CN102816230A - 人血白蛋白的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种人血白蛋白的制备方法,该方法是从人血浆分离的废弃物组分IV沉淀中提取、纯化出人血白蛋白,从而可以提高血浆的综合利用。本发明包括以下步骤:1、将组分IV沉淀溶解后压滤分离得到滤液A;2、边搅拌滤液A边加入聚乙二醇,压滤分离,得到滤液B;3、调整滤液B的pH,控制滤液B的温度,压滤分离,得到滤液C;4、边搅拌滤液C边加入聚乙二醇,得到反应液C,压滤分离,得到沉淀;5、沉淀溶解,进行DEAE Sepharose fast flow弱阴离子交换层析,超滤;6、将超滤液中的蛋白浓度稀释后加入辛酸钠,调整pH至6.8~7.0,除菌过滤、巴氏灭活,得到人血白蛋白成品。
Description
技术领域
本发明涉及一种血液制品的制备方法,特别是涉及一种从人血浆分离的废弃物组分IV沉淀中提取人血白蛋白的方法。
背景技术
人血白蛋白是一种一级结构简单的单链蛋白,其分子量为66250道尔顿(Da),由585个残基构成,富含门冬氨酸及谷氨酸而缺乏色氨酸。白蛋白分子小,表面面积相对较大,能穿过毛细血管壁和细胞间隙,负电性强,能与多种分子可逆结合,故能在血液循环与各种体液之间传递运送各种生理活动中所需的物质。
人血白蛋白主要用于因失血、创伤及烧伤等引起的休克,脑水肿及大脑损伤所致的脑压增高,对防治低蛋白血症及肝硬化或肾病引起的水肿或腹水有较好的疗效。
现阶段临床上用于治疗的白蛋白(除基因工程产品外)全是来源商业化的人血浆,以人血浆为起始原料,由于受生产工艺所限,有大量人血白蛋白残留在组分IV沉淀中,被作为废物焚烧处理,造成大量资源浪费。人血浆作为国家战略资源,十分珍贵且资源有限,人血白蛋白作为生命的急救药品,具有不可替代性作用。为了更好的满足临床病人需求,同时降低该药品的生产成本,充分利用宝贵的血浆资源,特开发出新的提取工艺。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种人血白蛋白的制备方法,该方法是从人血浆分离的废弃物组分IV沉淀中提取、纯化出安全有效的人血白蛋白,从而可以提高血浆的综合利用,降低了人血白蛋白的生产成本。
本发明所提供的技术方案是:一种人血白蛋白的制备方法,包括以下步骤:
1)组分IV沉淀溶解:以人血浆分离的废弃物组分IV沉淀为起始原料,将组分IV沉淀投入0.01~0.03mol/L、pH值6.8~7.4的Tris-HCl缓冲液中得到反应液A,调整反应液A的pH为6.8~7.4,控制反应液A温度为-1~1℃,搅拌溶解后压滤分离,得到滤液A;
2)边搅拌滤液A边加入分子量为3000~4000的聚乙二醇,使聚乙二醇浓度为8~14%(质量/体积),得到反应液B,调整反应液B的pH至6.0~6.5,控制反应液B温度为-1~1℃,搅拌混合后静置沉淀,压滤分离,得到滤液B;
3)调整滤液B的pH至5.5~5.8,控制滤液B的温度为-1~1℃,搅拌混合后静置沉淀,压滤分离,得到滤液C;
4)边搅拌滤液C边加入分子量为3000~4000的聚乙二醇,使聚乙二醇浓度为20~25%(质量/体积),得到反应液C,调整反应液C的pH至4.8~5.2,控制反应液C的温度为-1~1℃,搅拌混合后静置沉淀,压滤分离,得到沉淀;
5)沉淀用0.01mol/L、pH值6.8~7.4橼酸钠-NaCl缓冲液溶解,得到沉淀溶解液,调节沉淀溶解液的pH为6.8~7.4后进行DEAE Sepharose fast flow弱阴离子交换层析,收集洗脱液进行超滤,得到超滤液;
6)收集超滤液,将超滤液中的蛋白浓度稀释至20%(质量/体积)后加入辛酸钠,使辛酸钠的浓度为0.16~0.18mmol/g蛋白质,调整pH至6.8~7.0,用除菌滤器过滤后60±0.5℃连续10小时恒温巴氏灭活,再次除菌滤器过滤,得到人血白蛋白成品。
本发明人血白蛋白的制备方法,其中:所述超滤所用超滤膜的截留分子量为10KD。
本发明人血白蛋白的制备方法,其中:所述聚乙二醇的分子量为3350。
本发明人血白蛋白的制备方法,其中:步骤1中所述Tris-HCl缓冲液体积是组分IV沉淀体积的2~4倍。
本发明人血白蛋白的制备方法,其中:步骤1中所述搅拌溶解的时间为5~8小时。
本发明人血白蛋白的制备方法,其中:所述进行DEAE Sepharose fast flow弱阴离子交换层析时先用0.01mol/L~0.1mol/L、pH6.8~7.4的枸橼酸钠-NaCl缓冲液平衡,再用0.1mol/L~0.3mol/L、pH6.8~7.4的枸橼酸钠-NaCl缓冲液梯度洗脱。
上述方法制备的人血白蛋白,仅与抗人血浆产生沉淀线,与抗马、牛、猪或羊血浆不产生沉淀线。
上述方法制备的人血白蛋白,与正常人血浆比较,主要沉淀线为人血白蛋白。
上述方法制备的人血白蛋白,聚乙二醇含量不高于0.5%,即5g/L,纯度应不低于蛋白质总量的96.0%(质量百分比)。
本发明人血白蛋白的制备方法步骤1-6中,对pH的调整均采用常规的酸碱中和法,采用NaOH水溶液、KOH水溶液或HCl水溶液。
本发明人血白蛋白的制备方法以人血浆中的组分IV沉淀为原料,所用组分IV沉淀应符合《中国药典》2010年版中关于“组分IV沉淀原料质量标准”。
本发明人血白蛋白的制备方法与现有技术的区别在于:采用血浆分离的废弃物组分IV沉淀为原料,提取人血白蛋白,大大提高了宝贵的人血浆的综合利用能力,高纯度97.5%的人血白蛋白的回收率可达到85%以上,提高了经济效益;采用聚乙二醇法和离子交换层析法相结合简化了生产工艺,降低了对大型设备低温高速离心机的需求,提高经济效益。
具体实施方式
组分IV的制备是本领域技术人员的常规技术手段,以下实施例中所用组分IV沉淀的制备方法包括以下步骤:
a、原料血浆融化
人原料血浆,水浴融化原料血浆,水浴中的水温控制在37℃以下;
b、组分I+II+III的乙醇沉淀及压滤分离
将原料血浆温度降至0℃以下并加入-15℃以下的乙醇,得到反应液,使反应液中的乙醇终浓度为20体积%,用pH4.0的醋酸缓冲液调节反应液pH至6.5±0.3、控制反应液温度在-4.5~~5.5℃,静置30分钟,进行压滤分离,所得沉淀为组分I+II+III沉淀,其是提取免疫球蛋白的起始原料;所得滤液为组分I+II+III滤液;
c、组分IV的乙醇沉淀及压滤分离
将组分I+II+III滤液的pH调至6.20±0.3,加入-15℃以下乙醇至最终乙醇浓度为40体积%,得到反应液1,控制反应液1的温度在-4.5~-5.5℃,静置30分钟,进行压滤分离,收集沉淀即为组分IV沉淀。
实施例1
a、组分IV沉淀溶解:以人血浆分离的废弃物组分IV沉淀为起始原料,组分IV沉淀溶解于0.01mol/L、pH值6.8的Tris-HCl缓冲液中得到反应液A,其中:Tris-HCl缓冲液体积是组分IV沉淀体积的2倍,调节反应液A的pH至6.8,控制反应液A的温度为-1~1℃,搅拌溶解5小时后压滤分离,得到滤液A;
b、边搅拌滤液A边加入分子量为3000的聚乙二醇至其浓度为8质量/体积%,得到反应液B,调整反应液B的pH至6.0,控制反应液B的温度为-1~1℃,继续搅拌2小时,静置1小时,压滤分离,得到滤液B;
c、调整滤液B的pH至5.5,控制滤液B的温度为-1~1℃,继续搅拌1小时,静置1小时,压滤分离,得到滤液C;
d、边搅拌滤液C边加入分子量为3000的聚乙二醇至其浓度为20质量/体积%,得到反应液C,调整反应液C的pH至4.8,控制反应液C的温度为-1~1℃,继续搅拌2小时,静置1小时,压滤分离,得到沉淀;
e、将沉淀用0.01mol/L、pH值6.8枸橼酸钠-NaCl缓冲液溶解,得到沉淀溶解液,调节沉淀溶解液的pH至6.8后将其进行DEAE Sepharose fast flow弱阴离子交换层析,用0.01mol/L~0.1mol/L、pH6.8的枸橼酸钠-NaCl缓冲液平衡,0.1mol/L~0.3mol/L、pH6.8的枸橼酸钠-NaCl缓冲液洗脱,收集洗脱液进行超滤,得到超滤液,超滤膜的截留分子量为10KD。
f、收集超滤液,用注射用水将超滤液中的蛋白浓度稀释至20质量/体积%后加入辛酸钠,使辛酸钠的浓度为0.16mmol/g蛋白质,调整pH至6.8~7.0,用除菌滤器过滤,60±0.5℃连续10小时恒温巴氏灭活,再次除菌滤器过滤,得到人血白蛋白成品。
按上述方法制取三批次的人血白蛋白成品,检测蛋白浓度和纯度,并计算蛋白回收率,结果如下表:
成品检测报告如下表:
实施例2
a、组分IV沉淀溶解:以人血浆分离的废弃物组分IV沉淀为起始原料,组分IV沉淀溶解于0.03mol/L、pH值7.4的Tris-HCl缓冲液中得到反应液A,其中:Tris-HCl缓冲液体积是组分IV沉淀体积的4倍,调节反应液A的pH至7.4,控制反应液A的温度为-1~1℃,搅拌溶解8小时后压滤分离,得到滤液A;
b、边搅拌滤液A边加入分子量为4000的聚乙二醇至其浓度为14质量/体积%,得到反应液B,调整反应液B的pH至6.5,控制反应液B的温度为-1~1℃,继续搅拌2小时,静置1小时,压滤分离,得到滤液B;
c、调整滤液B的pH至5.8,控制滤液B的温度为-1~1℃,继续搅拌1小时,静置1小时,压滤分离,得到滤液C;
d、边搅拌滤液C边加入分子量为4000的聚乙二醇至其浓度为25质量/体积%,得到反应液C,调整反应液C的pH至4.8,控制反应液C的温度为-1~1℃,继续搅拌2小时,静置1小时,压滤分离,得到沉淀;
e、将沉淀用0.01mol/L、pH值7.4的枸橼酸钠-NaCl缓冲液溶解,得到沉淀溶解液,调节沉淀溶解液的pH至7.4后将其进行DEAE Sepharose fast flow弱阴离子交换层析,用0.01mol/L~0.1mol/L、pH7.4的枸橼酸钠-NaCl缓冲液平衡,0.1mol/L~0.3mol/L、pH7.4的枸橼酸钠-NaCl缓冲液洗脱,收集洗脱液进行超滤,得到超滤液,超滤膜的截留分子量为10KD。
f、收集超滤液,用注射用水将超滤液中的蛋白浓度稀释至20质量/体积%后加入辛酸钠,使辛酸钠的浓度为0.18mmol/g蛋白质,调整pH至6.8~7.0,用除菌滤器过滤,60±0.5℃连续10小时恒温巴氏灭活,再次除菌滤器过滤,得到人血白蛋白成品。
按上述方法制取三批次的人血白蛋白成品,检测蛋白浓度和纯度,并计算蛋白回收率,结果如下表:
成品检测报告如下表:
实施例3
a、组分IV沉淀溶解:以人血浆分离的废弃物组分IV沉淀为起始原料,组分IV沉淀溶解于0.02mol/L、pH值7.0的Tris-HCl缓冲液中得到反应液A,其中:Tris-HCl缓冲液体积是组分IV沉淀体积的3倍,调节反应液A的pH至7.0,控制反应液A的温度为-1~1℃,搅拌溶解6小时后压滤分离,得到滤液A;
b、边搅拌滤液A边加入分子量为3350的聚乙二醇至其浓度为11质量/体积%,得到反应液B,调整反应液B的pH至6.2,控制反应液B的温度为-1~1℃,继续搅拌2小时,静置1小时,压滤分离,得到滤液B;
c、调整滤液B的pH至5.6,控制滤液B的温度为-1~1℃,继续搅拌1小时,静置1小时,压滤分离,得到滤液C;
d、边搅拌滤液C边加入分子量为3350的聚乙二醇至其浓度为22质量/体积%,得到反应液C,调整反应液C的pH至5.0,控制反应液C的温度为-1~1℃,继续搅拌2小时,静置1小时,压滤分离,得到沉淀;
e、将沉淀用0.01mol/L、pH值7.0的枸橼酸钠-NaCl缓冲液溶解,得到沉淀溶解液,调节沉淀溶解液的pH至7.0后将其进行DEAE Sepharose fast flow弱阴离子交换层析,用0.01mol/L~0.1mol/L、pH7.0的枸橼酸钠-NaCl缓冲液平衡,0.1mol/L~0.3mol/L、pH7.0的枸橼酸钠-NaCl缓冲液洗脱,收集洗脱液进行超滤,得到超滤液,超滤膜的截留分子量为10KD。
f、收集超滤液,用注射用水将超滤液中的蛋白浓度稀释至20质量/体积%后加入辛酸钠,使辛酸钠的浓度为0.16mmol/g蛋白质,调整pH至6.8~7.0,用除菌滤器过滤,60±0.5℃连续10小时恒温巴氏灭活,再次除菌滤器过滤,得到人血白蛋白成品。
按上述方法制取三批次的人血白蛋白成品,检测蛋白浓度和纯度,并计算蛋白回收率,结果如下表:
成品检测报告如下表:
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述,并非对本发明的范围进行限定,在不脱离本发明设计精神的前提下,本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进,均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (9)
1.一种人血白蛋白的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:
1)组分IV沉淀溶解:以人血浆分离的废弃物组分IV沉淀为起始原料,将组分IV沉淀投入0.01~0.03mol/L、pH值6.8~7.4的Tris-HCl缓冲液中得到反应液A,调整反应液A的pH为6.8~7.4,控制反应液A温度为-1~1℃,搅拌溶解后压滤分离,得到滤液A;
2)边搅拌滤液A边加入分子量为3000~4000的聚乙二醇,使聚乙二醇浓度为8~14%(质量/体积),得到反应液B,调整反应液B的pH至6.0~6.5,控制反应液B温度为-1~1℃,搅拌混合后静置沉淀,压滤分离,得到滤液B;
3)调整滤液B的pH至5.5~5.8,控制滤液B的温度为-1~1℃,搅拌混合后静置沉淀,压滤分离,得到滤液C;
4)边搅拌滤液C边加入分子量为3000~4000的聚乙二醇,使聚乙二醇浓度为20~25%(质量/体积),得到反应液C,调整反应液C的pH至4.8~5.2,控制反应液C的温度为-1~1℃,搅拌混合后静置沉淀,压滤分离,得到沉淀;
5)沉淀用0.01mol/L、pH值6.8~7.4橼酸钠-NaCl缓冲液溶解,得到沉淀溶解液,调节沉淀溶解液的pH为6.8~7.4后进行DEAE Sepharose fast flow弱阴离子交换层析,收集洗脱液进行超滤,得到超滤液;
6)收集超滤液,将超滤液中的蛋白浓度稀释至20%(质量/体积)后加入辛酸钠,使辛酸钠的浓度为0.16~0.18mmol/g蛋白质,调整pH至6.8~7.0,用除菌滤器过滤后60±0.5℃连续10小时恒温巴氏灭活,再次除菌滤器过滤,得到人血白蛋白成品。
2.根据权利要求1所述的人血白蛋白的制备方法,其特征在于:所述超滤所用超滤膜的截留分子量为10KD。
3.根据权利要求2所述的人血白蛋白的制备方法,其特征在于:所述聚乙二醇的分子量为3350。
4.根据权利要求3所述的人血白蛋白的制备方法,其特征在于:步骤1中所述Tris-HCl缓冲液体积是组分IV沉淀体积的2~4倍。
5.根据权利要求4所述的人血白蛋白的制备方法,其特征在于:步骤1中所述搅拌溶解的时间为5~8小时。
6.根据权利要求1所述的人血白蛋白的制备方法,其特征在于:所述进行DEAE Sepharosefast flow弱阴离子交换层析时先用0.01mol/L~0.1mol/L、pH6.8~7.4的枸橼酸钠-NaCl缓冲液平衡,再用0.1mol/L~0.3mol/L、pH6.8~7.4的枸橼酸钠-NaCl缓冲液梯度洗脱。
7.根据权利要求1-6之一所述的方法制备的人血白蛋白,其特征在于:仅与抗人血浆产生沉淀线,与抗马、牛、猪或羊血浆不产生沉淀线。
8.根据权利要求1-6之一所述的方法制备的人血白蛋白,其特征在于:与正常人血浆比较,主要沉淀线为人血白蛋白。
9.根据权利要求1-6之一所述的方法制备的人血白蛋白,其特征在于:聚乙二醇含量不高于0.5%,纯度应不低于蛋白质总量的96.0%。
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