CN104004084B - 一种人血白蛋白的生产方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人血白蛋白的生产方法，其技术方案要点是一种人血白蛋白的生产方法，主要包括血浆的合并与融化、组分I的制作与离心、组分II+III的制作和压滤、组分IV的制作和压滤、组分V的制作和压滤、组分V沉淀溶解过滤、超滤透析浓缩、配制、巴氏灭活、除菌灌装、孵放、检定的步骤，所述超滤透析浓缩的步骤中调节pH值至5.5~6.0，调节氯化钠浓度至1.5~2.0%，旨在提供一种铝离子含量低，产品质量高的人血白蛋白的生产方法。

Description

一种人血白蛋白的生产方法
技术领域
本发明涉及一种生物制品技术中蛋白质的分离、提纯工艺方法，更具体地说，它涉及一种人血白蛋白的生产方法。
背景技术
人血白蛋白是人体血液中最主要的一种功能性蛋白质，其主要的生理功能为调节人体渗透压和新陈代谢中物质运输，临床上主要用于治疗烧伤、烫伤及脑水肿和肝腹水等症。
目前主要的分离方法是以乙醇为沉淀剂的低温乙醇法，由于乙醇浓度、温度、pH值等工艺参数的选择不合理使得蛋白成分收率偏低、人血白蛋白组分中的不稳定物质（如脂蛋白）去除不彻底；另一方面，在现有的人血白蛋白生产过程中需要加入硅藻土，而硅藻土不可避免的含有一定量的铝元素，在加工中容易在人血白蛋白成品里残留一定量的铝离子进而影响产品的质量。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种铝离子含量低，产品质量高的人血白蛋白的生产方法。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种人血白蛋白的生产方法，主要包括血浆的合并与融化、组分I的制作与离心、组分II+III的制作和压滤、组分IV的制作和压滤、组分V的制作和压滤、组分V沉淀溶解过滤、超滤透析浓缩、配制、巴氏灭活、除菌灌装、孵放、检定的步骤，其特征是：所述超滤透析浓缩的步骤中调节pH值至5.5~6.0，调节氯化钠浓度至1.5~2.0%。
通过采用上述技术方案，由于在较低pH值和较高盐浓度的状态下是有利于铝离子被置换透析的同时又不影响蛋白稳定性的，因此在超滤透析浓缩中采用低pH环境可以使得在加工人血白蛋白的过程中所加入的硅藻土带来的铝离子更容易被氢离子和钠离子置换，从而降低了铝离子的残留量，提高了产品的质量。
本发明进一步设置为：所述超滤透析浓缩过程中采用连续等倍透析法与梯度升温法相结合进行操作。
超滤透析浓缩采用连续等倍透析法可使得反应液可多次透析进一步提升产品质量，透析过程中提升反应液温度是基于在温度较高时有利于置换反应发生的原理，而实际生产中考虑到超滤透析初始阶段反应液乙醇含量较高，温度骤然升高难以保持蛋白的稳定性，因此结合实际生产条件采用梯度升温来缓慢提升制换反应的速率，有利于保证产品质量。
本发明进一步设置为：所述血浆的合并与融化、组分I的制作与离心、组分II+III的制作和压滤、组分IV的制作和压滤、组分V的制作和压滤、组分V沉淀溶解过滤、超滤透析浓缩、配制、巴氏灭活、除菌灌装、孵放、检定的步骤具体为：
（1）、血浆的合并与融化，将温度低于-5℃的血浆置于解冻罐内，罐体夹层内通37℃以下的温水，融化过程中保持血浆温度全程不超过4℃，反应得到融化的混合血浆；
（2）、组分I的制作与离心，调节混合血浆pH值到7.00~7.40，并保持混合血浆温度-2.5~-3.5℃，加入乙醇并调节乙醇的体积浓度至8%，调节离子强度至0.15，之后对其进行离心，保持离心全程混合血浆温度保持在-2.5~-3.5℃，得到组分I沉淀和组分I上清液；
（3）、组分II+III的制作和压滤，取组分I上清液，调节pH值至6.85~6.95，保持组分I上清液温度-4.5~-5.5℃，加入乙醇并调节乙醇的体积浓度至20%，调节离子强度至0.14，得到组分II+III反应液；取组分II+III反应液按28g/L血浆的量添加硅藻土并搅拌30分钟以上，之后对组分II+III反应液进行压滤，压滤过程中保持过滤压力小于等于2.0Kg/cm2,得到组分II+III沉淀和组分II+III上清液；
（4）、组分IV的制作和压滤，取组分II+III上清液连续进行组分IV-1和IV-4制作，按照108.1ml/L的比例加入冷注射用水，调节pH值至5.10~5.20，保持组分II+III上清液温度为-4.5~-5.5℃，加入乙醇并调节乙醇的体积浓度至18%，调节离子强度至0.13，静置6小时以上，使组分II+III上清液中产生组分IV-1沉淀；调节pH值至5.95~6.05温度为-4.5~-5.5℃，加入乙醇并调节乙醇的体积浓度至40%，调节离子强度至0.10，静置8小时以上，之后继续向组分II+III上清液中按21g/L血浆的量添加硅藻土，搅拌30分钟以上对其进行压滤，压滤过程中保持过滤压力小于等于2.0Kg/cm2，得到组分IV上清液和组分IV-1沉淀与组分IV-4沉淀混合形成的组分IV沉淀；
（5）、组分V的制作和压滤，取组分IV上清液，调节pH值至4.75~4.85，保持组分IV上清液温度为-9~-11℃，加入乙醇并调节乙醇的体积浓度至40%，调节离子强度至0.09，静置3小时以上；之后进行压滤，压滤过程中保持过滤压力小于等于2.0Kg/cm2，得到组分V上清液和组分V沉淀；
（6）、组分V沉淀溶解过滤，取组分V沉淀加4~5倍沉淀量的注射用水进行溶解，溶解过程中保持温度为1~3℃，之后对反应液进行澄清过滤，得到组分V溶解过滤液；
（7）、超滤透析浓缩，超滤透析浓缩过程中调节pH值至5.5~6.0，调节氯化钠浓度至1.5~2%，并连续进行8次透析，其每次透析的组分V溶解液温度依次为2℃、3℃、5℃、9℃、17℃、25℃、25℃、25℃、25℃、25℃，其每次透析的透析水体积为等倍的组分V浓缩液体积，得到人血白蛋白原液；
（8）、配制、巴氏灭活、除菌灌装、孵放、检定，取人血白蛋白原液加入注射用水调节蛋白含量19.5~20.5%，加入辛酸钠并调节辛酸钠含量至0.140~0.180mmol/L，加入氯化钠调节钠离子含量至130~160mmol/L,调节pH值至6.6~7.0，之后对人血白蛋白原液进行巴氏灭活，巴氏灭活过程中保持人血白蛋白原液温度为60±0.5℃持续10小时，之后进行过滤除菌，得到人血白蛋白半成品；然后对人血白蛋白半成品进行无菌灌装和孵放，孵放过程保持温度30~32℃，至少孵放14天，最后对产品进行二次灯检，合格品即为人血白蛋白成品；最后将人血白蛋白成品包装入库。
通过采用上述技术方案，组分I+II+III和组分IV采用分步反应，单步过滤沉淀，分步反应时不进行过滤分离（组分I产生沉淀之后并不马上过滤，而是待组分II+III沉淀一起产生之后再进行过滤；组分IV-1沉淀产生后也同样不马上过滤，而是待组分IV-4沉淀也产生并与组分IV-1沉淀混合形成组分IV沉淀之后再进行过滤），而减少蛋白沉淀时不同组分之间的共沉现象，提高产品收率，使人血白蛋白成品中的不稳定物质（如脂蛋白）去除更加彻底，且超滤透析浓缩的过程中设置的连续等倍透析和梯度升温的具体参数也使生产工艺更加合理，加工效率更高，铝离子浓度被进一步降低，保证了产品各项指标符合并高于国家标准。
附图说明
图1为本发明工艺流程方框示意图。
具体实施方式
一种人血白蛋白的生产方法，具体为：
（1）、血浆的合并与融化：
将温度低于-5℃的血浆置于解冻罐内，罐体夹层内通37℃以下的温水，融化过程中保持血浆温度全程不超过4℃，反应得到融化的混合血浆；
（2）、组分I的制作与离心：
调节混合血浆pH值到7.00~7.40，并保持混合血浆温度-2.5~-3.5℃，加入乙醇并调节乙醇的体积浓度至8%，调节离子强度至0.15，之后对其进行离心，保持离心全程混合血浆温度保持在-2.5~-3.5℃，得到组分I沉淀（可用于制作纤维蛋白原），和组分I上清液；
（3）、组分II+III的制作和压滤：
取组分I上清液，调节pH值至6.85~6.95，保持组分I上清液温度-4.5~-5.5℃，加入乙醇并调节乙醇的体积浓度至20%，调节离子强度至0.14，得到组分II+III反应液。取组分II+III反应液按28g/L血浆的量添加硅藻土并搅拌30分钟以上，之后对组分II+III反应液进行压滤，压滤过程中保持过滤压力小于等于2.0Kg/cm2,得到组分II+III沉淀（可用于人免疫球蛋白和凝血酶原复合物）和组分II+III上清液；
（4）、组分IV的制作和压滤：
取组分II+III上清液连续进行组分IV-1和IV-4制作，按照108.1ml/L的比例加入冷注射用水，调节pH值至5.10~5.20，保持组分II+III上清液温度为-4.5~-5.5℃，加入乙醇并调节乙醇的体积浓度至18%，调节离子强度至0.13，静置6小时以上，使组分II+III上清液中产生组分IV-1沉淀。调节pH值至5.95~6.05温度为-4.5~ -5.5℃，加入乙醇并调节乙醇的体积浓度至40%，调节离子强度至0.10，静置8小时以上，之后继续向组分II+III上清液中按21g/L血浆的量添加硅藻土，搅拌30分钟以上对其进行压滤，压滤过程中保持过滤压力小于等于2.0Kg/cm2，得到组分IV上清液和组分IV-1沉淀与组分IV-4沉淀混合形成的组分IV沉淀；（组分IV沉淀里含有转铁蛋白等成分，可进行相应的加工）；
（5）、组分V的制作和压滤：
取组分IV上清液，调节pH值至4.75~4.85，保持组分IV上清液温度为-9~-11℃，加入乙醇并调节乙醇的体积浓度至40%，调节离子强度至0.09，静置3小时以上。之后进行压滤，压滤过程中保持过滤压力小于等于2.0Kg/cm2，得到组分V上清液（组分V上清液可输送至乙醇回收罐对乙醇进行回收，节能环保，提高原材料利用率）和组分V沉淀；
（6）、组分V沉淀溶解过滤，取组分V沉淀加4~5倍沉淀量的注射用水进行溶解，溶解过程中保持温度为1~3℃，之后对反应液进行澄清过滤，得到组分V溶解过滤液；
（7）、超滤透析浓缩，超滤透析浓缩过程中调节pH值至5.5~6.0，调节氯化钠浓度至1.5~2.0%，并连续进行8次透析，其每次透析的组分V溶解液温度依次为2℃、3℃、5℃、9℃、17℃、25℃、25℃、25℃、25℃、25℃，其每次透析的透析水体积为等倍的组分V浓缩液体积，得到人血白蛋白原液；
（8）、配制、巴氏灭活、除菌灌装、孵放、检定：
取人血白蛋白原液加入注射用水调节蛋白含量19.5~20.5%，加入辛酸钠并调节辛酸钠含量至0.140~0.180mmol/L，加入氯化钠调节钠离子含量至130~160mmol/L,调节pH值至6.6~7.0，之后对人血白蛋白原液进行巴氏灭活，巴氏灭活过程中保持人血白蛋白原液温度为60±0.5℃持续10小时，之后进行过滤除菌（膜孔径为0.22um），得到人血白蛋白半成品。然后对人血白蛋白半成品进行无菌灌装和孵放，孵放过程保持温度30~32℃，至少孵放14天，最后对产品进行二次灯检，合格品即为人血白蛋白成品。最后将人血白蛋白成品包装入库。
上述步骤中所加入的乙醇为浓度为95%的乙醇溶液；上述步骤中调节pH值依靠无水醋酸钠的水溶液、冰醋酸的水溶液或氢氧化钠的水溶液。
上述组分Ⅰ，组分Ⅱ+Ⅲ，组分IV，组分IV-1，组分IV-4，组分V为所属技术领域的通用分类方法，在本发明中是对特定物质的名称的命名，并不是指单纯的序号。
上述体积浓度也可用V/V表示，其他如无特殊说明均视为质量百分比。

Claims (1)

1.一种人血白蛋白的生产方法，主要包括血浆的合并与融化、组分I的制作与离心、组分II+III的制作和压滤、组分IV的制作和压滤、组分V的制作和压滤、组分V沉淀溶解过滤、超滤透析浓缩、配制、巴氏灭活、除菌灌装、孵放、检定的步骤，其特征是：所述超滤透析浓缩的步骤中调节pH值至5.5~6.0，调节氯化钠浓度至1.5~2.0%；所述超滤透析浓缩过程中采用连续等倍透析法与梯度升温法相结合进行操作；步骤具体为：
（1）、血浆的合并与融化，将温度低于-5℃的血浆置于解冻罐内，罐体夹层内通37℃以下的温水，融化过程中保持血浆温度全程不超过4℃，反应得到融化的混合血浆；
（2）、组分I的制作与离心，调节混合血浆pH值到7.00~7.40，并保持混合血浆温度-2.5~-3.5℃，加入乙醇并调节乙醇的体积浓度至8%，调节离子强度至0.15，之后对其进行离心，保持离心全程混合血浆温度保持在-2.5~-3.5℃，得到组分I沉淀和组分I上清液；
（3）、组分II+III的制作和压滤，取组分I上清液，调节pH值至6.85~6.95，保持组分I上清液温度-4.5~-5.5℃，加入乙醇并调节乙醇的体积浓度至20%，调节离子强度至0.14，得到组分II+III反应液；取组分II+III反应液按28g/L血浆的量添加硅藻土并搅拌30分钟以上，之后对组分II+III反应液进行压滤，压滤过程中保持过滤压力小于等于2.0Kg/cm2,得到组分II+III沉淀和组分II+III上清液；
（4）、组分IV的制作和压滤，取组分II+III上清液连续进行组分IV-1和IV-4制作，按照108.1ml/L的比例加入冷注射用水，调节pH值至5.10~5.20，保持组分II+III上清液温度为-4.5~-5.5℃，加入乙醇并调节乙醇的体积浓度至18%，调节离子强度至0.13，静置6小时以上，使组分II+III上清液中产生组分IV-1沉淀；调节pH值至5.95~6.05，温度为-4.5~-5.5℃，加入乙醇并调节乙醇的体积浓度至40%，调节离子强度至0.10，静置8小时以上，之后继续向组分II+III上清液中按21g/L血浆的量添加硅藻土，搅拌30分钟以上对其进行压滤，压滤过程中保持过滤压力小于等于2.0Kg/cm2，得到组分IV上清液和组分IV-1沉淀与组分IV-4沉淀混合形成的组分IV沉淀；
（5）、组分V的制作和压滤，取组分IV上清液，调节pH值至4.75~4.85，保持组分IV上清液温度为-9~-11℃，加入乙醇并调节乙醇的体积浓度至40%，调节离子强度至0.09，静置3小时以上；之后进行压滤，压滤过程中保持过滤压力小于等于2.0Kg/cm2，得到组分V上清液和组分V沉淀；
（6）、组分V沉淀溶解过滤，取组分V沉淀加4~5倍沉淀量的注射用水进行溶解，溶解过程中保持温度为1~3℃，之后对反应液进行澄清过滤，得到组分V溶解过滤液；
（7）、超滤透析浓缩，超滤透析浓缩过程中调节pH值至5.5~6.0，调节氯化钠浓度至1.5~2%，并连续进行8次透析，其每次透析的组分V溶解液温度依次为2℃、3℃、5℃、9℃、17℃、25℃、25℃、25℃、25℃、25℃，其每次透析的透析水体积为等倍的组分V浓缩液体积，得到人血白蛋白原液；
（8）、配制、巴氏灭活、除菌灌装、孵放、检定，取人血白蛋白原液加入注射用水调节蛋白含量19.5~20.5%，加入辛酸钠并调节辛酸钠含量至0.140~0.180mmol/L，加入氯化钠调节钠离子含量至130~160mmol/L,调节pH值至6.6~7.0，之后对人血白蛋白原液进行巴氏灭活，巴氏灭活过程中保持人血白蛋白原液温度为60±0.5℃持续10小时，之后进行过滤除菌，得到人血白蛋白半成品；然后对人血白蛋白半成品进行无菌灌装和孵放，孵放过程保持温度30~32℃，至少孵放14天，最后对产品进行二次灯检，合格品即为人血白蛋白成品；最后将人血白蛋白成品包装入库。
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