CN104151422A - 一种重组人生长激素的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种在大肠杆菌中以包涵体形式表达重组人生长激素(recombinant human growth hormone,rhHGH)的制备方法，其包括如下主要步骤：高压匀浆破碎菌体细胞、包涵体漂洗，尿素变性溶解所述包涵体、控速分级复性该包涵体蛋白、离心、超滤膜浓缩、过滤除菌、冷冻干燥制成成品等步骤。通过本发明的制备方法所制备的重组人生长激素蛋白具有纯度高、活性高的优点。本发明的制备方法利用蛋白质的控速分级复性进行复性和尿素变性、通过超滤膜技术即可制备纯度高、活性高的重组人生长激素蛋白。同时可以省略层析步骤，大大缩短了工时、降低了生产成本。本发明可高效、简便、低成本地获得rhHGH纯品。
Description
技术领域
本发明涉及从大肠杆菌表达的胞内包涵体形式的蛋白质制备高纯度重组人生长激素的方法，属于蛋白质生物化学工程领域。
背景技术
人生长激素(human growth hormone,HGH)是由人脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的一种重要的非糖基化激素蛋白，由191个氨基酸组成的单链蛋白，相对分子质量在22kD左右，等电点为4.9，分子中存在两对二硫键(De Palo EF.Clin Chim Acta，2006，364:67-76)。HGH的受体遍及人的全身组织器官，其作用机理一般认为HGH与靶细胞膜上特异性受体结合后，通过cAMP改变氨基酸及代谢产物的转运，诱导某些特异性蛋白质和核酸的合成(Kopchick JJ.Endo Revs，2002，23:623-646.)。人生长激素几乎对人体所有组织都有促生长功能，能促使脂肪、糖类的降解，增进蛋白质和核酸的合成。研究发现，生长激素含量的变化影响到人体的多个系统，包括免疫系统、循环系统、泌尿系统、消化系统等(Naoki H.J Clin Endo and Meta，2001，86:4284-4291.)。临床上，HGH主要用于治疗儿童自发性的垂体型侏儒症，安全有效。近些年来，HGH的应用不断扩大，人们将其应用到了烧伤、骨折、创伤、出血性溃疡、组织坏死、肌肉萎缩、骨质疏松、肥胖及衰老等疾病(Jennifer DW.J Clin Endo Meta，1999，84:3591-3601；Marleau S.Cardiovasc Res，2006，69:26-35；Aimaretti G.J Endocrinol Invest，2005，28:984-989；Aimaretti G.Endocr Dev，2005，9:76-88；Koo GC.J Immunol，2001，15，66:4195-4201.)
不同物种的生长激素的差别很大，种属特异性很强。早期临床应用的生长激素是从人脑的垂体中提取的，价格极其昂贵，一个人的垂体中最多能提取出3-5mg的生长激素。20世纪80年代之后，基因工程技术的发展，出现了重组蛋白技术，使得大规模生产HGH成为可能。从此可以廉价获得与天然人生长因子相似或者完全一致的基因工程药物原料。1985年美国FDA首次批准基因技术生 产的重组人生长激素用于临床治疗，其需求量和销售额逐年增长。
目前，利用大肠杆菌表达重组人生长激素，有两种不同的技术途径，一种是生产分泌型的重组人生长激素，一种则是生产胞内型。经无数次实践验证，生产分泌型的重组人生长激素，虽然步骤简单，但其表达量很低，成本也极其高，不能满足市场的需要。重组胞内型的人生长激素蛋白，其表达量非常大，但复性效果往往不好，复性后的蛋白质折叠不好，稳定性差，蛋白活性低。
基于现有技术存在的问题，本发明提供了一种重组人生长激素的复性的方法，较容易获得大量的高纯度和活性高的蛋白。
发明内容
基于现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种从大肠杆菌表达的胞内包涵体形式的蛋白质制备高纯度重组人生长激素的方法。所述方法包括：高压匀浆破碎菌体细胞、漂洗包涵体和调节pH值、尿素变性溶解所述包涵体蛋白、控速分级复性该包涵体蛋白、离心、超滤膜浓缩、过滤除菌、冷冻干燥制成成品步骤。
在本发明的一个方面，所述漂洗包涵体和调节pH值步骤是用含有0.1-5％的去污剂的去离子水和调节pH至6-8，漂洗包涵体3-5次。优选地，所述去污剂为曲拉通X-100。
在本发明的又一个方面，所述控速分级复性该包涵体蛋白的步骤为：先是添加等体积的4M尿素稀释变性蛋白，使尿素浓度降低到6M；再添加等体积的1M尿素稀释，其浓度降到3.5M；最后添加等体积的水稀释到1.75M。而且，所述控速多级尿素梯度复性该包涵体蛋白步骤是通过控制添加尿素或水的流速来实现的。其中，所述控制添加尿素或水的流速为1-100mL/分钟，优选为10-20mL/分钟，最优选为15mL/分钟。
在本发明的又一个方面，所述超滤膜浓缩的步骤是用截留分子量为10000道尔顿-30000道尔顿的超滤膜进行反复超滤浓缩。
在本发明的一个具体方面，本发明提供了从肠杆菌表达的胞内包涵体形式的蛋白质制备高纯度重组人生长激素的方法，其包括以下步骤:
1)新发酵获得的重组人生长激素大肠杆菌细胞，于高压匀浆机中，在≦10℃条件下进行破菌；
2)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5-2小时，弃除清液，收集固体沉淀；
3)沉淀转移至搅拌罐中。加入10-30倍含0.1％的曲拉通X-100的去离子水搅拌，调pH值为7.0，在≦20℃搅拌2小时；
4)重复步骤2)和3)2-3次；
5)步骤4)的沉淀加沉淀体积重量比20-80倍的含1mM Beta-巯基乙醇的8M尿素溶液，搅拌2-4小时使蛋白变性溶解；
6)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5-2小时，收集澄清液体，弃除产生的少量黑色沉淀杂质；
7)澄清液体转移到搅拌罐中，边搅拌边加入等体积4M的尿素，添加尿素的流速为10-20mL/分钟，最后尿素浓度降为6M；
8)边搅拌边加入步骤7)总量等体积的1M尿素，添加尿素的流速为10-20mL/分钟，这时尿素浓度为3.5M；
9)边搅拌边加入步骤8)总量等体积的纯净水，添加水的流速为10-20mL/分钟，这时尿素浓度为1.75M；
10)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5-2小时，收集澄清液体；
11)用截留分子量为10000-20000道尔顿的超滤机浓缩，到1/5-1/10体积；
12)加入去离子水到原体积，重复步骤11)6次以上，再加入去离子水到原体积；
13)用截留分子量为20000-35000道尔顿的超滤机超滤；
14)用截留分子量为10000-20000道尔顿的超滤机浓缩，到1/10-1/50体积；
15)用除菌过滤机除菌，冷冻干燥，分装得成品。
在本发明的进一步具体方面，本发明提供了从肠杆菌表达的胞内包涵体形式的蛋白质制备高纯度重组人生长激素的方法，其包括以下步骤:
1)新发酵获得的重组人生长激素大肠杆菌细胞，于高压匀浆机中，在≦10℃条件下进行破菌；
2)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心1小时，弃除清液，收集固体沉淀；
3)沉淀转移至搅拌罐中。加入10-30倍含0.1％的曲拉通X-100的去离子水搅拌，调pH值为7.0，在≦20℃搅拌2小时,用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5-2小时，弃除清液，收集固体沉淀；
4)重复步骤2)和3)2-3次；
5)步骤4)的沉淀加沉淀体积重量比50倍的含1mM Beta-巯基乙醇的8M尿素溶液，搅拌2-4小时使蛋白变性溶解；
6)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5小时，收集澄清液体，弃除产生的少量黑色沉淀杂质；
7)澄清液体转移到搅拌罐中，边搅拌边加入等体积4M的尿素，添加尿素的流速为10-20mL/分钟，最后尿素浓度降为6M；
8)边搅拌边加入步骤7)总量等体积的1M尿素，添加尿素的流速为10-20mL/分钟，这时尿素浓度为3.5M；
9)边搅拌边加入步骤8)总量等体积的纯净水，添加水的流速为10-20mL/分钟，这时尿素浓度为1.75M；
10)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5小时，收集澄清液体；
11)用截留分子量为10000-20000道尔顿的超滤机浓缩，到1/8体积；
12)加入去离子水到原体积，重复步骤11)6次以上，再加入去离子水到原体积；
13)用截留分子量为20000-35000道尔顿的超滤机超滤；
14)用截留分子量为10000-20000道尔顿的超滤机浓缩，到1/20体积；
15)用除菌过滤机除菌，冷冻干燥，分装得成品。
在本发明的更进一步具体方面，本发明提供了从肠杆菌表达的胞内包涵体形式的蛋白质制备高纯度重组人生长激素的方法，其包括以下步骤:
1)新发酵获得的重组人生长激素大肠杆菌细胞，于高压匀浆机中，在≦10℃条件下进行破菌；
2)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心1小时，弃除清液，收集固体沉淀；
3)沉淀转移至搅拌罐中。加入10-30倍含0.1％的曲拉通X-100的去离子水搅拌，调pH值为7.0，在≦20℃搅拌2小时；
4)重复步骤2)和3)2-3次；
5)步骤4)的沉淀加沉淀体积重量比50倍的含1mM Beta-巯基乙醇的8M尿素溶液，搅拌2-4小时使蛋白变性溶解；
6)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5小时，收集澄清液体，弃除产生的少量黑色沉淀杂质；
7)澄清液体转移到搅拌罐中，边搅拌边加入等体积4M的尿素，添加尿素的流速为15mL/分钟，最后尿素浓度降为6M；
8)边搅拌边加入步骤7)总量等体积的1M尿素，添加尿素的流速为15mL/分钟，这时尿素浓度为3.5M；
9)边搅拌边加入步骤8)总量等体积的纯净水，添加水的流速为15mL/分钟，这时尿素浓度为1.75M；
10)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5小时，收集澄清液体；
11)用截留分子量为15000道尔顿的超滤机浓缩，到1/8体积；
12)加入去离子水到原体积，重复步骤11)6次以上，再加入去离子水到原体积；
13)用截留分子量为30000道尔顿的超滤机超滤；
14)用截留分子量为15000道尔顿的超滤机浓缩，到1/20体积；
15)用除菌过滤机除菌，冷冻干燥，分装得成品。
本发明的方法在去除杂蛋白和杂质方面，不需要使用传统除杂用的氯仿、丙酮、乙醇等对人有害的溶剂，同时省略了高温加热法除杂蛋白的步骤，不尽节约了能源也避免了高温对rhHGH破坏。本发明的方法操作简单，生产成本低廉，适用于大规模工业化生产，实现了低成本生产重组人生长激素的工艺方法。 离心和过滤所得到的滤液由于不含有任何有害物质，不会污染环境。本工艺几乎不产生固形废弃物，没有固型垃圾。复性过程所产生尿素，可以回收，用于植物肥料。
附图说明
图1是重组人生长激素生产工艺路线图。
图2是重组人生长激素在大肠杆菌中的表达情况。泳道1、诱导前；泳道2、IPTG诱导后；泳道3、破菌后离心上清；泳道4、破菌后离心沉淀。
图3是重组人生长激素包涵体蛋白洗杂后沉淀的电泳图。
图4是纯化后冷冻干燥粉产品电泳图。
图5是纯化后冷冻干燥粉产品用分子筛方法检测纯度的层析图谱。
图6是自制多孔喷头示意图。图中的A、B、C、D、E、F代表它们的尺寸，可根据蛋白复性罐体的尺寸设计。
具体实施方式
为了提供对本发明的实质性理解，在下文中以不同的详细程度描述了本发明的某些方面、模式、实施方式、变型和特征。
在实施本发明的过程中，使用了生物化学、蛋白质生物化学、蛋白质生物化学工程等很多传统技术。这些技术是熟知的。
在本发明的一个实施方式中，提供了从大肠杆菌表达的胞内包涵体形式的蛋白质制备高纯度重组人生长激素的方法，所述方法包括：高压匀浆破碎菌体细胞、漂洗包涵体和调节pH值、尿素变性溶解所述包涵体蛋白、控速分级复性所述包涵体蛋白、离心、超滤膜浓缩、过滤除菌、冷冻干燥制成成品等步骤(图1)。
首先，对细菌体表达的重组人生长激素进行破碎，为了能够保证重组人生长激素蛋白在菌体破碎过程中不发生热变性或降解，通常情况下在≦10℃条件下进行破菌，例如在10℃、8℃、6℃，优选在4℃左右。
在本发明的一些实施方式中，使用了高速离心步骤，以去除产物中不需要的杂质，可以是10000-20000转/分，例如12000-20000转/分，合适为14000-20000转/分，例如在一些具体实施例中采用15000转/分钟离心，离心时间通常控制在2个小时以内，例如1.5小时、1小时、45分钟或30分钟。
本发明中的洗涤包涵体实施方式中，在去离子水中加入了去污剂，。去污剂可以是曲拉通X-100、吐温20(20-80的分子个数)、NP-40、OB-2、脂肪酸钠等阳离子型去污剂、阴离子型去污剂或中性去污剂，可以是单一去污剂，也可以是这些去污剂的按比例的混合物，优选为曲拉通X-100。去污剂使用浓度为0.001-20％，优选0.05-2％，更优选为0.05-1％。在一些的具体实施例中，加入去离子水搅拌后，调节了pH值，所述的pH值可以在3-10之间，pH值过高会使目标蛋白溶解丢失，优选pH值在6-8之间，最优选为pH值7左右。重复洗涤蛋白是非常必要的，是为了去除杂蛋白，提高产品纯度。可以重复洗涤多次，优选2-6次，优选3次。
通常地，选择尿素、盐酸胍及其衍生物作为蛋白质变性剂。本发明中的一些具体实施例中使用了8M尿素是蛋白质变性剂，为了溶解目标蛋白，使目标蛋白变性，打开它们的错误折叠的二维和三维构象。尿素的使用量可以是6-9M，优选7M-9M，最优选为8M。所加变性剂的量一般在沉淀量的10-100倍(W/V)，优选20-100倍，最优选在50倍。本发明一些具体实施例中，向所述的蛋白质变性溶解液体中添加了还原剂，这些还原剂可以使蛋白质分子间和分子内的二硫键断裂，有利于蛋白质的变性和复性。还原剂可以是还原性谷胱甘肽、Beta-巯基乙醇、维生素C及其衍生物、四氢化碳等有机还原剂和无机还原剂，优选还原剂为Beta-巯基乙醇。
术语“蛋白质的控速分级复性”是指变性后，对变性剂通过控制流速进行稀释过程，通过控制流速和复性时间，达到不同变性剂浓度的梯度，以确保包涵体蛋白的完全复性和保持其结构稳定性。复性时间不受限制，但过长的复性时间也不是所期望的，这是基于蛋白质性质和能量消耗所决定的。
在本发明的一些实施方式中，进行了纯化蛋白质的分级复性过程，一般先使蛋白多肽形成二级结构，再折叠形成三级结构。这个过程需要逐渐降低蛋白 质变性剂的浓度，如果过于快速，会使变性蛋白相互缠绕，不利于复性。实现流速控制装置的示意图见图6。
在复性过程中，所添加的液体为复性剂。添加的复性剂可以是相应的低浓度的变形剂，例如尿素，也可以是水，例如纯净水、超纯水、去离子水，也可以是也可以是缓冲液，如Tris-Cl、磷酸缓冲液、碳酸缓冲液、柠檬酸缓冲液等有机或无机缓冲液。在本发明的具体实施方案中，所用的复性液体为尿素或水。在不同阶段复性，可以加入不同浓度的尿素，例如可以逐级加入0-7M尿素，合适为0-6M尿素，优选分别加入4M、3M、2M或1M尿素。
为了更好地控制所述流速，本发明中设计和使用了自动多孔喷头。其形式酷似淋浴喷头，由多个出水口，自制多孔喷头，目的是使每个反应体系表面，在单位时间里流下的复性剂(例如尿素或超纯水)不至于使其局部尿素浓度降得太快，以防蛋白折叠不好，多个出水点既可防止局部尿素浓度降得太快，又能保证复性时间缩短，大大降低生产工时。每个出水口流速在1-100mL/分钟，孔的直径可以在0.01-10cm，例如0.5mm，1mm，5mm，1cm等。孔间间距为0.01-10cm，例如0.5mm，1mm，5mm，1cm等(见图2)。以防局部流量过快，影响蛋白复性效率。通过该装置，每个出水点的流速也可以在1mL-50mL/分钟，合适为5-25mL/分钟，优选为10-20mL/分钟，最优选15mL/分钟。
本发明一些具体实施例中，进行了过滤浓缩步骤。首先，用超滤装置除尿素的过程，一般来说，重复次数越多，除尿素越干净，但到尿素含量达到0.01mM以下时，就可以满足产品要求，次数越多工时就越长，所以本工艺选用6次，第六次为0.0067mM。
还有，截留分子量较大的蛋白杂质及其复性时缠绕在一起的折叠不好的目标蛋白，因为一个折叠好的重组人生长激素蛋白分子量在22000道尔顿左右，两个分子缠在一起，分子量要超过40000道尔顿，不容易通过30000道尔顿的超滤柱微孔，而被截流，可保证产品的质量。
在本发明的一些实施方式中，使用20000-35000道尔顿的超滤装置(超滤机)进行超滤，优选地使用30000超滤装置(超滤机)。
最后是产品浓缩步骤，一切小于20000道尔顿的超滤装置(超滤机)都可用于浓缩，但截流分子量太大的超滤装置会丢失一些目标蛋白，截流分子量在 400-500道尔顿纳滤机也可以使用，由于纳滤装置造价较高，我们选用截流分子量在1000-20000道尔顿的超滤装置，优选为截流分子量在15000道尔顿超滤装置。
在本发明的一个具体实施方式中，本发明提供了从肠杆菌表达的胞内包涵体形式的蛋白质制备高纯度重组人生长激素的方法，其包括以下步骤:
1)新发酵获得的重组人生长激素大肠杆菌细胞，于高压匀浆机中，在≦10℃条件下进行破菌；
2)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5-2小时，弃除清液，收集固体沉淀；
3)沉淀转移至搅拌罐中。加入10-30倍含0.1％的曲拉通X-100的去离子水搅拌，调pH值为7.0，在≦20℃搅拌2小时；
4)重复步骤2)和3)2-3次；
5)步骤4)的沉淀加沉淀体积重量比20-80倍的含1mM Beta-巯基乙醇的8M尿素溶液，搅拌2-4小时使蛋白变性溶解；
6)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5-2小时，收集澄清液体，弃除产生的少量黑色沉淀杂质；
7)澄清液体转移到搅拌罐中，边搅拌边加入等体积4M的尿素，添加尿素的流速为10-20mL/分钟，最后尿素浓度降为6M；
8)边搅拌边加入步骤7)总量等体积的1M尿素，添加尿素的流速为10-20mL/分钟，这时尿素浓度为3.5M；
9)边搅拌边加入步骤8)总量等体积的纯净水，添加水的流速为10-20mL/分钟，这时尿素浓度为1.75M；
10)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5-2小时，收集澄清液体；
11)用截留分子量为10000-20000道尔顿的超滤机浓缩，到1/5-1/10体积；
12)加入去离子水到原体积，重复步骤11)6次以上，再加入去离子水到原体积；
13)用截留分子量为20000-35000道尔顿的超滤机超滤；
14)用截留分子量为10000-20000道尔顿的超滤机浓缩，到1/10-1/50体积；
15)用除菌过滤机除菌，冷冻干燥，分装得成品。
在本发明的进一步具体实施方式中，本发明提供了从肠杆菌表达的胞内包涵体形式的蛋白质制备高纯度重组人生长激素的方法，其包括以下步骤:
1)新发酵获得的重组人生长激素大肠杆菌细胞，于高压匀浆机中，在≦10℃条件下进行破菌；
2)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心1小时，弃除清液，收集固体沉淀；
3)沉淀转移至搅拌罐中。加入10-30倍含0.1％的曲拉通X-100的去离子水搅拌，调pH值为7.0，在≦20℃搅拌2小时；
4)重复步骤2)和3)2-3次；
5)步骤4)的沉淀加沉淀体积重量比50倍的含1mM Beta-巯基乙醇的8M尿素溶液，搅拌2-4小时使蛋白变性溶解；
6)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5小时，收集澄清液体，弃除产生的少量黑色沉淀杂质；
7)澄清液体转移到搅拌罐中，边搅拌边加入等体积4M的尿素，添加尿素的流速为10-20mL/分钟，最后尿素浓度降为6M；
8)边搅拌边加入步骤7)总量等体积的1M尿素，添加尿素的流速为10-20mL/分钟，这时尿素浓度为3.5M；
9)边搅拌边加入步骤8)总量等体积的纯净水，添加水的流速为10-20mL/分钟，这时尿素浓度为1.75M；
10)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5小时，收集澄清液体；
11)用截留分子量为10000-20000道尔顿的超滤机浓缩，到1/8体积；
12)加入去离子水到原体积，重复步骤11)6次以上，再加入去离子水到原体积；
13)用截留分子量为20000-35000道尔顿的超滤机超滤；
14)用截留分子量为10000-20000道尔顿的超滤机浓缩，到1/20体积；
15)用除菌过滤机除菌，冷冻干燥，分装得成品。
在本发明的更进一步具体实施方式中，本发明提供了从肠杆菌表达的胞内包涵体形式的蛋白质制备高纯度重组人生长激素的方法，其包括以下步骤:
1)新发酵获得的重组人生长激素大肠杆菌细胞，于高压匀浆机中，在≦10℃条件下进行破菌；
2)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心1小时，弃除清液，收集固体沉淀；
3)沉淀转移至搅拌罐中。加入10-30倍含0.1％的曲拉通X-100的去离子水搅拌，调pH值为7.0，在≦20℃搅拌2小时；
4)重复步骤2)和3)2-3次；
5)步骤4)的沉淀加沉淀体积重量比50倍的含1mM Beta-巯基乙醇的8M尿素溶液，搅拌2-4小时使蛋白变性溶解；
6)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5小时，收集澄清液体，弃除产生的少量黑色沉淀杂质；
7)澄清液体转移到搅拌罐中，边搅拌边加入等体积4M的尿素，添加尿素的流速为15mL/分钟，最后尿素浓度降为6M；
8)边搅拌边加入步骤7)总量等体积的1M尿素，添加尿素的流速为15mL/分钟，这时尿素浓度为3.5M；
9)边搅拌边加入步骤8)总量等体积的纯净水，添加水的流速为15mL/分钟，这时尿素浓度为1.75M；
10)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5小时，收集澄清液体；
11)用截留分子量为15000道尔顿的超滤机浓缩，到1/8体积；
12)加入去离子水到原体积，重复步骤11)6次以上，再加入去离子水到原体积；
13)用截留分子量为30000道尔顿的超滤机超滤；
14)用截留分子量为15000道尔顿的超滤机浓缩，到1/20体积；
15)用除菌过滤机除菌，冷冻干燥，分装得成品。
同时，对制备的重组人生长激素用法玛西亚(Phamarcia)蛋白质纯度分析仪AKTA Purifier的分子筛Superdex75检验产品的纯度，经过分析测定得到重组人生长激素纯度均在95％以上，例如96％，97％，98％，99％，有的甚至接近100％，例如99.5％，99.8或99.9％。
进一步，根据中国药典2010年版二部附录XII提供的方法对制备的重组人生长激素的活性也进行了测定，比活性均在3.0IU/mg以上,例如3.2IU/mg以上，3.4IU/mg以上，3.6IU/mg以上。
经过计算得出，蛋白质可回收率在65％以上，例如75、80％、85％以上，在一些本发明优选实施方式中，蛋白质可回收率在80％以上，例如85％以上，例如90％、92％、95、97％、99％。
本发明的方法操作简单，生产成本低廉，适用于大规模工业化生产，实现了低成本生产重组人生长激素的工艺方法。离心和过滤所得到的滤液由于不含有任何有害物质，不会污染环境。本工艺几乎不产生固形废弃物，没有固型垃圾。复性过程所产生尿素，可以回收，用于植物肥料。
结合附图1，对本发明的从包涵体形式的重组蛋白到通过一系列蛋白纯化方法，实现了人生长激素蛋白工业生产的目的，以下对本发明的技术方案作进一步说明.
通过如下实施例描述，更好地理解本发明，但本发明并不仅仅局限于所记载的实施例。
实施例
实施例1
1)新发酵获得的重组人生长激素大肠杆菌细胞1公斤(图1和图2)，加入80升去离子水，搅拌均匀，于高压匀浆机中，在≦10℃条件下进行破菌；
2)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，弃除清液，收集固体沉淀约0.6公斤；
3)将沉淀转移至搅拌罐中。加入30升的去离子水(含0.1％的曲拉通X-100)搅拌，调pH值为7.0，在≦20℃搅拌2小时；
4)重复步骤2)和3)2-3次，得沉淀约0.4公斤(图3)；
5)步骤4)的沉淀加20升的8M尿素(含1mMBeta-巯基乙醇)溶液，搅拌2小时使蛋白变性溶解；
6)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，收集澄清液体，弃除产生的少量黑色沉淀杂质；
7)澄清液体转移到搅拌罐中，边搅拌边加入20升4M的尿素，流速为15mL/分；
8)边搅拌边加入步骤7)40升的1M尿素，流速为15mL/分；
9)边搅拌边加入步骤7)80升的纯净水，流速为15mL/分；
10)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，收集澄清液体；
11)用截留分子量为15000道尔顿的超滤机浓缩到8升；
12)加入80升去离子水，重复步骤11)6次以上，再加入去离子水到80升；
13)用截留分子量为30000道尔顿的超滤机超滤，收集穿过液；
14)用截留分子量为15000道尔顿的超滤机浓缩，到4升；
15)用除菌过滤机除菌，冷冻干燥，分装得成品约200克(图4)。
所得制品的纯度为98.8％，活性为3.6IU/mg,回收率为97.8％。
实施例2
1)新发酵获得的重组人生长激素大肠杆菌细胞5公斤，加入400升去离子水，搅拌均匀，于高压匀浆机中，在≦10℃条件下进行破菌；
2)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，弃除清液，收集固体沉淀约3公斤；
3)将沉淀转移至搅拌罐中。加入150升的去离子水(含0.1％的曲拉通X-100)搅拌，调pH值为7.0，在≦20℃搅拌2小时；
4)重复步骤2)和3)2-3次，得沉淀月2公斤；
5)步骤4)的沉淀加100升的8M尿素(含1mMBeta-巯基乙醇)溶液，搅拌2小时使蛋白变性溶解；
6)6)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，收集澄清液体，弃除产生的少量黑色沉淀杂质；
7)澄清液体转移到搅拌罐中，边搅拌边加入100升4M的尿素，流速为15mL/分，用5个导管；
8)边搅拌边加入步骤7)200升的1M尿素，流速为15mL/分，用5个导管；
9)边搅拌边加入步骤7)400升的纯净水，流速为15mL/分，用5个导管；
10)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，收集澄清液体；
11)用截留分子量为15000道尔顿的超滤机浓缩到40升；
12)加入400升去离子水，重复步骤11)6次以上，再加入去离子水到400升；
13)用截留分子量为30000道尔顿的超滤机超滤，收集穿过液；
14)用截留分子量为15000道尔顿的超滤机浓缩，到20升；
15)用除菌过滤机除菌，冷冻干燥，分装得成品约1000克。所得制品的纯度为97.8％，活性为3.5IU/mg,回收率为96.7％。
实施例3
1)新发酵获得的重组人生长激素大肠杆菌细胞10公斤，加入800升去离子水，搅拌均匀，于高压匀浆机中，在≦10℃条件下进行破菌；
2)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，弃除清液，收集固体沉淀约6公斤；
3)将沉淀转移至搅拌罐中。加入300升的去离子水(含0.1％的曲拉通X-100)搅拌，调pH值为7.0，在≦20℃搅拌2小时；
4)重复步骤2)和3)2-3次，得沉淀约4公斤；
5)步骤4)的沉淀加200升的8M尿素(含1mMBeta-巯基乙醇)溶液，搅拌2小时使蛋白变性溶解；
6)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，收集澄清液体，弃除产生的少量黑色沉淀杂质；
7)澄清液体转移到搅拌罐中，边搅拌边加入200升4M的尿素，流速为150mL/分，用喷淋头；
8)边搅拌边加入步骤7)400升的1M尿素，流速为15mL/分，用5个导管；边搅拌边加入步骤7)400升的纯净水，流速为15mL/分，用喷淋头；用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，收集澄清液体；
9)用截留分子量为15000道尔顿的超滤机浓缩到80升；
10)加入800升去离子水，重复步骤11)6次以上，再加入去离子水到800升；
11)用截留分子量为30000道尔顿的超滤机超滤，收集穿过液；
12)用截留分子量为15000道尔顿的超滤机浓缩，到40升；
用除菌过滤机除菌，冷冻干燥，分装得成品约2000克。所得制品的纯度为96.5％，活性为3.6IU/mg,回收率为97.7％。
本发明有效果在于：所制备的人生长激素蛋白具有活性高，纯度高，回收率高。
本发明不局限在本申请中描述的特定实施方式，用作本发明的单独的方面的单一说明。本领域技术人员将理解，可以不脱离本申请的精神和范围的情况下进行各种修改和改动。实际上，用于实施本发明的所述模式的各种修改对于生物化学和生物工程或相关领域的技术人员来说都是显而易见的，均应落入本发明权利要求书的范围。
根据以上描述，除了本文中列举的以外，本公开的范围内的功能上等同的用途对于本领域的本领域技术人员而言是明显的。这样的改动和修改意欲落在所附权利要求的范围内。本公开仅受所附权利要求以及与这样的权利要求的的范围所等同的全部范围限制。应当理解，本公开不局限于特定的方法、试剂、组合物和生物系统，当然，所述方法、试剂、组合物和生物系统可以变化。还可理解，本文中使用的术语仅用于描述特定的实施方式，不用来是限制性的。
本文所参考的或引用的所有专利、专利申请、在先申请和出版物通过引用而全文并入本文，包括所有的附图和表格，使得它们不与本说明书的明确教导相矛盾。在权利要求范围内提出其他的实施方式。
Claims (10)
1.一种在大肠杆菌中以包涵体形式表达重组人生长激素的制备方法，其包括如下步骤：高压匀浆破碎菌体细胞、漂洗包涵体和调节pH值、尿素变性溶解所述包涵体、控速分级复性该包涵体蛋白、离心、超滤膜浓缩、过滤除菌、冷冻干燥制成成品步骤。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述漂洗包涵体和调节pH值步骤是用含有0.1-5％的去污剂的去离子水漂洗包涵体3-5次和调节pH值至6-8。
3.如权利要求2所述的方法，其中，所述去污剂为曲拉通X-100。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述控速分级复性该包涵体蛋白的步骤为：先是添加等体积的4M尿素稀释变性蛋白，使尿素浓度降低到6M；再添加等体积的1M尿素稀释，其浓度降到3.5M；最后添加等体积的水稀释到1.75M。
5.如权利要求4所述的方法，其中，所述控速分级复性该包涵体蛋白的步骤是通过控制添加尿素或水的流速在1-100mL/分钟来实现的。
6.如权利要求4所述的方法，其中，所述控速分级复性该包涵体蛋白的步骤是通过控制添加尿素或水的流速在10-20mL/分钟来实现的。
7.如上述权利要求所述的方法，其中，所述超滤膜浓缩的步骤是用截留分子量为10000道尔顿-30000道尔顿的超滤膜进行反复超滤浓缩。
8.如权利要求7所述的方法，其中，所述的方法包括的步骤如下：
(1)新发酵获得的重组人生长激素大肠杆菌细胞，于高压匀浆机中，在≦10℃条件下进行破菌；
(2)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5-2小时，弃除清液，收集固体沉淀；
(3)沉淀转移至搅拌罐中。加入10-30倍含0.1％的曲拉通X-100的去离子水搅拌，调pH值为7.0，在≦20℃搅拌2小时；
(4)重复步骤2)和3)2-3次；
(5)步骤4)的沉淀加沉淀体积重量比20-80倍的含1mM Beta-巯基乙醇的8M尿素溶液，搅拌2-4小时使蛋白变性溶解；
(6)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5-2小时，收集澄清液体，弃除产生的少量黑色沉淀杂质；
(7)澄清液体转移到搅拌罐中，边搅拌边加入等体积4M的尿素，添加尿素的流速为10-20mL/分钟，最后尿素浓度降为6M；
(8)边搅拌边加入步骤7)总量等体积的1M尿素，添加尿素的流速为10-20mL/分钟这时尿素浓度为3.5M；
(9)边搅拌边加入步骤8)总量等体积的纯净水，添加水的流速为10-20mL/分钟，这时尿素浓度为1.75M；
(10)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5-2小时，收集澄清液体；
(11)用截留分子量为10000-20000道尔顿的超滤机浓缩，到1/5-1/10体积；
(12)加入去离子水到原体积，重复步骤11)6次以上，再加入去离子水到原体积；
(13)用截留分子量为20000-35000道尔顿的超滤机超滤；
(14)用截留分子量为10000-20000道尔顿的超滤机浓缩，到1/10-1/50体积；
(15)用除菌过滤机除菌，冷冻干燥，分装得成品。
9.如权利要求8所述的方法，其中，所述的方法包括的步骤如下：
1)新发酵获得的重组人生长激素大肠杆菌细胞，于高压匀浆机中，在≦10℃条件下进行破菌；
2)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心1小时，弃除清液，收集固体沉淀；
3)沉淀转移至搅拌罐中。加入10-30倍含0.1％的曲拉通X-100的去离子水搅拌，调pH值为7.0，在≦20℃搅拌2小时；
4)重复步骤2)和3)2-3次；
5)步骤4)的沉淀加沉淀体积重量比50倍的含1mM Beta-巯基乙醇的8M尿素溶液，搅拌2-4小时使蛋白变性溶解；
6)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5小时，收集澄清液体，弃除产生的少量黑色沉淀杂质；
7)澄清液体转移到搅拌罐中，边搅拌边加入等体积4M的尿素，添加尿素的流速为10-20mL/分钟，最后尿素浓度降为6M；
8)边搅拌边加入步骤7)总量等体积的1M尿素，添加尿素的流速为10-20mL/分钟，这时尿素浓度为3.5M；
9)边搅拌边加入步骤8)总量等体积的纯净水，添加水的流速为10-20mL/分钟，这时尿素浓度为1.75M；
10)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5小时，收集澄清液体；
11)用截留分子量为10000-20000道尔顿的超滤机浓缩，到1/8体积；
12)加入去离子水到原体积，重复步骤11)6次以上，再加入去离子水到原体积；
13)用截留分子量为20000-35000道尔顿的超滤机超滤；
14)用截留分子量为10000-20000道尔顿的超滤机浓缩，到1/20体积；
15)用除菌过滤机除菌，冷冻干燥，分装得成品。
10.如权利要求9所述的方法，其中，所述的方法包括的步骤如下：
1)新发酵获得的重组人生长激素大肠杆菌细胞，于高压匀浆机中，在≦10℃条件下进行破菌；
2)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心1小时，弃除清液，收集固体沉淀；
3)沉淀转移至搅拌罐中。加入10-30倍含0.1％的曲拉通X-100的去离子水搅拌，调pH值为7.0，在≦20℃搅拌2小时；
4)重复步骤2)和3)2-3次；
5)步骤4)的沉淀加沉淀体积重量比50倍的含1mM Beta-巯基乙醇的8M尿素溶液，搅拌2-4小时使蛋白变性溶解；
6)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5小时，收集澄清液体，弃除产生的少量黑色沉淀杂质；
7)澄清液体转移到搅拌罐中，边搅拌边加入等体积4M的尿素，添加尿素的流速为15mL/分钟，最后尿素浓度降为6M；
8)边搅拌边加入步骤7)总量等体积的1M尿素，添加尿素的流速为15mL/分钟，这时尿素浓度为3.5M；
9)边搅拌边加入步骤8)总量等体积的纯净水，添加水的流速为15mL/分钟，这时尿素浓度为1.75M；
10)用螺罐式连续高速离心机15000转/分钟离心，离心0.5小时，收集澄清液体；
11)用截留分子量为15000道尔顿的超滤机浓缩，到1/8体积；
12)加入去离子水到原体积，重复步骤11)6次以上，再加入去离子水到原体积；
13)用截留分子量为30000道尔顿的超滤机超滤；
14)用截留分子量为15000道尔顿的超滤机浓缩，到1/20体积；
15)用除菌过滤机除菌，冷冻干燥，分装得成品。
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