CN102174068B - 大规模纯化含有HisTaq和甲酸水解位点的融合蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大规模纯化含有His Taq和甲酸水解位点的融合蛋白的方法与应用。该方法包括如下步骤：对表达含有His Taq和甲酸水解位点的融合蛋白的工程菌发酵液进行预处理，得到含有His Taq和甲酸水解位点的融合蛋白粗提物，通过Ni-NTA柱亲和层析和C18反向疏水柱脱盐，得到融合蛋白粗提物的初次纯化蛋白，接着甲酸水解，再通过Ni-NTA柱亲和层析和C18反向疏水柱脱盐，得到初级纯化的目的多肽，HPLC精制后可得纯度高于95％的目的多肽。本发明所述的方法有效地对含有His Taq和甲酸水解位点的融合蛋白进行大规模的制备，最终目的多肽的得率高、纯度高、耗时短、成本低，可达到g级别以上生产规模，可以满足动物实验以及临床前的实验研究。
Description
技术领域
本发明涉及一种蛋白质纯化方法，特别涉及一种大规模纯化含有His Taq和甲酸水解位点的融合蛋白的方法与应用。
背景技术
目前，多肽的制备方法主要包括化学合成法和基因工程法。对于氨基酸数目不大以及需量较小的多肽，可以通过化学合成法合成。但是，对于氨基酸数目较多的多肽用化学方法合成难度大，成本高，而且周期也长，譬如100mg纯度大于95％的样品需要420元左右人民币一个氨基酸，按50个左右氨基酸需要2万多元，而纯度大于98％需要800元人民币每个氨基酸，按50个氨基酸计算需要4万元，而且需要4周左右时间。因此要大量获得高纯度以及氨基酸数目较多的目的肽，采用基因工程方法成本远远低于化学合成法。
基因工程方法表达多肽需要考虑到菌体对外源基因的容忍度、表达方式以及纯化工艺。因此，现有多肽的构建过程中通常添加标签，构成融合蛋白，这不仅是为了增大多肽的分子量，相对降低其在菌体中的降解速度，而且有利于纯化，降低成本。由于标签可能会影响目的多肽的功能，因此，一般会在标签与目的多肽之间加入酶解位点，纯化工艺后期通过酶解释放目的多肽。其中，甲酸水解((Asp↓Pro/Gly)位点是实验室常用的一个酶解位点，纯化后的融合蛋白通过甲酸水解释放出目的多肽。相对于需用引入酶进行酶解的位点，譬如肠激酶酶解位点，甲酸水解位点由于使用甲酸得到目的多肽，没有引入新的蛋白污染，后续纯化工艺更为简单，成本更低。但是，目前没有关于利用甲酸水解方法来大规模水解融合蛋白制备多肽的报道，这可能是由于甲酸水解条件控制不好容易引起非特异性剪(Expression，purification and structural studies of ashort antimicrobial peptide.Biochimica et Biophsica Acta：1788(2009)314-323)，造成副产物增加，从而得率低。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种简单、低成本、高效率、高纯度，中间过程可以时实定量、监控、分析的大规模纯化含有His Taq和甲酸水解位点的融合蛋白的方法。所述的大规模为目的多肽得率为g级别的规模。
本发明的另一目的在于提供上述方法的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种大规模纯化含有His Taq和甲酸水解位点的融合蛋白的方法，为首先利用Ni2+亲和层析分离得到融合蛋白，然后用甲酸水解融合蛋白，然后再通过Ni2+亲和层析去除未水解的融合蛋白，得到纯化的目的多肽；具体包括以下步骤：
(1)对表达含有His Taq和甲酸水解位点的融合蛋白的工程菌发酵液进行预处理，得到含有His Taq和甲酸水解位点的融合蛋白粗提物：
①含有His Taq和甲酸水解位点的融合蛋白为分泌形式表达时，则去除工程菌发酵液中的固体物质，收集发酵上清液，对发酵上清液进行浓缩；
②含有His Taq和甲酸水解位点的融合蛋白为包涵体形式表达时，则收集工程菌菌体，进行破碎，然后将包涵体进行变性，溶解于溶液中；
所述的工程菌优选为细菌，更优选为大肠杆菌；
(2)融合蛋白粗提物的初次纯化
A、用含10～20mM咪唑的溶解缓冲液A平衡Ni-NTA柱至基线稳定，然后将步骤(1)得到的融合蛋白粗提物上柱，流速为3～6ml/min，Ni-NTA柱的载量为25～35mg蛋白/ml柱体积；上柱完后，用含10～20mM咪唑的溶解缓冲液A洗柱子至基线，然后用含250～500mM咪唑的溶解缓冲液A洗脱至基线停止，收集蛋白峰处的洗脱液；最后用含1M咪唑的溶解缓冲液A冲洗Ni-NTA柱至基线，将残留在柱上的蛋白和其它杂质全部洗脱下来，再用去离子水冲洗Ni-NTA柱，Ni-NTA柱得以重复利用；所述的溶解缓冲液A的组成为：6M尿素、25～50mM Na2HPO4、300～500mM NaCl，pH 8.0；所述去离子水的用量优选为至少4倍柱体积；
B、将蛋白峰处的洗脱液过C18反向疏水柱进行脱盐处理，具体步骤如下：将蛋白峰处的洗脱液的pH值调为3～4，然后上脱盐平衡液平衡好的C18反向疏水柱；上柱的条件为流速5～14ml/min，载量6g融合蛋白/L柱体积；接着用体积百分比0.1％的三氟乙酸水溶液冲洗C18反向疏水柱至无盐；用脱盐洗脱液洗脱至基线为止，收集不在基线处的洗脱液，浓缩至原体积的1/5，真空冷冻干燥，得到初级纯化蛋白；所述的脱盐平衡液为三氟乙酸、乙腈、超纯水按照体积比0.1∶5∶94.9混合得到的溶液；所述的脱盐洗脱液为三氟乙酸、乙腈、超纯水按照体积比0.1∶50∶49.9混合得到的溶液；所述的pH值优选通过冰醋酸进行调节；所述的C18反向疏水柱的规格优选为径高比为0.4；所述的浓缩优选为使用旋转蒸发仪进行浓缩，条件为水浴温度45℃；所述的三氟乙酸和乙腈均为色谱纯级别；
(3)甲酸水解释放目的肽
用体积百分比为50％～60％的甲酸(色谱纯)溶解初级纯化蛋白，初级纯化蛋白的终浓度为10～30mg/ml，于避光条件下、42～45℃的条件下振荡36～48h进行水解，水解后浓缩，真空冷冻干燥，得到甲酸水解蛋白；所述的浓缩优选为使用旋转蒸发仪进行浓缩，条件为水浴温度45℃；
(4)目的多肽的初步纯化
A、用含10～20mM咪唑的溶解缓冲液A平衡Ni-NTA柱至基线稳定，将样品上柱，样品为用含10～20mM咪唑的溶解缓冲液A溶解的甲酸水解蛋白，且pH值为8.0；样品上柱量为2～3倍柱体积，流速为2～5ml/min；收集含有目的多肽的过柱液；所述的含10～20mM咪唑的溶解缓冲液A与甲酸水解蛋白的用量比例优选为100ml∶1g；
B、用含10～20mM咪唑的溶解缓冲液A冲洗Ni-NTA柱至基线，收集过柱液；
C、将步骤A和B的过柱液合并，得到初步纯化的目的多肽；
D、用含250～1mol/L咪唑的溶解缓冲液A冲洗Ni-NTA柱至基线，再用去离子水冲洗Ni-NTA柱，Ni-NTA柱得以重复利用；
(5)C18反向疏水柱脱盐处理
初步纯化的目的多肽通过C18反向疏水柱进行脱盐处理，同步骤(2)B，差异仅在于流速为3～5ml/min；
(6)目的多肽的精制，通过制备型的高效液相色谱(HPLC)进行制备
HPLC的条件为乙腈的起始浓度为体积百分比10％，终止浓度为体积百分比60％，分管收集洗脱液；HPLC检测各管收集液，确定各管收集液中目的肽的纯度，合并纯度高于质量百分比95％的各管收集液，纯度低于95％的各管收集液可合并后再次用HPLC进行精制；真空冷冻干燥纯度高于95％的各管收集液合并液，得到纯度高于95％的目的多肽(不含His Taq和甲酸水解位点)；所述HPLC的耗时优选为30min～60min；
所述含有His Taq和甲酸水解位点的融合蛋白的目的基因优选公开号为“CN101294187A”、发明名称为“一种缓释生物活性多肽的方法与应用”中所涉及的GLP-1衍生物；
所述含有His Taq和甲酸水解位点的融合蛋白在进行重组载体构建时所用的载体优选为pMFH载体；
所述表达含有His Taq和甲酸水解位点的融合蛋白的工程菌优选申请号为“201010221511.8”、名称为“利用乳糖诱导pMFH载体生产重组蛋白的发酵方法”的专利申请中所指的重组工程菌pMFH-GLP-1-PA6.2-BL21(DE3)；
步骤(1)中所述的含有His Taq和甲酸水解位点的融合蛋白为包涵体形式表达时，更优选采取包含以下步骤的预处理方法：
I、将收集得到的工程菌菌体与pH 7.4、50mM的PBS缓冲液混合均匀，室温静置30min，然后在压力为120～150MPa的条件下均质破菌至少一次，收集不溶性物质；pH 7.4、50mM的PBS缓冲液的使用体积优选为相当于工程菌菌体质量的10倍；所述的收集不溶性物质的方法优选为离心；离心的条件优选为4℃、10000rpm离心30min；
II、然后依次用洗涤液A和洗涤液B对步骤I得到的不溶性物质进行洗涤；洗涤液A为pH 8.0、20mM的Tris-HCl；洗涤液B为含有2M尿素的pH 7.4、50mM的PBS缓冲液；所述的洗涤的条件优选为以50rpm的速度搅拌10min；所述的洗涤液A的使用体积优选为相当于工程菌菌体质量的10倍；所述的洗涤液B的使用体积优选为相当于工程菌菌体质量的10倍；
III、用含10～20mmol/L咪唑的溶解缓冲液A溶解步骤II洗涤处理好的不溶性物质，除去其中仍不能溶解的物质；上清液用孔径为0.45μm的膜进行过滤，收集滤液，得到含有His Taq和甲酸水解位点的融合蛋白的粗提物；所述的溶解缓冲液A的组成为：6M尿素、25～50mM Na2HPO4、300～500mM NaCl，pH8.0；所述的溶解缓冲液的使用体积优选为相当于工程菌菌体质量的10倍；所述的除去其中仍不能溶解的物质的方式优选为离心；离心的条件优选为4℃、10000rpm离心30min；
上述方法还有选在制备过程中含有实时监控的步骤，其中步骤(2)使用融合蛋白标准曲线，步骤(3)～(6)使用目的多肽标准曲线；
所述的融合蛋白标准曲线的建立方法为：
A、称按照步骤(1)和步骤(2)得到初级纯化蛋白粉末100mg，用2mL含按体积比30∶0.1∶69.9混合的乙腈/三氟乙酸/水溶液溶解，再用前述溶液稀释成浓度5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL和25mg/mL的溶液，每个浓度的溶液各取1mL；
B、HPLC检测上述浓度梯度的融合蛋白溶液，上样量均为20μL，HPLC条件为：流动相A为按体积比1∶999的三氟乙酸/水溶液，流动相B为按体积比1∶999的三氟乙酸/乙腈溶液，20分钟线性梯度洗脱，流动相B从体积百分比30％升至体积百分比60％，洗脱流速是1.0mL/min，检测波长214nm；
C、记录HPLC检测各个样品的融合蛋白峰面积值，以融合蛋白峰面积值对融合蛋白浓度绘制标准曲线；
所述的目的多肽标准曲线的建立方法为：
A、称取精制的目的多肽粉末10mg(即最终产品)，用2mL含按体积比30∶0.1∶69.9混合的乙腈/三氟乙酸/水溶液溶解，再用前述溶液稀释成浓度0.25mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL和2mg/mL的溶液，每个浓度的溶液各取1mL；
B、HPLC检测上述浓度梯度的目的肽溶液，上样量均为20μL，HPLC条件为：流动相A为按体积比1∶999的三氟乙酸/水溶液，流动相B为按体积比1∶999的三氟乙酸/乙腈溶液，20分钟线性梯度洗脱，流动相B从体积百分比5％升至体积百分比95％，洗脱流速是1.0mL/min，检测波长214nm；
C、记录HPLC检测各个样品的目的肽峰面积值，以目的肽峰面积值对目的肽浓度绘制标准曲线。
所述大规模纯化含有His Taq和甲酸水解位点的融合蛋白的方法应用于HisTaq、甲酸水解位点和目的多肽依次连接、且目的多肽本身不含有His Taq和甲酸水解位点的融合蛋白，其中特别适合应用于对长度为40～100个氨基酸的含有His Taq和甲酸水解位点的融合蛋白进行纯化。氨基酸个数少于40个，本发明较化学合成方法成本优势不明显；氨基酸个数多于100个，对于表达以及蛋白复性都较困难，此发明技术优势也不明显。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明所述的方法有效地对含有His Taq和甲酸水解位点的融合蛋白进行大规模的制备，最终目的多肽的得率高、纯度高、耗时短(需时为7～10天)、成本低，可达到g级别以上生产规模，可以满足动物实验以及临床前的实验研究。譬如利用本发明的方法对按照专利申请号201010221511.8的实施例1进行制备的菌体(共210g菌体)进行纯化(一次性)，得到纯度99.5％的目的多肽为1230.6mg，成本只有3～4千元人民币，而通过化学合成法合成同样长度的1g目的多肽需要40万元，耗时3个多月。这是由于本发明所使用的Ni2+亲和层析对于融合蛋白纯化不仅具有得率高以及纯化简单，蛋白纯度高的优点，C18反向疏水柱脱盐能力强，耗时短，而且从经济上来讲层析的填料Ni-NTA树脂和C18反向疏水柱填料可以通过再生多次重复使用，再生所需要的试剂主要为乙醇、EDTA、硫酸镍等，成本比较低。
(2)与其他的蛋白脱盐技术相比，本发明所用的C18反向疏水柱脱盐技术具有脱盐效率高、脱盐率高、蛋白回收率高，并且在精制前的C18反向疏水柱脱盐不仅起到脱盐效果，也起到对粗品的一个简单纯化效果。
(3)与其它通过融合蛋白的基因工程方法制备多肽时运用酶切法释放目的肽相比，本发明运用的甲酸水解条件释放目的肽具有目的肽释放效率高、不会带入酶蛋白干扰，方便除去、操作简单、适合大规模生产、成本低等优点。
附图说明
图1是SDS-PAGE电泳图，其中：
M为Marker(从小到大依次为14.3kDa、20.1kDa、29.0kDa、44.3kDa、66.4kDa、97.2kDa)，20.1kDa附近较深的条带就是目的蛋白GLP-1衍生物融合蛋白所在的位置；泳道1为实施例1步骤(2)ANi-NTA亲和层析前的样品；泳道2实施例1步骤(2)ANi-NTA亲和层析后的样品。
图2是实施例1步骤(3)甲酸水解后的样品进行HPLC检测的结果图，其中：保留时间9.9min的峰是目的肽峰。
图3是实施例1步骤(4)得到的目的多肽进行HPLC检测的结果图，其中：保留时间10min的峰为目的肽的峰。
图4是SDS-PAGE结果图，其中：
M为Marker(从小到大分别是2.5kDa、6kDa、14.4kDa、21.5kDa、55.4kDa)，2.5kDa～6kDa之间的带为目的多肽条带；泳道1为实施例1甲酸水解前样品；泳道2为实施例1甲酸水解后样品；泳道3为实施例1步骤(4)得到的目的多肽。
图5是经过HPLC精制后目的多肽的HPLC分析图谱，其中：目的多肽的保留时间是10min。
图6是质谱鉴定实施例1得到的最终产品的结果图。
图7是实施例1融合蛋白的标准曲线图，横坐标表示HPLC积分的融合蛋白面积，纵坐标表示融合蛋白浓度。
图8是实施例1最终得到的目的肽的标准曲线图：横坐标表示HPLC积分的目的肽面积，纵坐标表示目的肽浓度。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)对表达含有His Taq和甲酸水解位点的融合蛋白的工程菌发酵液进行预处理，得到含有His Taq和甲酸水解位点的融合蛋白粗提物：
在210g湿菌体(专利申请号201010221511.8实施例1发酵所得)中加入2100ml pH 7.4、50mM的PBS缓冲液，混合均匀，得到菌体悬浮液。菌体悬浮液在高压匀浆机(压力为150MPa)下破菌一次。4℃10000rpm离心30min弃上清，取沉淀，样品以包涵体形式存在于沉淀中。用2100ml洗涤液A(pH 8.0、20mM的Tris-HCl)洗涤沉淀，洗涤方式为50rpm/min搅拌10min；接着4℃10000rpm离心30min弃上清，取沉淀。再用2100ml洗涤液B(含有2M尿素的pH 7.4、50mM的PBS缓冲液)洗涤沉淀，洗涤方式为50rpm/min搅拌10min；接着4℃10000rpm离心30min，弃上清，取沉淀。用2100ml含10mM咪唑的溶解缓冲液A(6M尿素，25mM Na2HPO4，300mM NaCl，pH 8.0)溶解沉淀，4℃10000rpm离心30min，弃沉淀，取上清；所得上清用0.45μm膜过滤，得到融合蛋白粗提物。
(2)融合蛋白粗提物的初次纯化
A、用含10mM咪唑的溶解缓冲液A(同步骤(1))平衡Ni-NTA柱至基线稳定，然后将步骤(1)得到的融合蛋白粗提物上柱，流速为3ml/min，Ni-NTA柱的载量为30mg蛋白/ml柱体积；上柱完后，用含10mM咪唑的溶解缓冲液A洗柱子至基线，然后用含250mM咪唑的溶解缓冲液A(同步骤(1))洗脱至基线停止，收集蛋白峰处的洗脱液，通过SDS-PAGE检测以及HPLC分析，SDS-PAGE的结果如图1所示，HPLC的结果表明得到16.38g融合蛋白，纯度为94.5％；最后用含1M咪唑的溶解缓冲液A冲洗Ni-NTA柱至基线，将残留在柱上的蛋白和其它杂质全部洗脱下来，再用4倍柱体积去离子水冲洗Ni-NTA柱，Ni-NTA柱得以重复利用；
B、将蛋白峰处的洗脱液过C18反向疏水柱(径高比为0.4)进行脱盐处理，具体步骤如下：用冰醋酸将蛋白峰处的洗脱液的pH值调为4.0，然后上脱盐平衡液(三氟乙酸、乙腈、超纯水按体积比0.1∶5∶94.9)平衡好的C18反向疏水柱；上柱的条件为流速14ml/min，载量6g融合蛋白/L柱体积；接着用体积百分比0.1％的三氟乙酸水溶液冲洗C18反向疏水柱至无盐；用脱盐洗脱液(三氟乙酸、乙腈、超纯水按体积比0.1∶50∶49.9)洗脱至基线为止，收集不在基线处的洗脱液，用旋转蒸发仪浓缩至原体积的1/5(水浴温度45℃)，混匀，分装至冻干管中，液氮预冻，-70℃真空冷冻干燥，得到初级纯化蛋白粉末，其脱盐率达到94.1％以上，脱盐回收率为87.6％(用HPLC进行检测，使用融合蛋白标准曲线)。
所用的试剂均为色谱纯级别，水为MiliQ水。
(3)甲酸水解释放目的肽
用体积百分比为50％％的甲酸(色谱纯)溶解初级纯化蛋白粉末，初级纯化蛋白的终浓度为30mg/ml，于45℃恒温避光、200rpm/min振荡48h进行水解，水解后用旋转蒸发仪浓缩至原来体积的20％(水浴温度45℃)时，加入适量水继续旋蒸，重复3次后抽去绝大部分甲酸，真空冷冻干燥，得到甲酸水解蛋白粉末，用SDS-PAGE检测，结果如图4所示；用HPLC进行检测(使用目的多肽标准曲线)，结果如图2所示；从结果可看出，甲酸的水解效率高。
(4)目的多肽的初步纯化
A、用含20mM咪唑的溶解缓冲液A(同步骤(1))平衡Ni-NTA柱至基线稳定，将样品上柱，样品为用含20mM咪唑的溶解缓冲液A溶解步骤(3)甲酸水解蛋白粉末得到溶液，且pH值为8.0，浓度为1g/100ml；样品上柱量为3倍柱体积，流速为3ml/min；收集含有目的多肽的柱穿液；
B、用含20mM咪唑的溶解缓冲液A冲洗Ni-NTA柱至基线，收集柱穿液；
C、将步骤A和B的过柱液合并，得到初步纯化的目的多肽；用SDS-PAGETricine检测(SDS-PAGE Tricine方法参考(蛋白质电泳技术指南，夏其昌等、化学工业出版社、第一版、31页)，结果如图4所示；用HPLC进行检测(使用目的多肽标准曲线)，结果如图3所示，其纯度为83.1％，回收率为68.5％；
D、用含250mol/L咪唑的溶解缓冲液A冲洗Ni-NTA柱至基线，再用去离子水冲洗Ni-NTA柱，Ni-NTA柱得以重复利用。
(5)C18反向疏水柱脱盐处理
初步纯化的目的多肽通过C18反向疏水柱进行脱盐处理，同步骤(2)B，差异仅在于流速为3ml/min；
(6)目的多肽的精制，通过制备型的高效液相色谱(HPLC制备柱：YMC-PACK ODS-A，250×20mm)进行制备
HPLC的条件为乙腈的起始浓度为体积百分比10％，终止浓度为体积百分比60％，需时31min(如表1所示)，流速2ml/min，分管收集洗脱液；HPLC检测各管收集液，确定各管收集液中目的肽的纯度，合并纯度高于质量百分比95％的各管收集液，纯度低于95％的各管收集液可合并后再次用HPLC进行精制；真空冷冻干燥纯度高于95％的各管收集液合并液，得到纯度为99.5％的目的多肽，回收率为71.9％(用HPLC进行检测，使用目的多肽标准曲线，结果如图5所示)，最终得到目的肽粉末1230.6mg，产率为351.6mg/L发酵液，5.86mg/g湿菌体。质谱鉴定(少量目的多肽冻干粉末，溶于10％(v/v)乙腈、89.9％H2O(v/v)、0.1％TFA(v/v)的溶液，过0.20μm滤膜，再取过滤后的液体30μL上四级杆质谱仪测定其分子量)，分子量与预期符合(如图6所示)。
表1
HPLC检测中：
I、融合蛋白标准曲线的建立
A、称按照步骤(1)和步骤(2)得到初级纯化蛋白粉末100mg，用2mL含30％(v/v)乙腈、69.9％H2O(v/v)、0.1％TFA(v/v)的溶液溶解，再用含30％(v/v)乙腈、69.9％H2O(v/v)、0.1％TFA(v/v)的溶液稀释成5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL等浓度梯度，每个梯度各1mL；
B、HPLC检测上述浓度梯度的融合蛋白溶液，上样量均为20μL，HPLC条件为：流动相A(99.9％v/v水，0.1％v/v TFA)，流动相B(99.9％v/v乙腈，0.1％v/v TFA)，20分钟线性梯度洗脱，流动相B从30％v/v升至60％v/v，洗脱流速是1.0mL/min，检测波长214nm；
C、记录HPLC检测各个样品的融合蛋白峰面积值，以融合蛋白峰面积值对融合蛋白浓度绘制标准曲线，如图7所示。
II、目的多肽标准曲线的建立
A、称取按照上述步骤得到精制的目的多肽粉末10mg，用2mL含30％(v/v)乙腈、69.9％H2O(v/v)、0.1％TFA(v/v)的溶液溶解，再用含30％(v/v)乙腈、69.9％H2O(v/v)、0.1％TFA(v/v)的溶液稀释成0.25mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL等浓度梯度，每个梯度各1mL；
B、HPLC检测上述浓度梯度的目的肽溶液，上样量均为20μL，HPLC条件为：流动相A(99.9％v/v水，0.1％v/v TFA)，流动相B(99.9％v/v乙腈，0.1％v/v TFA)，20分钟线性梯度洗脱，流动相B从5％v/v升至95％v/v，洗脱流速是1.0mL/min，检测波长214nm；
C、记录HPLC检测各个样品的目的肽峰面积值，以目的肽峰面积值对目的肽浓度绘制标准曲线(如图8所示)。
本实施例在制备过程中通过SDS-PAGE和HPLC的实时跟踪，可以保证大规模制备过程，即实际生产中的质量控制。
实施例2
(1)对表达含有His Taq和甲酸水解位点的融合蛋白的工程菌发酵液进行预处理，得到含有His Taq和甲酸水解位点的融合蛋白粗提物：同实施例1步骤(1)，其中区别仅在于，样品为专利申请号201010221511.8实施例2发酵所得的菌体300g，所用的溶液体积均为菌体质量的10倍，洗涤处理好的沉淀用含20mM咪唑的溶解缓冲液A(6M尿素，50mM Na2HPO4，500mM NaCl，pH 8.0)溶解。
(2)融合蛋白粗提物的初次纯化
A、用含20mM咪唑的溶解缓冲液A(同步骤(1))平衡Ni-NTA柱至基线稳定，然后将步骤(1)得到的融合蛋白粗提物上柱，流速为4ml/min，Ni-NTA柱的载量为35.2mg蛋白/ml柱体积；上柱完后，用含20mM咪唑的溶解缓冲液A洗柱子至基线，然后用含250mM咪唑的溶解缓冲液A(同步骤(1))洗脱至基线停止，收集蛋白峰处的洗脱液，通过HPLC检测(使用融合蛋白标准曲线，按实施例1建立)，得到24g融合蛋白，纯度为94.1％；最后用含1M咪唑的溶解缓冲液A冲洗Ni-NTA柱至基线，将残留在柱上的蛋白和其它杂质全部洗脱下来，再用1倍柱体积去离子水冲洗Ni-NTA柱，Ni-NTA柱得以重复利用；
B、将蛋白峰处的洗脱液过C18反向疏水柱(径高比为0.4)进行脱盐处理，具体步骤如下：用冰醋酸将蛋白峰处的洗脱液的pH值调为3.5，然后上脱盐平衡液(三氟乙酸、乙腈、超纯水按体积比0.1∶5∶94.9)平衡好的C18反向疏水柱；上柱的条件为流速8ml/min，载量6g融合蛋白/L柱体积；接着用体积百分比0.1％的三氟乙酸水溶液冲洗C18反向疏水柱至无盐；用脱盐洗脱液(三氟乙酸、乙腈、超纯水按体积比0.1∶50∶49.9)洗脱至基线为止，收集不在基线处的洗脱液，用旋转蒸发仪浓缩至原体积的1/5(水浴温度45℃)，混匀，分装至冻干管中，液氮预冻，-70℃真空冷冻干燥，得到初级纯化蛋白粉末，通过HPLC检测(使用融合蛋白标准曲线，按实施例1建立)，脱盐率达到94.3％以上，脱盐回收率为86.7％。
所用的试剂均为色谱纯级别，水为MiliQ水。
(3)甲酸水解释放目的肽
用体积百分比为60％的甲酸(色谱纯)溶解初级纯化蛋白粉末，初级纯化蛋白的终浓度为10mg/ml，于42℃恒温避光、200rpm/min振荡48h进行水解，水解后用旋转蒸发仪浓缩至原来体积的20％(水浴温度45℃)时，加入适量水继续旋蒸，重复3次后抽去绝大部分甲酸，真空冷冻干燥，得到甲酸水解蛋白粉末，通过HPLC检测(使用目的多肽标准曲线，按实施例1建立)，甲酸水解率为49.65％，水解得率为11.22％。
(4)目的多肽的初步纯化
A、用含20mM咪唑的溶解缓冲液A(同步骤(1))平衡Ni-NTA柱至基线稳定，将样品上柱，样品为用含20mM咪唑的溶解缓冲液A溶解步骤(3)甲酸水解蛋白粉末得到溶液，且pH值为8.0，浓度为1g/100ml；样品上柱量为3倍柱体积，流速为4ml/min；收集含有目的多肽的柱穿液；
B、用含20mM咪唑的溶解缓冲液A冲洗Ni-NTA柱至基线，收集柱穿液；
C、用HPLC检测，将步骤A和B的过柱液合并，HPLC检测(使用目的多肽标准曲线，按实施例1建立的)，得到初步纯化的目的多肽纯度为81.4％，回收率为65.3％；
D、用含250mol/L咪唑的溶解缓冲液A冲洗Ni-NTA柱至基线，再用去离子水冲洗Ni-NTA柱，Ni-NTA柱得以重复利用。
(5)C18反向疏水柱脱盐处理
初步纯化的目的多肽通过C18反向疏水柱进行脱盐处理，同步骤(2)B，差异仅在于流速为4ml/min；
(6)目的多肽的精制，通过制备型的高效液相色谱(HPLC制备柱：YMC-PACK ODS-A，250×20mm)进行制备
HPLC的条件为乙腈的起始浓度为体积百分比10％，终止浓度为体积百分比60％，需时46min(如表2所示)，流速lml/min，分管收集洗脱液；HPLC检测各管收集液，确定各管收集液中目的肽的纯度，合并纯度高于质量百分比95％的各管收集液，纯度低于95％的各管收集液可合并后再次用HPLC进行精制；真空冷冻干燥纯度高于95％的各管收集液合并液，得到纯度为99.5％的目的多肽，回收率为77％(用HPLC进行检测，使用目的多肽标准曲线)，最终得到目的肽粉末1173mg，产率为335.1mg/L发酵液，3.91mg/g湿菌体。质谱鉴定，分子量与预期符合。
表2
实施例3
(1)对表达含有His Taq和甲酸水解位点的融合蛋白的工程菌发酵液进行预处理，得到含有His Taq和甲酸水解位点的融合蛋白粗提物：同实施例1步骤(1)，其中区别仅在于，样品为专利申请号201010221511.8实施例3发酵所得的菌体370g，高压匀浆机压力为120MPa，所用的溶液体积均为菌体质量的10倍。
(2)融合蛋白粗提物的初次纯化
A、用含10mM咪唑的溶解缓冲液A(同步骤(1))平衡Ni-NTA柱至基线稳定，然后将步骤(1)得到的融合蛋白粗提物上柱，流速为6ml/min，Ni-NTA柱的载量为24.9mg蛋白/ml柱体积；上柱完后，用含20mM咪唑的溶解缓冲液A洗柱子至基线，然后用含250mM咪唑的溶解缓冲液A(同步骤(1))洗脱至基线停止，收集蛋白峰处的洗脱液，通过HPLC检测(使用融合蛋白标准曲线，按实施例1建立)，得到19.24g融合蛋白，，纯度为90.7％；最后用含1M咪唑的溶解缓冲液A冲洗Ni-NTA柱至基线，将残留在柱上的蛋白和其它杂质全部洗脱下来，再用1倍柱体积去离子水冲洗Ni-NTA柱，Ni-NTA柱得以重复利用；
B、将蛋白峰处的洗脱液过C18反向疏水柱(径高比为0.4)进行脱盐处理，具体步骤如下：同实施例2步骤(2)B，区别仅在于上柱的条件为流速10ml/min，得到初级纯化蛋白粉末，通过HPLC检测(使用融合蛋白标准曲线，按实施例1建立)，脱盐率达到93.7％以上，脱盐回收率为88.5％。
(3)甲酸水解释放目的肽
同实施例1步骤(3)，区别仅在于初级纯化蛋白的终浓度为20mg/ml，振荡的时间为36h，得到甲酸水解蛋白粉末，HPLC进行检测(使用目的多肽标准曲线)，甲酸水解率为65.5％，水解得率为12.5％。
(4)目的多肽的初步纯化
A、同实施例1步骤(4)A，区别仅在于流速为3ml/min；收集含有目的多肽的柱穿液；
B、用含20mM咪唑的溶解缓冲液A冲洗Ni-NTA柱至基线，收集柱穿液；
C、将步骤A和B的过柱液合并，得到初步纯化的目的多肽；用HPLC进行检测(使用目的多肽标准曲线)，其纯度为75.4％，回收率为65.3％；
D、用含250mol/L咪唑的溶解缓冲液A冲洗Ni-NTA柱至基线，再用去离子水冲洗Ni-NTA柱，Ni-NTA柱得以重复利用。
(5)C18反向疏水柱脱盐处理
同实施例1步骤(5)。
(6)目的多肽的精制，通过制备型的高效液相色谱(HPLC制备柱：YMC-PACK ODS-A，250×20mm)进行制备
同实施例1步骤(6)，区别仅在于需时76min(如表3所示)，流速0.5ml/min，分管收集洗脱液；HPLC检测各管收集液，确定各管收集液中目的肽的纯度，合并纯度高于质量百分比95％的各管收集液，纯度低于95％的各管收集液可合并后再次用HPLC进行精制；真空冷冻干燥纯度高于95％的各管收集液合并液，得到纯度为99.5％的目的多肽，回收率为75.3％(用HPLC进行检测，使用目的多肽标准曲线)，最终得到目的肽粉末1047.1mg，产率为209mg/L发酵液，2.83mg/g湿菌体。质谱鉴定，分子量与预期符合。
表3
实施例4
(1)对表达含有His Taq和甲酸水解位点的融合蛋白的工程菌发酵液进行预处理，得到含有His Taq和甲酸水解位点的融合蛋白粗提物：同实施例1步骤(1)，其中区别仅在于，样品为专利申请号201010221511.8实施例四发酵所得菌体230g，高压匀浆机压力为120MPa，所用的溶液体积均为菌体质量的10倍。
(2)融合蛋白粗提物的初次纯化
A、用含10mM咪唑的溶解缓冲液A(同步骤(1))平衡Ni-NTA柱至基线稳定，然后将步骤(1)得到的融合蛋白粗提物上柱，流速为5ml/min，Ni-NTA柱的载量为27.4mg蛋白/ml柱体积；上柱完后，用含10mM咪唑的溶解缓冲液A洗柱子至基线，然后用含250mM咪唑的溶解缓冲液A(同步骤(1))洗脱至基线停止，收集蛋白峰处的洗脱液，通过HPLC检测(使用融合蛋白标准曲线，按实施例1建立)，得到14.47g融合蛋白，，纯度为93.2％；最后用含1M咪唑的溶解缓冲液A冲洗Ni-NTA柱至基线，将残留在柱上的蛋白和其它杂质全部洗脱下来，再用1倍柱体积去离子水冲洗Ni-NTA柱，Ni-NTA柱得以重复利用；
B、将蛋白峰处的洗脱液过C18反向疏水柱(径高比为0.4)进行脱盐处理，具体步骤如下：同实施例2步骤(2)B，区别仅在于上柱的条件为流速5ml/min，得到初级纯化蛋白粉末，通过HPLC检测(使用融合蛋白标准曲线，按实施例1建立)，脱盐率达到93.5％以上，脱盐回收率为86.7％。
(3)甲甲酸水解释放目的肽
同实施例1步骤(3)，区别仅在于振荡的时间为36h，得到甲酸水解蛋白粉末，HPLC进行检测(使用目的多肽标准曲线)，甲酸水解率为68％，水解得率为17.8％。
(4)目的多肽的初步纯化
A、同实施例1步骤(4)A，区别在于用含10mM咪唑溶解缓冲液A平衡Ni-NTA柱至基线稳定，流速为2ml/min；收集含有目的多肽的柱穿液；
B、用含10mM咪唑的溶解缓冲液A冲洗Ni-NTA柱至基线，收集柱穿液；
C、将步骤A和B的过柱液合并，得到初步纯化的目的多肽；用HPLC进行检测(使用目的多肽标准曲线)，其纯度为85.8％，回收率为63.4％；
D、用含250mol/L咪唑的溶解缓冲液A冲洗Ni-NTA柱至基线，再用去离子水冲洗Ni-NTA柱，Ni-NTA柱得以重复利用。
(5)C18反向疏水柱脱盐处理
同实施例1步骤(5)。
(5)样品C18预柱脱盐处理
初步纯化的目的多肽通过C18反向疏水柱进行脱盐处理，同步骤(2)B，差异仅在于流速为5ml/min；
(6)目的肽的精制同实施例一，得到纯度为99.63％的目的多肽，回收率为75％(用HPLC进行检测，使用目的多肽标准曲线)，最终得到目的肽粉末1058mg，产率为302.3mg/L发酵液，4.6mg/g湿菌体。质谱鉴定，分子量与预期符合。
实施例5
对表达含有His Taq和甲酸水解位点的融合蛋白的工程菌发酵液进行预处理，得到含有His Taq和甲酸水解位点的融合蛋白粗提物：同实施例2步骤(1)，其中区别仅在于，样品为专利申请号201010221511.8实施例五发酵所得菌体320g，高压匀浆机压力为150MPa下破菌两次，所用的溶液体积均为菌体质量的10倍。
(2)融合蛋白粗提物的初次纯化
A、用含20mM咪唑的溶解缓冲液A(同步骤(1))平衡Ni-NTA柱至基线稳定，然后将步骤(1)得到的融合蛋白粗提物上柱，流速为4ml/min，Ni-NTA柱的载量为30.4mg蛋白/ml柱体积；上柱完后，用含20mM咪唑的溶解缓冲液A洗柱子至基线，然后用含250mM咪唑的溶解缓冲液A(同步骤(1))洗脱至基线停止，收集蛋白峰处的洗脱液，通过HPLC检测(使用融合蛋白标准曲线，按实施例1建立)，得到24g融合蛋白，纯度为94.1％；最后用含1M咪唑的溶解缓冲液A冲洗Ni-NTA柱至基线，将残留在柱上的蛋白和其它杂质全部洗脱下来，再用1倍柱体积去离子水冲洗Ni-NTA柱，Ni-NTA柱得以重复利用；
B、将蛋白峰处的洗脱液过C18反向疏水柱(径高比为0.4)进行脱盐处理，具体步骤如下：用冰醋酸将蛋白峰处的洗脱液的pH值调为3.5，然后上脱盐平衡液(三氟乙酸、乙腈、超纯水按体积比0.1∶5∶94.9)平衡好的C18反向疏水柱；上柱的条件为流速12ml/min，载量6g融合蛋白/L柱体积；接着用体积百分比0.1％的三氟乙酸水溶液冲洗C18反向疏水柱至无盐；用脱盐洗脱液(三氟乙酸、乙腈、超纯水按体积比0.1∶50∶49.9)洗脱至基线为止，收集不在基线处的洗脱液，用旋转蒸发仪浓缩至原体积的1/5(水浴温度45℃)，混匀，分装至冻干管中，液氮预冻，-70℃真空冷冻干燥，得到初级纯化蛋白粉末，通过HPLC检测(使用融合蛋白标准曲线，按实施例1建立)，脱盐率达到92.5％以上，脱盐回收率为86.5％。
所用的试剂均为色谱纯级别，水为MiliQ水。
(3)甲酸水解释放目的肽
同实施例1步骤(3)，区别仅在于初级纯化蛋白的终浓度为10mg/ml，甲酸浓度为55％，得到甲酸水解蛋白粉末，HPLC进行检测(使用目的多肽标准曲线)，甲酸水解率为53.3％，水解得率为12.1％。
(4)目的多肽的初步纯化
同实施例1。用HPLC进行检测(使用目的多肽标准曲线)，其纯度为79.1％，回收率为65.3％；
(5)样品C18预柱脱盐处理
同实施例2。
(6)目的肽精制同实施例1。得到纯度为99.5％的目的多肽，回收率为77.3％(用HPLC进行检测，使用目的多肽标准曲线)，最终得到目的肽粉末1356mg，产率为387mg/L发酵液，4.24mg/g湿菌体。质谱鉴定，分子量与预期符合。
实施例6
对表达含有His Taq和甲酸水解位点的融合蛋白的工程菌发酵液进行预处理，得到含有His Taq和甲酸水解位点的融合蛋白粗提物：同实施例1步骤(1)，其中区别仅在于，样品为专利申请号201010221511.8实施例6发酵所得的菌体260g。
(2)融合蛋白粗提物的初次纯化
A、用含20mM咪唑的溶解缓冲液A(同步骤(1))平衡Ni-NTA柱至基线稳定，然后将步骤(1)得到的融合蛋白粗提物上柱，流速为6ml/min，Ni-NTA柱的载量为33.2mg蛋白/ml柱体积；上柱完后，用含20mM咪唑的溶解缓冲液A洗柱子至基线，然后用含500mM咪唑的溶解缓冲液A(同步骤(1))洗脱至基线停止，收集蛋白峰处的洗脱液，通过HPLC检测(使用融合蛋白标准曲线，按实施例1建立)，得到19.76g融合蛋白，纯度为91.8％；最后用含1M咪唑的溶解缓冲液A冲洗Ni-NTA柱至基线，将残留在柱上的蛋白和其它杂质全部洗脱下来，再用1倍柱体积去离子水冲洗Ni-NTA柱，Ni-NTA柱得以重复利用；
B、将蛋白峰处的洗脱液过C18反向疏水柱(径高比为0.4)进行脱盐处理，具体步骤如下：用冰醋酸将蛋白峰处的洗脱液的pH值调为3.5，然后上脱盐平衡液(三氟乙酸、乙腈、超纯水按体积比0.1∶5∶94.9)平衡好的C18反向疏水柱；上柱的条件为流速14ml/min，载量6g融合蛋白/L柱体积；接着用体积百分比0.1％的三氟乙酸水溶液冲洗C18反向疏水柱至无盐；用脱盐洗脱液(三氟乙酸、乙腈、超纯水按体积比0.1∶50∶49.9)洗脱至基线为止，收集不在基线处的洗脱液，用旋转蒸发仪浓缩至原体积的1/5(水浴温度45℃)，混匀，分装至冻干管中，液氮预冻，-70℃真空冷冻干燥，得到初级纯化蛋白粉末，通过HPLC检测(使用融合蛋白标准曲线，按实施例1建立)，脱盐率达到92.5％以上，脱盐回收率为76.2％。
所用的试剂均为色谱纯级别，水为MiliQ水。
(3)甲酸水解释放目的肽
方法同实施例1。HPLC进行检测(使用目的多肽标准曲线)，甲酸水解率为67.5％，水解得率为16.9％。
(4)目的肽的粗提取
同实施例1。用HPLC进行检测(使用目的多肽标准曲线)，其纯度为81.4％，回收率为65.3％；
(5)样品C18预柱脱盐处理
同实施例1。
(6)目的肽精制同实施例1。得到纯度为99.6％的目的多肽，回收率为76.2％(用HPLC进行检测，使用目的多肽标准曲线)，最终得到目的肽粉末1396mg，产率为400mg/L发酵液，5.37mg/g湿菌体。质谱鉴定，分子量与预期符合。
对比实施例1
(1)对表达含有His Taq和甲酸水解位点的融合蛋白的工程菌发酵液进行预处理，得到含有His Taq和甲酸水解位点的融合蛋白粗提物：
菌体加50mlBufferA(6mol/L尿素，50mmol/LNaH2PO4，300mM NaCl，pH8.0)，摇床内室温摇动20min重悬菌体，菌体悬浮液在高压匀浆机破菌。4℃10000rpm离心30min，弃沉淀，留上清。
(2)融合蛋白粗提物的初次纯化
A、用含10mM咪唑的BufferA平衡Ni-NTA柱至基线稳定，然后将步骤(1)得到的融合蛋白粗提物上柱，上柱完后，分别用含10mM、40mM咪唑的BufferA洗柱子至基线，然后用含250mM咪唑的BufferA洗脱融合蛋白。
B、融合蛋白利用Waters 5gC18反相疏水柱进行脱盐处理，由70％的已腈洗脱融合蛋白。
(3)甲酸水解释放目的肽
用体积百分比为70％甲酸(色谱纯)溶解初级纯化蛋白粉末，于45℃下避光水解24h。
(4)目的多肽的纯化
水解产物再次经Ni2+NTA琼脂糖树脂柱纯化以除去融合蛋白和融合蛋白水解后的载体蛋白部分，因为它们仍然带6个组氨酸。收集流过Ni2+NTA琼脂糖树脂柱的通过蛋白，经HPLC分析和制备：流动相A(10％CNCH3：90％H2O，0.1％TFA)，流动相B(100％CNCH3，0.1％TFA)；流速1ml/min；30min线性梯度洗脱B相至70％，检测波长280nm，收集目的肽的HPLC单峰，经冷冻干燥得到目的肽产品。质谱鉴定分子量正确。
与本发明实施例对比，对比实施例水解率只有30％左右，水解得率也只有不到10％，产生的副产物多，纯化的工艺条件不能放大，只得到纯度大于98％的11.6mg/L发酵液的目的肽。远远低于本发明400mg/L发酵液的产率。
对比实施例2
本实施例同实施例1，区别仅在于此实施例没有第(5)样品C18预柱脱盐处理这个步骤。对比实施例2的精制回收率仅为40％，实施例1为71.9％。而且没有脱盐处理就精制对制备柱的使用寿命也受很大影响，大大增加了工艺成本。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种大规模纯化含有His Tag和甲酸水解位点的融合蛋白的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)对表达含有His Tag和甲酸水解位点的融合蛋白的工程菌发酵液进行预处理，得到含有His Tag和甲酸水解位点的融合蛋白粗提物：
①含有His Tag和甲酸水解位点的融合蛋白为分泌形式表达时，则去除工程菌发酵液中的固体物质，收集发酵上清液，对发酵上清液进行浓缩；
②含有His Tag和甲酸水解位点的融合蛋白为包涵体形式表达时，则收集工程菌菌体，进行破碎，然后将包涵体进行变性，溶解于溶液中；
(2)融合蛋白粗提物的初次纯化
A、用含10～20mM咪唑的溶解缓冲液A平衡Ni-NTA柱至基线稳定，然后将步骤(1)得到的融合蛋白粗提物上柱，流速为3～6ml/min，Ni-NTA柱的载量为25～35mg蛋白/ml柱体积；上柱完后，用含10～20mM咪唑的溶解缓冲液A洗柱子至基线，然后用含250～500mM咪唑的溶解缓冲液A洗脱至基线停止，收集蛋白峰处的洗脱液；最后用含1M咪唑的溶解缓冲液A冲洗Ni-NTA柱至基线，将残留在柱上的蛋白和其它杂质全部洗脱下来，再用去离子水冲洗Ni-NTA柱，Ni-NTA柱得以重复利用；所述的溶解缓冲液A的组成为：6M尿素、25～50mM Na2HPO4、300～500mM NaCl，pH8.0；
B、将蛋白峰处的洗脱液过C18反向疏水柱进行脱盐处理，具体步骤如下：将蛋白峰处的洗脱液的pH值调为3～4，然后上脱盐平衡液平衡好的C18反向疏水柱；上柱的条件为流速5～14ml/min，载量6g融合蛋白/L柱体积；接着用体积百分比0.1％的三氟乙酸水溶液冲洗C18反向疏水柱至无盐；用脱盐洗脱液洗脱至基线为止，收集不在基线处的洗脱液，浓缩至原体积的1/5，真空冷冻干燥，得到初级纯化蛋白；所述的脱盐平衡液为三氟乙酸、乙腈、超纯水按照体积比0.1:5:94.9混合得到的溶液；所述的脱盐洗脱液为三氟乙酸、乙腈、超纯水按照体积比0.1:50:49.9混合得到的溶液；
(3)甲酸水解释放目的肽
用体积百分比为50％～60％的甲酸溶解初级纯化蛋白，初级纯化蛋白的终浓度为10～30mg/ml，于避光条件下、42～45℃的条件下振荡36～48h进行水解，水解后浓缩，真空冷冻干燥，得到甲酸水解蛋白；
(4)目的多肽的初步纯化
A、用含10～20mM咪唑的溶解缓冲液A平衡Ni-NTA柱至基线稳定，将样品上柱，样品为用含10～20mM咪唑的溶解缓冲液A溶解的甲酸水解蛋白，且pH值为8.0；样品上柱量为2～3倍柱体积，流速为2～5ml/min；收集含有目的多肽的过柱液；
B、用含10～20mM咪唑的溶解缓冲液A冲洗Ni-NTA柱至基线，收集过柱液；
C、将步骤A和B的过柱液合并，得到初步纯化的目的多肽；
D、用含250mol/L咪唑的溶解缓冲液A冲洗Ni-NTA柱至基线，再用去离子水冲洗Ni-NTA柱，Ni-NTA柱得以重复利用；
(5)C18反向疏水柱脱盐处理
初步纯化的目的多肽通过C18反向疏水柱进行脱盐处理，同步骤(2)B，差异仅在于流速为3～5ml/min；
(6)目的多肽的精制，通过制备型的高效液相色谱进行制备
HPLC的条件为乙腈的起始浓度为体积百分比10％，终止浓度为体积百分比60％，分管收集洗脱液；HPLC检测各管收集液，确定各管收集液中目的肽的纯度，合并纯度高于质量百分比95％的各管收集液，纯度低于95％的各管收集液可合并后再次用HPLC进行精制；真空冷冻干燥纯度高于95％的各管收集液合并液，得到纯度高于95％的目的多肽；
所述的含有His Tag和甲酸水解位点的融合蛋白为His Tag、甲酸水解位点和目的多肽依次连接、且目的多肽本身不含有His Tag和甲酸水解位点的融合蛋白。
2.根据权利要求1所述大规模纯化含有His Tag和甲酸水解位点的融合蛋白的方法，其特征在于：在纯化过程中用HPLC实时监控每一步骤得到产品质量，其中步骤(2)使用融合蛋白标准曲线，步骤(3)～(6)使用目的多肽标准曲线；
所述的融合蛋白标准曲线的建立方法为：
A、称按照步骤(1)和步骤(2)得到初级纯化蛋白粉末100mg，用2mL按体积比30:0.1:69.9混合的乙腈/三氟乙酸/水溶液溶解，再用按体积比30:0.1:69.9混合的乙腈/三氟乙酸/水溶液稀释成浓度5mg/mL、10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL和25mg/mL的溶液，每个浓度的溶液各取1mL；
B、HPLC检测上述浓度梯度的融合蛋白溶液，上样量均为20μL，HPLC条件为：流动相A为按体积比1:999的三氟乙酸/水溶液，流动相B为按体积比1:999的三氟乙酸/乙腈溶液，20分钟线性梯度洗脱，流动相B从体积百分比30％升至体积百分比60％，洗脱流速是1.0mL/min，检测波长214nm；
C、记录HPLC检测各个样品的融合蛋白峰面积值，以融合蛋白峰面积值对融合蛋白浓度绘制标准曲线；
所述的目的多肽标准曲线的建立方法为：
A、称取精制的目的多肽粉末10mg，用2mL按体积比30:0.1:69.9混合的乙腈/三氟乙酸/水溶液溶解，再用按体积比30:0.1:69.9混合的乙腈/三氟乙酸/水溶液稀释成浓度0.25mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL和2mg/mL的溶液，每个浓度的溶液各取1mL；
B、HPLC检测上述浓度梯度的目的肽溶液，上样量均为20μL，HPLC条件为：流动相A为按体积比1:999的三氟乙酸/水溶液，流动相B为按体积比1:999的三氟乙酸/乙腈溶液，20分钟线性梯度洗脱，流动相B从体积百分比5％升至体积百分比95％，洗脱流速是1.0mL/min，检测波长214nm；
C、记录HPLC检测各个样品的目的肽峰面积值，以目的肽峰面积值对目的肽浓度绘制标准曲线。
3.根据权利要求1或2所述大规模纯化含有His Tag和甲酸水解位点的融合蛋白的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的含有His Tag和甲酸水解位点的融合蛋白为包涵体形式表达时，采取包含以下步骤的预处理方法：
I、将收集得到的工程菌菌体与pH7.4、50mM的PBS缓冲液混合均匀，室温静置30min，然后在压力为120～150MPa的条件下均质破菌至少一次，收集不溶性物质；
II、然后依次用洗涤液A和洗涤液B对步骤I得到的不溶性物质进行洗涤；洗涤液A为pH8.0、20mM的Tris-HCl；洗涤液B为含有2M尿素的pH7.4、50mM的PBS缓冲液；
III、用含10～20mmol/L咪唑的溶解缓冲液A溶解步骤II洗涤处理好的不溶性物质，除去其中仍不能溶解的物质；上清液用孔径为0.45μm的膜进行过滤，收集滤液，得到含有His Tag和甲酸水解位点的融合蛋白的粗提物；所述的溶解缓冲液A的组成为：6M尿素、25～50mM Na2HPO4、300～500mM NaCl，pH8.0。
4.根据权利要求3所述大规模纯化含有His Tag和甲酸水解位点的融合蛋白的方法，其特征在于：
步骤I中所述pH7.4、50mM的PBS缓冲液的使用体积为工程菌菌体质量的10倍；
步骤I中所述的收集不溶性物质的方法为离心；
步骤II中所述的洗涤的条件为以50rpm的速度搅拌10min；
步骤II中所述的洗涤液A的使用体积为工程菌菌体质量的10倍；
步骤II中所述的洗涤液B的使用体积为工程菌菌体质量的10倍；
步骤III中所述含10～20mmol/L咪唑的溶解缓冲液A的使用体积为工程菌菌体质量的10倍；
步骤III中所述的除去其中仍不能溶解的物质的方式为离心。
5.根据权利要求4所述大规模纯化含有His Tag和甲酸水解位点的融合蛋白的方法，其特征在于：所述离心的条件为4℃、10000rpm离心30min。
6.根据权利要求1所述大规模纯化含有His Tag和甲酸水解位点的融合蛋白的方法，其特征在于：所述融合蛋白的长度为40～100个氨基酸。
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