에 대한 상대 보유 시간에 있어 유의미한 변형은 관찰되지 않았다.
GMP 공정에서의 필터 평가
TFF 단계 전후 모두에서 공정 규모로 GmAb-DFO를 제조하기 위한 접합 반응에 셀룰로오스 아세테이트 0.2μm 필터(Sartobran MidiCaps 0.05m2, Sartorius)를 사용한 여과 단계를 추가하였다. 요약하면, 출발 재료인 지렌툭시맙(GmAb; GmAb 제품 모음)의 용액을 pH 9.6으로 조정하여 pH 조정된 GmAb 모음을 제공하였다. TFP-N-sucDf-Fe 용액을 아세토니트릴 내에서 제조하고 pH 조정된 GmAb 모음에 첨가하였다. 반응을 주변 온도에서 30±2분 동안 인큐베이션하여 접합 생성물 모음을 제공하였다. 접합 생성물 모음을 pH 7.0으로 조정하고, 35℃로 가열하고, 추가로 pH 4.4로 적정하여 낮은 pH 접합 생성물 모음을 제공하였다. 디소듐 EDTA의 첨가에 의해 GmAb-N-sucDf-Fe로부터 철을 제거하였다. 반응물을 35℃에서 인큐베이션하여 트랜스킬레이트된 생성물 모음을 제공하였다. 트랜스킬레이트된 생성물 모음을 0.05m2 Sartobran 셀룰로오스 아세테이트 필터(0.2μm)를 사용하여 필터링하여 필터링된 트랜스킬레이트된 모음을 제공하였다. 필터에 0.9% NaCl를 흘렸다. 그런 다음 필터링된 트랜스킬레이트된 생성물 모음을 0.9% NaCl로 UFDF 공정에 적용하여 UFDF 접합 모음을 제공하였다. UFDF 접합 모음을 0.05m2 Sartobran 셀룰로오스 아세테이트 필터(0.2μm)를 사용하여 필터링하여 필터링된 UFDF 접합 모음을 제공하였다. 생성물의 완전한 회수를 위해 필터에 0.9% NaCl을 흘려 필터링된 UFDF 접합 모음을 수득하였다. 최종 BDS 재료를 제공하기 위해, 필터링된 UFDF 접합 모음을 최종 바이오버든 저감 단계로서 PVDF 막이 있는 0.01m2 Millipak 20(0.2μm) 필터에 통과시켰다. 4개의 배치를 평가하였다: 배치 #1; 배치 #2; 배치 #3; 배치 #4.
이들 배치로부터의 공정 중 SEC-HPLC 결과는 도 3에 나타나 있고 표 11에 요약되어 있다. 이들 데이터는 사전 TFF 셀룰로오스 아세테이트 필터가 4개 배치 모두에 걸쳐 HMW 응집체 함량을 ~15% 내지 ~4%로 지속적으로 저감시킬 수 있었던 반면, 사후 TFF 셀룰로오스 아세테이트 필터는 HMW 응집체 "연마"를 제공하여 HMW 함량을 ~3% 내지 ~1%로 저감 시켰음을 보여준다. 분석된 4개 배치 모두에서, 셀룰로오스 아세테이트 여과 전략은 높은(>85%-95%) 단량체 회수로 HMW 응집체 수준을 만족스러운 사양 내 수준으로 효과적으로 제어할 수 있었다. 이는 셀룰로오스 아세테이트 필터가 공정 규모 접합 반응 동안 상이한 조건 하에서 HMW 응집체를 제거하는 데 유용하다는 것을 알려준다.
표 11. 공정 규모 GmAb-DFO 배치에 대한 공정 중 SEC-HPLC 데이터
실시예 3. HuJ591-DOAT-177Lu의 응집체 제거
HuJ591-DOTA 재료의 pH를 pH 4.0으로 조정하고 35℃에서 60분간 인큐베이션함으로써 응집된 HuJ591-DOTA 샘플을 생성하였다.
60μL의 응집된 HuJ591-DOTA를 50uL의 177Lu/HCl에 첨가하고 35℃에서 35분 동안 인큐베이션하여 응집된 177Lu-DOTA-HuJ591을 생성하였다.
110μL의 응집된 177Lu-DOTA-HuJ591을 셀룰로오스 아세테이트 0.22μm 필터에 통과시켰다.
재료를 A280(나노드롭) 및 SEC-HPLC 사전 및 사후 여과로 분석하였다(표 12 참조).
표 12. 셀룰로오스 아세테이트 여과 전후 177Lu-DOTA-HuJ591 분석의 요약

Claims (18)

  1. 단백질, 단백질의 응집체 및 액체 담체를 포함하는 조성물로부터 단백질의 응집체를 제거하는 방법으로서, 다음을 포함하는, 방법:
    - 조성물을 셀룰로오스 아세테이트 막에 통과시켜 단백질이 막을 실질적으로 통과하게 하면서 막 상에 응집체의 적어도 일부를 선택적으로 흡착시키는 단계를 포함하는 하나 이상의 필터링 단계에 조성물을 적용하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 단백질은 접합된 화학적 모이어티를 포함하는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 접합된 화학적 모이어티는 킬레이트 리간드를 포함하는, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 킬레이트 리간드는 데스페리옥사민(DFO) 및 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-N,N',N'',N'''-테트라아세트산(DOTA)으로부터 선택되는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질은 단백질 표적화제를 포함하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질은 항체를 포함하는, 방법.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질은 지렌툭시맙 또는 HuJ591을 포함하는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 셀룰로오스 아세테이트 막은 약 0.015m2 내지 약 0.6m2의 크기를 갖는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 셀룰로오스 아세테이트 막은 약 0.2μm 내지 약 0.8μm의 평균 직경을 갖는 기공을 포함하는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 각 필터링 단계에서 액체는 독립적으로 약 4.0 내지 약 8.0의 pH를 갖는, 방법.
  11. 제1항 내지 10항 중 어느 한 항에 있어서, 각 필터링 단계에서 액체 담체는 독립적으로 수용액인, 방법.
  12. 제1항 내지 11항 중 어느 한 항에 있어서, 각 필터링 단계에서 액체 담체는 독립적으로 완충 용액인, 방법.
  13. 제1항 내지 12항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 필터링 단계는 셀룰로오스 아세테이트 막의 크기 대비 조성물 내 응집체 함량을 약 0.02mg/cm2 내지 약 0.15mg/cm2로 독립적으로 저감시키는, 방법.
  14. 제1항 내지 13항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 필터링 단계는 조성물 내 단백질 종의 전체 단백질 함량 대비 조성물 내 응집체 함량을 약 10% 이하로 독립적으로 저감시키는, 방법.
  15. 제1항 내지 14항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 미립자 물질 또는 바이오버든의 제거를 위한 것이 아닌, 방법.
  16. 제1항 내지 15항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 바람직하지 않은 응집체가 형성되는 단백질 접합체를 제조하기 위한 공정으로부터 얻어지는, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 얻을 수 있거나 얻은 단백질.
  18. 단백질, 단백질의 응집체 및 액체 담체를 포함하는 조성물로부터 단백질의 응집체를 제거하고/제거하거나; 단백질, 단백질의 응집체 및 액체 담체를 포함하는 조성물로부터 단백질의 응집체를 선택적으로 흡착하기 위한 셀룰로스 아세테이트 막.
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