CN107176999A

CN107176999A - 一种人血白蛋白的制备方法

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Publication number: CN107176999A
Application number: CN201710311182.8A
Authority: CN
Inventors: 徐建生; 田健生; 王珍
Original assignee: WUHAN ZHONG YUAN RUI DE BIOLOGICAL PRODUCTS Co Ltd
Current assignee: WUHAN ZHONG YUAN RUI DE BIOLOGICAL PRODUCTS Co Ltd
Priority date: 2017-05-05
Filing date: 2017-05-05
Publication date: 2017-09-19

Abstract

本发明涉及一种生物制品技术中蛋白质的分离、提取方法，具体涉及人血白蛋白的制备方法，依次进行以下步骤制得，分离组分Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ、分离组分Ⅳ、分离组分Ⅴ、精制纯化；超滤、巴氏灭活、除菌灌装，检定成品，将检定合格后产品贴签、装盒等进行包装。本发明采用相对温和的加压过滤分离方法，对蛋白质分子结构无影响，确保了制备出高质量的人血白蛋白；大大提高了产品收率，并能够向临床提供低铝离子含量甚至不含铝离子的人血白蛋白，提高了人血白蛋白的质量。

Description

一种人血白蛋白的制备方法

技术领域

本发明涉及一种生物制品技术中蛋白质的分离、提取方法，具体涉及人血白蛋白的制备方法。

背景技术

人血浆白蛋白(HPA)是有585个氨基酸组成的单链非糖蛋白，分子量为66KD，是血浆中含量最多的一种蛋白质，在人体内HPA主要生理功能是维持血液渗透压和携带血液中多种配基(包括脂肪酸、氨基酸、类固醇、金属离子及药物)与组织进行交换等生理功能，临床上主要用于手术输血和危重病人补液，治疗创伤休克、发烧、水肿、低白蛋白血症和红细胞过多症等，而且能增强人体抵抗能力，是重要的临床药物，也是迄今为止产量最大、用量最大的蛋白质药物。当前，HPA的临床使用量巨大，国际上年使用量约达600吨，我国临床使用量也已达100吨左右，并将随着农村生活水平和医疗条件的改善不断增加。

现有技术中多采用低温乙醇工艺分离血浆蛋白，分离各组分多采用离心分离的方法，它存在如下缺点：一是离心剪切力对蛋白质的影响，离心分离转速每分钟一般在14000转以上，超高速剪切力对蛋白质沉淀颗粒造成的破坏，可能造成蛋白质立体结构的变化；二是离心分离采用超高速离心，一般达到14000转以上，机器产热需要接近—30℃以下的工艺冷媒在离心机转鼓周围提供冷环境，以降低转鼓超高速旋转产生的热量，防止蛋白受热而变性。同时离心操作间温度也要求—5℃以下，加上离心机本身的高耗电(3KW/台)，整体上能耗特别大，而且要求低温的操作条件；三是离心操作由于单台离心机转鼓容量有限，需要多台设备同时开启，不易进行管道自动化，人员劳动强度大，安全风险高，制品“跑、冒、滴、漏”不可避免，此法产品收率一般在2.5g/ml血浆以下，产品收率低。

另一种较为改进的方法是，采用加压过滤分离方法，但是在过滤之前，反应混悬液中必须加入足够量的硅藻土或珍珠岩的助滤剂，才能保证过滤的实现。而硅藻土或珍珠岩等助滤剂中主要成分是二氧化硅，占70～80％，其次要成分就是三氧化二铝，约占10～20％不等，这些三氧化二铝经过蛋白反应溶液后会有一定比例的铝离子形式存在进入制品溶液。从所周知，铝离子对人体有致癌作用，国家药品标准规定有关人血白蛋白质量标准都有明确的规定，必须小于200微克/升。另一方面，加压过滤所用的深层滤板，其主要成分是纤维素纤维、硅藻土、珍珠岩等，也同样有铝离子释放进入制品中；并且还存在超滤透析注射用水体积大的缺陷：为了去除生产过程中引入的铝离子，在生产过程的超滤工序中，至少需要首次浓缩液10 倍以上的注射用水进行反复透析，才有可能使制品中铝离子小于200微克/升，而且即便是再增加透析倍数，铝离子也始终会大于100微克/升。

中国专利公开文件CN102532304A，提出一种人血白蛋白的制备方法，其中分离组分Ⅰ +Ⅱ+Ⅲ、分离组分Ⅳ、分离组分Ⅴ、精制纯化四步骤的pH值偏低使收率偏低。

发明内容

本发明的目的是为了克服上述现有技术存在的缺陷，而提供一种人血白蛋白的制备方法，其收率明显提供。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案如下：人血白蛋白的制备方法，包括以下步骤：

第一步，分离组分Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ：将低温冰冻人血浆融化为液体状态，加入药用乙醇，至最终乙醇的体积达到人血浆和药用乙醇混合液总体积的22％，同时用1mol/L醋酸溶液调节人血浆和药用乙醇混合液的pH至6.4～6.6，并调节血浆蛋白质使其质量分数达到5.5％，调控温度至－5.5℃，搅拌2小时以上，静置4小时以上后，往混合液中按25g/L加入硅藻土或珍珠岩或二者组合作为助滤剂，采用加压过滤分离方法分离组分Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ沉淀；

第二步，分离组分Ⅳ：将第一步收集的压滤上清液，用1mol/L醋酸溶液调节pH至6.2～6.4，加入药用乙醇至乙醇的体积达到第一步收集的压滤上清液和药用乙醇混合液总体积的40％，调控温度至－5℃，搅拌2小时以上，静置6小时以上，往混合液中按20g/L加入硅藻土或珍珠岩或二者组合作为助滤剂，采用加压过滤分离方法分离组分Ⅳ沉淀；

第三步：分离组分Ⅴ：将第二步收集的压滤上清液，用pH为4.0的缓冲液调节pH至4.9～4.95，加入药用乙醇至上一步收集的压滤上清液和药用乙醇混合液总体积的40％，调控温度至－9℃，搅拌2小时以上，静置8小时以上，采用加压过滤分离方法分离组分Ⅴ沉淀；

第四步：精制纯化，采用用pH4.0缓冲液调节组分Ⅴ沉淀的pH 4.60～4.70，调控温度至－2～－3℃，静置4小时以上，深层过滤，收集过滤液进入下一工序；

第五步，超滤：将上一工序深层过滤液的用1mol/LNaHCO₃溶液调整滤过液pH为6.8～7.0，再浓缩深层过滤液至蛋白质含量22％以上，收集超浓缩液进入下一步工序；

第六步，巴氏灭活：将上一步超滤浓缩液调pH 7.0～7.2，添加辛酸钠，至每克蛋白质中添加0.14～0.18克辛酸钠，60±0.5℃水浴保温10小时。

第七步，除菌灌装，检定成品，将检定合格后产品贴签、装盒等进行包装。

上述技术方案的第五步中，超滤的具体步骤是，将第四步得到的深层过滤液用1mol/LNaHCO₃溶液调整pH为6.8～7.0，启用超滤机预浓缩控制程序，浓缩制品至蛋白浓度为100～120g/L左右，浓缩过程进液压力不超过4.5bar，回流压力不超过2.5bar，TMP不超过3.5bar，往制品溶液中添加质量分数为10％-30％的氯化钠溶液，至氯化钠溶液的体积达到制品溶液和氯化钠混合液总体积的1.0～1.5％，用体积为5倍浓缩液体积且质量份数为0.9％的氯化钠溶液透析，接着用体积为1倍浓缩液体积且质量份数为0.5％的氯化钠溶液透析，至乙醇体积含量≤0.25％，再浓缩制品溶液至蛋白质含量≥22％。

上述技术方案的第七步中，除菌灌装的具体步骤是，用装配有0.2微米滤膜的除菌滤器将第六步中巴氏灭活后的蛋白溶液进行除菌过滤，采用机器自动化灌装至每瓶50ml。

本发明采用相对温和的加压过滤分离方法，对蛋白质分子结构无影响，确保了制备出高质量的人血白蛋白；加压过滤分离方法，仅需要一台转子泵或气动泵即可提供压滤机足够的动力，操作环境温度也只需2～8℃，完全能够在低温的状态下生产，能耗低；生产过程中采用压滤机，一台过滤面积30平方的压滤机相当于20台左右的管式离心机的工作能力，单台压滤机可以实现管道相对密闭连接，制品回收彻底，本发明提高了前发明的分离组分Ⅰ+Ⅱ+ Ⅲ、分离组分Ⅳ、分离组分Ⅴ、精制纯化四步骤的pH值，使人血白蛋白收率大大提高，一般收2.9g/ml血浆以上，产品收率大大提高；本发明超滤的过程中，首次仅需要5倍浓缩液体积溶液透析，减少了超滤透析体积，减少生产中透析用注射用水的用量；能够向临床提供低铝离子含量甚至不含铝离子的人血白蛋白。

本发明在低温乙醇压滤分离工艺过程中的超滤步骤中，将蛋白溶液的pH值由4.6～4.7调至6.8～7.0，降低了蛋白溶液的粘度提升了滤过率从而提高了收率，其次缩短了超滤时间；另外蛋白溶液的pH值由4.6～4.7调至6.8～7.0接近中性使超滤过程中蛋白溶液不易变性，提高了人血白蛋白质量，首次浓缩后，钠离子含量在1.0～1.5％，先后用6倍浓缩制品重量的0.9％ NaCl溶液和0.5％NaCl溶液进行等体积透析脱盐、脱醇，透析过程进液压力不超过4.5bar，回流压力不超过2.5bar，TMP不超过3.5bar，0.9％的NaCl溶液用量为0.5％的NaCl溶液的两倍以上，用盐水透析增加阳离子交换的机率，有效降低铝离子含量，使生产的人血白蛋白铝离子含量控制在50微克/升以下，在试验过程中甚至检测到铝离子为零，大大降低人血白蛋白制品中铝离子含量，向临床提供铝离子含量低甚至不含铝离子的人血白蛋白；超滤结束后，将白蛋白溶液pH调整到7.0～7.2，有效确保了白蛋白在巴氏灭活和以后的储存中的稳定性；提高了人血白蛋白的质量。

本发明的有益效果在于：提高了以上四步骤的pH将收率由2.7g/ml血浆以上提高至 2.9g/ml血浆以上。在低温乙醇压滤分离工艺过程中的超滤步骤中，将蛋白溶液的pH值由 4.6～4.7调至6.8～7.0，降低了蛋白溶液的粘度提升了滤过率从而提高了收率，其次缩短了超滤时间；另外蛋白溶液的pH值由4.6～4.7调至6.8～7.0接近中性使超滤过程中蛋白溶液不易变性，提高了人血白蛋白质量。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，便于清楚地了解本发明，但它们不对本发明构成限定。

实施例1：

第一步，沉淀组分Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ：低温冰冻血浆融化为液体状态，加入体积份数为95％的－ 15℃药用乙醇至最终乙醇浓度至22％，同时用1mol/L醋酸溶液调节pH 6.4，血浆蛋白含量5.5％，调控温度至－5.5℃，搅拌2小时，静置5小时，往混合液中按25g/L加入硅藻土和珍珠岩二者组合作为助滤剂，采用加压过滤分离，收集压滤分离组分沉淀Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ供制备人免疫球蛋白，收集压滤上清液进入下一步工序；

第二步，沉淀组分Ⅳ：将上一步收集的压滤上清液，用1mol/L醋酸溶液调节pH6.2，加入体积份数为95％的－15℃药用乙醇至最终乙醇的体积达到上一步收集的压滤上清液和药用乙醇混合液总体积的40％，调控温度至－5℃，搅拌3小时，静置6小时，往反应混悬液中按20g/L加入硅藻土或珍珠岩或二者组合作为助滤剂，采用加压过滤分离，压滤分离组分Ⅳ沉淀供制备微量蛋白质，收集压滤上清液进入下一步工序。

第三步，沉淀组分Ⅴ：将上一步收集的压滤上清液，用pH为4.0的缓冲液调节pH4.9，加入体积份数为95％的－15℃药用乙醇至最终乙醇的体积达到上一步收集的压滤上清液和药用乙醇混合液总体积的40％，调控温度至－8℃，搅拌2小时，静置8小时，采用加压过滤分离，压滤上清液废弃或回收乙醇，收集压滤分离组分Ⅴ沉淀进入下一步工序。

第四步，精制纯化：将上一工序收集的组分Ⅴ沉淀用4％乙醇溶液溶解，用pH为4.0的缓冲液调节pH 4.60，调控温度至－2℃，静置4小时，深层过滤，收集过滤液进入下一工序。

第五步，超滤：将上一步深层过滤液用1mol/LNaHCO₃溶液调整滤过液pH为6.8，浓缩使制品溶液蛋白质含量100g/L，往制品中添加氯化钠至氯化钠含量1.0％，先用4倍浓缩液体积的0.9％氯化钠溶液连续透析，接着用2倍浓缩液体积的0.5％氯化钠溶液透析至乙醇含量≤0.25％，再浓缩制品溶液至蛋白质含量≥22％以上，超滤过程用时306分钟，收集浓缩液进入下一步工序。

第六步，巴氏灭活：将上一步超滤浓缩液调pH7.0，添加辛酸钠，至每克蛋白质中添加 0.14克辛酸钠，60℃水浴保温10小时。

第七步，除菌灌装：用装配有0.2微米滤膜的除菌滤器将上一步巴氏灭活后蛋白溶液进行除菌过滤，采用机器自动化灌装至每瓶50ml，分装收率为29.6g/kg血浆。

第八步，成品检定：灌装后制品进行14天放孵后逐瓶外观灯检，灯检合格率为99.9％，灯检合格产品按照抽样程序抽检，进行成品检定。

第九步，成品包装：将成品检定合格后产品贴签、装盒等进行包装。

实施例2：

第一步，分离组分Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ：以人血浆为原料，将低温冰冻人血浆融化为液体状态，加入体积份数为95％的－15℃的药用乙醇，至最终乙醇的质体积达到人血浆和药用乙醇混合液总体积的22％，同时用1mol/L醋酸溶液调节人血浆和药用乙醇混合液的pH至6.5，使血浆蛋白质含量5.5％，调控温度至－5.5℃，搅拌2小时以上，静置4小时以上后，往混合液中按25g/L加入硅藻土作为助滤剂，采用加压过滤分离方法分离组分Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ沉淀，收集组分Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ沉淀供制备人免疫球蛋白，收集压滤上清液进入下一步工序；

第二步，分离组分Ⅳ：将第一步收集的压滤上清液，用1mol/L醋酸溶液调节pH至6.3，加入体积份数为95％的－15℃药用乙醇至乙醇的体积达到上一步收集的压滤上清液和药用乙醇混合液总体积的40％，调控温度至－5℃，搅拌4小时，静置8小时，往混合液中按20g/L 加入硅藻土作为助滤剂，采用加压过滤分离方法分离组分Ⅳ沉淀，供制备微量蛋白质，收集压滤上清液进入下一步工序；

第三步：分离组分Ⅴ：将第二步收集的压滤上清液，用pH为4.0的缓冲液调节pH至4.92，加入体积份数为95％的－15℃药用乙醇至的质量达到上一步收集的压滤上清液和药用乙醇混合液总体积的40％,调控温度至－8℃，搅拌6小时，静置10小时，采用加压过滤分离方法分离组分Ⅴ沉淀，收集压滤分离组分Ⅴ沉淀进入下一步工序；

第四步：精制纯化，将上一工序收集的组分Ⅴ沉淀，采用pH为4.0的缓冲液的调节pH 至4.65，调控温度至-2.5℃，静置4小时，深层过滤，收集过滤液进入下一工序；

第五步，超滤：将上一工序深层过滤液用1mol/LNaHCO₃溶液调整滤过液pH为6.90，浓缩使制品溶液的蛋白质的质量含量为110g/L，往制品溶液中添加氯化钠至氯化钠的质量达到制品溶液和氯化钠混合液总体积的1.3％，先用4倍浓缩液体积且质量份数为0.9％的氯化钠溶液透析，接着用2倍浓缩液体积的0.5％氯化钠溶液透析至乙醇体积含量为0.15％，再浓缩制品溶液至蛋白质含量250g/L，超滤过程用时341分钟，收集超浓缩液进入下一步工序；

第六步，巴氏灭活：将上一步超滤浓缩液调pH7.1，添加辛酸钠，至每克蛋白质中添加 0.16克辛酸钠，60.5℃水浴保温10小时。

第七步，除菌灌装，用装配有0.2微米滤膜的除菌滤器将巴氏灭活后的蛋白溶液进行除菌过滤，采用机器自动化灌装至每瓶50ml，分装收率为29.5g/kg血浆，检定成品，将检定合格后产品贴签、装盒等进行包装。

实施例3：

第一步，分离组分Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ：将低温冰冻人血浆融化为液体状态，加入体积份数为95％的－15℃的药用乙醇，至最终乙醇的体积达到人血浆和药用乙醇混合液总体积的22％，同时用1mol/L醋酸溶液调节人血浆和药用乙醇混合液的pH至6.6，使血浆蛋白质的质量含量 5.5％，调控温度至－5.5℃，搅拌8小时，静置12小时，往混合液中按25g/L加入硅藻土或珍珠岩或二者组合作为助滤剂，采用加压过滤分离方法分离组分Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ沉淀，收集组分Ⅰ +Ⅱ+Ⅲ沉淀供制备人免疫球蛋白，收集压滤上清液进入下一步工序；

第二步，分离组分Ⅳ，将第一步收集的压滤上清液，用1mol/L醋酸溶液调节pH至6.6，加入体积份数为95％的－15℃药用乙醇至乙醇的体积达到上一步收集的压滤上清液和药用乙醇混合液总体积的40％，调控温度至－5℃，搅拌8小时以上，静置9，往混合液中按20g/L 加入珍珠岩作为助滤剂，采用加压过滤分离方法分离组分Ⅳ沉淀；

第三步：分离组分Ⅴ：将第二步收集的压滤上清液，用pH为4.0的缓冲液调节pH至4.95，加入体积份数为95％的－15℃药用乙醇至的体积达到上一步收集的压滤上清液和药用乙醇混合液总体积的40％，调控温度至－8℃，搅拌6小时，静置12小时，采用加压过滤分离方法分离组分Ⅴ沉淀，收集压滤分离组分Ⅴ沉淀进入下一步工序；

第四步：精制纯化，将上一工序收集的组分Ⅴ沉淀，采用pH为4.0的缓冲液调节pH至 4.7，调控温度至－3℃，静置12小时，深层过滤，收集过滤液进入下一工序；

第五步，超滤：将第四步得到的深层过滤液用1mol/LNaHCO₃溶液调整滤过液pH至7.0，浓缩使制品溶液的蛋白质的质量含量为120g/L，往制品溶液中添加氯化钠至氯化钠的质量达到制品溶液和氯化钠混合液总体积的1.5％，先用4倍浓缩液体积且质量份数为0.9％的氯化钠溶液透析，接着用2倍浓缩液体积且质量份数为0.5％氯化钠溶液透析，至乙醇体积含量 0.2％，再浓缩制品溶液至蛋白质含量为300g/L；超滤过程用时382分钟，收集超浓缩液进入下一步工序；

第六步，巴氏灭活：将上一步超滤浓缩液调pH 7.2，添加辛酸钠，至每克蛋白质中添加 0.14～0.18克辛酸钠，59.5℃水浴保温10小时。

第七步，除菌灌装，用装配有0.2微米滤膜的除菌滤器将巴氏灭活后的蛋白溶液进行除菌过滤，采用机器自动化灌装至每瓶50ml，分装收率为29.1g/kg血浆，检定成品，将检定合格后产品贴签、装盒等进行包装。

本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

Claims

1.人血白蛋白的制备方法，包括以下步骤：

2.按权利要求1所述的人血白蛋白的制备方法，其特征在于第五步中，超滤的具体步骤是，将第四步得到的深层过滤液用1mol/LNaHCO₃溶液调整pH为6.8～7.0，启用超滤机预浓缩控制程序，浓缩制品至蛋白浓度为100～120g/L左右，浓缩过程进液压力不超过4.5bar，回流压力不超过2.5bar，TMP不超过3.5bar，往制品溶液中添加质量分数为10％-30％的氯化钠溶液，至氯化钠溶液的体积达到制品溶液和氯化钠混合液总体积的1.0～1.5％，用体积为5倍浓缩液体积且质量份数为0.9％的氯化钠溶液透析，接着用体积为1倍浓缩液体积且质量份数为0.5％的氯化钠溶液透析，至乙醇体积含量≤0.25％，再浓缩制品溶液至蛋白质含量≥22％。

3.按权利要求1所述的人血白蛋白的制备方法，其特征在于第七步中，除菌灌装的具体步骤是，用装配有0.2微米滤膜的除菌滤器将第六步中巴氏灭活后的蛋白溶液进行除菌过滤，采用机器自动化灌装至每瓶50ml。