CN101294187B - 一种缓释生物活性多肽的方法与应用 - Google Patents
一种缓释生物活性多肽的方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种缓释生物活性多肽的方法与应用,该方法是用一种对血浆环境敏感的连接分子将生物活性多肽与血清白蛋白结合多肽连接起来组成一个融合多肽并转入宿主,宿主的血浆蛋白酶或血液的微碱性pH催化裂解连接分子,释放其中包涵的生物活性多肽,从而达到延长生物活性肽在人体内循环半衰期的目的。本发明的缓释生物活性多肽的方法可用于制备抗人类2-型糖尿病多肽药物、抗人类骨质疏松症多肽药物和抗癌多肽药物等多肽药物。本发明的缓释生物多肽的方法,不但延长了生物活性多肽在人体内循环的半衰期,还保持了生物活性多肽的生理活性,此外,使用融合多肽也比单独使用活性多肽具有更强的药物动力学性质。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,具体涉及一种以血浆蛋白酶或者血液的微碱性pH为基础缓释生物活性多肽的方法与应用。
背景技术
多肽在水溶液中没有特定的三维空间结构。分子量小于6千道尔顿的多肽可通过特异性地结合细胞信号途径中的蛋白质受体或者适配体来发挥独特的生物作用。因此,在获得有效的小分子药物之前,对于那些迫切需要治疗的疾病,例如糖尿病、癌症、艾滋病等,肽或者多肽类似物作为能够靶向性作用于那些偏轨的蛋白质-蛋白质信号作用,将是治疗这类疾病的有效手段。然而,肽类药物易被血浆蛋白酶水解,并被清除出体循环系统,使得它们的半衰期缩短而在临床使用中受到限制。因此,需要通过改善这些肽类的药物代谢动力学特性,以增强这些肽类药物在体内的功效。
目前的许多方法中,把一个生物活性蛋白(这个蛋白在给药以后易被清除)和一个血浆蛋白(这个蛋白是自然存在的,具有低的清除率)偶联在一起,是一种有前景提高生物活性肽半衰期的策略(Sheffield WP,Cardiovacs HaematolDisord 1,1-5,2001)这种融合蛋白临床应用的优势是能够减少药物注射的频率和提高药物在体内的浓度。一些病原体为免遭排斥而进化获得了特异性地结合到免疫球蛋白、白蛋白、纤维结合蛋白或者纤维蛋白素原等循环的蛋白质衍生物分子,以上策略与这种病原体的策略相似。
实际应用中,具有治疗作用的蛋白质或者肽往往是通过与血清白蛋白结合来改善其自身的半衰期短的药物代谢动力学性质。血清白蛋白是哺乳动物血液循环系统中最丰富的蛋白(人的血液中含量为40g/L)。人血清白蛋白广泛地分布于身体地各个部分,特别是在肠和血液这两个部分,在血液中,它主要与维持渗透压有关。人血清白蛋白是一种天然的载体,它参与内源性的运输,它能够传送数目众多的天然存在的分子,同样它也能够传送治疗的分子(Sellers等,Albumin Structure,Function and Uses,eds by Rosenoer VM et al,Pergamon,Oxford,p159,1977)。结合脂类、胆红素等分子就是它的功能之一。人血清白蛋白的半衰期是19天(McCurdy TR et al,J Lab Clin Med 143,115-120,2004)。这为延长治疗用的蛋白质或者多肽在体循环半衰期提供了一种有希望的方法。把蛋白直接共价的偶联到血清白蛋白上,或者连接到能够与血清白蛋白相互作用的肽或者蛋白上,这两种策略都已经被报道,且都能够导致蛋白在体内的半衰期的延长。利用白蛋白结合肽或者链球菌G蛋白的衍生物来延长在血液中的清除率很高的蛋白的半衰期(EP486525;US 6267964)。Roland Stork等报道了将抗体与链球菌G蛋白的白蛋白结合结构域(ABD)融合而改善抗体的药代动力学特性的策略(Roland Stork,Dafne Müller和Roland E.Kontermann’Protein Engineering Design and Selection,doi:10.1093/protein/gzm061)。这个策略也用于单链双特异性抗体(scDb CEACD3),融合抗体能够把细胞毒性T淋巴细胞导向到表达CEA的肿瘤细胞。这种新颖的具有三种功能的融合蛋白(scDb-ABD)可在哺乳动物细胞中被表达,且它能够同时识别人和鼠血清白蛋白这两种抗原。这个策略只增加了一个小的蛋白结构域(即46个氨基酸),利用了与血清白蛋白的高亲和力的非共价的相互作用,有希望将被广泛地用于改善小的重组抗体分子的血清半衰期。Dafne Müller等构建了一些重组的双特异性的抗体和血清白蛋白的融合蛋白,并分析了这些分子的生物活性和药代动力学性质(Dafne Müller,Anette Karle,Bettina Meiβburger,Ines ,Roland Stork,和Roland E.KontermannJ.Biol.Chem.,282,12650-12660,2007)。重组抗体的三个部分是由两个不同的scFv分子,双特异性的scDb或者taFv分子分别与人血清白蛋白融合而成。这些重组体抗体(scFv2-HSA,scDb-HSA,taFv-HAS)能够直接与肿瘤抗原、癌胚抗原以及T细胞受体复合物CD3相互作用,而且它们保留了未融合的所有结合能力。Dennis等利用噬菌体展示肽文库筛选出相对较短的多肽来结合到血清白蛋白上,这些肽能够与血清白蛋白结合,同时它们与具有肿瘤靶向性的生物活性化合物相连(Mark S.Dennis,Min Zhang,Y.Gloria Meng,Miryam Kadkhodayan,Daniel Kirchhofer,Dan Combs,和Lisa A.Damico,J Biol Chem 277,35035-35043,2002)。这些融合物的半衰期比单独生物活性肽长,并与那些由PEG共价修饰的生物活性肽分子的半衰期相当。另一方面,血清白蛋白融合物提供了一种新的普遍适用的方法,这个方法能够改善那些被快速清除的蛋白的药代动力学特性。Dennis等还利用抗体Fab4D5,即一个从单抗trastuzumab(HERCEPTIN)中获得的双功能分子,它能够同时结合血清白蛋白和肿瘤抗原HER2(erbB2)(Mark S.Dennis,Hongkui Jin,DebraDugger,Renhui Yang,Leanne McFarland,Annie Ogasawara,Simon Williams,Mary J.Cole,Sarajane Ross and Ralph Schwall,Cancer Res,67,254-61,2007)。更重要的是,AB.Fab4D5不会像Fab4D5那样在肾脏中蓄积,这说明这个双功能分子与血清白蛋白的相互作用改变了它的清除路径和新陈代谢途径。快速的靶向作用,优良的肿瘤沉淀和滞留可能使AB.Fab成为一个用于成像和肿瘤治疗的特殊分子。Vladimir Tolmachev等报道说,通过与血清白蛋白的可逆结合能够有效地降低肾脏的排泄和吸收(Vladimir Tolmachev,Anna Orlova等,Cancer Res,67,2773-82,2007)。
作为另一种选择,多肽或者蛋白质药物同样能够直接与血清白蛋白融合。CD4蛋白上的两个细胞外的类似免疫球蛋白结构域(V1、V2)与人血清白蛋白的结合不但保持了CD4的生物活性,而且在一个实验兔模型中与单独的CD4相比,其半衰期提高了140倍,即从0.25±0.1小时提高到到34±4小时(Yeh等,Proc Natl Acad Sci USA,89,1904-1910,1992)。Sung等人观察到,当干扰素β与人血清白蛋白结合后,干扰素β的半衰期从8小时提高到了36-40小时(Sung等,J Interferon Cytokine Res,23,25-28,2003)。
Baggio等报道说,人胰高血糖素样肽1(GLP-1)与血清白蛋白的重组体蛋白(Albugon),在BHK-GLP-1R细胞中具有激化GLP-1受体依赖的cAMP的形成(Baggio等,Diabetes,53,2492-2500,2004)。虽然与GLP-1受体促进剂exendin-4相比EC50有所降低(0.2:20nmol/mol)。Jung-Guk Kim等检测了CJC-1131的生物活性,CJC-1131是一种DPP IV耐受的GLP-1衍生物,GLP-1与血清白蛋白共价结合(Jung-Guk Kim等,Diabetes,52,751-759,2003)。这些实验结果证实与血清白蛋白结合的耐受DPP IV的GLP-1化合物(albumin-conjugated DAC:GLP-1)模拟了天然GLP-1的活动,代表一种新的延长GLP-1受体信号的激活作用的方法。(Yoram Shechter等,Bioconjug Chem.,16,913-920,2005)报道说,在生理条件下胰岛素和血清白蛋白的结合物能够缓慢地释放胰岛素,这为长效胰岛素提供了一种新的概念。皮下注射这种长效胰岛素后,降糖效果的出现推迟了0.5-1个小时,并且持续了12个小时。
肽或蛋白药物可通过多种方法增强其在体内的稳定性,提高其半衰期,如与人血清白蛋白或人血清白蛋白结合蛋白的共价链接等,但是这些方法使得结合的肽或蛋白药物因融合而部分或者完全丧失了活力,且结合的肽或蛋白药物不能被释放出来。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足,提供一种缓释生物活性多肽的方法,该方法以血浆蛋白酶或者血液的微碱性pH为基础缓释生物活性多肽,其释放的多肽依然保持有生理活性,从而延长了生物活性多肽在体内的半衰期。
本发明的另一个目的在于提供上述方法在制备多肽药物中的应用。
本发明的方法其技术原理为:给与宿主一种融合多肽,这个融合肽包括一个生物活性肽和一个血清白蛋白结合肽,二种多肽之间由可被血浆蛋白酶或血液的微碱性pH催化裂解的连接分子连接,当该融合肽转入宿主体内后,宿主体内的血浆蛋白酶或者血液的中性、碱性环境作为开关就可缓慢地释放包涵于融合肽内的生物活性肽,从而达到延长生物活性多肽在体内循环半衰期的目的。
本发明的方法中所述的融合多肽,是由一种对血浆环境敏感的连接分子将生物活性肽与血清白蛋白结合肽(ABP)连接而成的,其结构为(ABP-LK-PEP)或(PEP-LK-ABP)。
上述结构式中:ABP为具有式(I)所示氨基酸序列的血清白蛋白结合肽,是对血清白蛋白具有高亲和力的12肽序列;
Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12
(I)
其中:
Xaa1为亮氨酸或其他氨基酸;
Xaa2、Xaa11为脯氨酸或其他氨基酸;
Xaa3、Xaa9均为除了半胱氨酸以外的任意一种氨基酸;
Xaa4、Xaa5、Xaa12可以是任意一种氨基酸;
Xaa6、Xaa8为带正电荷的氨基酸;
Xaa7、Xaa10为疏水性氨基酸。
在式(1)所示氨基酸序列中,亮氨酸和脯氨酸为保守氨基酸,这两个氨基酸的具体位置和数目并不固定,可适用于本发明的血清白蛋白结合肽有SLFRHQHATPQI、SLLHWTHKIPAL、KYNHSHLYWQRP、NVCLPKWGCLWE、DVCLPQWGCLWG、DICLPRWGCLWE和NICLPRWGCLWD等;当Xaa1为亮氨酸,Xaa2和Xaa11为脯氨酸时,可适用于本发明的血清白蛋白结合肽为LPWHLKYREPPR、LPHSHRAHSLPP。
PEP是指任意一种活性肽,这些多肽在经过与血清白蛋白结合肽融合后,它们的半衰期能够被增强,这些肽包括人胰高血糖素样肽1或其类似物、降钙素、与Bcl-2簇细胞凋亡蛋白相结合的多肽(如Bax蛋白的BH3多肽)等。
LK是能够被在生理学上存在的血浆蛋白酶或者血液的微碱性pH切开的连接分子,如二硫键或凝血蛋白酶识别位点。上述连接分子充当一种机关功能,逐步释放生物活性多肽。当连接分子为凝血蛋白酶识别位点时,该连接分子具有式(II)所示氨基酸序列:
Xaaj-Xaak-Xaai-Arg-Xaam-Xaan
(II)
其中:Xaaj、Xaak为疏水氨基酸或缺失;
Xaai为脯氨酸或缬氨酸;
Xaam、Xaan为非酸性氨基酸或缺失。
可适用于作为本发明连接分子的凝血蛋白酶识别位点有:FNPRGA、FNPRGS、FNPRGP、FNPRPP、FNPRPA等。
当LK为二硫键时,在生物活性肽的氨基端和ABP的羧基端各引入一个半胱氨酸,两种多肽之间由二硫键链接。
本发明的血清白蛋白结合肽是利用M13噬菌体展示肽文库筛选出来的,如New England Biolabs的Ph.D.-12噬菌体文库,New England Biolabs的Ph.D.-12噬菌体文库是线性随机12肽文库,该文库中复合物至少有109个,它们的滴度是1012pfu/ml。
本发明将人血清白蛋白通过物理吸附固定在多孔板上,用Ph.D.-12文库与多孔板上的人血清蛋白相互作用,洗涤未结合噬菌体,再洗脱分离已结合的噬菌体,扩增洗脱物并重复淘选,利用通用引物-96gIII(例如:New EnglandBiolabs的引物5′-CCCTCATAGTAGCGTAACG-3′),对最后三步淘洗出来的噬菌体颗粒进行DNA测序分析后,即可获得对人血清白蛋白具有高度亲和力的12肽序列,即为血清白蛋白的结合肽(ABP),该结合肽具有式(I)所示氨基酸序列,也称为基序。
本发明的血清白蛋白结合肽,其基序与Denis等(Denis等,J Biol Chem277,35035-35043,2002)发现的多肽序列有明显的区别,Denis等发现的多肽序列为半保守,而本发明的12肽序列,其保守氨基酸为亮氨酸和脯氨酸,且保守氨基酸中不含有半胱氨酸。
本发明的融合多肽可以通过标准的固相法多肽合成技术制备:肽合成仪为商业化产品,例如Applied Biosystems公司生产的多肽合成仪产品;固相法合成多肽用试剂可从化学原料公司购买。例如:NovaBiochem的产品;合成方法为本技术领域人员通常使用的常规方法,包括保护氨基酸反应,偶联,去偶联等步骤。
本发明的融合多肽还可以通过重组DNA技术来制备。例如,利用pMFH/大肠杆菌蛋白表达系统(Su ZD等,Protein Eng Des Sel.17,647-657,2004),将ABP-LK-PEP肽基因序列融合到一个融合蛋白载体(如MFH)上,表达出一个融合蛋白(如MFH-ABP-LK-PEP),接着该融合蛋白,通过化学裂解来释放出与血清白蛋白有结合能力的融合多肽(即ABP-LK-PEP肽)。通过等离子共振法测定这些融合多肽与人血清白蛋白的亲合力。
本发明利用血液的生理微碱性pH环境作为催化剂来还原二硫键连接分子,从而缓慢释放生物活性多肽。在不同pH值的溶液条件下,二硫键的稳定性是不同的,酸性pH环境能够二硫键稳定,而中性或者碱性pH环境下则二硫键不稳定。在生理条件下,血液的pH值为中偏碱性,如人体血液的pH值为7.4左右。这提供了一个极好地生理然环境来自行还原二硫键。
本发明还可以利用生理上存在的生物催化剂从融合多肽中释放出生物活性多肽。血浆蛋白酶是特异性最高的蛋白降解酶,而且在生理条件下它被严格地调控,凝血酶是被研究的最透彻的几个血浆蛋白酶之一,在正常人的血液中有微量活性的凝血酶,而在病患者血液中凝血酶活性比正常人的稍高(如糖尿病,癌症病)。假如以凝血酶作为活化功能肽的开关,理论上,这样微量的凝血酶能够作用于它的底物,即一段氨基酸序列,可达到缓释多肽的目的。氨基酸序列:亮氨酸-缬氨酸-脯氨酸-精氨酸-甘氨酸-丝氨酸,被发现为牛凝血酶的最佳作用底物,人凝血酶同样能够识别这个序列,但人凝血酶比牛凝血酶能够更加高效地识别另一种氨基酸序列,即苯丙氨酸-天冬酰胺-脯氨酸-精氨酸-甘氨酸-丝氨酸(Su ZD等,Protein Eng Des Sel.17,647-657,2004)。
本发明的缓释生物活性多肽的方法可用于制备抗人类2-型糖尿病、抗人类骨质疏松症、抗癌等疾病的多肽药物,且该多肽药物可与药物学上可接受的任何载体混合。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:1.本发明的缓释生物活性多肽的方法,其采用的融合多肽结构保证了生物活性多肽在体内的缓慢释放,不但延长了生物活性多肽在人体内循环的半衰期,还保持了生物活性多肽的生理活性;2.本发明使用融合多肽比单独使用活性多肽具有更强的药物动力学性质;3.本发明的缓释生物活性多肽的方法,其所用融合多肽,虽然也是采用将多肽药物与血清白蛋白结合肽连接起来,但是本发明的连接是采用一种能够被在生理学上存在的血浆蛋白酶或者血液的微碱性pH切开的连接分子,这使得整个融合多肽对血浆环境的非常敏感,可根据人体的自身需要来控制融合多肽释放生物多肽药物,同时也保证了所释放多肽的活性。
附图说明
图1为ELISA法测定序列1~9的噬菌体与人血清白蛋白结合能力曲线图;
图2为纯化后融合蛋白的高效液相色谱图;
图3为纯化后融合多肽的高效液相色谱图;
图4为等离子共振(SPR)实验测定DP3.1融合多肽与人白蛋白结合力的动力学曲线图;
图5为当肽段被人凝血酶水解时DP6.2肽浓度(即峰面积)与时间之间的函数关系图;
图6为ABP-LK-GLP-1-3.1肽峰面积在被凝血酶和DPP IV水解时与时间之间的函数关系图;
图7为ABP-LK-GLP-1-4.1肽被人凝血酶和DPP IV水解时,峰值区域与时间之间的函数关系图。
具体实施方式
实施例1噬菌体展示法筛选人血清白蛋白结合肽
本实施例采用New England Biolabs的Ph.D.-12噬菌体文库,来筛选人血清白蛋白结合肽。
New England Biolabs的Ph.D.-12噬菌体文库是以M13噬菌体为根据来设计的,包含线性的12个肽的随机组合序列。这个文库的多肽种类至少有109个,它们的滴度是1012pfu/ml。
噬菌体展示文库筛选人血清白蛋白结合肽一共进行四轮筛选:
将人血清白蛋白(Sigma-Aldrich,St-Louis,USA)溶于0.1mol/L的NaHCO3缓冲液中(pH 8.6),配制成100μg/ml的人血清白蛋白溶液(pH 8.6)。
第一轮筛选:
1.取1.5ml的人血清白蛋白溶液(100μg/ml,pH 8.6)加入到无菌的聚苯乙烯培养皿(60×15mm)中,然后将平板放在4℃潮湿容器中,慢速振荡过夜。
2.噬菌体库使用量为10μl,溶解在1ml含0.1体积%吐温-20的TBS缓冲液中,将噬菌体文库加入到上述已包被好的平板中,噬菌体文库与人血清白蛋白在室温条件下温和地振荡结合1小时。
3.结合后,用含有0.1%吐温-20的TBS缓冲液重复洗涤,去除没有结合的噬菌体。
4.将人血清白蛋白溶于2mol/L的Glycine-HCl(pH 2.2)中,配制成浓度为1mg/ml的溶液,用该溶液洗脱结合的噬菌体,洗脱时间少于10分钟,然后马上加入150μl的1mol/L Tris-HCl(pH 9.1)中和洗脱的噬菌体。
5.将洗脱的噬菌体取少量利用大肠杆菌ER2738通过滴定法确定噬菌体的浓度,其余洗脱的噬菌体进行扩增:将过夜培养的大肠杆菌ER2738细胞按照1∶100的比例稀释到LB培养基中;取1ml稀释的培养物于培养管中;用灭菌木牙签在不多于100个噬菌斑的平板中取一个蓝斑,并转移到含有稀释培养液的试管中,在37℃振荡培养5小时;然后把培养液转移至微量离心管中,12,000转速下离心10分钟,收集上清液即为扩增的噬菌体;吸取80%的上清液,储藏在4℃,通常,在数星期内,其滴度应保持不变。
第二轮:
取1.5ml 100μg/ml pH8.6的人血清白蛋白溶液加入到无菌的聚苯乙烯培养皿(60×15mm)中,然后将平板放在4℃潮湿容器中,慢速振荡过夜,封闭后加入第一轮扩增后的噬菌体文库,进行第二轮筛选,步骤与第一轮筛选相同。
第三轮:
将取1.5ml 100μg/ml pH8.6的人血清白蛋白溶液加入到无菌的聚苯乙烯培养皿(60×15mm)中,然后将平板放在4℃潮湿容器中,慢速振荡过夜,封闭后加入第二轮扩增后的噬菌体文库,进行第三轮筛选,步骤与第一轮筛选相同。
第四轮:
取1.5ml 100μg/ml pH8.6的人血清白蛋白溶液加入到无菌的聚苯乙烯培养皿(60×15mm)中,然后将平板放在4℃潮湿容器中,慢速振荡过夜,封闭后加入第三轮扩增后的噬菌体文库,噬菌体与人血清白蛋白在室温条件下温和地振荡结合20分钟,洗涤去除未结合噬菌体时,将TBS缓冲液中的吐温-20提高到0.3体积%,进行第四轮筛选,步骤与第一轮筛选相同,但是不用检测噬菌体滴度和扩增噬菌体。
将第二、三和四轮筛选洗出来的噬菌体中随机选择10~20个噬菌斑进行DNA测序,采用通用引物96gIII,(其序列为5′-CCC TCATAG TTA GCG TAACG-3′),表1总结了经DNA序列测定结果而推演出的氨基酸序列。
表1噬菌体展示文库筛选出的对人血清白蛋白有高度亲和力的氨基酸序列
序列号 | 氨基酸序列 |
1 | NVCLPKWGCLWE |
2 | DVCLPQWGCLWG |
3 | DICLPRWGCLWE |
4 | NICLPRWGCLWD |
5 | LPWHLKYREPPR |
6 | LPHSHRAHSLPP |
7 | SLFRHQHATPQI |
8 | SLLHWTHKIPAL |
9 | KYNHSHLYWQRP |
实施例2 酶联免疫吸附实验(ELISA)法测定所筛选噬菌体与人血清白蛋白的亲和力
将实施例1得到的分别含有表1所示9条氨基酸序列的噬菌斑均各自进行单克隆筛选以及纯培养,得到分别含有上述9条肽链的噬菌体单克隆,用于本实施例的试验。
用0.1mol/L的NaHCO3稀释人血清白蛋白溶液至100μg/ml,用该溶液覆盖一排ELISA多孔板板孔,每孔加入200μL该溶液后,放置在密封的潮湿环境中4℃过夜。另外一个多孔板用来连续稀释噬菌体。这两个板都用1%酪蛋白溶液(溶于0.1mol/L NaHCO3)覆盖。每一组噬菌体单克隆均连续稀释四倍,让第一个孔中含有约1012个噬菌体颗粒,最后一个孔含有约2.0×105个噬菌体颗粒。利用多通道移液管把每一排被稀释的噬菌体转移到已用人血清白蛋白覆盖的多孔板。室温下振荡培养1小时,用含有0.3%(体积比)Tween-20的TBS缓冲液反复洗涤,再用兔抗M13噬菌体抗体孵育,然后用辣根过氧化物酶连接的羊抗兔IgG孵育,测定结合的噬菌体。
通过加入ABTS/H2O2底物,在405nm处检测来确定结合的辣根过氧化物酶量。每一个样品重复测定三次。表2统计了在405nm处读出的每一组吸光度数值。在对照组实验中,不加入噬菌体,表3统计了在405nm处读出的底物背景吸光率。ELISA法测定的每一个结合噬菌体在405nm的吸光率与结合的噬菌体数量成正比,如图1所示。
表2酶联免疫吸附实验(ELISA)法测定白蛋白与结合噬菌体的亲和力
序列号 | 12 | 11 | 10 | 9 | 8 | 7 | 6 | 5 | 4 | 3 | 2 | 1 | |
1 | 样品 | 0.084 | 0.090 | 0.093 | 0.108 | 0.126 | 0.156 | 0.183 | 0.291 | 0.510 | 0.976 | 1.344 | 1.492 |
1 | 空白 | 0.040 | 0.044 | 0.044 | 0.044 | 0.045 | 0.048 | 0.049 | 0.050 | 0.050 | 0.051 | 0.051 | 0.058 |
2 | 样品 | 0.068 | 0.071 | 0.075 | 0.084 | 0.098 | 0.115 | 0.141 | 0.178 | 0.279 | 0.356 | 0.389 | 0.411 |
2 | 空白 | 0.035 | 0.035 | 0.035 | 0.035 | 0.036 | 0.036 | 0.035 | 0.035 | 0.035 | 0.036 | 0.038 | 0.039 |
3 | 样品 | 0.095 | 0.097 | 0.100 | 0.117 | 0.140 | 0.187 | 0.260 | 0.461 | 0.901 | 1.402 | 1.831 | 2.036 |
3 | 空白 | 0.037 | 0.038 | 0.041 | 0.041 | 0.043 | 0.045 | 0.046 | 0.053 | 0.055 | 0.055 | 0.061 | 0.063 |
4 | 样品 | 0.080 | 0.081 | 0.094 | 0.095 | 0.115 | 0.163 | 0.214 | 0.409 | 0.811 | 1.208 | 1.571 | 1.781 |
4 | 空白 | 0.041 | 0.041 | 0.043 | 0.043 | 0.044 | 0.047 | 0.048 | 0.048 | 0.053 | 0.055 | 0.055 | 0.058 |
5 | 样品 | 0.071 | 0.076 | 0.077 | 0.086 | 0.104 | 0.123 | 0.155 | 0.198 | 0.302 | 0.406 | 0.501 | 0.593 |
5 | 空白 | 0.040 | 0.040 | 0.041 | 0.041 | 0.043 | 0.043 | 0.045 | 0.045 | 0.046 | 0.047 | 0.047 | 0.048 |
6 | 样品 | 0.085 | 0.090 | 0.094 | 0.110 | 0.125 | 0.181 | 0.253 | 0.431 | 0.883 | 1.333 | 1.723 | 1.969 |
6 | 空白 | 0.043 | 0.043 | 0.044 | 0.046 | 0.046 | 0.047 | 0.055 | 0.061 | 0.064 | 0.067 | 0.069 | 0.077 |
7 | 样品 | 0.080 | 0.080 | 0.081 | 0.091 | 0.110 | 0.129 | 0.143 | 0.251 | 0.543 | 0.761 | 0.931 | 1.105 |
7 | 空白 | 0.043 | 0.043 | 0.044 | 0.044 | 0.044 | 0.044 | 0.043 | 0.044 | 0.047 | 0.044 | 0.047 | 0.048 |
8 | 样品 | 0.078 | 0.082 | 0.085 | 0.101 | 0.121 | 0.141 | 0.164 | 0.267 | 0.575 | 0.875 | 1.114 | 1.250 |
8 | 空白 | 0.040 | 0.040 | 0.042 | 0.043 | 0.043 | 0.044 | 0.044 | 0.046 | 0.048 | 0.049 | 0.049 | 0.049 |
9 | 样品 | 0.077 | 0.078 | 0.085 | 0.097 | 0.097 | 0.120 | 0.149 | 0.193 | 0.299 | 0.619 | 0.804 | 0.910 |
9 | 空白 | 0.043 | 0.043 | 0.043 | 0.044 | 0.044 | 0.044 | 0.045 | 0.047 | 0.048 | 0.049 | 0.049 | 0.051 |
表2中,数字1,2,3......12表示4倍系列稀释后依次升高的噬菌体数目,如1表示2.4×105,12表示1012;序列号1-9是含表1所述9条肽链的噬菌体的单克隆,如本表中序列号1即是含有表1中序列号1所对应氨基酸序列NVCLPKWGCLWE的噬菌体单克隆。
表3 9种经选择的噬菌体用酶联免疫吸附实验(ELISA)法测定时的吸光值
序列号 | 12 | 11 | 10 | 9 | 8 | 7 | 6 | 5 | 4 | 3 | 2 | 1 |
1 | 0.040 | 0.046 | 0.049 | 0.064 | 0.081 | 0.108 | 0.134 | 0.241 | 0.560 | 0.925 | 1.293 | 1.434 |
2 | 0.033 | 0.036 | 0.040 | 0.049 | 0.062 | 0.079 | 0.106 | 0.143 | 0.244 | 0.320 | 0.351 | 0.372 |
3 | 0.058 | 0.059 | 0.059 | 0.076 | 0.097 | 0.142 | 0.214 | 0.408 | 0.846 | 1.347 | 1.770 | 1.973 |
4 | 0.039 | 0.040 | 0.051 | 0.052 | 0.071 | 0.116 | 0.166 | 0.361 | 0.758 | 1.153 | 1.516 | 1.723 |
5 | 0.031 | 0.036 | 0.036 | 0.045 | 0.061 | 0.080 | 0.110 | 0.153 | 0.256 | 0.359 | 0.454 | 0.545 |
6 | 0.042 | 0.047 | 0.050 | 0.064 | 0.079 | 0.134 | 0.198 | 0.370 | 0.819 | 1.266 | 1.654 | 1.892 |
7 | 0.037 | 0.037 | 0.037 | 0.047 | 0.066 | 0.085 | 0.100 | 0.207 | 0.496 | 0.717 | 0.884 | 1.057 |
8 | 0.038 | 0.042 | 0.043 | 0.058 | 0.078 | 0.097 | 0.120 | 0.221 | 0.527 | 0.826 | 1.065 | 1.201 |
9 | 0.034 | 0.035 | 0.042 | 0.053 | 0.053 | 0.076 | 0.104 | 0.146 | 0.251 | 0.570 | 0.755 | 0.859 |
表3中,数字1,2,3......12表示4倍系列稀释后依次升高的噬菌体数目,如1表示2.4×105,12表示1012;实验重复3次,表中数值为(阳性组值-对照组值)3次的平均值;序列号1-9是含表1所述9条肽链的噬菌体的单克隆,如本表中序列号1即是含有表1中序列号1所对应氨基酸序列NVCLPKWGCLWE的噬菌体单克隆。
实施例3 利用重组DNA技术制备抗2型糖尿病的ABP-LK-GLP融合肽
在本实施例中,以人胰高血糖素样肽1(GLP-1)为例,来设计治疗2-型糖尿病的新治疗肽。
大约90%的糖尿病患者患的是2型糖尿病,2型糖尿病又称非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)。2型糖尿病患者通常能够产生胰岛素,但是产生的胰岛素不能被体细胞有效的利用。这主要是因为针对血糖升高的水平产生的胰岛素并不足以使细胞有效地吸收葡萄糖,从而达不到降低血糖水平的目的。
自从人胰高血糖素样肽1在1984年被发现以来,它已经被证实在临床上对糖尿病的各个阶段都能有效降低血糖浓度。更重要的是,使用人胰高血糖素样肽时,几乎没有观察到低血糖的危险,因为,人胰高血糖素样肽1只是刺激天然葡萄糖诱导的胰岛素分泌。胰高血糖素样肽1可诱导很多生物效应,例如:刺激胰岛素的分泌,抑制胰高血糖素分泌,抑制胃的排空,提高葡萄糖的利用,以及诱导体重减轻。此外,临床前的研究表明胰高血糖素样肽1还可以阻止糖尿病发展过程中发生的β-细胞的退化。其最凸出的特性可能是它在刺激胰岛素分泌的同时并不会有血糖过低的危险,而在用胰岛素疗法或者一些引起胰岛素表达提高的口服药疗法中常发生血糖过低的危险。
人胰高血糖素样肽-1由于治疗2型糖尿病具有一些独一无二的并且有益的效果而成为潜在的药物。通过体内的基因疗法能够持续的产生治疗水平的人胰高血糖素样肽1,这可缓和高血糖症,维持长时间的正常血糖量。近来,筛选的人胰高血糖素样肽1受体的小分子促效剂的研究工作刚开始,到临床使用将有很多的工作路要做。综合来说,利用多肽分子来治疗2型糖尿病的方法已经被大家所接受,因为人胰高血糖素样肽1和其受体的相互作用涉及较大的相互作用界面。在过去的十年间,已经通过突变和侧链替代等方法设计了许多人胰高血糖素样肽类似物,但是除发现Extindin-4外,并没有什么显著的进步。然而,这些人胰高血糖素样肽1类似物要么降低了活性,要么仍然很快被清除。
人胰高血糖素样肽1是一个内源性的具有30或者31个氨基酸残基的多肽,从胰高血糖素原前体中断裂得来,它有两种天然结构,GLP-1(7-36)氨基和GLP-1(7-37),其中GLP-1(7-36)氨基的氨基酸序列为HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-NH2;GLP-1(7-37)的氨基酸序列为HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG。
人胰高血糖素样肽1作为一种治疗药物,受限于它会被二肽酶DPP IV以及中性的肽链内切酶NEP24.11快速降解。人胰高血糖素样肽1的N-末端是受体的核心部分,具有高亲和力,C-末端通过与受体的N-末端的相互作用来确保它的选择性。所以,改造这种药物的挑战在于构建一种稳定的具有长半衰期的人胰高血糖素样肽1类似物。表4列举出一系列按ABP-LK-PEP模式设计的缓释人胰高血糖素样肽1(GLP-1)的融合多肽。ABP-LK-GLP多肽通过甲硫氨酸(Met,或M)或者天冬氨酸-辅氨酸序列(Asp-Pro或DP)与MFH融合载体相连形成融合蛋白,这种连接便于化学水解。这些ABP-LK-GLP多肽可按照我们已专利化的方法进行制备(Osborne JM和Su ZD等,J.Biomol.NMR,26,317-326,2003;Su ZD等,Protein Eng Des Sel.17,647-657,2004;Li HJ等,Protein Expression&Purification,50,238-46,2006;Su ZD等,PCT/CA2003/001197)。化学裂解后,连接MFH融合载体和ABP-LK-GLP多肽之间的甲硫氨酸(即M或Met)将随MFH融合载体除去。连接MFH融合载体和ABP-LK-GLP多肽之间的天冬氨酸-辅氨酸序列(DP或Asp-Pro)中的天冬氨酸(即D或Asp)将随MFH融合载体除去,但辅氨酸(即P或Pro)将保留在ABP-LK-GLP多肽的羧基端。分析测定证明,保留在ABP-LK-GLP多肽的羧基端的辅氨酸不影响ABP-LK-GLP多肽与血清白蛋白的亲和能力。
表4缓释人胰高血糖素样多肽-1类似物
氨基酸序列 | 名称 |
PDICLPRWGCLWEFNPRGA HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | DP3.1 |
PDICLPRWGCLWEFNPRGP HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | DP3.2 |
PDICLPRWGCLWEFNPRGS HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | DP3.3 |
PNICLPRWGCLWDFNPRGA HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | DP4.1 |
PNICLPRWGCLWDFNPRGP HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | DP4.2 |
PNICLPRWGCLWDFNPRGS HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | DP4.3 |
PLPHSHRAHSLPPFNPRGA HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | DP6.1 |
PLPHSHRAHSLPPFNPRGP HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | DP6.2 |
PLPHSHRAHSLPPFNPRGS HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | DP6.3 |
PSLLHWTHKIPALFNPRGA HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | DP8.1 |
PSLLHWTHKIPALFNPRGP HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | DP8.2 |
PSSLLHWTHKIPALFNPRGS HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | DP8.3 |
DICLPRWGCLWEFNPRGA HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | M3.1 |
DICLPRWGCLWEFNPRGP HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | M3.2 |
DICLPRWGCLWEFNPRGS HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | M3.3 |
NICLPRWGCLWDFNPRGA HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | M4.1 |
NICLPRWGCLWDFNPRGP HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | M4.2 |
NICLPRWGCLWDFNPRGS HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | M4.3 |
LPHSHRAHSLPPFNPRGA HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | M6.1 |
LPHSHRAHSLPPFNPRGP HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | M6.2 |
LPHSHRAHSLPPFNPRGS HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | M6.3 |
SLLHWTHKIPALFNPRGA HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | M8.1 |
SLLHWTHKIPALFNPRGP HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | M8.2 |
SLLHWTHKIPALFNPRGS HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | M8.3 |
LPHSHRAHSLPPFNPRPP HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | PP6.2 |
LPHSHRAHSLPPFNPRPA HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | PA6.2 |
每个用于表达表4中融合多肽(即ABP-LK-GLP)的DNA序列通过使用2个部分重叠的5′-寡核苷酸引物和一个3′-寡核苷酸引物,以标准的PCR方法,以质粒pCMFH-GLP-1(Li HJ等,Protein Expression&Purification,50,238-46,2006)中的GLP-1基因为模板,进行扩增GLP-1(7-37)基因。引物的设计采用大肠杆菌偏好的密码子,5′-寡核苷酸引物用于在GLP-1(7-37)基因的5′-端引入ABP即LK的DNA序列。同时在PCR产物的5′-端和3-端分别引入EcoR I和BamH I酶切位点。PCR产物为编码的重组体多肽ABP-LK-GLP的DNA片段,PCR的产物用Qiagen PCR产物纯化试剂盒(Mississauga,Ontario)纯化,用EcoR I和BamH I进行水解形成粘性末端,再将酶切过的DNA片断插入到经同样酶切处理过的pMFH-MCS表达载体上。构建好的重组ABP-LK-GLP-1多肽表达质粒经DNA测序确认,分别命名为pMFH-DP3.1,pMFH-DP3.2,pMFH-DP3.3,pMFH-DP4.1,pMFH-DP4.2,pMFH-DP4.3,pMFH-DP6.1,pMFH-DP6.2,pMFH-DP6.3,pMFH-DP8.1,pMFH-DP8.2,和pMFH-DP8.3,及pMFH-M3.1,pMFH-M3.2,pMFH-M3.3,pMFH-M4.1,pMFH-M4.2,pMFH-M4.3,pMFH-M6.1,pMFH-M6.2,pMFH-M6.3,pMFH-M8.1,pMFH-M8.2,pMFH-M8.3,pMFH-PP6.2 and pMFH-PA6.2。
以上质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌进行融合蛋白表达。
用Ni-NTA琼脂糖树脂以标准步骤进行纯化,其具体步骤如下:
(1)在含有100μg/ml青霉素的50毫升LB培养基中接种,培养过夜之后,转接于1升含有同样浓度青霉素的LB培养基中,37℃培养;
(2)当菌体浓度达到OD600nm=0.8时,加入终浓度为1mmol/L IPTG开始诱导,诱导的条件为37℃培养12小时后,在6000转/分钟转速下离心20分钟收集菌体;
(3)将上述菌体重新悬浮,轻柔振荡20分钟,悬浮液含有6mol/L尿素、20mmol/L的Tris-HCl(pH8.0)和100mmol/L NaCl;
(4)接着将菌体用超生波处理1分钟之后,10,000转/分钟转速下离心30分钟,收集上清液;
(5)裂解液含有50mmol/L的Tris(pH 8.0)、100mmol/L NaCl和6mol/L尿素溶液,用该裂解液平衡Ni-NTA树脂柱,平衡好后加入上述上清液,然后用含有10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L和40mmol/L咪唑浓度的裂解液对Ni-NTA树脂柱进行预洗脱,目标蛋白用含有200mmol/L咪唑浓度的裂解液从Ni-NTA树脂柱洗脱,洗脱液用C18 Sep-Pak柱进行脱盐,最后冷冻干燥。
融合蛋白经过SDS-PAGE,HPLC和质谱测定进行鉴定,如2所示,证实纯化后的融合蛋白纯度超过99%。蛋白质浓度以在OD280nm处的吸光值进行计算(Gill和von Hippel,Anal Biochem.,182,319-26,1989)。
融合蛋白用70%甲酸(含有溴化氰或者不含溴化氰)水解释放多肽ABP-LK-GLP。当70%甲酸中含有溴化氰时,溴化氰晶体以与融合蛋白的终摩尔比为100∶1的量加入,之后室温下避光静置24小时。当70%甲酸中不含有溴化氰时,该水解反应的条件为45℃,避光温和振荡24小时,水解溶液用旋转蒸发仪蒸发至干燥,得冻干粉末。
将上述冻干粉末溶解于6mol/L尿素和10mmol/L Tris的溶液中,将其pH调至7.0以上,将溶液再过一次Ni-NTA树脂柱,除去MFH融合载体和残余的未消化的融合蛋白,将得到的含有多肽ABP-LK-GLP的流出液用C18Sep-Pak柱进行脱盐,冷冻干燥。最后将此重组多肽利用HPLC C18反相柱进行纯化,为含0.2%甲酸的水-乙腈梯度溶液洗脱。
纯化后的多肽ABP-LK-GLP用SDS-PAGE、HPLC和质谱测定法进行检测,如图3所示,证实该纯化后的多肽纯度超过99%。蛋白质浓度以OD280nm处的吸光值进行计算(Gill和von Hippel,Anal Biochem.,182,319-26,1989)。
实施例4固相法制备ABP-LK-PEP融合多肽。
利用二甲基六氢吡啶甲酰胺的胺保护和2-(2-吡啶酮-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸的偶合作用,在PerSeptive Biosystems多肽自动合成仪中产生的9-芴甲氧羰基衍生物,通过聚乙烯-乙二醇-聚苯乙烯树脂,也可以制备ABP-LK-PEP融合多肽。所有9-芴甲氧羰基氨基酸,其他化学物质和溶剂均由商业来源购得。C-末端酰胺的类似物用50umol Rink AM树脂制备。氨基酸的切割和脱保护反应在90体积%三氟乙酸,5体积%苯甲硫醚,3体积%苯甲醚和2体积%乙二硫醇中进行。粗制的多肽利用HPLC C18反相柱上进行纯化,洗脱液为含0.1体积%甲酸的水-乙腈梯度溶液。纯化后多肽以质谱测定法验证。所有蛋白的纯度可达到99%或以上。
实施例5 ABP-LK-PEP融合多肽的氨基化
含有C-末端氨基的ABP-LK-PEP融合多肽,可采用先酶法转酰基,再光解作用除去保护基团的方法制备。
转酰胺基反应在50mmol/L HEPES缓冲液(pH 7.5,含5mmol/L EDTA)或50mmol/L CHES缓冲液(pH 9.5,含5mmol/L EDTA)中进行。多肽底物用5体积%乙酸溶解制得浓度为40mmol/L的多肽底物溶液。亲核试剂(比如亮氨酸)溶解于50mmol/L HEPES缓冲液(pH 7.5,含5mmol/L EDTA),制得终浓度为500mmol/L的亲核试剂溶液。每20μl多肽底物溶液于950μl亲核试剂溶液混合,再以25μl/每毫升混合液的量加入羧肽酶,羧肽酶终浓度为0.002~0.07mg/ml。该过程由HPLC检测,当没有其他产物形成时加入2.5体积%的三氟醋酸可中止反应。
转酰胺基作用也可以在有机溶剂的环境中进行,合适的有机溶剂包括二甲基亚砜,N,N′-乙酰二甲胺,二甲基甲酰胺等类似的溶剂。该方法在{Bongerset al.,Int.J Peptide Protein Res.,40:268,1992}中有描述。
转酰胺基作用还可以发生于水溶性溶液中。多肽底物用5体积%乙酸溶解制得浓度为40mmol/L的多肽底物溶液。亲核试剂,比如亮氨酸,溶解于50mmol/L HEPES缓冲液(pH 7.5,含5mmol/L EDTA),制得终浓度为500mmol/L的亲核试剂溶液。取多肽底物溶液20μl加入950μl亲核试剂溶液,20℃,再将羧肽酶以25μl/每毫升溶液的量加入混合液中,羧肽酶终浓度为0.002~0.07mg/ml。转酰基作用的产物为ABP-LK-GLP-ONPGA。该过程由HPLC检测,当没有其他产物形成时加入2.5体积%的三氟醋酸可中止反应。
转酰基产物,即ABP-LK-GLP-ONPGA,可由光分解进行切割:将多肽ONPGA溶于12.5ml甲醇,再加入12.5ml 80mmol/L的NaHSO3,用5mol/LNaOH将pH调至9.5。反应混合物用N2脱气15分钟。然后用SP200UV灯在氮气条件下进行光分解,分别在第0,30,60及120分钟处取样用HPLC进行分析,结果也与对照样品进行比对。
实施例6 利用等离子共振(SPR)仪测定人血清白蛋白与多肽的亲和力
多肽ABP-LK-GLP与人血清白蛋白的亲和力使用BIAcore 3000 SPR仪分析。人血清白蛋白偶联到CM5生物芯片上(5000单位),多肽ABP-LK-GLP以0,0.315,0.625,1.25,2.5和5μM的浓度,30μL/min的流速注入。芯片用10mM NaOH再生,结合的多肽可在5分钟内解离。注射液经过非偶联通道的信号从偶联通道信号扣除后用以计算一定时期内结合多肽的数量,如图4所示。含有0.05%Tween-20的缓冲液PBS用于所有样品的稀释。等离子共振曲线用BIAcore动力学评估软件进行分析(Version 4.1)。用一比一结合模型模拟求得结合速率(kon)和解离速率(Koff)值,利用结合速率(Kon)和解离速率(Koff)即可求得KD,即解离常数。其结果总结于表5。
表5ABP-LK-GLP融合多肽与人白蛋白之间的结合常数(Kd)
融合多肽 | 所含ABP氨基酸序列 | Kd(M) |
DP3.1 | DICLPRWGCLWE | 1.03×10-6 |
DP5.1 | LPWHLKYREPPR | 4.60×10-6 |
DP6.2 | LPHSHRAHSLPP | 1.44×10-6 |
DP8.3 | SLLHWTHKIPAL | 2.92×10-6 |
实施例7体外凝血酶切割ABP-LK-GLP-1缓释LK-GLP-1
将ABP-LK-GLP-1多肽和人血白蛋白分别溶解于200μL的PBS缓冲液(pH7.4)中,ABP-LK-GLP多肽的终浓度为10μmol/L,人血白蛋白的终浓度为0.3μmol/L。然后将人凝血酶(0.009活力单位)加入到上述混合物中,再将混合物分成6等分,避光在37℃水解24小时。分别在0,2,6,12,16和24小时这几个时段中每次取出一份样品加入三氟乙酸(终浓度为0.2%)中止反应,再用HPLC和TOF质谱测定法分析上清液。
表6列出了对应不同时间段用凝血酶切割DP6.2肽的质谱峰面积。峰面积代表DP6.2肽的相对浓度。图5表示的是当肽段被人凝血酶水解时DP-6.2肽浓度(即峰面积)与时间之间的函数关系。因此,水解反应的半衰期可以从图5中计算出来,约为9小时。
表6DP6.2融合多肽由凝血酶单酶切实验的时间梯度表
时间(h) | 0 | 2 | 6 | 12 | 16 | 24 |
6.2肽质谱积分面积 | 10055375.5 | 7974113.2 | 6263427.6 | 3764023.7 | 2394306.8 | 456948.1 |
面积比 | 100% | 79.3% | 62.3% | 37.4% | 23.8% | 4.5% |
实施例8 体外用凝血酶和DPP IV水解ABP-LK-GLP缓释活性GLP-1肽
ABP-LK-GLP多肽和人血白蛋白分别溶解于200μL的PBS缓冲液(pH7.4)中,ABP-LK-GLP多肽的终浓度为10μM,人血白蛋白的终浓度为0.3μM。将人凝血酶(0.009活力单位)和DPP IV(0.0016纳克)加入上述混合物中,然后将反应分成6等份并避光37℃反应24小时。分别于0,2,6,12,16和24小时时取样,每次取出一个份样品并煮沸2分钟以中止反应,然后离心。用HPLC和TOF质谱测定法分析上清液。
表7列出DP3.1肽在酶切的不同时间段中所对应的质谱峰面积,峰面积显示DP3.1肽的相对浓度。图6表示DP3.1肽峰面积在被人凝血酶和DPP IV水解时与时间之间的函数关系,酶切反应的半衰期(即活性多肽缓释半衰期)可以通过图8函数曲线推算出来,约为13小时。
表7DP3.1融合多肽由凝血酶和DPP IV双酶切实验的时间梯度表
时间(h) | 0 | 2 | 6 | 12 | 16 | 24 |
3.1肽质谱积分面积 | 28079570.3 | 22632133.7 | 19234505.7 | 15977275.5 | 3743753.1 | 1881331.2 |
面积比 | 100% | 80.6 | 68.5% | 56.9% | 13.3% | 6.7% |
表8列出了DP-4.1肽通过凝血酶分裂的不同时间段所对应的质谱峰面积。图7显示DP-4.1肽被人凝血酶和DPP IV水解时,峰值区域与时间之间的函数关系,其水解反应的半衰期(即活性多肽缓释半衰期)可以通过图9推算出来,约为7小时。
表8 ABP-LK-GLP-4.1融合多肽由凝血酶和DPP IV双酶切实验的时间梯度表
时间(h) | 0 | 2 | 6 | 12 | 16 | 24 |
4.1肽质谱积分面积 | 12626709.1 | 9482015.7 | 6652133.7 | 4459186.4 | 2643753.6 | 912774.9 |
面积比 | 100% | 75.1% | 52.7% | 35.3% | 20.9% | 7.2% |
实施例9 从ABP-LK-GLP-1肽释放出来的GLP-1肽对GLP-1受体活化实验
实施例8中,经过凝血酶和DPP IV作用,GLP-1从ABP-LK-GLP-1中缓释出后,在反应中加入50μmol/L的DPP IV抑制剂(Linco,St.Charles,MO)和50μmol/L的PPACK终止反应。ABP-LK-GLP释放出的GLP-1,在加入CHO/GLP-1R细胞中后,以竞争方式结合人GLP-1受体来代替[125I]GLP-1。具体的实验步骤以Montrose-Rafizadeh等描述的方法略加修改完成:
(1)转化GLP-1受体质粒的CHO细胞用12孔板培养,在实验前2小时用无血清Ham’s F12培养基洗涤细胞,用0.5mL无血清Ham’s F12培养基洗2次后,细胞用含有2%(mg/ml)BSA和10mmol/L葡萄糖的Ham’s F12培养液4℃过夜培养,培养液中加入缓释的GLP-1肽和30,000cpm125I-GLP-1(GELife Science,QC)。
(2)培养结束后,去除上清液,用冷PBS洗细胞3次,然后再室温下用0.5ml的0.5mol/L NaOH和0.1%(mg/ml)SDS混合10分钟。细胞裂解物的放射计量使用Apec-Series λ-counter检测(ICN Biomedicals,Inc.,Costa Mesa,CA)。IC50值列在表9中。
表9 ABP-LK-GLP融合多肽在CHO/GLP-1R中的受体结合力和cAMP分析
氨基酸序列 | 名称 | 受体结合力IC50(nM) | cAMP生产力EC50(nM) |
GLP-1(7-36)-NH2 | GLP-1(7-37) | 0.3±0.06 | 3.1±0.8 |
GLP-1(7-37)-OH | GLP-1(7-36) | 2.4±0.6 | 20±2.1 |
FNPRHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | FN-GLP | 450±13 | >1000 |
LVPRHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | LV-GLP | 467±14 | >1000 |
PDICLPRWGCLWEFNPRGAHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | DP3.1 | 2.1±0.5 | 23±2.0 |
PDICLPRWGCLWEFNPRGPHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | DP3.2 | 2.3±0.7 | 19±1.5 |
PDICLPRWGCLWEFNPRGSHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | DP3.3 | 2.3±0.5 | 21±2.1 |
PNI CLPRWGCLWDFNPRGAHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | DP4.1 | 2.5±0.8 | 19±2.1 |
PNICLPRWGCLWDFNPRGPHAEGTFTSDVS SYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | DP4.2 | 2.4±0.7 | 22±2.2 |
PNICLPRWGCLWDFNPRGSHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | DP4.3 | 2.1±0.7 | 18±2.2 |
PLPHSHRAHSLPPFNPRGAHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | DP6.1 | 2.0±0.7 | 23±2.2 |
PLPHSHRAHSLPPFNPRGPHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | DP6.2 | 2.1±0.8 | 23±2.1 |
PLPHSHRAHSLPPFNPRGSHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | DP6.3 | 2.2±0.6 | 20±2.1 |
PSLLHWTHKIPALFNPRGAHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | DP8.1 | 2.2±0.6 | 24±2.4 |
PSLLHWTHKIPALFNPRGPHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | DP8.2 | 1.9±0.5 | 22±2.2 |
PSSLLHWTHKIPALFNPRGSHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | DP8.3 | 2.5±0.6 | 23±2.2 |
DICLPRWGCLWEFNPRGAHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | M3.1 | 2.2±0.5 | 22±2.0 |
DICLPRWGCLWEFNPRGPHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | M3.2 | 2.1±0.7 | 21±2.1 |
DICLPRWGCLWEFNPRGSHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | M3.3 | 2.4±0.5 | 22±2.1 |
NICLPRWGCLWDFNPRGAHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | M4.1 | 2.4±0.8 | 21±2.1 |
NICLPRWGCLWDFNPRGPHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | M4.2 | 2.2±0.7 | 21±2.2 |
NICLPRWGCLWDFNPRGSHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | M4.3 | 2.2±0.7 | 19±2.2 |
LPHSHRAHSLPPFNPRGAHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | M6.1 | 2.2±0.7 | 24±2.2 |
LPHSHRAHSLPPFNPRGPHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | M6.2 | 2.3±0.8 | 21±2.1 |
LPHSHRAHSLPPFNPRGSHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | M6.3 | 2.4±0.6 | 23±2.1 |
SLLHWTHKIPALFNPRGAHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | M8.1 | 2.2±0.6 | 24±2.4 |
SLLHWTHKIPALFNPRGPHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | M8.2 | 1.9±0.5 | 21±2.2 |
SLLHWTHKIPALFNPRGSHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | M8.3 | 2.2±0.6 | 21±2.2 |
LPHSHRAHSLPPFNPRPPHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | PP6.2 | 2.3±0.8 | 21±2.1 |
LPHSHRAHSLPPFNPRPAHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | PA6.2 | 2.2±0.7 | 23±2.4 |
实施例10 ABP-LK-GLP-1释放的GLP-1对细胞内产生cAMP的影响
将12孔板中经GLP-1受体转化的CHO细胞培养至密度60%~70%,然后用Krebs-Ringer phosphate缓冲液洗3次。随后添加1mL KRP溶液(含0.1%BSA),置于增湿培养箱里培养2小时。实验测定前,加入1ml KRP溶液(含0.1%BSA和1mmg/ml IBMX),随后加入GLP-1进行分析,对照试验中不加GLP-1,反应时间为30分钟,然后用冷PBS洗涤细胞3次以终止反应。细胞用1ml冷高氯酸(0.6mg/ml)处理细胞5分钟释放胞内cAMP。用84μl碳酸钾(5mg/ml)将样品pH值调至7,涡旋振荡样品,并离心5分钟(2000g,4℃)以获取沉淀。将上清液真空干燥,并溶解于300uL 0.05mg/ml Tris缓冲液(pH7.5,含4mmg/ml EDTA)。在样品中加入碳酸氢钠(0.15μmg/ml)和硫酸锌(0.15μmg/ml),然后放冰上放置15分钟。离心5分钟(2000g,4℃)去除沉淀。上清液用[3H]cAMP竞争结合分析试剂盒(Amersham Biotech,QC)分析。EC50值列在表9中。
由表9可以看出,ABP-LK-GLP-1释放的GLP-1具有高的生理活性。
实施例11 用GLP-1抗体测定老鼠模型中ABP-LK-GLP肽的半衰期
本实施例采用竞争酶联免疫测定方法,使用结合在生物素上对GLP-1(7-36)有特异性亲和力的抗体测定人血浆样本中由ABP-LK-GLP缓释的GLP-1量。96孔板由羊抗鼠IgG抗体覆盖。GLP-1标准品或样本,标记抗原和GLP-1抗体加入孔内进行竞争免疫反应。在混合保温并清洗培养板后,在孔的表面,加入用HRP标记的亲和素streptoavidin(SA-HRP)以形成HRP标记的streptoavidin-生物素-GLP-1抗体复合物。最后,通过邻苯二胺氟安定(OPD)为底物测定HRP酶的活性,并计算GLP-1的浓度。
在测试开始前,所有的试剂盒样本都置于室温下。滴定多孔板(FlowLaboratories)用50μL的40μg/ml的卵清蛋白覆盖,并在4℃下放置过夜。多孔板用含有0.1%Tween-20的PBS(0.35ml/孔)洗两次,然后置37℃下用2%BSA封闭1小时。冲洗过的板,用老鼠血浆补充到终体积为100μL。先加入标记抗原溶液4μL与每个孔,每个标准溶液各加3μL,形成浓度梯度(0,0.206,0.617,1.852,5.556,16.67,50ng/mL),然后加入样本,最后是加4μL的GLP-1抗体入孔内。用粘合箔覆盖著板,并在4℃下保温16~18小时。用接近0.35mL/孔的PBS洗涤4次。然后再于每孔加入10μL的SA-HRP溶液。用粘合箔覆盖著板,在室温下用培养板振荡器振荡培养1小时。用0.35mL/孔的PBS溶液洗涤5次。将10μL底物溶液加入每个孔内并在室温下保温30分钟。每孔加入10μL终止液终止反应。在492nm处检测光吸收值。计算标准品孔的的平均吸光值并绘制好的标准曲线。样本的GLP-1浓度通过对应的标准曲线中的吸光值来读取。结果列于表10。
表10 ABP-LK-GLP-1融合多肽在老鼠模型中的半衰期分析
名称 | 氨基酸序列 | 半衰期t1/2(小时) | 半衰期t1/2(小时) | 半衰期t1/2(小时) |
11μg多肽 | 100μg多肽 | 150μg多肽 | ||
GLP-1(7-37) | GLP-1(7-36)-NH2 | 0.031 | 0.032 | 0.032 |
GLP-1(7-36) | GLP-1(7-37)-OH | 0.032 | 0.031 | 0.032 |
FN-GLP | FNPRHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | 2.3 | 2.4 | 3.1 |
DP6.2 | PLPHSHRAHSLPPFNPRGPHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | 5.3 | 5.6 | 12.5 |
PP6.2 | LPHSHRAHSLPPFNPRPPHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | 35.6 | 49.5 | 98.3 |
PA6.2 | LPHSHRAHSLPPFNPRPAHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG | 26.4 | 32.7 | 65.4 |
实施例12 ABP-LK-CT融合多肽在老鼠模型中的半衰期分析
降钙素(calcitonin,CT)是一种是32个氨基酸组成的多肽激素。降钙素自1961年由加拿大生理学家Coop等人发现以来,人们对其结构、生理、药理等进行了广泛研究,并不断得到新突破。随着对降钙素的深入研究,它在临床的应用范围也不断扩大,并越来越被重视。降钙素抑制骨的吸收,又能抑制骨自溶作用,使骨骼释放钙减少,同时骨骼不断摄取血浆中的钙,导致血钙降低,降钙素还可抑制骨盐的溶解与转移,抑制骨基质分解,提高骨的更新率、增加尿钙、尿磷排泄,引起低钙血症或低磷血症。在体内的降低血钙作用很短暂,降钙素可对抗甲状旁腺激素对骨骼的作用。
本发明所使用的降钙素及其ABP-LK-CT融合多肽采用实施例3和实施例5的方法制备。ABP-LK-CT融合多肽在老鼠模型中的半衰期分析按类似实施例12的方法使用降钙素抗体进行,其结果列于表11中,融合多肽可提高降钙素在血液中的半衰期近70倍。
表11 ABP-LK-CT融合多肽在老鼠模型中的半衰期分析
氨基酸序列 | 名称 | 半衰期t1/2(小时) | 半衰期t1/2(小时) |
11μg多肽 | 200μg多肽 | ||
CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTNTGSGTP-NH2 | CT | 1.25 | 2.11 |
LPHSHRAHSLPPFNPRGPCSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTNTGSGTP-NH2 | ABP-LK-CT | 37.8 | 76.3 |
实施例13 Bcl-2簇蛋白质相结合多肽与ABP构建融合多肽在老鼠模型中的半衰期分析
Bax是一种促凋亡蛋白,它的BH3结构域合成的多肽能促进细胞发生凋亡。当BH3结构发生突变不能和Bcl-XL结合则不能引起细胞凋亡。BH3域中一段截短的多肽仅含14个氨基酸的肽链(58-71),即RYGRELRRMSDEFE,同样具有与Bcl-XL结合及促凋亡活性。合成BH3多肽对多种癌细胞的有凋亡作用。
本发明所使用的BH3多肽及其ABP-LK-BH3融合多肽采用实施例4的方法制备。ABP-LK-BH3融合多肽在老鼠模型中的半衰期分析按类似实施例12的方法使用BH3抗体进行,其结果列于表12。融合多肽可提高BH3在血液中的半衰期近195倍。
表12含Bcl-2簇蛋白质相结合多肽的ABP-LK-CT融合多肽在老鼠模型中的半衰期分析
氨基酸序列 | 名称 | 半衰期t1/2(小时) | 半衰期t1/2(小时) |
12μg多肽 | 100μg多肽 | ||
RYGRELRRMSDEFE | BH3 | 0.4 | 0.74 |
LPHSHRAHSLPPFNPRGA RYGRELRRMSDEFE | ABP-LK-BH3 | 42.3 | 86.5 |
Claims (4)
1.一种融合多肽,其特征在于包括一个生物活性肽和一个血清白蛋白结合肽,二种多肽之间由被血浆蛋白酶或血液的微碱性pH催化裂解的连接分子连接;所述血清白蛋白结合肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1~9所示;所述连接分子的氨基酸序列如SEQ ID NO:10~14所示。
2.根据权利要求1所述融合多肽,其特征在于所述的两种多肽之间由二硫键连接。
3.根据权利要求1所述融合多肽,其特征在于所述生物活性肽为BH3域中58~71的一段截短的多肽;所述生物活性肽的序列为RYGRELRRMSDEFE。
4.根据权利要求3所述融合多肽在制备多肽药物中的应用,其特征在于所述多肽药物为抗癌多肽药物。
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