CN106366200A - 制备重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种制备重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的方法，该方法采用Sepharose Q-XL阴离子交换层析-Uni Phenyl-30L疏水层析-中空纤维柱脱盐-UniQ-30L阴离子交换层析-中空纤维柱超滤置换。本发明提供的方法能够制备纯度高达99％以上的重组葡激酶-水蛭素融合蛋白。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及蛋白质的制备方法，更具体的，本发明涉及重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的制备方法。
背景技术
重组葡激酶-水蛭素融合蛋白(SFH)是一种溶栓药物，它通过分子中的溶栓成分葡激酶而发挥溶栓作用，通过分子中水蛭素的C-末端对凝血酶的高度亲和力可以使药物快速到达血栓部位并提高血栓部位的药物浓度，从而提高溶栓效率。在血栓部位，葡激酶和水蛭素之间的连接肽可被血栓局部的凝血因子Xa识别并裂解，靶向释放出的水蛭素可在血栓局部发挥抗凝活性。SFH在临床上用于血栓栓塞性疾病，包括急性心肌梗塞、深静脉血栓等的溶栓治疗。
然而，重组葡激酶-水蛭素融合蛋白(SFH)的制备方法仍有待改进。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。在重组葡激酶-水蛭素融合蛋白(SFH)的生产过程中，相关杂质(如宿主DNA、内毒素等)的去除、维持目标蛋白的活性、高效率的收集目标蛋白，成为了重组葡激酶-水蛭素融合蛋白(SFH)制备过程的一个重大难关。为此，本发明的一个目的在于提出一种具有生产周期短、产量高、重要工艺步骤能够放大生产、SFH原液纯度、宿主DNA残留、内毒素等重要指标稳定合格的重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的制备方法。
在本发明的第一个方面，本发明提出了一种制备重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：(1)将菌体进行裂解和离心处理，以便获得裂解液，所述菌体表达所述重组葡激酶-水蛭素融合蛋白；(2)利用中空纤维柱对所述裂解液进行第一过滤处理，以便获得第一滤液；(3)利用Sepharose Q-XL作为阴离子交换介质对所述第一滤液进行第一层析处理和第一洗脱处理，以便获得第一洗脱液；(4)利用UniPhenyl-30L作为疏水层析介质对所述第一洗脱液进行第二层析处理和第二洗脱处理，以便获得第二洗脱液；(5)利用第一滤膜，通过超滤对所述第二洗脱液进行脱盐处理和超滤置换处理，以便获得浓缩液；(6)利用UniQ-30L作为阴离子交换介质对所述浓缩液进行第三层析处理和第三洗脱处理，以便获得第三洗脱液；以及(7)利用第二滤膜，对所述第三洗脱液进行超滤置换处理，以便获得所述重组葡激酶-水蛭素融合蛋白。
上述的Sepharose Q-XL阴离子交换层析、Uni Phenyl-30L疏水层析、UniQ-30L阴离子交换层析是不同型号的层析介质。制备的样品溶液通过上述的一系列层析纯化和超滤置换后，可以得到高产量的以及SFH原液纯度、宿主DNA残留、内毒素等重要指标稳定合格的重组葡激酶-水蛭素融合蛋白。根据本发明的实施例，通过本发明的方法制备的重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的纯度高达99％以上。
根据本发明的实施例，上述制备重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的方法还可以具有下列附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，在上述步骤(1)中，菌体裂解是在pH7.0的Tris-HCl缓冲液中进行的，菌体裂解过程是将菌体与缓冲液反复冻融四次，其中，每次所述冻融包括在-20摄氏度下冷冻过夜和在37摄氏度下进行解冻。与现有技术相比，本发明中菌体裂解环境更加温和，更有利于目标蛋白的活性和结构的保持，从而有利于提高重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的产量。
根据本发明的实施例，在步骤(2)中，所述中空纤维柱具有0.22微米的孔径，所述中空纤维柱是预先被pH7.0的Tris-HCl缓冲液进行平衡处理的。采用0.22微米的中空纤维质柱进行过滤是本发明的一项重要改进，与现有技术相比，既减少了过滤次数，又减少了工艺处理时间，降低了工艺处理成本，并且中空纤维超滤膜分离效率均远远大于超滤膜包的分离效率，从而既提高了重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的产量，又使其宿主DNA与内毒素的残留等重要指标都能严格控制在合格线以内。
根据本发明的实施例，步骤(3)包括：将所述第一滤液上样至装载有所述SepharoseQ-XL层析介质的层析柱，其中，所述第一滤液的线性流速为6厘米/分钟，并且所述层析柱的介质装载量不超过60g/L,上样结束后，依次采用下列洗脱液进行所述第一洗脱：5柱体积的pH7.0的20mM Tris-HCl缓冲液；3柱体积的pH7.0的20mM Tris-HCl缓冲液与pH7.0的20mMTris-HCl-0.5M NaCl缓冲液的混合物，其中，pH7.0的20mMTris-HCl-0.5M NaCl缓冲液的体积含量为14％；3柱体积的pH7.0的20mM Tris-HCl缓冲液与pH7.0的20mMTris-HCl-0.5M NaCl缓冲液的混合物，其中，pH7.0的20mMTris-HCl-0.5M NaCl缓冲液的体积含量为60％；以及3柱体积的pH7.0的20mMTris-HCl-0.5M NaCl缓冲液。与现有技术相比，Sepharose Q-XL填充材料价格便宜，易于放大生产，而且层析效率更高，从而既提高了重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的产量，又使其宿主DNA与内毒素的残留等重要指标都能严格控制在合格线以内。
根据本发明的实施例，步骤(4)包括：将所述第一洗脱液与3M(NH4)2SO4缓冲液混合，将所得混合液上样至装载有所述Uni Phenyl-30L疏水层析介质的层析柱，其中所述混合液的流速为3.5厘米/分钟，并且所述层析介质的载量不超过30g/L,上样结束后，依次采用下列洗脱液进行所述第二洗脱：5柱体积的pH8.0的20mM Tris-HCl-1.5M(NH4)2SO4缓冲液；以及3柱体积的pH8.0的20mM Tris-HCl缓冲液。与现有技术相比，本发明在离子交换层析之后采用Uni Phenyl-30L疏水层析，交替采用不同的层析技术，可以有效提高目标蛋白的产量，又使其残留物质等重要指标都能严格控制在合格线以内。
根据本发明的实施例，在步骤(5)中，所述第一滤膜的膜孔径是5KD,所述第一滤膜的材质是改性聚醚砜，将所述第二洗脱液泵入装载有所述第一滤膜的超滤系统进行脱盐处理，并用pH8.0的20mMTris-HCl缓冲液对所述第二洗脱液进行超滤置换，所述超滤置换的倍数是7倍。与现有技术相比，由于步骤(4)中的疏水层析的洗脱条件是通过改变洗脱液的盐-水比例，改变其极性，使吸附在固定相上的不同极性组分根据其疏水性的差异先后被解吸下来，以达到分离目的，因此步骤(5)对所述第二洗脱液进行了脱盐处理。超滤过程是在常温下进行，条件温和无成分破坏，因而特别适宜对蛋白质的脱盐与浓缩。而且超滤过程不发生相变化，无需加热，能耗低，无需添加化学试剂，无污染。从而超滤脱盐浓缩处理后的样品更有利于下一步的层析纯化，既提高了重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的产量，又使其宿主DNA与内毒素的残留等重要指标都能严格控制在合格线以内。
根据本发明的实施例，步骤(6)包括：将所述浓缩液上样至装载有所述UniQ-30L层析介质的层析柱，其中，所述浓缩液的线性流速为3.5厘米/分钟，并且所述层析柱的介质装载量不超过30g/L,上样结束后，依次采用下列洗脱液进行所述第三洗脱：5柱体积的pH8.0的20mM Tris-HCl缓冲液；5柱体积的pH8.0的20mM Tris-HCl缓冲液与pH8.0的20mMTris-HCl-0.5M NaCl缓冲液的混合物，其中，pH8.0的20mMTris-HCl-0.5M NaCl缓冲液的体积含量为10％；5柱体积的pH8.0的20mM Tris-HCl缓冲液与pH8.0的20mMTris-HCl-0.5M NaCl缓冲液的混合物，其中，pH8.0的20mMTris-HCl-0.5M NaCl缓冲液的体积含量为30％；以及3柱体积的pH8.0的20mMTris-HCl-0.5M NaCl缓冲液。将步骤(5)得到的浓缩液经过上述步骤(6)的阴离子交换层析后，所得到的重组葡激酶-水蛭素融合蛋白洗脱液具有高纯度的特点，其宿主DNA与内毒素的残留等重要指标都能严格控制在合格线以内。根据本发明的实施例，通过本发明的方法制备的重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的纯度高达99％以上。
根据本发明的实施例，在步骤(7)中：所述第二滤膜的膜孔径是5KD,所述第二滤膜的材质是改性聚醚砜，所述第三洗脱液泵入装载有所述第二滤膜的超滤系统，并用磷酸缓冲液对所述第三洗脱液进行超滤置换，所述超滤置换的倍数是7倍。与现有技术相比，最后一步中超滤置换材质效率更高，超滤装置采用蠕动泵动力，动力更加均匀和有力，从而使得超滤浓缩和置换的效率更高，以便获得高产量的和SFH原液纯度、宿主DNA残留、内毒素等重要指标得到稳定控制的重组葡激酶-水蛭素融合蛋白。
在本发明第二个方面，本发明提出了一种制备重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的方法，根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：
配制缓冲液
缓冲液A:20mM Tris-Cl pH 7.0
缓冲液B:20mM Tris-Cl 0.5M NaCl pH 7.0
缓冲液C：20mM Tris-Cl–1.5M(NH4)2SO4pH 8.0
缓冲液D：3M(NH4)2SO4
缓冲液E:20mM Tris-Cl pH 8.0
缓冲液F:20mM Tris-Cl 0.5M NaCl pH 8.0
菌体前处理
发酵下灌后经洗涤的菌体，每100g菌体加200ml缓冲液A，混和均匀，放入-20℃冰冻过夜，将已冻好的菌体在37℃解冻，然后再次放入-20℃过夜，如此反复冻融4次，菌液在37℃解冻后转入离心杯中，离心转速5000rpm，时间60min，温度4摄氏度，收集裂解上清液，该上清液即为裂解液，用缓冲液A循环平衡0.22微米中空纤维柱10min，裂解液经0.22微米中空纤维柱澄清，收集滤过液，该滤液称为第一滤液。
Sepharose Q-XL阴离子交换层析
将Sepharose Q-XL阴离子交换介质装入层析柱，待层析介质沉降完全后，安装缓冲液分布器，分布器与层析介质之间需压实，清洗并用2M的NaCl活化Sepharose Q-XL层析介质，以缓冲液A平衡Sepharose Q-XL层析介质，平衡体积为5个柱体积，将第一滤液上样至Sepharose Q-XL层析介质，线性流速为6厘米/分钟，介质载量不高于60g/L，上样结束后，以缓冲液A继续冲洗5个柱体积，按阶段洗脱程序流洗Sepharose Q-XL，洗脱浓度如下：
5柱体积的pH7.0的20mM Tris-HCl缓冲液；
3柱体积的pH7.0的20mM Tris-HCl缓冲液与pH7.0的20mMTris-HCl-0.5M NaCl缓冲液的混合物，其中，pH7.0的20mMTris-HCl-0.5M NaCl缓冲液的体积含量为14％；
3柱体积的pH7.0的20mM Tris-HCl缓冲液与pH7.0的20mMTris-HCl-0.5M NaCl缓冲液的混合物，其中，pH7.0的20mMTris-HCl-0.5M NaCl缓冲液的体积含量为60％；以及
3柱体积的pH7.0的20mMTris-HCl-0.5M NaCl缓冲液，
在60％B洗脱区域出现目的蛋白峰，UV高于30mAu开始收集样品，UV低于50mAU时停止收集，此时收得样品溶液称为第一洗脱液。
Uni Phenyl-30L疏水层析
将Uni Phenyl-30L疏水层析介质装入层析柱，待层析介质沉降完全后，安装缓冲液分布器，分布器与层析介质之间需压实，清洗Uni Phenyl-30L疏水层析介质，以缓冲液C平衡Uni Phenyl-30L疏水层析介质，平衡体积为3个柱体积。
将蛋白粗提组分按1:1的比例加入缓冲液D，充分混匀，将混合液上样至Uni Phenyl-30L疏水层析介质，线性流速为3.5厘米/分钟，介质载量不高于30g/L，上样结束后，以缓冲液C继续冲洗5个柱体积，按阶段洗脱程序流洗Uni Phenyl-30L疏水层析介质，洗脱浓度如下：
5柱体积的pH8.0的20mM Tris-HCl-1.5M(NH4)2SO4缓冲液；以及
3柱体积的pH8.0的20mM Tris-HCl缓冲液，
在100％E洗脱区间出现目的蛋白峰，UV高于30mAu以上开始收样，UV低于50mAU时停止收集，此时收得样品称之为第二洗脱液。
样品脱盐
安装超滤系统，品牌为仕比纯，膜孔径为5KD，材质为改性聚醚砜。
用蠕动泵匀速将0.1M NaOH泵入超滤系统，pH试纸侧滤出端和回流端出液为碱性后，管路均放入0.1M NaOH循环30min，NaOH循环完成后用注射用水冲洗10个体积，pH试纸测滤出端和回流端出水均为中性后，换缓冲液PB循环平衡10分钟。
将Uni Phenyl-30L疏水层析收获的样品用蠕动泵泵入超滤系统，控制入口压力低于5psi，回流端放入无热原容器，滤出端用洁净容器收集滤出液，回流液(即浓缩液)浓缩到目的体积时，加入缓冲液E进行洗滤置换，置换倍数为7倍，置换完毕的样品称之为第二滤液并用于下级层析。
UniQ-30L阴离子交换层析
将UniQ-30L阴离子交换介质装入层析柱，待层析介质沉降完全后，安装缓冲液分布器，分布器与层析介质之间需压实，清洗并用2M NaCl活化UniQ-30L层析介质，以缓冲液E平衡UniQ-30L层析介质，平衡体积为5个柱体积。
将脱盐后的蛋白组分上样至UniQ-30L层析介质，线性流速为3.5厘米/分钟，介质载量不高于30g/L，上样结束后，以缓冲液E继续冲洗5个柱体积，按阶段洗脱程序流洗UniQ-30L层析介质，洗脱浓度如下：
5柱体积的pH8.0的20mM Tris-HCl缓冲液；
5柱体积的pH8.0的20mM Tris-HCl缓冲液与pH8.0的20mMTris-HCl-0.5M NaCl缓冲液的混合物，其中，pH8.0的20mMTris-HCl-0.5M NaCl缓冲液的体积含量为10％；
5柱体积的pH8.0的20mM Tris-HCl缓冲液与pH8.0的20mMTris-HCl-0.5M NaCl缓冲液的混合物，其中，pH8.0的20mMTris-HCl-0.5M NaCl缓冲液的体积含量为30％；以及
3柱体积的pH8.0的20mMTris-HCl-0.5M NaCl缓冲液，
在30％F洗脱区域出现目的蛋白峰，UV高于30mAu以上开始收样，UV低于50mAU时停止收集，此时收得样品即为目标蛋白组分，称此样品为第三洗脱液。
超滤置换
安装超滤系统，品牌为仕比纯，膜孔径为5KD，材质为改性聚醚砜，用蠕动泵匀速将0.1M NaOH泵入超滤系统，pH试纸侧滤出端和回流端出液为碱性后，管路均放入0.1MNaOH循环30分钟，NaOH循环完成后用注射用水冲洗10个体积，pH试纸测滤出端和回流端出水均为中性后，换缓冲液PB循环平衡10min，将UniQ-30L收获的样品组分用蠕动泵泵入超滤系统，控制入口压力低于5psi，回流端放入无热原容器，滤出端用洁净容器收集滤出液，回流液(即浓缩液)浓缩到目的体积时，加入PB缓冲液进行洗滤置换，置换倍数为7倍。
浓缩液置换完毕，即为目标蛋白重组葡激酶-水蛭素融合蛋白。
综上所述，根据本发明的实施例，经过依次的中空纤维柱过滤、阴离子交换层析、疏水层析、脱盐处理、阴离子交换层析和超滤置换，可以得到高产量的和SFH原液纯度、宿主DNA残留、内毒素等重要指标都得到稳定控制的重组葡激酶-水蛭素融合蛋白。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种重组葡激酶-水蛭素融合蛋白，根据本发明的实施例，所述重组葡激酶-水蛭素融合蛋白具有至少99％的纯度，任选的，所述重组葡激酶-水蛭素融合蛋白是通过上述方法获得的。根据本发明的实施例，本发明提出的重组葡激酶-水蛭素融合蛋白纯度高，大大提高了重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的药用安全性。
附图说明
图1是根据本发明实施例的小规模的Sepharose Q-XL阴离子交换层析的层析图谱，
图2是根据本发明实施例的小规模的Sepharose Q-XL阴离子交换层析的电泳图谱，
图3是根据本发明实施例的小规模的Uni Phenyl-30L疏水层析的层析图谱，
图4是根据本发明实施例的小规模的Uni Phenyl-30L疏水层析的电泳图谱，
图5是根据本发明实施例的小规模的UniQ-30L阴离子交换层析的层析图谱，
图6是根据本发明实施例的小规模的UniQ-30L阴离子交换层析的电泳图谱，
图7是根据本发明实施例的中级规模的Sepharose Q-XL阴离子交换层析的层析图谱，
图8是根据本发明实施例的中级规模的Uni Phenyl-30L疏水层析的层析图谱，
图9是根据本发明实施例的中级规模的UniQ-30L阴离子交换层析的层析图谱；以及
图10是根据本发明实施例的中级规模的UniQ-30L阴离子交换层析的电泳图谱。
图示说明
图2中1表示流穿峰区域样品，2表示定位marker，3表示对照样品，4表示空白对照样品，5表示目的峰区域样品；
图4中1表示对照样品，2表示空白对照，3表示流穿峰区域样品，4表示杂质峰区域样品，5表示目的峰区域样品，6表示碱洗峰区域样品；
图6中1表示对照样品，2表示定位marker，3表示Sepharose Q-XL目的峰区域样品，4表示Uni Phenyl-30L目的峰区域样品，5表示低浓度盐洗UniQ-30L目的峰区域样品，6表示高浓度盐洗UniQ-30L目的峰区域样品；
图10中1表示对照样品，3-5表示重组葡激酶-水蛭素融合蛋白(SFH)。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
蛋白质药物被称为生物制品或生物药。生物药的粗制品，如细菌发酵上清液、细胞发酵上清液中，不仅含有所需的目的蛋白药物，也含有许多必须与目的蛋白分离的杂质，包括宿主蛋白、宿主DNA、内毒素等。这些杂质的存在不仅影响治疗效果，并且危害患者健康。在重组葡激酶-水蛭素融合蛋白(SFH)的生产过程中，相关杂质(如宿主DNA、内毒素等)的去除、维持目标蛋白的活性、高效率的收集目标蛋白，成为了重组葡激酶-水蛭素融合蛋白(SFH)制备过程的一个重大难关。为此，本发明的一个目的在于提出一种具有生产周期短、产量高、重要工艺步骤能够放大生产、SFH原液纯度、宿主DNA残留、内毒素等重要指标稳定合格的重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的制备方法和一种纯度高达99％以上的重组葡激酶-水蛭素融合蛋白。
制备重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的方法
包括：(1)将菌体进行裂解和离心处理，以便获得裂解液，所述菌体表达所述重组葡激酶-水蛭素融合蛋白；(2)利用中空纤维柱对所述裂解液进行第一过滤处理，以便获得第一滤液；(3)利用Sepharose Q-XL作为阴离子交换介质对所述第一滤液进行第一层析处理和第一洗脱处理，以便获得第一洗脱液；(4)利用Uni Phenyl-30L作为疏水层析介质对所述第一洗脱液进行第二层析处理和第二洗脱处理，以便获得第二洗脱液；5)利用第一滤膜，通过超滤对所述第二洗脱液进行脱盐处理和超滤置换处理，以便获得浓缩液；(6)利用UniQ-30L作为阴离子交换介质对所述浓缩液进行第三层析处理和第三洗脱处理，以便获得第三洗脱液；以及(7)利用第二滤膜，对所述第三洗脱液进行超滤置换处理，以便获得所述重组葡激酶-水蛭素融合蛋白。上述的Sepharose Q-XL阴离子交换层析、Uni Phenyl-30L疏水层析、UniQ-30L阴离子交换层析是不同型号的层析介质。通过将制备的样品溶液通过上述步骤所述的一系列层析纯化和超滤置换后，可以得到高产量的以及SFH原液纯度、宿主DNA残留、内毒素等重要指标稳定合格的重组葡激酶-水蛭素融合蛋白。
下面对各步骤进行详细分析
裂解菌体
根据本发明的实施例，在上述步骤(1)中，菌体裂解是在pH7.0的Tris-HCl缓冲液中进行的，菌体裂解过程是将菌体与缓冲液反腐冻融四次，之后进行离心处理，其中，每次冻融包括在-20摄氏度下冷冻过夜和在37摄氏度下进行解冻。
现有技术中缓冲液的pH是8.0，菌体裂解过程是将菌体与缓冲液反腐冻融八次，无离心处理过程。因此与现有技术相比，本发明中菌体裂解环境更加温和，减少了菌体反复冻融的次数，增加了裂解液离心处理，因而更有利于目标蛋白的活性和结构的保持，从而有利于提高重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的产量。
中空纤维柱过滤
根据本发明的实施例，在步骤(2)中，所述中空纤维柱具有0.22微米的孔径，所述中空纤维柱是预先被pH7.0的Tris-HCl缓冲液进行平衡处理的。采用0.22微米的中空纤维质柱进行过滤是本发明的一项重要改进。
现有技术采用超滤膜包澄清，裂解液需要经过两次超滤膜包澄清，膜包孔径大小依次是10微米和0.22微米。因此与现有技术相比，本发明既减少了过滤次数，又减少了工艺处理时间，降低了工艺处理成本，并且中空纤维超滤膜分离效率远远大于超滤膜包的分离效率，从而既提高了重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的产量，又使其宿主DNA与内毒素的残留等重要指标都能严格控制在合格线以内。
Sepharose Q-XL阴离子交换层析
根据本发明的实施例，步骤(3)包括：将所述第一滤液上样至装载有所述SepharoseQ-XL层析介质的层析柱，其中，所述第一滤液的线性流速为6厘米/分钟，并且所述层析柱的介质装载量不超过60g/L,上样结束后，依次采用下列洗脱液进行所述第一洗脱：5柱体积的pH7.0的20mM Tris-HCl缓冲液；3柱体积的pH7.0的20mM Tris-HCl缓冲液与pH7.0的20mMTris-HCl-0.5M NaCl缓冲液的混合物，其中，pH7.0的20mMTris-HCl-0.5M NaCl缓冲液的体积含量为14％；3柱体积的pH7.0的20mM Tris-HCl缓冲液与pH7.0的20mMTris-HCl-0.5M NaCl缓冲液的混合物，其中，pH7.0的20mMTris-HCl-0.5M NaCl缓冲液的体积含量为60％；以及3柱体积的pH7.0的20mMTris-HCl-0.5M NaCl缓冲液。
现有技术中，阴离子交换层析是采用装载有Streamline Q-XL层析介质的层析柱，目前Streamline Q-XL已经停产，且价格较高，与现有技术相比，Sepharose Q-XL填充材料价格便宜，易于放大生产，而且层析效率更高。现有技术中，滤液流速是0.5厘米/分钟，介质载量不高于10g/l,因此与现有技术相比，装载有Sepharose Q-XL的层析柱流速更快，载量更高，从而大大提高了重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的产量。现有技术中，洗脱梯度是：0％B5CV→10％B 3CV→10～17％B 1.5CV→17～27％B 4CV→27～100％B 0.2CV→100％B 1.2CV，其中5CV代表5柱体积的pH 8.0的20mM Tris-HCl缓冲液,B代表pH8.0 20mM Tris-HCl 1M NaCl缓冲液混合液，与现有技术相比，本发明中梯度洗脱所用缓冲液的pH更加温和，而且盐浓度更低，洗脱梯度少，因此可以大大提高洗脱液中重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的含量，并使洗脱液中宿主DNA与内毒素的残留得到严格控制。
Uni Phenyl-30L疏水层析
根据本发明的实施例，步骤(4)包括：将所述第一洗脱液与3M(NH4)2SO4缓冲液混合，将所得混合液上样至装载有所述Uni Phenyl-30L疏水层析介质的层析柱，其中所述混合液的流速为3.5厘米/分钟，并且所述层析介质的载量不超过30g/L,上样结束后，依次采用下列洗脱液进行所述第二洗脱：5柱体积的pH8.0的20mM Tris-HCl-1.5M(NH4)2SO4缓冲液；3柱体积的pH8.0的20mM Tris-HCl-1.5M(NH4)2SO4缓冲液；以及3柱体积的pH8.0的20mMTris-HCl缓冲液。
与现有技术相比，本发明采用了的Uni Phenyl-30L疏水层析，疏水层析是利用盐-水体系中，样品组分的疏水基团和固定相的疏水配基之间的疏水力的不同，而使样品组分得以分离的一种层析方法。洗脱条件是通过改变洗脱液的盐-水比例，改变其极性，使吸附在固定相上的不同极性组分根据其疏水性的差异先后被解吸下来，达到分离目的。交替采用不同的层析技术，可以有效提高目标蛋白的产量，又使其残留物质等重要指标都能严格控制在合格线以内。
脱盐处理
根据本发明的实施例，在步骤(5)中，所述第一滤膜的膜孔径是5KD,所述第一滤膜的材质是改性聚醚砜，将所述第二洗脱液泵入装载有所述第一滤膜的超滤系统进行脱盐处理，并用pH8.0的20mMTris-HCl缓冲液对所述第二洗脱液进行超滤置换，所述超滤置换的倍数是7倍。
与现有技术相比，由于步骤(4)中的疏水层析的洗脱条件是通过改变洗脱液的盐-水比例，使吸附在固定相上的不同极性组分根据其疏水性的差异先后被解吸下来，以达到分离目的，因此步骤(5)对所述第二洗脱液进行了脱盐处理。超滤过程是在常温下进行，条件温和无成分破坏，因而特别适宜对蛋白质的脱盐与浓缩。而且超滤过程不发生相变化，无需加热，能耗低，无需添加化学试剂，无污染。从而超滤脱盐浓缩处理后的样品更有利于下一步的层析纯化，既提高了重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的产量，又使其宿主DNA与内毒素的残留等重要指标都能严格控制在合格线以内。
UniQ-30L阴离子交换层析
根据本发明的实施例，步骤(6)包括：将所述浓缩液上样至装载有所述UniQ-30L层析介质的层析柱，其中，所述浓缩液的线性流速为3.5厘米/分钟，并且所述层析柱的介质装载量不超过30g/L,上样结束后，依次采用下列洗脱液进行所述第三洗脱：5柱体积的pH8.0的20mM Tris-HCl缓冲液；5柱体积的pH8.0的20mM Tris-HCl缓冲液与pH8.0的20mMTris-HCl-0.5M NaCl缓冲液的混合物，其中，pH8.0的20mMTris-HCl-0.5M NaCl缓冲液的体积含量为10％；5柱体积的pH8.0的20mM Tris-HCl缓冲液与pH8.0的20mMTris-HCl-0.5M NaCl缓冲液的混合物，其中，pH8.0的20mMTris-HCl-0.5M NaCl缓冲液的体积含量为30％；以及3柱体积的pH8.0的20mMTris-HCl-0.5M NaCl缓冲液。将步骤(5)得到的浓缩液经过上述步骤(6)的阴离子交换层析后，所得到的重组葡激酶-水蛭素融合蛋白洗脱液具有高纯度的特点，其宿主DNA与内毒素的残留等重要指标都能严格控制在合格线以内。
现有技术中，进一步纯化采用的是Source 15Q阴离子交换层析，Source 15Q阴离子交换介质价格较高，洗脱液在Source 15Q阴离子交换介质中的线性流速是0.6厘米/分钟，介质载量不高于10g/L,因此相比现有技术，UniQ-30L层析介质的层析效率更高，易于放大生产。现有技术中，梯度洗脱条件是0％D 1CV→0～14％D 2CV→14～20％D 6CV→20～100％D 0.2CV→100％D 1CV，其中1CV代表1柱体积pH8.7的20mM Tris-HCl缓冲液，D代表pH8.7的20mMTris-HCl-1M NaCl缓冲液,洗脱后出现两目的蛋白峰，因此与现有技术相比，本发明中梯度洗脱所用缓冲液的pH更加温和，而且盐浓度更低，洗脱梯度少，出现一处目的蛋白峰，从而大大提高洗脱液中重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的含量，并使洗脱液中宿主DNA与内毒素的残留得到严格控制。
超滤置换
根据本发明的实施例，在步骤(7)中：所述第二滤膜的膜孔径是5KD,所述第二滤膜的材质是改性聚醚砜，所述第三洗脱液泵入装载有所述第二滤膜的超滤系统，并用磷酸缓冲液对所述第三洗脱液进行超滤置换，所述超滤置换的倍数是7倍。
现有技术中，最后一步超滤置换采用5KD的超滤浓缩管，所用样品是两组份的混合洗脱液，循环动力是是离心驱动，与现有技术相比，最后一步中超滤置换材质效率更高，超滤装置采用蠕动泵动力，动力更加均匀和有力，从而使得超滤浓缩和置换的效率更高，以便获得高产量的和SFH原液纯度、宿主DNA残留、内毒素等重要指标得到稳定控制的重组葡激酶-水蛭素融合蛋白。
重组葡激酶-水蛭素融合蛋白
本发明提出了一种重组葡激酶-水蛭素融合蛋白，根据本发明的实施例，所述重组葡激酶-水蛭素融合蛋白具有至少99％的纯度，任选的，所述重组葡激酶-水蛭素融合蛋白是通过上述方法获得的。根据本发明的实施例，发明人发现，本发明的重组葡激酶-水蛭素融合蛋白，经HPLC检测，其纯度高达99％以上，而现有技术所得的重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的纯度仅能达到约95％。本发明的重组葡激酶-水蛭素融合蛋白纯度高，大大提高了重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的药用安全性。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：层析介质均为50ml,小规模制备
配制缓冲液
缓冲液A:20mM Tris-Cl pH 7.0
缓冲液B:20mM Tris-Cl 0.5M NaCl pH 7.0
缓冲液C：20mM Tris-Cl–1.5M(NH4)2SO4pH 8.0
缓冲液D：3M(NH4)2SO4
缓冲液E:20mM Tris-Cl pH 8.0
缓冲液F:20mM Tris-Cl 0.5M NaCl pH 8.0
菌体前处理
发酵下灌后经洗涤的菌体，每100g菌体加200ml缓冲液A，混和均匀，放入-20℃冰冻过夜。将已冻好的菌体在37℃解冻，然后再次放入-20℃过夜，如此反复冻融4次。菌液在37℃解冻后转入离心杯中，离心转速5000rpm，时间60min，温度4℃，收集裂解上清液，该上清液即为裂解液。用缓冲液A循环平衡0.22微米中空纤维柱10min，裂解液经0.22微米中空纤维柱澄清，收集滤过液，该滤液称为第一滤液。
Sepharose Q-XL阴离子交换层析
将Sepharose Q-XL阴离子交换介质装入层析柱，待层析介质沉降完全后，安装缓冲液分布器，分布器与层析介质之间需压实。清洗并用2M NaCl活化Sepharose Q-XL层析介质。以缓冲液A平衡Sepharose Q-XL层析介质，平衡体积为5个柱体积。
将第一滤液上样至Sepharose Q-XL层析介质，线性流速为6cm/min，介质载量不高于60g/L。
上样结束后，以缓冲液A继续冲洗5个柱体积，按阶段洗脱程序流洗Sepharose Q-XL，洗脱浓度如下：
0％B 5CV→14％B 3CV→60％B 3CV→100％B 3CV
在60％B洗脱区域出现目的蛋白峰，UV高于30mAu开始收集样品，UV低于50mAU时停止收集。此时收得样品溶液称为第一洗脱液。
第一洗脱液层析图谱如图1所示，第一洗脱液蛋白电泳检测结果如图2所示
图1、图2结果显示：
与3道对照样品和4道空白对照样品电泳检测结果比较分析得出：1道流穿峰所示区域中的杂质蛋白较多但已有少量目的蛋白被洗脱出，5道目的峰所示区域中的目标蛋白的含量明显增多，杂质蛋白有但已经显著减少。
Uni Phenyl-30L疏水层析
将Uni Phenyl-30L疏水层析介质装入层析柱，待层析介质沉降完全后，安装缓冲液分布器，分布器与层析介质之间需压实。清洗Uni Phenyl-30L疏水层析介质。以缓冲液C平衡Uni Phenyl-30L疏水层析介质，平衡体积为3个柱体积
将蛋白粗提组分按1:1的比例加入缓冲液D，充分混匀。将混合液上样至Uni Phenyl-30L疏水层析介质，线性流速为3.5cm/min，介质载量不高于30g/L。上样结束后，以缓冲液C继续冲洗5个柱体积。按阶段洗脱程序流洗Uni Phenyl-30L疏水层析介质，洗脱浓度如下：
0％C 5CV→100％E 3CV→纯水3CV
在100％E洗脱区间出现目的蛋白峰，UV高于30mAu以上开始收样，UV低于50mAU时停止收集。此时收得样品称之为第二洗脱液。
第二洗脱液层析图谱如图3所示，第二洗脱液蛋白电泳检测结果如图4所示
图3、图4结果显示：
与1道对照样品和2道空白对照样品电泳检测结果比较分析得出：3道流穿峰所示区域中的蛋白几乎没有，4道杂质峰所示区域中无目标蛋白存在，5道目的峰所示区域中的目标蛋白量大且杂质蛋白少，6道碱洗峰所示区域中有少量目标蛋白，杂质蛋白量多。
样品脱盐
安装超滤系统，品牌为仕比纯，膜孔径为5KD，材质为改性聚醚砜。
用蠕动泵匀速将0.1M NaOH泵入超滤系统，pH试纸侧滤出端和回流端出液为碱性后，管路均放入0.1M NaOH循环30min。NaOH循环完成后用注射用水冲洗10个体积，pH试纸测滤出端和回流端出水均为中性后，换缓冲液PB循环平衡10min。
将Uni Phenyl-30L疏水层析收获的样品用蠕动泵泵入超滤系统，控制入口压力低于5psi，回流端放入无热原容器，滤出端用洁净容器收集滤出液。回流液(即浓缩液)浓缩到目的体积时，加入缓冲液E进行洗滤置换，置换倍数为7倍。置换完毕的样品称之为第二滤液并用于下级层析。
UniQ-30L阴离子交换层析
将UniQ-30L阴离子交换介质装入层析柱，待层析介质沉降完全后，安装缓冲液分布器，分布器与层析介质之间需压实。清洗并用2M NaCl活化UniQ-30L层析介质。以缓冲液E平衡UniQ-30L层析介质，平衡体积为5个柱体积。
将脱盐后的蛋白组分上样至UniQ-30L层析介质，线性流速为3.5cm/min，介质载量不高于30g/L。上样结束后，以缓冲液E继续冲洗5个柱体积。按阶段洗脱程序流洗UniQ-30L层析介质，洗脱浓度如下：
0％F 5CV→10％F 5CV→30％F 5CV→100％F 3CV
在30％F洗脱区域出现目的蛋白峰，UV高于30mAu以上开始收样，UV低于50mAU时停止收集。此时收得样品即为目标蛋白组分，称此样品为第三洗脱液。
第三洗脱液层析图谱如图5所示，第二洗脱液蛋白电泳检测结果如图6所示
图5、图6结果显示：经过Sepharose Q-XL阴离子交换层析、Uni Phenyl-30L疏水层析和UniQ-30L阴离子交换层析后，收集到的蛋白样品一步步被提纯，最后所得蛋白样品纯度最高，而且收集到的目标蛋白的量随着UniQ-30L介质浓度的增高而增大。
超滤置换
安装超滤系统，品牌为仕比纯，膜孔径为5KD，材质为改性聚醚砜。用蠕动泵匀速将0.1M NaOH泵入超滤系统，pH试纸侧滤出端和回流端出液为碱性后，管路均放入0.1MNaOH循环30min。NaOH循环完成后用注射用水冲洗10个体积，pH试纸测滤出端和回流端出水均为中性后，换缓冲液PB循环平衡10min。将UniQ-30L收获的样品组分用蠕动泵泵入超滤系统，控制入口压力低于5psi，回流端放入无热原容器，滤出端用洁净容器收集滤出液。回流液(即浓缩液)浓缩到目的体积时，加入PB缓冲液进行洗滤置换，置换倍数为7倍。
浓缩液置换完毕，即为目标蛋白重组葡激酶-水蛭素融合蛋白。
实施例2：层析介质均为500ml,中极规模制备
除非明确说明，在下列实施例中采用和实施例1相同的方法对重组葡激酶-水蛭素融合蛋白进行制备。
Sepharose Q-XL阴离子交换层析的层析图谱如图7所示，
Uni Phenyl-30L疏水层析的层析图谱如图8所示，
UniQ-30L阴离子交换层析的层析图谱如图9所示，
UniQ-30L阴离子交换层析的电泳图谱如图10所示，其中3-5道是本发明制备过程得到的三份不同批次的重组葡激酶-水蛭素融合蛋白。
图10结果显示：经过Sepharose Q-XL阴离子交换层析、Uni Phenyl-30L疏水层析和UniQ-30L阴离子交换层析后，最终收集到的目标蛋白样品纯度很高。
对比实施例1和实施2可以看出，通过本发明的实施例所列的制备方法，可以得到高纯度的重组葡激酶-水蛭素融合蛋白，HPLC检测并采用面积归一化法的计算方法，结果显示本发明的制备方法所得到的重组葡激酶-水蛭素融合蛋白纯度高达99％以上，而现有技术的纯度只能达到约95％。并且本发明的实施例所列的制备方法可以用于重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的扩大生产，具有现实意义。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.一种制备重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将菌体进行裂解和离心处理，以便获得裂解液，所述菌体表达所述重组葡激酶-水蛭素融合蛋白；
(2)利用中空纤维柱对所述裂解液进行第一过滤处理，以便获得第一滤液；
(3)利用Sepharose Q-XL作为阴离子交换介质对所述第一滤液进行第一层析处理和第一洗脱处理，以便获得第一洗脱液；
(4)利用Uni Phenyl-30L作为疏水层析介质对所述第一洗脱液进行第二层析处理和第二洗脱处理，以便获得第二洗脱液；
(5)利用第一滤膜，通过超滤对所述第二洗脱液进行脱盐处理和超滤置换处理，以便获得浓缩液；
(6)利用UniQ-30L作为阴离子交换介质对所述浓缩液进行第三层析处理和第三洗脱处理，以便获得第三洗脱液；以及
(7)利用第二滤膜，对所述第三洗脱液进行超滤置换处理，以便获得所述重组葡激酶-水蛭素融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述裂解处理包括将所述菌体与pH7.0的Tris-HCl缓冲液混合后进行冻融四次，其中，每次所述冻融包括在-20摄氏度下冷冻过夜和在37摄氏度下进行解冻。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，
所述中空纤维柱具有0.22微米的孔径，
所述中空纤维柱是预先被pH7.0的Tris-HCl缓冲液进行平衡处理的。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)包括：
将所述第一滤液上样至装载有所述Sepharose Q-XL层析介质的层析柱，其中，所述第一滤液的线性流速为6厘米/分钟，并且所述层析柱的介质装载量不超过60g/L,
上样结束后，依次采用下列洗脱液进行所述第一洗脱：
5柱体积的pH7.0的20mM Tris-HCl缓冲液；
3柱体积的pH7.0的20mM Tris-HCl缓冲液与pH7.0的20mMTris-HCl-0.5M NaCl缓冲液的混合物，其中，pH7.0的20mMTris-HCl-0.5M NaCl缓冲液的体积含量为14％；
3柱体积的pH7.0的20mM Tris-HCl缓冲液与pH7.0的20mMTris-HCl-0.5M NaCl缓冲液的混合物，其中，pH7.0的20mMTris-HCl-0.5M NaCl缓冲液的体积含量为60％；以及
3柱体积的pH7.0的20mMTris-HCl-0.5M NaCl缓冲液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)包括：
将所述第一洗脱液与3M(NH4)2SO4缓冲液混合，将所得混合液上样至装载有所述Uni Phenyl-30L疏水层析介质的层析柱，其中所述混合液的流速为3.5厘米/分钟，并且所述层析介质的载量不超过30g/L,
上样结束后，依次采用下列洗脱液进行所述第二洗脱：
5柱体积的pH8.0的20mM Tris-HCl-1.5M(NH4)2SO4缓冲液；以及
3柱体积的pH8.0的20mM Tris-HCl缓冲液。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(5)中，
所述第一滤膜的膜孔径是5KD,
所述第一滤膜的材质是改性聚醚砜，
将所述第二洗脱液泵入装载有所述第一滤膜的超滤系统进行脱盐处理，并用pH8.0的20mMTris-HCl缓冲液对所述第二洗脱液进行超滤置换，所述超滤置换的倍数是7倍。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)包括：
将所述浓缩液上样至装载有所述UniQ-30L层析介质的层析柱，其中，所述浓缩液的线性流速为3.5厘米/分钟，并且所述层析柱的介质装载量不超过30g/L,
上样结束后，依次采用下列洗脱液进行所述第三洗脱：
5柱体积的pH8.0的20mM Tris-HCl缓冲液；
5柱体积的pH8.0的20mM Tris-HCl缓冲液与pH8.0的20mMTris-HCl-0.5M NaCl缓冲液的混合物，其中，pH8.0的20mMTris-HCl-0.5M NaCl缓冲液的体积含量为10％；
5柱体积的pH8.0的20mM Tris-HCl缓冲液与pH8.0的20mMTris-HCl-0.5M NaCl缓冲液的混合物，其中，pH8.0的20mMTris-HCl-0.5M NaCl缓冲液的体积含量为30％；以及
3柱体积的pH8.0的20mMTris-HCl-0.5M NaCl缓冲液。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(7)中，
所述第二滤膜的膜孔径是5KD,
所述第二滤膜的材质是改性聚醚砜，
将所述第三洗脱液泵入装载有所述第二滤膜的超滤系统，并用磷酸缓冲液对所述第三洗脱液进行超滤置换，所述超滤置换的倍数是7倍。
9.一种制备重组葡激酶-水蛭素融合蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
配制缓冲液
缓冲液A:20mM Tris-Cl pH 7.0
缓冲液B:20mM Tris-Cl 0.5M NaCl pH 7.0
缓冲液C：20mM Tris-Cl–1.5M(NH4)2SO4pH 8.0
缓冲液D：3M(NH4)2SO4
缓冲液E:20mM Tris-Cl pH 8.0
缓冲液F:20mM Tris-Cl 0.5M NaCl pH 8.0
菌体前处理
发酵下灌后经洗涤的菌体，每100g菌体加200ml缓冲液A，混和均匀，放入-20℃冰冻过夜，将已冻好的菌体在37℃解冻，然后再次放入-20℃过夜，如此反复冻融4次，菌液在37℃解冻后转入离心杯中，离心转速5000rpm，时间60min，温度4摄氏度，收集裂解上清液，该上清液即为裂解液，用缓冲液A循环平衡0.22微米中空纤维柱10min，裂解液经0.22微米中空纤维柱澄清，收集滤过液，该滤液称为第一滤液，
Sepharose Q-XL阴离子交换层析
将Sepharose Q-XL阴离子交换介质装入层析柱，待层析介质沉降完全后，安装缓冲液分布器，分布器与层析介质之间需压实，清洗并用2M的NaCl活化Sepharose Q-XL层析介质，以缓冲液A平衡Sepharose Q-XL层析介质，平衡体积为5个柱体积，
将第一滤液上样至Sepharose Q-XL层析介质，线性流速为6厘米/分钟，介质载量不高于60g/L，
上样结束后，以缓冲液A继续冲洗5个柱体积，按阶段洗脱程序流洗Sepharose Q-XL，洗脱浓度如下：
5柱体积的pH7.0的20mM Tris-HCl缓冲液；
3柱体积的pH7.0的20mM Tris-HCl缓冲液与pH7.0的20mMTris-HCl-0.5M NaCl缓冲液的混合物，其中，pH7.0的20mMTris-HCl-0.5M NaCl缓冲液的体积含量为14％；
3柱体积的pH7.0的20mM Tris-HCl缓冲液与pH7.0的20mMTris-HCl-0.5M NaCl缓冲液的混合物，其中，pH7.0的20mMTris-HCl-0.5M NaCl缓冲液的体积含量为60％；以及
3柱体积的pH7.0的20mMTris-HCl-0.5M NaCl缓冲液，
在60％B洗脱区域出现目的蛋白峰，UV高于30mAu开始收集样品，UV低于50mAU时停止收集，此时收得样品溶液称为第一洗脱液，
Uni Phenyl-30L疏水层析
将Uni Phenyl-30L疏水层析介质装入层析柱，待层析介质沉降完全后，安装缓冲液分布器，分布器与层析介质之间需压实，清洗Uni Phenyl-30L疏水层析介质。以缓冲液C平衡Uni Phenyl-30L疏水层析介质，平衡体积为3个柱体积，
将蛋白粗提组分按1:1的比例加入缓冲液D，充分混匀，将混合液上样至Uni Phenyl-30L疏水层析介质，线性流速为3.5厘米/分钟，介质载量不高于30g/L，上样结束后，以缓冲液C继续冲洗5个柱体积，按阶段洗脱程序流洗Uni Phenyl-30L疏水层析介质，洗脱浓度如下：
5柱体积的pH8.0的20mM Tris-HCl-1.5M(NH4)2SO4缓冲液；以及
3柱体积的pH8.0的20mM Tris-HCl缓冲液，
在100％E洗脱区间出现目的蛋白峰，UV高于30mAu以上开始收样，UV低于50mAU时停止收集，此时收得样品称之为第二洗脱液，
样品脱盐
安装超滤系统，品牌为仕比纯，膜孔径为5KD，材质为改性聚醚砜，
用蠕动泵匀速将0.1M NaOH泵入超滤系统，pH试纸侧滤出端和回流端出液为碱性后，管路均放入0.1M NaOH循环30min，NaOH循环完成后用注射用水冲洗10个体积，pH试纸测滤出端和回流端出水均为中性后，换缓冲液PB循环平衡10分钟，
将Uni Phenyl-30L疏水层析收获的样品用蠕动泵泵入超滤系统，控制入口压力低于5psi，回流端放入无热原容器，滤出端用洁净容器收集滤出液，回流液(即浓缩液)浓缩到目的体积时，加入缓冲液E进行洗滤置换，置换倍数为7倍，置换完毕的样品称之为第二滤液并用于下级层析，
UniQ-30L阴离子交换层析
将UniQ-30L阴离子交换介质装入层析柱，待层析介质沉降完全后，安装缓冲液分布器，分布器与层析介质之间需压实，清洗并用2M NaCl活化UniQ-30L层析介质，以缓冲液E平衡UniQ-30L层析介质，平衡体积为5个柱体积，
将脱盐后的蛋白组分上样至UniQ-30L层析介质，线性流速为3.5厘米/分钟，介质载量不高于30g/L，上样结束后，以缓冲液E继续冲洗5个柱体积，按阶段洗脱程序流洗UniQ-30L层析介质，洗脱浓度如下：
5柱体积的pH8.0的20mM Tris-HCl缓冲液；
5柱体积的pH8.0的20mM Tris-HCl缓冲液与pH8.0的20mMTris-HCl-0.5M NaCl缓冲液的混合物，其中，pH8.0的20mMTris-HCl-0.5M NaCl缓冲液的体积含量为10％；
5柱体积的pH8.0的20mM Tris-HCl缓冲液与pH8.0的20mMTris-HCl-0.5M NaCl缓冲液的混合物，其中，pH8.0的20mMTris-HCl-0.5M NaCl缓冲液的体积含量为30％；以及
3柱体积的pH8.0的20mMTris-HCl-0.5M NaCl缓冲液，
在30％F洗脱区域出现目的蛋白峰，UV高于30mAu以上开始收样，UV低于50mAU时停止收集，此时收得样品即为目标蛋白组分，称此样品为第三洗脱液，
超滤置换
安装超滤系统，品牌为仕比纯，膜孔径为5KD，材质为改性聚醚砜，用蠕动泵匀速将0.1M NaOH泵入超滤系统，pH试纸侧滤出端和回流端出液为碱性后，管路均放入0.1MNaOH循环30分钟，NaOH循环完成后用注射用水冲洗10个体积，pH试纸测滤出端和回流端出水均为中性后，换缓冲液PB循环平衡10min，将UniQ-30L收获的样品组分用蠕动泵泵入超滤系统，控制入口压力低于5psi，回流端放入无热原容器，滤出端用洁净容器收集滤出液，回流液(即浓缩液)浓缩到目的体积时，加入PB缓冲液进行洗滤置换，置换倍数为7倍，
浓缩液置换完毕，即为目标蛋白重组葡激酶-水蛭素融合蛋白。
10.一种重组葡激酶-水蛭素融合蛋白，其特征在于，所述重组葡激酶-水蛭素融合蛋白具有至少99％的纯度，任选的，所述重组葡激酶-水蛭素融合蛋白是通过权利要求1～9中任一项所述的方法获得的。
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