JP5827994B2 - ポリペプチド - Google Patents
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Description
血清アルブミンは、哺乳動物血清中で最も豊富なタンパク質(40g/l;ヒト中約0.7mM)であり、そしてその機能の1つは、脂質及びビリルビンのような分子を結合することである(非特許文献1)。血清アルブミンには、酵素的又は免疫学的機能が全くない。さらにまた、ヒト血清アルブミン(HSA)は、多くの天然及び治療分子の内因性輸送及び送達に関与する天然の担体(natural carrier)である(非特許文献2)。血清アルブミンの半減期は、動物の大きさに正比例しており、ここで、例えばヒト血清アルブミンは、19日の半減期を有し、そしてウサギ血清アルブミンは、約5日の半減期を有する(非特許文献3)。HSAは、体中に、特に間質及び血液区分に広く分布しており、そこで主に浸透圧(osmolarity)の維持に関与している。構造的に、アルブミンは、3つの相同ドメイン及び全体で584個又は585個のアミノ酸を含む単鎖タンパク質である(非特許文献4)。アルブミンは、17個のジスルフィド架橋及び1個の反応性チオール、34位にシステインを含むが、N結合された及びO結合された炭水化物部分がない(前出Petersの非特許文献5)。
タンパク質を直接血清アルブミンに又は血清アルブミンに生体内で結合が可能となるペプチド若しくはタンパク質に共有結合する、いくつかの戦略が報告されている。後者のアプローチの例は、例えば、特許文献1中、特許文献2中及び非特許文献6中に記載されている。最初の文献は、とりわけ、他のタンパク質の半減期を延長するために、レンサ球菌Gタンパク質(SpG)に由来するアルブミン結合ペプチド又はタンパク質の使用を記載している。その着想は、細菌に由来するアルブミン結合ペプチド/タンパク質を、血液から迅速に排泄されることがわかっている治療上興味深いペプチド/タンパク質に融合させることである。このようにして生成された融合タンパク質は、生体内で血清アルブミンに結合し、そしてそのより長い半減期から便益をもたらし、それにより融合された治療上興味深いペプチド/タンパク質の正味の半減期が延長される。特許文献2及びDennis 等(非特許文献6)は、同じ概念に関するが、ここで、執筆者らは、血清アルブミンを結合するために比較的短いペプチドを用いている。ペプチドは、ファージディスプレイペプチドライブラリー(phage displayed peptide library)から選択された。Dennis等は、初期の研究において、ヒト補体受容体タイプ1へのレンサ球菌Gタンパク質のアルブミン結合ドメインの組換え融合に対する免疫応答の強化が見出されたことを記載している。また、特許文献3(Dennis)として公開された米国特許出願は、ここでもファージディスプレイ技術によって同定されたペプチドリガンドを含む構築物の使用を開示しており、それは血清アルブミンに結合し、そして腫瘍標的化のため生物活性化合物にコンジュゲート(conjugated)されている。
レンサ球菌Gタンパク質(SpG)は、レンサ球菌の特定菌株の表面上に存在する二機能性受容体であり、そしてIgG及び血清アルブミンの両方に結合が可能である(非特許文献7)。構造は、いくつかの構造的及び機能的に異なるドメイン(非特許文献8)、より正確には3つのIg−結合ドメイン及び3つの血清アルブミン結合ドメイン(非特許文献9)による高度な反復性がある。SpG中の3つの血清アルブミン結合ドメインの1つの構造は、決定されており、3へリックスバンドル折り畳み構造(three-helix bundle fold)を示している(非特許文献10)。46個のアミノ酸モチーフは、ABD(アルブミン結合ドメイン)として定義されており、そしてまた、後にG148−GA3(Gタンパク質関連のアルブミン結合のためのGA)と指定されている。例えば特許文献4には、46個のアミノ酸モチーフABDのアルブミン結合変異体が、開示されている。
上記の3ヘリックス含有タンパク質に加えて、アルブミンを結合する他の無関係な細菌タンパク質もある。
近年では、レンサ球菌Gタンパク質菌株148(G148)のアルブミン結合領域内で、いくつかのT細胞及びB細胞エピトープが実験的に同定された(非特許文献15)。研究を支持する執筆者らは、ワクチン中のG148のT細胞エピトープの使用、すなわち、アルブミン結合領域に固有の免疫刺激性を用いることに興味があった。Goetsch等は、G148の配列中に、B細胞エピトープ、すなわち、免疫感作(immunization)後に抗体によって結合された領域をさらに見出した。ヒトに投与するための医薬組成物では、免疫応答がないことが望ましい。
従って、アルブミン結合ドメインG148は、それ自体、上述のその免疫刺激性のためこのような組成物における使用には適していない。
i)LAX3AKX6X7ANX10 ELDX14YGVSDF YKRLIX26KAKT
VEGVEALKX39X40 ILX43X44LP
(式中、互いに独立して
X3は、E、S、Q及びCから選ばれ;
X6は、E、S及びCから選ばれ;
X7は、A及びSから選ばれ;
X10は、A、S及びRから選ばれ;
X14は、A、S、C及びKから選ばれ;
X26は、D及びEから選ばれ;
X39は、D及びEから選ばれ;
X40は、A及びEから選ばれ;
X43は、A及びKから選ばれ;
X44は、A、S及びEから選ばれ;
位置45のLは、存在するか又は存在せず;そして
位置46のPは、存在するか又は存在しない)
及び
ii)i)に定義された配列に対して少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を含むアルブミン結合ポリペプチドによって克服又は緩和される。
・ポリペプチドは、例えば、G148−GA3、そして他の細菌由来のアルブミン結合ドメインと比較して異なる表面を示す。違いは、このような細菌タンパク質に以前に暴露されたヒトのような被験者における抗体反応のなんらかのリスクを低下又は排除しうることである。
・ポリペプチドは、例えば、G148−GA3及び共通の親ポリペプチド配列の他の関連しているが異なる突然変異体よりも少ない潜在的T細胞エピトープを含み、そのため、ヒトのような被験者に投与されたときに低い免疫原性を示す。
・ポリペプチドは、ヒトのような被験者に投与されたときに、循環抗体とのより低い反応性を示す。従って、例えば、ヒト血清の試験セットで測定されたG148−GA3によって生じる抗体交差反応性と比較して、循環抗体に暴露されたポリペプチドの表面、すなわち、アルブミンとの結合相互作用に関与しないポリペプチド表面におけるアミノ酸置換によって抗体交差反応性が低下する。
・ポリペプチドは、KD値によって定義されるような、より高い結合親和性に関して、そしてkoff値によって定義されるような、より遅い速度(slower off-rate)に関していずれも、例えば、細菌タンパク質由来のアルブミン結合ドメインのような知られた天然に存在する(naturally occurring)アルブミン結合ポリペプチドよりも高いアルブミン結合能力を有する。
・ポリペプチドは、例えば、細菌タンパク質に由来するアルブミン結合ドメインのような知られた天然に存在するアルブミン結合ポリペプチドよりも少ない、ポリペプチドの安定性問題に関連するアミノ酸残基を含む。従って、ポリペプチドは、例えば、酸化しやすいメチオニン又はトリプトファンを含まず、そして1つしかアスパラギンを含まない。
・ポリペプチドは、55℃より上の融点によって定義されるように、以前のアルブミン結合ポリペプチド、例えばWO09/016043に開示されたものよりもより高い構造安定性を有する。
i)本明細書に記載された第1の態様によるアルブミン結合ポリペプチドからなる第1の部分;及び
ii)所望の生物活性を有するポリペプチドからなる第2の部分;
を含む融合タンパク質又はコンジュゲート(conjugate)が提供される。
方法は、
それ自体で100μg/mlを超えない水に対する溶解度を有する化合物を備える工程;そして
化合物を、本明細書に記載された態様によるアルブミン結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲートに共有結合させ、こうして化合物及びアルブミン結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲートの共有結合性複合体を含む組成物を形成する工程;
を含む。
化合物を、本明細書に記載された態様によるアルブミン結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲートに共有結合させ、こうして化合物及びアルブミン結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲートの共有結合性複合体を形成する工程;並びに
アルブミン結合ポリペプチドとアルブミンとの非共有結合性結合を促進する条件下で化合物及びアルブミン結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲートの前記複合体をアルブミンと混合する工程;
を含み、
それによって、前記複合体中の化合物の水への溶解度が、化合物それ自体の水への溶解度より大きくなる、化合物の水溶解度を高める方法を提供する。
実施例1:
アルブミン結合ポリペプチドのクローニング、発現、精製及び特性評価
この実施例では、アミノ酸配列が図1及び添付の配列リストに提示された10種の異なるアルブミン結合ポリペプチド、PEP07913(配列番号:153)、PEP07912(配列番号:156)、PEP07914(配列番号:158)、PEP07968(DOTAコンジュゲート化PEP07911、配列番号:159)、PEP06923(配列番号:154)、PEP07271(配列番号:155)、PEP07554(配列番号:156)、PEP07844(配列番号:161)、PEP07986(配列番号:163)及びPEP08296(DOTAコンジュゲート化PEP08185、配列番号:148)を、クローニングし、精製し、そして特徴付けた。
アルブミン結合ポリペプチド変異体のクローニング
適当なオリゴヌクレオチドで部位特異的突然変異誘発法を用いてG148−GA3中に突然変異を生じさせて所望のアルブミン結合ポリペプチド変異体を得た。アルブミン結合ポリペプチド変異体の前に特定のエンドヌクレアーゼ部位及びN末端MGSS配列を加えるプライマーを用いて遺伝子フラグメントをPCRによって増幅した。フラグメントをNdeI及びNotIで切断し、精製し、そしてクローニングベクター、プラスミドpAY02556(興味の遺伝子を発現するためにpBR322からの複製起点、カナマイシン耐性遺伝子及びT7プロモーターを含む)に連結し、同じ酵素で制限した。ライゲーションをエレクトロコンピテントE. coli TOP10セルに形質転換した。形質転換細胞を、50μg/mlのカナマイシンで補充されたTBABプレート(30g/lトリプトース血液寒天培地ベース)上に広げ、続いて37℃で一夜インキュベーションした。PCRを用いてコロニーをスクリーニングし、そしてビオチン化オリゴヌクレオチド及びBigDye(R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems)を用いて製造者のプロトコールに従って、増幅されたフラグメントのシークエンシングを行った。Magnatrix 8000(NorDiag AB)を用いて、磁性ストレプトアビジンコーティングビーズへの結合によってシークエンシング反応物を精製し、そしてABI PRISM(R) 3100 Genetic Analyzer(PE Applied Biosystems)で分析した。すべてのアルブミン結合ポリペプチド変異体を、単量体としてサブクローニングし、そして発現ベクターによってコードされた構築物は、MGSS[PP###]であり、ここでPP###は、アルブミン結合ポリペプチドの配列を構成するアミノ酸残基に対応する。
N末端MGSS伸張又はN末端His6−タグのいずれか、続いてTEV−プロテアーゼ認識部位及びグリシン残基を用いて、アルブミン結合ポリペプチド変異体を、大腸菌BL21(DE3)中で発現させた。各アルブミン結合ポリペプチド変異体のコロニーを用いて50μg/mlの濃度にカナマイシンで補充されたTSB+YE培地4mlに接種した。培養物を37℃で約5時間増殖させた。それぞれの培養物から3mlを用いて、パラレルバイオリアクター(Greta system, Belach Bioteknik AB)中で、50μg/mlの濃度にカナマイシンで補充されたTSB+YE800mlに接種した。800ml/分での通気、そして溶存酸素レベルを30%より上に保つ撹拌プロファイルにより、37℃でOD600 2まで培養を実施し、続いて最終濃度0.5mMまでIPTGを添加した。培養を5時間続け、その後、培養物を10℃に冷却し、通気を止め、そして撹拌を300rpmに下げた。細胞沈殿物を遠心分離(15600×g、4℃、20分)によって集め、そして精製まで−20℃で貯蔵した。
1000 U Benzonase(R)(1.01654.001, Merck)を添加された結合バッファー(20mMナトリウムリン酸、0.5M NaCl、20mMイミダゾール、pH7.4)35ml中で、可溶性ヘキサヒスチジンタグ付きのポリペプチドPEP07913(配列番号:153)、PEP07912(配列番号:156)、PEP07914(配列番号:158)、PEP07968(配列番号:159)、PEP07986(配列番号:163)及びPEP08185(配列番号:148)を含む凍結された細胞沈殿物を懸濁し、そして超音波処理によって破壊した。ポリペプチドのそれぞれについて、超音波処理した懸濁液を遠心分離(1時間、37000×g、4℃)によって清澄化(clarified)し、そして上澄みをHis GraviTrapTMカラム(11-0033-99, GE Healthcare)上に装填した。カラムを洗浄バッファー(20mMリン酸ナトリウム、0.5M NaCl、60mMイミダゾール、pH7.4)10mlで洗浄した後、溶離バッファー(20mMリン酸ナトリウム、0.5M NaCl、0.5Mイミダゾール、pH7.4)3mlでポリペプチドを溶離した。PD−10脱塩カラム(17-0851-01, GE Healthcare)を用いてバッファーを切断バッファー(50mM Tris−HCl、150mM NaCl、pH8)に交換した。280nmで吸光度を測定することによってポリペプチド生成物の量を決定した後、DTTを最終濃度5mMまで加えた。His6タグ付きのTEVプロテアーゼを、ポリペプチド生成物に対して1:10の質量比率で切断バッファーに加えた。緩速混合下、4℃で切断を一夜実施した。切断混合物にイミダゾールを20mMの濃度まで加えた後、切断されたHis6−タグ、His6−タグ付きのTEVプロテアーゼ及びHis6−タグ付きの非切断生成物を除去するため、混合物をHis GraviTrapTMカラム(11-0033-99, GE Healthcare)に装填した。
可溶性アルブミン結合ポリペプチド変異体PEP06923(配列番号:154)、PEP07271(配列番号:155)、PEP07554(配列番号:156)及びPEP07844(配列番号:161)を含む凍結された細胞沈殿物を20mM Tris−HCl(pH8)中に懸濁し、そして超音波処理によって破壊した。ポリペプチド変異体のそれぞれについて、超音波処理された懸濁液を遠心分離(30分、32000×g、4℃)によって清澄化し、そして上澄みをHSA-Sepharoseカラム(GE Healthcare)上に装填した。TST−バッファー(25mM Tris−HCl、1mM EDTA、200mM NaCl、0.05%Tween 20、pH8.0)、続いて5mM NH4Ac、pH5.5で洗浄した後、結合したアルブミン結合ポリペプチド変異体を0.5M HAc(pH3.2)で溶離した。
15 RPCカラム(GE Healthcare)上に装填した。カラムを10CVのRPC Aバッファーで洗浄し、結合したポリペプチドを10CV中の0〜50%RPC Bバッファー(アセトニトリル中の0.1%TFA)の線状勾配で溶離した。流速は2ml/分であり、そして280nmで吸光度をモニターした。純粋なアルブミン結合ポリペプチド変異体を含む画分を、SDS−PAGE分析によって特定し、そして貯めた。最後に、使い捨てのPD−10脱塩カラム(GE Healthcare)を用いてバッファーを1xPBS(2.68mM KCl、137mM NaCl、1.47mM KH2PO4、8.1mM Na2HPO4、pH7.4)に交換した。
NanoDrop(R) ND-1000分光光度計を用いて280nmで吸光度を測定することによって濃度を評価した。タンパク質をSDS−PAGE及びLC−MSでさらに分析した。
アルブミン結合ポリペプチド変異体の発現レベルは、SDS−PAGE分析から推定して生成物10〜30mg/g細胞沈殿物であった。
アルブミン結合ポリペプチドについての親和性測定
この実施例では、Biacore機器を用いてヒト血清アルブミン(HSA)に対する親和性について、実施例1で合成又は発現し、そして精製されたPEP06923(配列番号:154)、PEP07271(配列番号:155)、PEP07844(配列番号:161)、PEP07912(配列番号:157)、PEP07913(配列番号:153)、PEP07914(配列番号:158)及びPEP07968(DOTAコンジュゲート化PEP07911、配列番号:159)を特徴付けた。PEP07913は、N末端グリシン残基が付加されたG148−GA3のアミノ酸配列に相当するのに対して、PEP07271、PEP07844、PEP07912、PEP07914及びPEP07968は、異なるN末端アミノ酸付加によるPP001(配列番号:1)、PP043(配列番号:43)、PP007(配列番号:7)、PP013(配列番号:13)及びPP037(配列番号:37)のアルブミン結合ポリペプチドに相当する。
Biacore2000機器(GE Healthcare)におけるBiosensor分析をHSA(Albucult(R), Novozymes)で実施し、製造者の勧告に従ってCM−5チップ(研究グレード;GE Healthcare)表面のカルボキシル化されたデキストラン層上へのアミンカップリングによって固定化した。チップの表面1を活性化し、そして不活性化し、そして注入中に参照細胞(ブランク表面)として用いたのに対して、表面2は、731レゾナンスユニット(RU)に固定化されたHSAを含み、そして表面4は、955RUに固定化されたHSAを含んだ。精製されたアルブミン結合ポリペプチド変異体をランニングバッファーHBS−EP(GE Healthcare)中で2.5nM、10nM及び40nMに希釈し、そして50μl/分の一定流速で5分間注入し、続いて60分間HBS−EPを注入した。10mM、HCl 25μlの1回注入により表面を再生した。親和性測定は、2セットで実施し;第1セットでは、HBS−EP、PEP06923、PEP07271、PEP07912、PEP07913、PEP07914及びPEP07968を注入し(チップ表面2)、そして第2セットでは、HBS−EP、PEP06923、PEP07844、PEP07912及びPEP07914を注入した(チップ表面4)。対照としてそれぞれのランでPEP06923を2回注入した。BiaEvaluationソフトウェア(GE Healthcare)を用いて結果を分析した。リガンド表面の曲線からブランク表面の曲線を減算した。
Biacore 2000機器は、技術的な制限があり、非常に高い親和性の測定が妨げられた。したがって、Biacore研究の目的は、HSAに対するアルブミン結合ポリペプチド変異体の親和性の正確な動態パラメータを決定することではなかった。しかし、結果からアルブミンに対するこれらのポリペプチドの相対的親和性の定量的評価を得た。参照表面及びバッファー注入の減算後、BIAevaluationソフトウェアを用い、物質移動について補正し、そして局所的パラメーターとしてRUmaxを設定して曲線を1:1(Langmuir)結合モデルに適合させた。曲線を図2に示す。相対的KD、ka(kon)、及びkd(koff)値を評価し、そして下の表に示した。
(配列番号:161)、PEP07912(配列番号:157)、PEP07914(配列番号:158)及びPEP07968(DOTAコンジュゲート化PEP07911、配列番号:159)は、すべて、HSAに対してほぼ同じ親和性を有するようであり、親G148−GA3(PEP07913;配列番号:153)の親和性を大きく超える。これらのポリペプチドのHSA親和性は、同様のオフレイト(off-rate)にもかかわらず、PEP06923(配列番号:154)と比較してわずかに低い。
アルブミン結合ポリペプチドについての融解温度(Tm)の測定
この実施例では、実施例1に記載したように発現し、そして精製されたアルブミン結合ポリペプチド変異体PEP07913(配列番号:153)、PEP06923(配列番号:154)、PEP07271(配列番号:155)、PEP07554(配列番号:156)、PEP07912(配列番号:157)、PEP07914(配列番号:158)、PEP07968(DOTAコンジュゲート化PEP07911、配列番号:159)、PEP07844(配列番号:161)及びPEP07986(配列番号:163)、並びに実施例5に記載したように製造されたアルブミンポリペプチド変異体PEP07975(DOTAコンジュゲート化PEP07834、配列番号:160)を、CD分析によって分析した。PEP07913は、N末端グリシン残基を有するG148−GA3の配列に相当し、PEP06923は、前出、Jonsson等によって以前に記載される改変高親和性誘導体であるのに対して、PEP07271、PEP07554、PEP07912、PEP07914、PEP07968、PEP07844及びPEP07975は、本開示による異なるN末端アミノ酸付加を有するPP001(配列番号:1)、PP007(配列番号:7)、PP013(配列番号:13)、PP037(配列番号:37)及びPP043(配列番号:43)アルブミン結合ポリペプチドの例である。
精製されたアルブミン結合ポリペプチド変異体を1xPBS中で0.4〜0.5mg/mlの最終濃度に希釈した。円偏光二色性(CD)分析を、光路長1mmのセル中、Jasco J-810分光偏光計において実施した。可変温度測定において、温度勾配5℃/分で、20℃から90℃まで221nmで吸光度を測定した。
温度プロットに対するCDにおける転移の中間点を決定することによって、種々のアルブミン結合ポリペプチド変異体の融解温度(Tm)を算出した。それらの結果を下の表3にまとめた。
血清反応分析
本明細書に開示されたアルブミン結合ポリペプチドのセットに結合可能な、IgGを含むヒト血清のパーセンテージを、ELISAによって分析した。全体で127人に相当する149個の血清サンプルをスクリーニングした。
コーティングバッファー(Sigma、カタログ番号3041)中で8μg/mlに希釈されたAlbucult(R)(Novozymes)50μl/ウェルでELISAプレート(96ウェル、ハーフエリアプレート(Costar、カタログ番号3690))をコートした。プレートを、4℃で3日間夜通しコートした。分析日に、プレートを水道水で2回洗浄し、そして0.05%カゼイン(PBSC)を含むリン酸緩衝食塩水(PBS)100μlで2時間ブロックした。プレートを空にし、そしてPBSC中で2μg/mlに希釈されたアルブミン結合ポリペプチドPEP07913(配列番号:153)、PEP06923(配列番号:154)、PEP07271(配列番号:155)、PEP07912(配列番号:157)、PEP07554(配列番号:156)、PEP07914(配列番号:158)、PEP07968(DOTAコンジュゲート化PEP07911、配列番号:159)及びPEP07844(配列番号:161)50μl/ウェルを、予め作成されたプレートレイアウトに従って加えた。室温(RT)で2時間インキュベーション後、自動化ELISA洗浄器を用いてプレートをPBSC中で4回洗浄した。血清24μlをPBSC 1174μlに加えることによって、129人からの149個の血清サンプルをPBSC中で50倍希釈した。希釈された血清50μlを、予め作成されたプレートレイアウトに従ってウェルごとに加えた。各血清サンプルを、シングレット(singlet)として試験した。各プレート上には、各アルブミン結合ポリペプチドに対する陽性及び陰性対照が含まれていた。
(PEP06923で免疫化された霊長類の血清から社内調製された50μl、0.5μl/mlの免疫グロブリン溶液)を陽性対照として加え、そしてPBSC50μlを陰性対照として用いた。プレートを室温で1時間インキュベートし、その後、自動化ELISA洗浄器を用いてPBSC中で4回洗浄した。PBSC中で10 000倍希釈された抗ヒトIgG(Southern Biotech、カタログ番号2040−05)50μl/ウェルを用いて、結合されたIgGを検出した。自動化ELISA洗浄器を用いてPBSC中で4回洗浄した後、基質50μl/ウェルを加えた(Pierceカタログ番号34021)。10〜15分後、各ウェルにH2SO4 50μlを添加することにより反応を停止した後、マルチウェルプレートリーダー(Victor3, Perkin Elmer)を用いて吸光度を測定した。
アルブミン結合ポリペプチドへのIgG結合についてスクリーニングした149個の血清のうち、23個は、全8つのポリペプチドに対して陰性(OD値<0.1)であり、すなわち、ポリペプチドに結合したIgGを示さなかった。1つ又はそれ以上のアルブミン結合ポリペプチドに対して陽性であった126個の血清を用いて分析を実施した。平均吸光度を算出し(図3A)、そしてOD値による血清のパーセンテージを、<0.15(図3B)又は>1.0(図3C)のいずれかと評価した。PEP07913(配列番号:153)、PEP06923(配列番号:154)及びPEP07844(配列番号:161)では、最も高い平均OD値及びIgG結合を有する血清の最も高いパーセンテージが得られたのに対して、PEP07968(DOTAコンジュゲート化PEP07911、配列番号:159)、PEP07914(配列番号:158)及びPEP07954(配列番号:156)に対しては、最小の反応性が見出された。
DOTAコンジュゲート化アルブミン結合ポリペプチドの化学合成
物質及び方法
標準Fmoc化学を用いて、固層ペプチド合成(Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis-A Practical Approach, W.C. Chan, P.D. White Eds, Oxford University Press 2000, 115-135中、Quibell, M. & Johnson, T.によって記載されたSPPS)によって433 A Peptide Synthesizer反応器(Applied Biosystems, Foster City, CA)中、0.1mmolスケールで、すなわち0.1mmolペプチドの理論的な可能な収量で、アルブミン結合ポリペプチドPEP07834(配列番号:160)を合成した。酸に不安定なFmocアミド樹脂を、合成を通して固体支持体(Rink Amide MBHA Resin LL(100−200メッシュ)、0.39mmolアミド/g樹脂(Novabiochem)を装填する)として用いた。
ALASAKEAAN AELDCYGVSD FYKRLIDKAK TVEGVEALKD AILAALPNH2
(配列番号:160−NH2)
下線を引かれたアミノ酸残基は、二重に結合された。樹脂結合ペプチド上の残っている任意の未反応アミノ基に、無水酢酸(0.5M無水酢酸(AlfaAesar)、0.125M DIEA、NMP中の0.015M HOBt)で5分間キャップした。すべてのカップリングの後、NMP中の20%ピペリジン(Sigma-Aldrich)で10分間処理することによって樹脂結合ペプチド上のN末端Fmoc基の脱保護を実施した。
PEP07834−アミド(配列番号:160−アミド)3mgを40℃で30分間20mM DTTにより還元した。PD−10カラム(GE Healthcare)上で0.2M酢酸アンモニウム、pH5.5へのバッファー交換によって過剰DTTの除去した。カップリングは、5倍モル過剰のキレート剤、水中のマレイミド−モノ−アミド−DOTA(Macrocyclics、カタログ番号B−272)溶液(1mg/ml)を用いて実施した。混合物を連続振盪下、30℃で1時間インキュベートした。非コンジュゲート化キレート剤からの精製は、半分取RPCカラム(Zorbax 300SB C18、9.4×250mm、5μm)上で行った。精製された物質の結合度を、Zorbax 300SB C8 150×2.1mm、3.5μm分析カラム上のHPLC−MSによって分析した。方法によって、PEP07975を表すマレイミド−DOTAコンジュゲート化PEP07834のみが検出された。
粗物質の溶離プロファイルに基づいて、アルブミン結合ポリペプチドPEP07834−アミド(配列番号:160−アミド)の合成収率は、8%であると決定された。測定された分子量は、4952.9Daであり、それは算出された理論分子量4952.6Daと十分に一致した。精製された生成物を分析したときに、タンパク質の約10〜15%は、ジスルフィド結合したホモ二量体であることがわかった(図4及び5)。DOTAコンジュゲート化ペプチド(PEP07975)の結合活性は、実施例2に記載されたように確認し(データは示さず)、そして融解温度は、実施例3に記載されたように決定した。
アルブミン結合ポリペプチドの免疫原性試験
ヒト白色人種52人からの末梢血単核細胞(PBMC)(CRI-Labo Medische Analyse,
Gent, Belgiumから入手した)においてT細胞増殖を誘発する能力についてPEP07913(配列番号:153)、PEP07912(配列番号:157)、PEP07914(配列番号:158)及びPEP07968(DOTAコンジュゲート化PEP07911、配列番号:159)を、スクリーニングした。PEP07913は、N末端グリシン残基を有するG148−GA3の配列に相当するのに対して、PEP07912、PEP07914及びPEP07968は、本開示による種々のN末端アミノ酸付加を伴うPP007(配列番号:7)、PP013(配列番号:13)及びPP037(配列番号:37)のアルブミン結合ポリペプチドの例である。
標準細胞生物学的方法に従って製造されたPBMCを、組織培養(TC)処理した96ウェル丸底プレート(Falcon)に300000PBMC/ウェルの量で加えた。900μg/ml(3倍モル過剰)の組換え型ヒトアルブミン(Albucult(R), Novozymes)をさらに含むAIMV培地(Invitrogen)中で100μl/ウェルのアルブミン結合ポリペプチドPEP07913、PEP07912、PEP07914及びPEP07968を添加することにより細胞を刺激した。これは、30μg/mlのアルブミン結合ポリペプチドの最終濃度に相当した。刺激は、八つ組で(eight-plicates)行い、すなわち同じアルブミン結合ポリペプチドを、同一量で、そして同じ条件下で8個のウェルに加えた。陽性対照ウェルでは、30μg/mlのキーホールリンペットヘモシアニン(Keyhole Limpet Hemocyanin)(KLH、Calbiochem)又は30μg/mlの破傷風トキソイド(TT、Statens Serum Institut)のいずれかで細胞を刺激した。陰性対照ウェルでは、900μg/mlのアルブミン入りの又はなしのAIMV培地のみを加えた。
in vitvoPBMC増殖アッセイを用いて、標的ヒト個体群において3倍過剰の組換え型ヒトアルブミンの存在下でのそれらの免疫原性の可能性についてアルブミン結合ポリペプチドPEP07913、PEP07912、PEP07914及びPEP07968を評価した。アルブミン対照と比較して、PEP07913では、ドナー52人のうち6人、PEP07912では、ドナー52人のうち5人、そしてPEP07914及びPEP07968では、ドナー52人のうちの1人でCD3+CD4+T細胞増殖が誘発された(図6A)。
異なる種からのアルブミンに対するアルブミン結合ポリペプチドの親和性
この実施例では、Biacore機器を用いてヒト(HSA)、カニクイザル(CSA)、ラット(RSA)、マウス(MSA)及びイヌ(DSA)からのアルブミンに対する親和性について、実施例1に記載された通り発現し、そして精製されたPEP06923(配列番号:154)、PEP07986(配列番号:163)及びPEP08296(DOTAコンジュゲート化PEP08185、配列番号:148)を特徴付けた。
Biacore2000機器(GE Healthcare)におけるBiosensor分析は、CM−5チップ(研究グレード;GE Healthcare)表面のカルボキシル化デキストラン層上にアミンカップリングによって固定化されたHSA(Albucult(R), Novozymes)、CSA(カニクイザル血清から社内精製した)、RSA(Sigma-Aldrich、カタログ番号A6272)、MSA(Sigma-Aldrich、カタログ番号A3559)及びDSA(MP Biomedicals、カタログ番号55925)を用いて、製造者の勧告に従って実施した。
Biacore 2000機器は、技術的制限があり、非常に高い親和性の測定が妨げられた。したがって、Biacore研究の目的は、それぞれHSA、CSA、RSA、MSA及びDSAに対するアルブミン結合ポリペプチド変異体の親和性の正確な動態パラメータを測定することではなかった。しかし、結果から、これらの異なる種からのアルブミンに対する閉鎖性ポリペプチド(enclosed polypeptides)の相対的な親和性の定量的評価を得た。参照表面及びバッファー注入の減算後、BIAevaluationソフトウェアを用い、物質移動について補正し、そして局所的パラメーターとしてRUmaxを設定して、曲線を1:1(Langmuir)結合モデルに適合させた。代表的な結合曲線を、図7に示す。
アルブミン結合ポリペプチドに融合されたタンパク質Z変異体のin vitvo活性
この実施例では、ヒト血清アルブミンの存在下でTF−1細胞のサイトカイン誘発性増殖をブロックするその機能性について、アルブミン結合ポリペプチド変異体PP013(配列番号:13)に遺伝子的に融合された変異体、サイトカイン特異的タンパク質Z(ブドウ球菌プロンテインAのドメインBの誘導体)を含むポリペプチドを試験した。TF−1細胞の増殖は、いくつかの異なるタイプのサイトカインのいずれかの存在に依存しており、そして増殖反応は、対応するサイトカイン特異的タンパク質Z変異体のようなブロッキング試薬によって阻害することができる。無関連タンパク質に対して特異性を有するタンパク質Z変異体に融合されたPP013を陰性対照として用いた。
Z−PP013融合タンパク質のクローニング
それぞれサイトカインX若しくはYに対して、又は無関連タンパク質(陰性対照)に対して特異性を有するタンパク質Z変異体の遺伝子フラグメントを、PstI及びAccI特異的エンドヌクレアーゼ部位を加えるプライマーを用いたPCRによって増幅した。フラグメントをPstI及びAccIで切断し、精製し、そして発現ベクター、プラスミドpAY02747に連結し、同じ酵素で制限した。pAY02747は、興味の遺伝子を発現するためにpBR322からの複製起点、カナマイシン耐性遺伝子及びT7プロモーターを含む。クローニング部位は、アミノ酸MGSSLQをコードする配列によって始まり、そしてVDSSPP013をコードする配列が続き、ここでPP013は、配列番号:13を有する開示されたアルブミン結合ポリペプチドである。ライゲーション、形質転換及び配列検証は、上記のように実施した。コードされたタンパク質は以下の通りであった:
1)MGSSLQ−ZX−VDSS−PP013(ZX−PP013と表す)
2)MGSSLQ−ZY−VDSS−PP013(ZY−PP013と表す)
3)MGSSLQ−Zneg−VDSS−PP013(Zneg−PP013と表す)
ZX−PP013、ZY−PP013及びZneg−PP013を、大腸菌BL21(DE3)細胞中で発現させた。各融合変異体の形質転換からのコロニーを用いて、カナマイシンで50μg/mlの濃度に補充されたTSB+YE培地のスターター培養液(starter cultures)50mlを接種した。100rpmで撹拌しながら、培養物を37℃で一夜増殖させた。次いで、スターター培養液を用いてカナマイシンで50μg/mlの濃度に補充されたTSB+YE培地900mlに接種した。培養物を、OD600 >1.1まで約1.5時間増殖させ、そこへIPTGを最終濃度0.2mMまで加えた。培養を5時間続けた。細胞沈殿物を遠心分離(15600g、4℃、20分)によって集め、そして精製まで−20℃で貯蔵した。
可溶性の融合タンパク質変異体ZX−PP013、ZY−PP013及びZneg−PP013を含む凍結された細胞沈殿物を、50mM Tris−HCl、150mM NaCl、pH8中で再懸濁し、そして1000 U Benzonase(R)(Merckカタログ番号1.01654.0001)を加えた。細胞を超音波処理によって破壊し、そして融合タンパク質変異体のそれぞれについて、超音波処理された懸濁液を、遠心分離(15分、37000 g、4℃)によって清澄化した。20xTST−バッファー(20x[25mM Tris−HCl、1mM EDTA、200mM NaCl、0.05%Tween 20、pH8.0])を、清澄化された懸濁液中に1×TSTバッファーが生成する体積で加えた。融合タンパク質変異体の各サンプルをHSA−セファロースカラム(GE Healthcare)上に装填した。TST−バッファー、続いて5mM NH4Ac、pH5.5で洗浄した後、結合した融合タンパク質変異体を0.5M HAc(pH2.5)で溶離した。
細胞株TF−1(Clカタログ番号300434)を、2ng/mlのrhGM−CSF (Miltenyi)を添加したRPMI 1640培地+10%ウシ胎児血清(Gibco)中で供給元によって推奨された通り増殖させた。実験日に、細胞を、RPMI 1640培地+10%ウシ胎児血清中で洗浄してGM−CSFを除去した。
図8に示すように、ZX−PP013及びZY−PP013は、HSAの存在下でそれぞれのサイトカイン誘発性増殖を阻害したのに対して、陰性対照、Zneg−PP013は、TF−1の増殖に影響を及ぼさなかった。従って、実験は、アルブミン結合ポリペプチドを含む融合タンパク質に組み込まれたとき、そしてまた、融合タンパク質がアルブミンに結合したときに、Z分子の機能が保持されたことを示している。
アルブミン結合ポリペプチドの長期安定性
この実施例では、実施例1に記載されたように発現し、そして精製されたPEP07986(配列番号:163)の安定性を、最長3ヵ月間、4、25及び40℃で貯蔵した後、調べた。貯蔵後のポリペプチドの状態は、Biacore機器を用いてHSAに対するその結合を測定することによって調べた。
凍結乾燥されたPEP07986を、2mg/mlの濃度で滅菌NaPiバッファー(20mMリン酸ナトリウム、150mM塩化ナトリウム、pH7.2)中に溶解した。参照サンプル(時間=0)を除去し、そして−80℃で貯蔵した。アリコート105μlを、滅菌スクリューキャップ型エッペンドルフチューブ中にパラフィルムで封入して4、25及び40℃で貯蔵した。1週間、2週間、1ヵ月及び3ヵ月後、各温度で貯蔵されたサンプルを、4℃に冷却し、13000rpmで5分間遠心分離し、次いでBiosensor分析まで−80℃で貯蔵した。
PEP07986(配列番号:163)のHSAへの結合は、4、25及び40℃で少なくとも3ヵ月間貯蔵した後、保持された。さまざまな条件で貯蔵されたPEP07986について得られたHSAへの最大結合反応を図9に示す。
過酷条件下でのアルブミン結合ポリペプチドの安定性
この実施例では、低pH(約4.0)バッファー中で熱処理(90℃)した後のアルブミン結合ポリペプチドPEP08296(DOTAコンジュゲート化PEP08185、配列番号:148)のバイオセンサー及び円偏光二色性(CD)分析を説明する。例えばDOTA修飾タンパク質の68Ga標識化には、このような過酷な反応条件を用いなければならないため、ポリペプチドの構造的同一性及びHSAに結合するその能力における高熱及び低pH処理の影響を、融解温度(Tm)、リフォールディング性及びHSAへの結合の測定によって調べた。
熱安定性のBiosensor分析
Biacore 2000機器(GE Healthcare)におけるBiosensor分析は、CM−5チップ(研究グレード;GE Healthcare)表面のカルボキシル化されたデキストラン層上へアミンカップリングによって固定化されたHSA(Albucult(R), Novozymes)を用いて、製造者の勧告に従って実施した。チップの表面1を活性化し、そして不活性化し、そして注入中に参照細胞(ブランク表面)として用いたのに対して、表面2は、724レゾナンスユニット(RU)に固定化されたHSAを含んだ。15mlファルコンチューブ中のPEP08296(50μl、100μg)を、0.2M酢酸ナトリウム(NaAc)450μl pH5.5により最終ペプチド濃度0.2mg/mlに希釈した。0.05M HCl 1.5mlを添加した後(68Ge/68Gaジェネレータ(generator)の溶離に用いた条件及び容積と類似している)、サンプルを90℃又は室温(対照)で10分間インキュベートし、次いで室温に移した。0.1Mクエン酸ナトリウム6mlを加えてpHを中和した。熱処理されたPEP08296(0.8及び4nM)を50μl/分の一定流速で5分間注入し、続いてHBS−EP中で15分間解離させた。10mM HCl 25μlを1回注入して表面を再生した。結果を、BIAevaluationソフトウェア(GE Healthcare)で分析した。リガンド表面の曲線からブランク表面の曲線を減算した。
PEP08296を、PBS中で最終濃度0.5mg/mlに溶解した。100mM HCl 9.5μlをPBS 100μlに加えることによってpH約4.0のPBSを調製した。円偏光二色性(CD)分析は、実施例3に記載された通り実施した。
熱処理後のPEP08296の構造的可逆性を調べるため、195と250の間の2つのCDスペクトルを、サンプルごとに20℃で記録した。第1のスペクトル後、90℃への加熱によるVTMサイクルを上記のように実施し、続いて195と250nmの間の第2のCDスペクトルを20℃で集めた。さらに、サーモミキサー(500rpm、10秒作動、30秒停止のインターバル混合)において90℃で12分間、PBS pH4.0バッファー又はPBS pH7.2バッファー中でPEP08296をインキュベートした。インキュベーション後、サンプルを氷上で冷却し、続いて13000rpmで1分間遠心分離し、そして195と250nmの間のCDスペクトルを20℃で記録した。
Biosensor分析を用いて、低pHと組み合わせた熱処理、すなわち、ポリペプチドの68Ga標識化に必要な一般的条件が、HSAに結合するPEP08296の能力に影響を及ぼすかどうかを調べた。図10は、Biacore 2000機器で実施されたこの結合分析の結果を示す。固定化ヒト血清アルブミン724RUを有する表面上に、0.8nM及び4nMの2種の異なる濃度のPEP08296を、注入した。90℃、pH4.0での10分間の熱処理により、HSAに対するPEP08296の結合能力がわずかに低下し、分子の潜在的構造変化を示している。
68Ga標識アルブミン結合ポリペプチドを用いた血液プールイメージング
この実施例を構成する実験では、ラットにおける68Ga標識PEP08296(DOTAコンジュゲート化PEP08185、配列番号:148)の全身分布を、1.5時間にわたる動的イメージングにより追跡した。標識化ポリペプチドと血清アルブミンの間の強い結合のため、標識ポリペプチドを用いて、例えば血液プール及び組織透過性を研究することができる。
PEP08296の68Ga標識化
以前に記載されたように(Velikyan et al (2008), Nucl Med Biol 35:529-536)、
0.1M HClを用いて、68Ge/68Gaジェネレータ(Obninsk, Russia)から68Gaを68GaCl3として溶離し、濃HClにより68GaCl4 -に変換し、陰イオン交換カラム(Chromafix-HCO3)上で捕捉し、続いて18MΩの水で溶離した。
イソフルラン(最初に5%、そして7:3の空気/O2と2%ブレンドした)を用いてラット(277g)に麻酔し、Euthanex CorporationからのMicroflexノンブリーザーマスク(non-rebreather masks)を用いてE−Z吸入器によって管理し、そしてmicroPET Focus120システム(Siemens, CTI Concorde Microsystems)内に横たえたまま、加熱パッド(37℃)上に保持した。68Ga−PEP08296、33MBqをシリンジ中に投入し、生理食塩水で0.5mlに希釈し、そして尾静脈から注射した。一定の床移動プロトコールで1.5時間床を移動させることによって全身からデータを入手した。データをMicroPET Managerで処理し、そしてランダム(randoms)、不感時間(dead time)及び減衰(decay)について補正した。ランプフィルターを用いる標準2Dフィルター逆投影によって画像を再構成し、そしてInveon Research Workplace(Siemens Medical Solutions)ソフトウェアを用いて評価した。
PEP08296についての基本的な分布パターン(図12)は、68Ga−DOTA、64Cu−DOTA及び11Cのような放射性同位体で標識化されたアルブミンのそれと非常に類似していた(例えばHoffend et al (2005), Nucl Med Biol 32:287-292 and Lu et al (2008), “[1-11C]Butanol and [Methyl-11C]Albumin for Blood Flow and Blood Pool
Imaging”, poster at the XIth Turku PET Symposium, 24-27 May 2008を参照のこと)。要するに、スキャンを通して主要血管において高い放射能濃度が観察された。また、大血液容量の臓器(肝臓、脾臓及び腎臓)も、心血液プール放射能として明確に描写されていた。膀胱中の放射能は、観察期間中に高められ、この腎排出の観察は、標識アルブミンベースのトレーサーによる以前の観察、そしてアルブミン自体の代謝のそれと一致した。
アルブミン結合ポリペプチドの溶解度
限外濾過を用いたサンプルの連続的濃縮、続いて濃度測定及び凝集状態の調査によって生理学的バッファー中のPEP07986(配列番号:163)の溶解度を調べた。280nmでの吸光度の直接読取りによって決定された濃度は、ゲル濾過によって測定された濃度と一致しており、凝集物が検出されない42mg/mlを超える溶解度を示した。
凍結乾燥されたPEP07986を、NaPiバッファー(20mMリン酸ナトリウム、150mM塩化ナトリウム、pH7.2)中に3mg/mlの濃度で溶解した。Amicon Ultra遠心式フィルターユニット、3kDaのカットオフ(cut off)(Millipore、カタログ番号UFC800324)を、スインギンググバケットローター(swinging bucket rotor)遠心分離機(Multifuge, Heraeus)中、4000gで20分間の遠心分離によってNaPiバッファー2mlで予めすすいだ。3mg/mlのPEP07986 1620μlを、第1の遠心式フィルターユニットに適用し、そして遠心分離を4000g、20℃で7分間実施した。さらなる分析のため25μlのサンプルを取出し(UFサンプル1)、そして残りのサンプルを第2の遠心濾過機ユニットへ移した。遠心分離及びサンプル取出しを、それぞれ8、9及び20分の回転時間で3回繰り返した(それぞれUFサンプル2、3及び4)。NanoDrop(R) ND-1000分光光度計を用い、そしてUFサンプル1〜4を、NaPiバッファー中でそれぞれ2、4、6及び12回希釈することによって吸光度の読取りを行った。吸光係数1を用いて濃度を算出したAbs 280=1.955mg/ml。NaPiバッファー中で平衡にされたSuperdex75 10/300 GLカラム(GE Healthcare)を用いて、1100 HPLCシステム(Agilent Technologies)においてゲル濾過を実施した。各UFサンプル10μlをカラムに適用した;NaPiバッファーをランニングバッファーとして用い、そして流速は0.5ml/分であった。5mg/mlの濃度で注射された分子量標準オボアルブミンのクロマトグラム(GE Healthcare)を同様に集めた。曲線下面積を積分することによって濃度を決定した。
280nmでの吸光度の直接読取りによって決定された濃度、及びゲル濾過によって決定された濃度を表5に示す。PEP07986(配列番号:163)の溶解度は、生理学的バッファー(20mMリン酸ナトリウム、150mM塩化ナトリウム、pH7.2)中で少なくとも42mg/mlであった。図13に示すようにゲル濾過によって凝集物は検出されなかった。
Claims (15)
- i)LAX3AKEAANA ELDX14YGVSDF YKRLIDKAKT
VEGVEALKDA ILAALP
(式中、互いに独立して
X3は、E及びSから選ばれ;X14は、A、S、C及びKから選ばれる)
及び
ii)i)に定義された配列に対して少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を含み、
相互作用のk off 値が多くとも5×10 -5 秒 -1 になるようにアルブミンに結合することができる、
アルブミン結合ポリペプチド。 - アミノ酸配列が、配列番号:1−26、配列番号:28−29、配列番号:31−32、配列番号:34−35、配列番号:37−62、配列番号:64−65、配列番号:67−68、配列番号:70−71、配列番号:73−74、配列番号:76−77、配列番号:79−80、配列番号:82−83、配列番号:85−86、配列番号:88−89、配列番号:91−92、配列番号:94−95、配列番号:97、配列番号:101、配列番号:103、配列番号:107、配列番号:109−110、配列番号:112−116、配列番号:118−122、配列番号:124−128、配列番号:130−133、配列番号:137、配列番号:139、配列番号:143、配列番号:164−167、配列番号:169−174、配列番号:176−181、配列番号:183−188、配列番号:190−195及び配列番号:197−203のいずれか1つから選ばれる、請求項1に記載のアルブミン結合ポリペプチド。
- アミノ酸配列が、配列番号:1−26、配列番号:28−29、配列番号:31−32、配列番号:34−35、配列番号:37−62、配列番号:64−65、配列番号:67−68、配列番号:70−71、配列番号:73−74、配列番号:76−77、配列番号:79−80、配列番号:82−83、配列番号:85−86、配列番号:88−89、配列番号:91−92、配列番号:94−95、配列番号:97、配列番号:101、配列番号:103、配列番号:107、配列番号:109−110、配列番号:112
−116、配列番号:118−122、配列番号:124−128、配列番号:130−133、配列番号:137、配列番号:139及び配列番号:143のいずれか1つから選ばれる、請求項2に記載のアルブミン結合ポリペプチド。 - アミノ酸配列が、配列番号:1、配列番号:7、配列番号:13、配列番号:19、配列番号:37、配列番号:43、配列番号:49及び配列番号:55のいずれか1つから選ばれる、請求項2又は3に記載のアルブミン結合ポリペプチド。
- ヒト血清アルブミンに結合することができる、請求項1〜4のいずれか1項に記載のアルブミン結合ポリペプチド。
- i)請求項1〜5のいずれか1項に記載のアルブミン結合ポリペプチドからなる第1の部分;及び
ii)所望の生物活性を有するポリペプチドからなる第2の部分;
を含む融合タンパク質又はコンジュゲート。 - 標識をさらに含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載のアルブミン結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲート。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のアルブミン結合ポリペプチド又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項8に記載のポリヌクレオチドを発現させることを含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載のポリペプチドの製造方法。
- 保護された反応性側鎖を有するアミノ酸及び/又はアミノ酸誘導体を用いた非生物学的ペプチド合成による、請求項1〜7のいずれか1項に記載のポリペプチドの製造方法であって、非生物学的ペプチド合成が、
アミノ酸及び/又はアミノ酸誘導体の段階的カップリングを行なって保護された反応性側鎖を有する請求項1〜7のいずれか1項に記載のポリペプチドを形成する工程;
ポリペプチドの反応性側鎖から保護基を除去する工程;及び
水溶液中でポリペプチドを折り畳む工程;
を含む、上記方法。 - 薬剤として使用するための、請求項6に記載の融合タンパク質又はコンジュゲート。
- 診断に使用するための、請求項6に記載の融合タンパク質又はコンジュゲート。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のアルブミン結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲートに結合された、
それ自体で100μg/mlを超えない水に対する溶解度を有する化合物を含む組成物であって;
ここにおいて、化合物及びアルブミン結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲートが共有結合されている、上記組成物。 - a)それ自体で100μg/mlを超えない水に対する溶解度を有する化合物を備える工程;及び
b)化合物を、請求項1〜7のいずれか1項に記載のアルブミン結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲートに共有結合させ、このようにして化合物及びアルブミン結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲートの共有結合性複合体を含む組成物
を形成する工程;
を含む、請求項13に記載の組成物の製造方法。 - 化合物の水溶解度を高める方法であって、それ自体で100μg/mlを超えない水への溶解度を有する化合物を備える工程;
化合物を、請求項1〜7のいずれか1項に記載のアルブミン結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲートに共有結合させ、こうして化合物及びアルブミン結合ポリペプチドの共有結合性複合体を形成する工程;並びに
アルブミン結合ポリペプチドとヒト血清アルブミンとの非共有結合性結合を促進する条件下で、化合物及びアルブミン結合ポリペプチド、融合タンパク質又はコンジュゲートの前記複合体をアルブミンと共に混合する工程;
を含み、それによって、該複合体中の化合物の水への溶解度が、化合物それ自体の水への溶解度より大きくなる、上記方法。
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