CN110305208A - 低温乙醇两步法分离的人血白蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种两步低温乙醇法分离法生产的人血白蛋白，其特征在于人血白蛋白的低温乙醇分离工艺中没有组分Ⅳ沉淀的分离步骤，组分I+Ⅱ+Ⅲ沉淀后直接分离组分V沉淀，通过超滤保留超滤滤过液的方法超滤除去大分子的杂蛋白，然后是对人血白蛋白超滤除去小分子的蛋白及残留乙醇、可能的铝离子。采用该工艺后的人血白蛋白产品的特点是，生产过程的管理严格执符合GMP要求，不存在返工或再加工生产，并且有较高的人血白蛋白产品得率，在现有基础上每1吨血浆的人血白蛋白产品生产得率提高12%。
Description
技术领域
本专利属于生物制药领域，提供了一种高收率的两步低温乙醇分离的人血白蛋白产品。
背景技术
《药品生产质量规范》（2010年修订）对于药品生产过程中潜在的回收加工或者重新加工的要求有如下两条：
第一百三十三条 产品回收需经预先批准，并对相关的质量风险进行充分评估，根据评估结论决定是否回收。回收应当按照预定的操作规程进行，并有相应记录。回收处理后的产品应当按照回收处理中最早批次产品的生产日期确定有效期。
第一百三十四条 制剂产品不得进行重新加工。不合格的制剂中间产品、待包装产品和成品一般不得进行返工。只有不影响产品质量、符合相应质量标准，且根据预定、经批准的操作规程以及对相关风险充分评估后，才允许返工处理。返工应当有相应记录。
人血白蛋白是血液制品行业的主要产品，占血液中总蛋白质含量的50～60%，分子量66000，不含糖。目前血液制品的生产工艺绝大部分是低温乙醇工艺，低温乙醇法生产人血白蛋白工艺的分离顺序是：以健康人血浆为原料，分离组分I+Ⅱ+Ⅲ沉淀，分离组分Ⅳ沉淀（有的工艺中该步骤又分为两步），分离组分V沉淀，精制纯化得到人血白蛋白，后进行一个超滤步骤操作9遍。该工艺中组分Ⅳ沉淀基本是没有得到具体产品，关键的是该步骤的白蛋白共沉淀最多，达到20%以上。所以有了诸多研究从组分Ⅳ沉淀中回收组分V沉淀然后制造人血白蛋白，比如：
广东卫伦生物制药有限公司于2010年01月19体申请的专利：回收Cohn氏组分Ⅳ沉淀中白蛋白的方法（申请号：201010101816.5）公开了一种从Cohn氏组分Ⅳ沉淀中回收白蛋白的方法,通过选择pH值、乙醇浓度、酸碱度和温度,使组分Ⅳ沉淀中的白蛋白与其它蛋白充分分离,每公斤组分Ⅳ沉淀可制得白蛋白110～120克,使血浆中白蛋白的总提取率提高到93%以上。
同路生物制药股份有限公司于2012年08月27日申请的人血白蛋白的制备方法（申请号：201210308161.8）提供了一种人血白蛋白的制备方法，该方法是从人血浆分离的废弃物组分Ⅳ沉淀中提取、纯化出人血白蛋白，从而可以提高血浆的综合利用。本发明包括以下步骤：1、将组分Ⅳ沉淀溶解后压滤分离得到滤液A；2、边搅拌滤液A边加入聚乙二醇，压滤分离，得到滤液B；3、调整滤液B的pH，控制滤液B的温度，压滤分离，得到滤液C；4、边搅拌滤液C边加入聚乙二醇，得到反应液C，压滤分离，得到沉淀；5、沉淀溶解，进行DEAESepharose fast flow弱阴离子交换层析，超滤；6、将超滤液中的蛋白浓度稀释后加入辛酸钠，调整pH至6.8～7.0，除菌过滤、巴氏灭活，得到人血白蛋白成品。
深圳市卫光生物制品股份有限公司于2015年01月05日申请的一种从组分Ⅳ-2沉淀中提取人血白蛋白的方法（申请号：201510003914.8）采用溶解组分Ⅳ-2沉淀、分离组分Ⅳ-1沉淀、分离组分Ⅳ-2沉淀、分离组分V沉淀、组分V沉淀溶解、过滤、超滤透析、浓缩、加温纯化、过滤、超滤透析、浓缩和配制的步骤用来制备人血白蛋白，各步骤前后紧密相连、层层相扣，所生产得到的人血白蛋白半成品，蛋白质含量在20.1％以上，纯度不低于蛋白质总量的98.0％，pH值为6.5～7.3，残余乙醇含量不高于0.025g/100ml。
由于血液制品属于高风险行业，尽管《中国药典》人血白蛋白质量标准后附载“组分Ⅳ沉淀原料质量标准”，但不允许产品回收或者再加工生产，所以上述专利不能有效的产生价值。但是一方面是国内人血白蛋白产品的巨大市场缺口，另一方面又存在低温乙醇法生产工艺中较大比例（达20%以上）的蛋白共沉淀引起的资源浪费。
按照《药品生产质量管理规范》（2010年修订）的要求，结合产业化大规模生产的技术特点（工艺最优化），那么我们毫不犹豫的选择取消组分Ⅳ沉淀的分离步骤，从资源充分利用和工艺优化的角度来看，目前的低温乙醇法生产人血白蛋白的生产工艺优化还有很大的文章，至少是解决掉人血白蛋白生产的蛋白质共沉淀问题。
为了有效的优化低温乙醇法人血白蛋白生产工艺，本专利立足于现有的低温乙醇法分离工艺，有效的解决了人血白蛋白生产的蛋白质共沉淀带来的产品得率总体偏低的难题。
发明内容
既然组分Ⅳ沉淀是低温乙醇法分离工艺中人血白蛋白共沉淀最多的（该步骤达20%以上，其余步骤的共沉淀小于5%）一个生产环节且没有产生有效的产品（组分Ⅳ沉淀或者是组分Ⅳ-1沉淀及组分Ⅳ-4沉淀都是焚烧废弃），那么取消该分离步骤而直接分离组分V沉淀就成为首先的选择。但是取消该分离步骤后，就意味着组分Ⅳ沉淀相应的蛋白质将较多的进入人血白蛋白产品之中，会影响人血白蛋白产品的蛋白质纯度。
从低温乙醇法分离血液制品的各个组分沉淀的蛋白质成分（参见：倪道明主编《血液制品》第3版（人民卫生出版社2013年3月3版4次印刷）第88页）如下表。
由表中可以看出，组分Ⅳ沉淀主要是大分子蛋白或者巨蛋白如α蛋白酶抑制剂、ATⅢ、补体成分、触珠蛋白。为此，我们选择了在超滤过程中采用两步法有效分离除去大分子杂蛋白并且避免人血白蛋白在组分Ⅳ沉淀分离过程中的蛋白质共沉淀的难题。
依据上述原理，本专利的人血白蛋白生产工艺为：
第一步：以健康人血浆为原料分离冷沉淀、组分I+Ⅱ+Ⅲ沉淀。
第二步：优化的工艺分离组分V沉淀。
第三步：采用截留分子量大于白蛋白分子量的超滤膜超滤除去大分子，在蛋白质溶液体积大浓度较低的情况下超滤除去大分子蛋白质，可以避免白蛋白分子聚集或者浓缩之后可能的超滤流失。
第四步：采用截留分子量小于白蛋白分子量（如10KD）的超滤膜超滤人血白蛋白溶液，除去小分子蛋白及其他小分子的物质。
第五步：60℃10小时巴氏病毒灭活。
第六步：除菌过滤及无菌灌装。
第七步：30℃至32℃保温培育21天，灯检合格后包装入库。
考虑到人血白蛋白在巴氏病毒灭活阶段可能产生蛋白质多聚体，所以，可以考虑将截留分子量高的超滤步骤调整至巴氏病毒灭活后进行，收集超滤滤过也搅拌均匀并测试渗透压摩尔浓度合格后进行除菌灌装。
上述生产工艺过程中具体的实施参数控制如下：
（1） 冷沉淀分离：温度0℃至6.0℃，维持1.0℃至5.0℃，用800 rpm至3000rpm的速度离心6分钟至20分钟，分离冷沉淀。
（2） 低温乙醇第一步分离（分离Cohn组分I、组分Ⅱ、组分Ⅲ）的工艺参数为：pH为6.5至7.8、乙醇含量为15%至24%、温度控制为-6.0℃至-2.5℃，蛋白质浓度范围为：4.0%至7.8%。
（3） 低温乙醇第二步分离（分离Cohn组分V）的工艺参数为：pH为3.5至5.8、乙醇含量为35%至54%、温度控制为-10.0℃至-4.5℃，蛋白质浓度范围为：0.6%至4.8%。
（4） 超滤第一步分离：采用高分子截留量（如80KD至100KD）超滤除去高分子杂蛋白，按照超滤的平均速度计算，将拟去除的高分子溶液超滤2至10遍，确保高分子蛋白溶液中几乎没有白蛋白分子。
（5） 超滤第二步分离：采用低分子截留量（如10KD至30KD）超滤除去小分子杂蛋白及小分子如乙醇及铝残留物，前3至6次为相同温度等体积的0.9%氯化钠溶液超滤，后3至6次为相同温度等体积的注射用水超滤，超滤完成后，进行超滤浓缩，浓缩至所需要的蛋白质浓度，如20至30%。
（6） 巴氏病毒灭活：超滤浓缩后的白蛋白溶液进行配制，确保辛酸钠含量和渗透压摩尔浓度接近人体正常血浆渗透压摩尔浓度之后，进行60℃10小时巴氏病毒灭活。
（7） 除菌过滤及无菌灌装，在灭活罐出口处及灌装生产的前端缓冲均安装0.2微米规格或者带有0.2微米除菌过滤的组合过滤器，实现无菌药品灌装生产的两级过滤生产控制。
（8） 30℃至32℃保温培育21天，灯检合格后包装入库。
该专利的人血白蛋白的关键特征在于其生产过程中取消了组分Ⅳ沉淀（组分Ⅳ-1沉淀及组分Ⅳ-2沉淀）的分离步骤。蛋白质分离过程中允许有这样的调整：冷沉淀分离步骤可以不进行直接分离组分I+Ⅱ+Ⅲ沉淀，同时组分I+Ⅱ+Ⅲ沉淀的分离可以分为组分I沉淀、组分Ⅱ+Ⅲ沉淀两步进行。当然也可以根据组分沉淀采取其他的组合进行组分I+Ⅱ+Ⅲ沉淀的分离。
本专利人血白蛋白生产的技术收益至少有如下3个方面：
（1）减少对乙醇的使用，较大的缩短了工艺时间，组分Ⅳ沉淀的分离约需要20至24小时，而改为超滤工艺后，在2至8小时内即可完成。
（2）有效的提高了人血白蛋白的得率，在现有工艺的基础上，人血白蛋白的得率可以提高12%。按照目前国内年血浆投料量为5000吨计算，采用该工艺后，将相当于目前工艺的5500吨左右血浆的白蛋白生产量，进一步保障了市场供应，减少了对产品进口的依赖。
（3）由于取消了组分Ⅳ沉淀的分离步骤，也就杜绝了血液制品生产过程中可能存在的回收生产问题，有效的优化了工艺管理，有效的保障了人血白蛋白产品品质。
实施实例1：低温乙醇两步工艺生产人血白蛋白。
（1） 冷沉淀分离：温度0.5℃，维持0.5℃至1.0℃，用800 rpm的速度离心20分钟，分离冷沉淀。
（2） 低温乙醇第一步分离（分离Cohn组分I、组分Ⅱ、组分Ⅲ）：
工艺参数为：pH为7.0、乙醇含量为23%、温度控制为-2.5℃，蛋白质浓度范围为6.8%。
组分沉淀制作完毕，按照5克/L加入硅藻土，压滤分离组分沉淀。压滤液用于分离Cohn组分V沉淀。
（3） 低温乙醇第二步分离（分离Cohn组分V）的工艺参数为。
工艺参数为：pH为4.2、乙醇含量为44%、温度控制为-9.8℃，蛋白质浓度范围为：1.6%。
组分沉淀制作完毕，按照6克/L加入硅藻土，压滤分离组分沉淀。压滤所得的沉淀即为组分V，注射用水溶解纯化过滤后用于生产人血白蛋白。
（4） 超滤第一步分离：采用高分子截留量（如100KD）超滤除去高分子杂蛋白，按照超滤的平均速度计算，将拟去除的高分子溶液超滤3遍，确保高分子蛋白溶液中几乎没有白蛋白分子。
（5） 超滤第二步分离：采用低分子截留量（如10KD）超滤除去小分子杂蛋白及小分子如乙醇及铝残留物，前6次为相同温度等体积的0.9%氯化钠溶液超滤，后3次为相同温度等体积的注射用水超滤，超滤完成后，进行超滤浓缩，浓缩至所需要的蛋白质浓度，如22%。
（6） 巴氏病毒灭活：超滤浓缩后的白蛋白溶液进行配制，确保辛酸钠含量为16mmol/克蛋白质，渗透压摩尔浓度接近人体正常血浆渗透压摩尔浓度（300 mOsmol/kg至340 mOsmol/kg）之后，进行60℃10小时巴氏病毒灭活。
（7） 除菌过滤及无菌灌装，在灭活罐出口处及灌装生产的前端缓冲均安装0.2微米规格或者带有0.2微米除菌过滤的组合过滤器，实现无菌药品灌装生产的两级过滤生产控制。
（8） 30℃至32℃保温培育21天，灯检合格后包装入库。
（9） 按《中国药典》人血白蛋白产品标准检验合格并经批签发后上市销售。
实施实例2：低温乙醇两步工艺生产人血白蛋白。
（1） 冷沉淀分离：温度5.0℃，维持4.5℃至6.0℃，用2200 rpm的速度离心10分钟，分离冷沉淀。
（2） 低温乙醇第一步分离（分离Cohn组分I、组分Ⅱ、组分Ⅲ）：
工艺参数为：pH为7.6、乙醇含量为18%、温度控制为-4.5℃，蛋白质浓度范围为6.8%。
组分沉淀制作完毕，按照5克/L加入硅藻土，压滤分离组分沉淀。压滤液用于分离Cohn组分V沉淀。
（3）、低温乙醇第二步分离（分离Cohn组分V）的工艺参数为。
工艺参数为：pH为3.7、乙醇含量为38%、温度控制为-9.5℃，蛋白质浓度范围为：3.6%。
组分沉淀制作完毕，按照6克/L加入硅藻土，压滤分离组分沉淀。压滤所得的沉淀即为组分V，注射用水溶解纯化过滤后用于生产人血白蛋白。
（4） 超滤第一步分离：采用高分子截留量（如80KD）超滤除去高分子杂蛋白，按照超滤的平均速度计算，将拟去除的高分子溶液超滤9遍，确保高分子蛋白溶液中几乎没有白蛋白分子。
（5） 超滤第二步分离：采用低分子截留量（如10KD）超滤除去小分子杂蛋白及小分子如乙醇及铝残留物，前5次为相同温度等体积的0.9%氯化钠溶液超滤，后4次为相同温度等体积的注射用水超滤，超滤完成后，进行超滤浓缩，浓缩至所需要的蛋白质浓度，如25%。
（6） 巴氏病毒灭活：超滤浓缩后的白蛋白溶液进行配制，确保辛酸钠含量为16mmol/克蛋白质，渗透压摩尔浓度接近人体正常血浆渗透压摩尔浓度（300 mOsmol/kg至340 mOsmol/kg）之后，进行60℃10小时巴氏病毒灭活。
（7） 除菌过滤及无菌灌装，在灭活罐出口处及灌装生产的前端缓冲均安装0.2微米规格或者带有0.2微米除菌过滤的组合过滤器，实现无菌药品灌装生产的两级过滤生产控制。
（8） 30℃至32℃保温培育21天，灯检合格后包装入库。
（9） 按《中国药典》人血白蛋白产品标准检验合格并经批签发后上市销售。
实施实例3：低温乙醇两步工艺生产人血白蛋白（不分离冷沉淀）。
（1） 低温乙醇第一步分离（分离Cohn组分I、组分Ⅱ、组分Ⅲ）：
工艺参数为：pH为7.6、乙醇含量为18%、温度控制为-4.5℃，蛋白质浓度范围为6.8%。
组分沉淀制作完毕，按照5克/L加入硅藻土，压滤分离组分沉淀。压滤液用于分离Cohn组分V沉淀。
（2）、低温乙醇第二步分离（分离Cohn组分V）的工艺参数为。
工艺参数为：pH为3.7、乙醇含量为38%、温度控制为-9.5℃，蛋白质浓度范围为：3.6%。
组分沉淀制作完毕，按照6克/L加入硅藻土，压滤分离组分沉淀。压滤所得的沉淀即为组分V，注射用水溶解纯化过滤后用于生产人血白蛋白。
（3） 超滤第一步分离：采用高分子截留量（如80KD）超滤除去高分子杂蛋白，按照超滤的平均速度计算，将拟去除的高分子溶液超滤9遍，确保高分子蛋白溶液中几乎没有白蛋白分子。
（4） 超滤第二步分离：采用低分子截留量（如10KD）超滤除去小分子杂蛋白及小分子如乙醇及铝残留物，前5次为相同温度等体积的0.9%氯化钠溶液超滤，后4次为相同温度等体积的注射用水超滤，超滤完成后，进行超滤浓缩，浓缩至所需要的蛋白质浓度，如25%。
（5） 巴氏病毒灭活：超滤浓缩后的白蛋白溶液进行配制，确保辛酸钠含量为16mmol/克蛋白质，渗透压摩尔浓度接近人体正常血浆渗透压摩尔浓度（300 mOsmol/kg至340 mOsmol/kg）之后，进行60℃10小时巴氏病毒灭活。
（6） 除菌过滤及无菌灌装，在灭活罐出口处及灌装生产的前端缓冲均安装0.2微米规格或者带有0.2微米除菌过滤的组合过滤器，实现无菌药品灌装生产的两级过滤生产控制。
（7） 30℃至32℃保温培育21天，灯检合格后包装入库。
（8） 按《中国药典》人血白蛋白产品标准检验合格并经批签发后上市销售。
实施实例4：低温乙醇两步工艺生产人血白蛋白（组分I+Ⅱ+Ⅲ沉淀分两步分离）。
（1） 冷沉淀分离：温度5.0℃，维持4.5℃至6.0℃，用2200 rpm的速度离心10分钟，分离冷沉淀，上清液用于分离组分I+Ⅱ+Ⅲ沉淀。。
（2-1） 低温乙醇第一步分离（分离Cohn组分I沉淀）：
工艺参数为：pH为7.2、乙醇含量为8%、温度控制为-3.5℃，蛋白质浓度范围为6%。
组分沉淀制作完毕，按照5克/L加入硅藻土，压滤分离组分沉淀。压滤液用于分离Cohn组分Ⅱ+Ⅲ沉淀。
（2-2） 低温乙醇第一步分离（分离组分Ⅱ+Ⅲ沉淀）：
工艺参数为：pH为6.9、乙醇含量为20%、温度控制为-4.5℃，蛋白质浓度范围为5.2%。
组分沉淀制作完毕，按照5克/L加入硅藻土，压滤分离组分沉淀。压滤液用于分离Cohn组分V沉淀。
（3）、低温乙醇第二步分离（分离Cohn组分V）的工艺参数为。
工艺参数为：pH为3.7、乙醇含量为38%、温度控制为-9.5℃，蛋白质浓度范围为：3.6%。
组分沉淀制作完毕，按照6克/L加入硅藻土，压滤分离组分沉淀。压滤所得的沉淀即为组分V，注射用水溶解纯化过滤后用于生产人血白蛋白。
（4） 超滤第一步分离：采用高分子截留量（如80KD）超滤除去高分子杂蛋白，按照超滤的平均速度计算，将拟去除的高分子溶液超滤9遍，确保高分子蛋白溶液中几乎没有白蛋白分子。
（5） 超滤第二步分离：采用低分子截留量（如10KD）超滤除去小分子杂蛋白及小分子如乙醇及铝残留物，前5次为相同温度等体积的0.9%氯化钠溶液超滤，后4次为相同温度等体积的注射用水超滤，超滤完成后，进行超滤浓缩，浓缩至所需要的蛋白质浓度，如25%。
（6） 巴氏病毒灭活：超滤浓缩后的白蛋白溶液进行配制，确保辛酸钠含量为16mmol/克蛋白质，渗透压摩尔浓度接近人体正常血浆渗透压摩尔浓度（300 mOsmol/kg至340 mOsmol/kg）之后，进行60℃10小时巴氏病毒灭活。
（7） 除菌过滤及无菌灌装，在灭活罐出口处及灌装生产的前端缓冲均安装0.2微米规格或者带有0.2微米除菌过滤的组合过滤器，实现无菌药品灌装生产的两级过滤生产控制。
（8） 30℃至32℃保温培育21天，灯检合格后包装入库。
（9） 按《中国药典》人血白蛋白产品标准检验合格并经批签发后上市销售。
实施实例5：低温乙醇两步工艺生产人血白蛋白（灭活后超滤）。
（1） 冷沉淀分离：温度0.5℃，维持0.5℃至1.0℃，用800 rpm的速度离心20分钟，分离冷沉淀。
（2） 低温乙醇第一步分离（分离Cohn组分I、组分Ⅱ、组分Ⅲ）：
工艺参数为：pH为7.0、乙醇含量为23%、温度控制为-2.5℃，蛋白质浓度范围为6.8%。
组分沉淀制作完毕，按照5克/L加入硅藻土，压滤分离组分沉淀。压滤液用于分离Cohn组分V沉淀。
（3） 低温乙醇第二步分离（分离Cohn组分V）的工艺参数为。
工艺参数为：pH为4.2、乙醇含量为44%、温度控制为-9.8℃，蛋白质浓度范围为：1.6%。
组分沉淀制作完毕，按照6克/L加入硅藻土，压滤分离组分沉淀。压滤所得的沉淀即为组分V，注射用水溶解纯化过滤后用于生产人血白蛋白。
（4） 超滤第一步分离：采用高分子截留量（如100KD）超滤除去高分子杂蛋白，按照超滤的平均速度计算，将拟去除的高分子溶液超滤3遍，确保高分子蛋白溶液中几乎没有白蛋白分子。
（5） 超滤第二步分离：采用低分子截留量（如10KD）超滤除去小分子杂蛋白及小分子如乙醇及铝残留物，前6次为相同温度等体积的0.9%氯化钠溶液超滤，后3次为相同温度等体积的注射用水超滤，超滤完成后，进行超滤浓缩，浓缩至所需要的蛋白质浓度，如22%。
（6） 巴氏病毒灭活：超滤浓缩后的白蛋白溶液进行配制，确保辛酸钠含量为16mmol/克蛋白质，渗透压摩尔浓度接近人体正常血浆渗透压摩尔浓度（300 mOsmol/kg至340 mOsmol/kg）之后，进行60℃10小时巴氏病毒灭活。
（7） 采用高分子截留量（如100KD）超滤除去高分子杂蛋白，按照超滤的平均速度计算，将拟去除的高分子溶液超滤3遍，确保高分子蛋白溶液中几乎没有白蛋白分子。
（8） 除菌过滤及无菌灌装，在灭活罐出口处及灌装生产的前端缓冲均安装0.2微米规格或者带有0.2微米除菌过滤的组合过滤器，实现无菌药品灌装生产的两级过滤生产控制。
（9） 30℃至32℃保温培育21天，灯检合格后包装入库。
（10） 按《中国药典》人血白蛋白产品标准检验合格并经批签发后上市销售。。
Claims (2)
1.本专利提供了一种两步低温乙醇法工艺分离的人血白蛋白制品，该两步法低温乙醇工艺的人血白蛋白的产品特征在于：人血白蛋白的低温乙醇分离工艺中没有组分Ⅳ沉淀的分离步骤，以健康人血浆为原料，分离组分I+Ⅱ+Ⅲ沉淀之后直接分离组分V沉淀，超滤生产包括两步，首先是超滤保留超滤滤过液，超滤除去大分子的杂蛋白，然后是对人血白蛋白超滤除去小分子的蛋白及残留乙醇、可能的铝离子，其生产工艺特征为包括以下的生产步骤：
（1） 冷沉淀分离：温度0℃至6.0℃，维持1.0℃至5.0℃，用800 rpm至3000rpm的速度离心6分钟至20分钟，分离冷沉淀；
（2） 低温乙醇第一步分离（分离Cohn组分I、组分Ⅱ、组分Ⅲ）的工艺参数为：pH为6.5至7.8、乙醇含量为15%至24%、温度控制为-6.0℃至-2.5℃，蛋白质浓度范围为：4.0%至7.8%；
（3） 低温乙醇第二步分离（分离Cohn组分V）的工艺参数为：pH为3.5至5.8、乙醇含量为35%至54%、温度控制为-10.0℃至-4.5℃，蛋白质浓度范围为：0.6%至4.8%：
（4） 超滤第一步分离：采用高分子截留量（如80KD至100KD）超滤除去高分子杂蛋白，按照超滤的平均速度计算，将拟去除的高分子溶液超滤2至10遍，确保高分子蛋白溶液中几乎没有白蛋白分子；
（5） 超滤第二步分离：采用低分子截留量（如10KD至30KD）超滤除去小分子杂蛋白及小分子如乙醇及铝残留物，前3至6次为相同温度等体积的0.9%氯化钠溶液超滤，后3至6次为相同温度等体积的注射用水超滤，超滤完成后，进行超滤浓缩，浓缩至所需要的蛋白质浓度，如20至30%；
（6） 巴氏病毒灭活：超滤浓缩后的白蛋白溶液进行配制，确保辛酸钠含量和渗透压摩尔浓度接近人体正常血浆渗透压摩尔浓度之后，进行60℃10小时巴氏病毒灭活；
（7）除菌过滤和无菌灌装生产，后进行30℃至32℃21天培育并灯检合格后包装入库；
（8）按《中国药典》人血白蛋白产品标准检验合格并经批签发后上市销售；
其产品的质量特征包括有：
（1）蛋白质的纯度不小于96%；
（2）其他指标符合《中国药典》人血白蛋白产品的质量标准。
2.按权利要求1，考虑到人血白蛋白巴氏病毒灭活期间可能产生蛋白多聚体，为了有效去除蛋白质多聚体，可以在巴氏病毒灭活后除菌灌装前增加一步分子截留量高的超滤或者将权利要求1的分子截留量高的超滤步骤调整至这一阶段进行。
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