KR910009342B1 - 생물학적 활성 추출물의 제조방법 - Google Patents

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Description

생물학적 활성 추출물의 제조방법

제1도는 물리화학적 행동에 따라 추출물내의 물질을 분류한 도표.

제2도, 제3도 및 제4도는 본 발명 방법에 따라 제조된 여러 가지 추출물의 생물학적 작용을 나타낸 도표.

제5도는 종래의 투석방법에 따라 제조된 지라추출물을 HPLC로 특성화시킨 도표.

제6도는 본 발명 방법에 따라 제조된 지라추출물을 HPLC로 특성화시킨 도표.

제7도는 본 발명 방법에 따라 제조된 흉선 추출물을 HPLC로 특성화시킨 도표.

제8도는 제7도에 따른 추출물을 가수분해시켜 HPLC로 특성화시킨 도표.

상당한 기간에 걸쳐 기관의 추출물을 제조하는 방법이 공지되어져 왔다. 많은 발명자들이 수용액의 간단한 추출에 대부분 만족하였는데 모든 실행방법은 기관을 기계적으로 처리하는 것으로 특히 단순한 과학적인 장치에서 행해진다. 골수, 신장, 심장, 혈액등의 이식의 중요성이 증가되고 여러 가지 기관, 특히 흉선(헤스, 1968)과 같은 기관의 생물학적 작용이 인식되고 세포 면역학이 급속하게 발전된 결과 치료학적인 목적을 위하여 생물학적 활성기관 추출물을 제조하는 방법이 집중적으로 연구되었다. 제조된 생성물이 부응해야할 요구조건에 따라, 산, 아세톤 또는 알코올 같이 생물학적으로 내성(耐性)이 약한 시약들을 사용하여 제조할 수도 있다. 생성물은 이들이 대응하는 기관으로부터 얻은 물질들을 분석학적으로 정확히 규정시킨 혼합물이거나 정확히 특성화된 순수 화합물이라는 점에서 완전 추출물과는 본질적으로 다르다.

대조적으로, 본 발명은 포유동물의 기관이나 세포 배양액으로부터 생물학적으로 활성이 있으며 발연물질 및 항원이 없는 저염의 완전 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 추출물은 10,000달톤 미만의 분자량을 갖는 생물학적 활성물질들의 혼합물로 되어 있으며 특히 물 이외에는 이물질이나 부수물 또는 다른 첨가물질을 전혀 포함하지 않는다는 점에서 구별된다.

놀랍게도 본 발명자는 기관 추출물 제조시 종래의 통상적인 침전반응을 완전히 제거할 수 있으며 열전달 장치와 냉각장치를 계속적으로 작동시킨 열교환기내에서 열변성시켜 유리하게 대치할 수 있음을 알아냈다.

따라서, 신규의 방법은 다음과 같이 이루어지는데, a) 가능한한 저균상태로, 또는 세균 배양일 경우 무균상태로 처리한 출발물질을 분쇄하여 세포를 붕괴시키고, b) 분쇄되고 붕괴된 물질을 재빨리 70-90℃의 온도, 바람직하기로는 약 80℃로 가열한후 바람직한 시간이 경과하면 다시 재빨리 4-10℃정도의 저온으로 냉각시켜, 단백질 같이 내열성이 없는 물질은 침전시키는 반면 박테리아와 효모는 다시 증식할 수 없도록 불활성시키거나 중온에서 다시 활성화될 수 있게 하고, c) 원심분리하여 침전생성물을 용액으로부터 분리하고, d) 한외여과하여 용액내에 남아있는 10,000달톤보다 큰 분자량을 갖는 물질을 제거해냄으로써 항원과 내생독소를 제거하고, e) 전기 투석하여 잔류 용액으로부터 용존염 이온들을 실질적으로 제거하는 것이다.

얻어진 추출물은 본 제조방법자체로 무균이며 멸균상태이지만 필요에 따라 안전한 조처로써 상기 방법후에 무균여과를 행할 수도 있다. 지금까지 공지된 방법과는 아주 대조적으로, 물 이외에는 그 어떤 이물질도 본 발명에 따른 계에 포함되지 않았다. 특히 방부제나 화학첨가제, 예를들어 무균상태 및 발열물질이 없는 상태로 만들기위한 살균제(예를들면 아지화합물)등을 출발물질이나 여러 가지 중간물질, 또는 최종생성물에 전혀 첨가하지 않았다. 즉 얻어진 추출물은 본 제조방법에 따라 발열물질이 없으며 무균상태이다. 제조방법 도중 이물질을 첨가하지 않았으므로 환자에게 훨씬 더 안전성을 줄 수 있으며 등록권위자에 손쉬운 수입을 줄 수 있으며 제조자에게 적은 경비가 들게 할 수 있다.

특히 언급되어야할 본 발명에 따른 방법의 특성은 담체 물질과 컬럼 크로마토그래피 분리법을 사용하지 않는다는 것이다. 이러한 점에서 신규추출방법은 공지의 방법과 명백히 대조적이며 이러한 중요한 차이점이 제조생성물의 조성에도 영향을 미친다.

사실상, 추출물내에 있는 물질을 그들의 기본적인 물리화학적 작용에 따라 분류할 경우, 제조 방법에 따라 얻어진 추출물에 대해 다음과 같은 도표를 얻을 수 있다:

첨부된 도표 1에 세가지 군의 분포를 도표상으로 나타내었다.

만일 바람직하지 못한 부분을 포함하고 있는 염이온들을 세파덱스^(R)상에서 컬럼 크로마토그래피하여 제거한다면 최종 생성물내에는 A로 표시된 부분의 물질만이 남게 되며 염이온외에 B부분, 즉 모든 소수성 물질 및 심지어 닌히드린-양성물질의 일부도 제거된다. 그러나 B부분에 존재하는 물질들도 생물학적 활성이 있는 것으로 증명되었으므로 이들이 손실된다는 것은 본 방법에 의해 얻어진 완전한 추출물에 대응하는 생성물에 대하여 상당히 손해를 미치는 것이다.

게다가 컬럼 크로마토그래피는 계내에 이물질, 즉 담체를 유도시킨다. 대체로 이들은 생성물내에 박테리아를 오염시킬 위험이 있으므로 최종생성물에 발열물질을 함유시키는 반면, 본 발명에 따라 얻어진 최종생성물은 발열물질이 존재하지 않는다.

마지막으로 모든 크로마토그래피 분리법을 사용하지 않게되면 용출하는데 걸리는 오랜시간과 사용된 다량의 용출액(물)을 제거하기 위한 부수적인 작업등이 필요없게 된다.

따라서, 공지의 추출방법으로 얻은 생성물과 비교하여볼 때 처음으로 얻은 생성물이 완전한 추출물로서 생물학적 활성물질, 특히 저분자량의펩티드(〈10,000달톤)를 모두 함유하게 되며, 또한 저농도의 염을 함유하며 발열물질과 항원이 없으므로 부가조처없이 직접 투여할 수 있다.

만약 비경구적 투여를 위해 생물학적 생성물로부터 발열물질을 제거하는 데에 따르는 작업 및 어려움(예를들면, German Offenlegungsschrift 3,229,132참조)과 통상적으로 첨가하는 방부제의 여러 가지 감광성 및 해로운 효과(특히 Hagers Handbuch der Pharmazeutischen Praxis, Springer Verlag, Berlin Heielberg New York 1977, P 313)에 대해 생각해 본다면, 새로운 본 방법의 특성 및 공지의 추출방법에 대한 우수성이 여실히 증명될 것이다.

본 방법을 하기에 상세히 설명하겠다. 본 방법은 모든 종류의 유기추출물을 제조하기 위해 사용할 수 있다. 가장 중요한 출발물질은 지라, 흉선, 간, 심장, 태반, 골수 및 혈액등과 같은 기관 및 조직이다. 그러나 세포배양액, 특히 동물세포 배양액의 추출물도 제조할 수 있으며 예를들면 흉선세포, 태아 송아지신장세포, 백혈구, 잡종세포, 섬유아세포등이다. 물론 이러한 세포배양액 뿐만 아니라 적당한 배양액으로부터 세척된 세포군들도 출발물질로 사용할 수 있다.

본 방법은 출발물질의 근원 및 전처리에 어떠한 제한도 가하지 않는다. 추출물의 생물학적 활성을 물질의 특정종류 및 특정적용에 제한하지도 않는다. 본 방법에 의해 제조된 추출물은 더 이상의 단계를 거쳐 각 분획으로 분리할 수 있으며 이로부터 순수한 물질을 분리해낼 수 있다.

a) 세포를 붕괴하고 분쇄한다.

모든 경우에 있어서 기관이나 세포배양액은 저균상태나 무균상태로 엄격히 취급하기 위하여 적절히 처리되어야 한다. 동물 기관일 경우, 그것을 얻자마자 즉시 탈지물질을 형성해내기 위해 분쇄하고 붕괴하여야한다. 만일 즉시 행할 수 없을 경우, -25℃까지의 저온이나 액체질소내에서 냉각시켜 형성하기 이전까지 그 상태로 저장한다. 이 상태에서는 그 안에 함유된 박테리아와 효소는 불황성이다. 그후 동결되었건 그렇지 않았건간에 기관을 분쇄기에서 잘게 썰어 얇은 슬러리로 만든다음, 발열물질이 없는 무균의 2차 증류수를 첨가하여 1:1(무게/부피)로 희석하여 세포를 붕괴하였다.

세포 배양액의 경우, 물질의 처리 및 그에 따른 저장은 무균상태에서 행해져야 한다. 분쇄 및 붕괴는 초음파에 의해 행해지는 것이 바람직하다. 음파파쇄는 냉각하에 행해져야 하는데 약 0-10℃가 바람직하다.

b) 가열하여 단백질을 침전시킨다.

슬러리를 병류(

流)장치에서 가열한후 동일한 장치에서 다시 냉각시킨다. 이러한 장치에서 슬러리는 열-전달 매질이나 냉각매질이 흐르는 재킷(jacket)에 위치한 나사선 강관을 통과하면서 흐른다. 슬러리의 유속은 조절할 수 있다. 둥근바닥 플라스크에서 가열하는 종래의 방법과 비교하여볼 때, 본 방법은 훨씬 시간이 절약되며 재현성있는 단백질 침전을 할 수 있다. 이러한 열변성의 형태 및 방법은 실지로 많은 특정한 이익을 제공한다. 모든 입자들이 균일하게 가열되도록 한 혼합장치에 의해 그 부분들이 관내에서 일정하게 혼합되므로 가열 매질 또는 냉각매질과 생성물사이에 효율적인 급속한 열교환이 일어나게되어 원하는 양을 갖도록 계속적으로 작동시킬 수 있다.

열교환기의 모듀울(modular)조절장치는 생성물의 감수성 및 특정요구조건에 적합하도록 몇가지의 조작조건을 만들 수 있다. 즉:

-온도를 조절할 수 있고,

-잔류시간 또는 반응시간을 조절할 수 있고,

-온도를 단계적으로 증가시킬 수 있다.

이러한 조절 방법으로 생성물에 대하여 물리학적 및 생화학적으로 적합한 순환처리를 할 수 있다. 급속한 온도교환은 열변성시키는데 필요한 시간 등과 같은 작업시간을 감소시켜 둥근바닥 플라스크를 사용한 종래의 방법에 비해 75%이상 감소된다. 그 결과 시간과 에너지가 절약되어 효율성이 증가된다.

c) 침전된 물질을 제거한다.

원심분리하여 고체상과 액체상을 분리하는데 경사분리기를 사용하는 것이 바람직하다. 실험실용 원심분리기(10ℓ에 대해 2시간 정도 걸림)로는 아주 적은 양만을 분리할 수 있으므로, 전단계에서 뿐만 아니라 후단계에서도 병류장치를 사용하는 것이 특별히 바람직하다. 예를들면, Flottweg Werk의 고속경사분리기(Dr. Georg, Bruckmayer GmbH Co. KG, Vilsbiburg, Federal Republic of Germany)를 사용한다. 고체는 부산물로 유용한 반면 액상은 다음단계에서 사용한다.

d) 유공섬유장치를 사용하여 한외여과한다.

경사분리하여 정제해낸 수용액에 발열물질이 없는 멸균 2차 증류수를 부피비로 3배를 계속해서 첨가한후 한외여과한다. 한외여과는 부피비로 몇배의 물을 계속적으로 가하면서 행한다. 이렇게 여과하면 실질적인 일정조건하에서 10,000미만의 분자량을 갖는 성분들을 최적으로 얻어낼 수 있는 장점이 있다. 유속 및 압력을 조절하면 여과액에 함유되는 물질의 양 및 종류를 조절할 수 있다. 한외여과는 2.5㎡의 막표면에 각각 4개의 원통형을 갖는, 로미콘 HF 형태[Romicon Inc., Woburn(MA, USA)에 의해 제조됨]나 아미콘 형태[Amicon Corporation, Danvers(MA, USA)에 의해 제조됨]의 유공섬유 한외여과 단위에서 행해진다. 10,000달톤 보다 큰 분자량을 갖는 분자들은 모두 분리되어진다. 4℃에서 시간당 160ℓ가 한외여과될 수 있다. 계속적으로 희석하여 실질적으로 적은 분자들을 모두 여과시킨다.

이 방법의 또다른 장점은 상기의 세단계, 즉 b,c 및 d 단계를 하나의 장치에 결합시킬 수있으므로 연속적으로 생산해낼 수 있다는 것이다. 각 장치는 개별적으로 사용할 수도 있고 열교환기에 결합하여 하나의 계열로 사용할 수도 있다.

얻어진 한외여과액은 진공증류시켜 부피를 감소시킨다. 초기 부피의 1/10-1/20로 농축시키는 것이 바람직하다.

e) 전기 투석한다.

전기장내에 전위차를 적용시킨 전기투석장치(예를들어 Berghof GmbH,Tobingen, Federal Republic of Germany 의 모델 BEL II)를 이용하여 농축 한외여과액으로부터 용존 염 이온을 제거한다. 가장 적은 단순이온이 가장 빠르게 이동하므로 선택성있는 방법을 제공한다. 게다가, 분자량이 400미만인 이온만이 막을 통과한다. 탈염효과는 시간, 적용된 전위차, 막의 종류 및 추출물의 조성에 기인한다. 추출물내의 여러 가지 인자가 전기투석방법의 이론적인 바탕에 영향을 미치므로, 추출물을 탈염하는데 따른 최적조건을 측정할 수 없으며 많은 부분을 알 수 없으므로 경험을 통해서 얻어야 한다. 그러나 Cl^-및 Na⁺같은 적은 염이온들은 2시간 이내에 추출물로부터 실질적인 양이 제거된다는 것은 명백한데, Cl^-및 Na⁺이온들을 100% 탈염시키는 것이 최적조건일 필요는 없다. 왜냐하면 아미노산, 펩티드 등과 같이 천천히 이동하는 작은 이온들도 부수적으로 손실되기 때문인데 이는 생물학적 활성의 손실을 뜻한다. 전위를 명확하게 증가시킬 수 없으므로(전기 투석이 일어나므로), 특별한 장치에 따라 달라지는 기관추출물의 양을 투석시킨 후에는 극반전 및 세척에 의해 막을 청정해야한다. 또한 30-40℃의 온도에서 더 빨리 투석되며, 약 37℃에서 생성물에 차이점을 유발하지않으면서 20℃에서보다 세배정도 빠르게 투석된다는 것을 알아냈다. 온도의 증가는 이온 이동의 활성도를 증가시키는 외에도, 편광의 효율을 감소시키며 하전되지 않았거나 유기로 하전된 분자들(오염 등과 같음)이 석출되는 것을 감소시켜 이온 선택적인 막을 변형시켜준다.

이온을 제거하는데 사용된 에너지는 대부분 열로 전환되므로, 37℃의 온도를 유지하기 위해서는 아주 적은 양의 첨가에너지만이 필요하게 되므로, 생성물 제조방법에 있어서 필요한 시간이 감소되었다는 것외에 또다른 장점이 된다. 종래에 사용했던 컬럼 크로마토그래피 탈염법은 비용이 많이들며 특히 중성 pH 값에서 박테리아가 오염될 수 있는 커다란 위험성이 있으며 게다가 컬럼 크로마토그래피 탈염법에서는 여러 가지 생물학적 활성물질이 염의 분획과 함께 분리되어져 나갔다. 이것 또한 전기투석에 의해 탈염시킨 방법의 장점을 나타내고 있다.

본 발명에 따라 얻어낸 완전 추출물의 무균성, 발열성 및 항원성을 다음 방법에 따라 실험하였다.

무균성: 미국 약전 XX(1980), p878-882

유럽 약전, 2nd Edition, 1st

Supplement, 1980, p52-55

발열성 : 유럽 약전 Volume II,

Swiss Edition, p56-59

항원성: 미국 약전 XX(1980), p 688

(투석물 수정함)

추출물의 생물학적 작용은 바르부르크(Warburg)시험에서 간의 균질액의 호흡이 증가되며 가역적으로 손상된 섬유아세포 배양액의 증식이 정상화되는 것으로 알 수 있다. 임상 시험에서, 완전 지라추출물과 완전 흉선추출물은 인간의 장해받는 면역계통에 조절작용 및 정상화 작용을 나타내었다.

하기의 실시예에 따라 제조된 추출물에 대한 상기의 생물학적 작용을 표 1과 표 2 및 도표 2,3,4,에 나타냈다.

[표 1]

[표 2]

도표 2,3 및 4는 여러 가지 시험용액을 첨가한 후에 손상된 섬유아세포의 DNA 에³H-티미딘을 편입시킨 것이다. 성장기에 있어서 탄산염이 중지되면 섬유아세포는 가역적으로 손상된다.³H-티미딘 편입에 의해 측정된 바와 같이, 시험물질을 첨가하면 섬유아세포의 증식이 정상화된다.

비교 제제형 용액은 42mg/ml의 농도를 갖고 있으나 다른 모든 시험용액은 고체를 10mg/ml 로 함유한다. 비교 제제형은 부피비로 1% 및 3% 의 농도에서 실험하였으며 다른 모든 생성물은 부피비로 각각 0.2, 0.5, 1,3 및 5%에서 실험하였다.

도표 2,3 및 4에서 약자 n.a.는 첨가제를 함유하지 않는다는 것을 의미하여 US 200은 독일특허 제1,076,888호(K.-H.Jaeger)에 따른 비교 제제형을 뜻하며 placebo는 보통 포유동물의 혈액에 존재하는 10,000달톤 미만의 분자량을 갖는 물질들의 혼합물로 구성된 것을 뜻한다.

제조 생성물의 특성화

기관 추출물을 특성화시키기 위해서는 HPLC로 언급되는 고성능 액체 크로마토그래피가 매우 적절한데 왜냐하면 이 방버은 특히 개개의 물질을 잘 분리해낼 수있으며 재현성이 우수하기 때문이다. 그 결과, 서로다른 생성물의 조성상의 차이점을 비교적 쉽게 알아낼 수있다. 또한 이 방법은 특정 문제에 대해 계통을 적용시킬 수 있다. 사용된 표준조건은 다음과 같다:

완충제 : 0.01M(NH₄)H₂PO₄

이동상 A : 0.1% 농도 프로피온산에 용해된 0.01M(NH₄)H₂PO₄

이동상 B : 90% 농도 메탄올

기울기 : 0% B-95%B

시간 : 30분

유속 : 1.5ml/분. 펜 기록기: 10mm/분

파장λ: 254nm

컬럼 : RP-8(제조자: E.Merck AG, Darmstadt, Federal Republic of Germany)

이 방법을 사용하면, 독일특허 제1,076,888호에 따른 투석방법에 의해 통상적으로 또는 진부하게 얻어낸 지라추출물(도표 5)과 본 발명에 따른 새로운 방법에 의해 얻어낸 추출물(도표 6)사이의 명백한 차이점을 알 수 있다:

도표는 특히 두 지점에서 다르게 나타난다. 오른쪽부터 시작하여 도표의 시점부근에서 종래방법은 신규방법에 비해 적은 피이크들만을 나타낸다. 도표의 왼쪽 절반에 있는 세 개의 우세한 피이크는 방부제(니파긴/니파졸)를 나타내는 것이며 신규방법에는 세 개의 피이크가 전혀 나타나지 않았다.

본 발명에 따라 제조된 흉선 추출물은 본 발명에 따라 제조된 지라 추출물(도표6)과 유사한 용리곡선(도표 7)을 나타낸다. 흉선 추출물을 가수분해(6N HCl,18시간,110℃)시키자 우세한 피이크가 없어졌다(도표 8). 적당히 염색하여 분별하고 얇은 막 크로마토그래피하면 사라졌던 피이크가 닌히드린-양성물질에 기인한 것임을 알수 있다.

펩티드 함량이 신규방법에 의해 얻은 추출물내에 더 많다는 것은 등전집속법(등전점에 따라 분리함)에 의해 더욱더 증명될 수 있다. 신규방법에 의해 제조된 추출물에서는 30코마시(Comassie) 청색-양성 띠보다 더 많이 검출할 수 있는 반면 종래 방법에서는 약하게 채색된 몇 개의 띠만을 검출할 수있었다.

[실시예 1]

[흉선]

송아지 흉선 5kg을 지방 조직을 제거하고 즉시 동결시켜 -25℃에서 저장한후 분쇄기에서 잘게썰어 슬러리로 만들었다. 발열물질이 없는 2차증류수 5ℓ를 슬러리에 가한후 10분간 80℃의 병류 가열기에 넣어두어 고분자량의 성분들을 침전시켰다. 그후 원심분리(원심분리기 또는 경사분리기)하여 냉각 슬러리로부터 고체상을 분리해낸후 발열물질이 없는 물 10ℓ를 상층액(막 표면 2.5㎡, PM -10 형태 로미콘 HF 1/3s)에 계속첨가하면서 한외여과하였다. 전기투석하여 농축 한외여과액으로부터 염이온을 추출해냈다. 발열물질 및 항원이 없는 저염의 흉선 추출물을 얻어냈다.

[실시예 2]

[지라]

a) 건강한 송아지에서 금방 얻어낸 지라기관 5kg을 지방조직을 제거하여 즉시 동결시켰다. 동결된 덩어리를 분쇄기에서 잘게 썰어 균질한 스러리로 만들었다. 발열물질이 없는 물 6ℓ를 첨가한 슬러리를 3분간 병류가열기(관 길이 5m)에서 80℃의 일정한 온도를 유지하도록 하였다. 병류 냉각기에서 6분간 4℃로 냉각한후 원심분리하여 침전물을 제거하였다.

상층액에 발열물질이 없는 물 18ℓ를 첨가하면서 계속하여 한외여과(분자량〈10,000달톤)한후 전기투석하여 농축물로부터 염이온을 실질적으로 제거하였다. 모든 단계를 거친후 미생물의 성장을 알아보기 위한 시험에서 음성으로 나타났다.

b) 건강한 송아지로부터 금방 얻은 지라기관 250kg을 지방조직을 제거하여 즉시 동결시켰다. 분쇄기를 사용하여 동결된 덩어리를 균질 슬러리로 만든후 발열물질이 없는 물 250ℓ를 가하여 5분간(5분=관 내에서의 입자 잔류시간)병류 가열기(관 길이 20m)에서 80℃로 가열한 후 병류 냉각기에서 6분간 4℃로 냉각하였다. 하향 경사 분리기로 고체침전물을 분리해냈다. 수성 상층액에 발열물질이 없는 물 900ℓ를 가하면서 계속하여 한외여과(분자량〈10,000달톤)하였다. 순환식 증발기로 한외여과액을 농축하여 실질적인 무균 여과액을 만들었다. 전기 투석법에 의해 농축물을 부분적으로 처리하여 염이온을 제거함으로써 저분자량 물질의 저염 수용액을 지라로부터 얻어냈다. 닫힌계에서 본 방법을 실행하였다.

[실시예 3]

[송아지의 혈청]

금방 얻은 송아지의 혈청 6ℓ에 발열물질이 없는 물 3ℓ를 첨가하였다. 이 서스펜션을 병류 가열기에서 75℃로 가열하여 5분간 같은 온도로 유지한후 병류 냉각기에서 4℃로 냉각하였다. 원심분리하여 침전물을 제거하였다. 5.5ℓ로 된 상층액에 발열물질이 없는 물 15ℓ를 가하면서 계속하여 한외여과(분자량〈10,000달톤)하였다. 전기 투석하여 염을 실질적으로 제거하여 발열물질이 없는 무균용액을 얻어냈다. 이러한 저분자량의 혈청 추출물은 배양액내에서 가역적으로 손상된 섬유아세포의 증식을 정상화시켰다.

[실시예 4]

[신선한 송아지 혈액]

방금 얻어낸 송아지 혈액 5ℓ에 발열물질이 없는 물 5ℓ를 첨가한 후 이 혼합물을 병류 가열기에서 80℃로 가열하였다. 같은 온도로 3분간 유지한 후 이 서스펜션을 병류냉각기에서 4℃로 냉각한 후 원심분리하여 침전물을 제거하였다. 6ℓ로 된 상층액에 발열물질이 없는 물 18ℓ를 가하면서 계속하여 한외여과(분자량〈10,000달톤)하였다. 전기투석하여 염을 실질적으로 제거하여 발열물질이 없는 무균용액을 얻어냈다. 이렇게 얻은 저분자량의 송아지 혈액 추출물은 배양액에서 손상된 섬유아세포의 증식을 정상화시켰다.

[실시예 5]

[송아지의 탈섬유소 혈액]

송아지의 탈섬유소 혈액 5.1kg 에 발열물질이 없는 물 5ℓ를 가한후 병류 가열기에서 80℃로 가열하여 같은 온도로 5분간 유지하였다. 병류 냉각기에서 4℃로 냉각한후 원심분리하여 침전물을 제거하였다. 7ℓ로 된 상층액에 발열물질이 없는 물 18ℓ를 가하면서 계속하여 한외여과(분자량 〈10,000달톤)하였다. 전기 투석하여 발열물질이 없으며 무균인 저염의 농축용액을 얻어냈다. 이 용액은 배양액에서 가역적으로 손상된 섬유아세포의 증식을 정상화시켰다.

[실시예 6]

[송아지의 척수]

방금 도살한 건강한 송아지의 척추로부터 척수 5kg을 분리했다. 발열물질이 없는 물 5ℓ를 가한후 병류 교환기에서 80℃로 가열하여 같은 온도로 5분간 유지하였다. 병류 냉각기에서 4℃로 냉각한 후 원심분리하여 부피를 1/3로 만든 상층액 3ℓ에 발열물질이 없는 물 9ℓ를 가하면서 한외여과(분자량〈10,000달톤)하였다. 부피를 감소시켜 농축액으로 만든후 전기투석하여 염이온을 제거하였다. 저염용액은 발열물질이 없으며 무균이었다. 이 용액은 배양액내의 가역적으로 손상된 섬유아세포의 증식을 정상화시켰으며 골수 세포내에서 말단 디옥시트랜스퍼라제의 활성을 증가시켰다.

[실시예 7]

[대퇴골의 골수]

방금 도살한 송아지의 대퇴골 30kg 으로부터 얻은 골수 3.5kg을 슬러리로 만들어 발열물질이 없는 물 5ℓ를 첨가하여 병류가열기에서 75℃로 가열하여 이 서스펜션을 같은 온도로 5분간 유지하였다. 병류 냉각기에서 4℃로 냉각한후 침전된 지방을 용액으로부터 분리했다. 탈지용액을 원심분리하여 5ℓ로 만든 상충액에 발열물질이 없는 물 15ℓ를 가하면서 계속하여 한외여과(분자량〈10,000달톤)하였다. 전기투석하여 농축생성물로부터 염이온을 제거하여 발열물질이 없으며 무균인 저염용액을 얻었다. 이 용액은 배양액내의 가역적으로 손상된 섬유아세포의 증식을 정상화시켰으며 말단 디옥시트랜스퍼라제의 활성을 증가시켰다.

[실시예 8]

[양의 태반]

방금 얻은 양의 태반을 동결시킨 로제테(rosettes)로부터 슬러리 4,700kg을 만들어 발열물질이 없는 물 5ℓ를 가하여 병류 가열기에서 80℃로 가열하여 같은 온도로 5분간 순환시키면서 유지하였다. 그후 슬러리를 4℃로 냉각한후 원심분리하여 침전물을 제거하여 7ℓ로 된 상층액에 발열물질이 없는 물 10ℓ를 가하면서 계속하여 한외여과(분자량〈10,000달톤)하였다. 전기 투석하여 얻은 저염용액은 발열물질이 없으며 무균이었다. 이 용액은 배양액내의 가역적으로 손상된 섬유아세포의 증식을 정상화시켰다.

[실시예 9]

[흉선 세포]

방금 얻어낸 양의 흉선기관10kg 에 인산염으로 완충시킨 염화나트륨 용액(pH 7.2) 10ℓ를 가한후 고무벙(bung)을 사용하여 가는 그물코를 가진 체에서 연마하였다. 이렇게하여 기관조직으로부터 흉선세포를 떼어내고 나머지 조직성분들은 버렸다. 인산염으로 완충시킨 염화나트륨용액으로 흉선세포를 두 번 세척한후 발열물질이 없는 2차 증류수 10ℓ를 가하였다(18×10⁸세포/ml). 흉선세포 10ml를 1분간 초음파(Soniprep 150: 진폭 4, 중파)로 붕괴하고 분쇄하였다. 흉선세포슬러리에 발열물질이 없는 2차 증류수 10ℓ를 첨가하여 병류 가열기에서 80℃로 가열하고 10분후 10℃냉각하였다. 변성된 단백질과 다른 불용성 세포 단편들을 TZ-28병류 회전자(20,000rpm, 잔류시간10분)가 있는 소르발(Sorvall) 원심분리기에서 원심분리하여 분리했다. 상층액에 발열물질이 없는 2차 증류수 20ℓ를 가하면서 계속하여 한외여과(제한 한계 분자량〉10,000)하였다. 한외여과액을 2,000ml 로 농축한후 전기투석하였다. 펩티드를 포함하는 생성물은 CO₂에 의해 손상된 섬유아세포의 성장-증진 작용을 나타냈다.

[실시예 10]

[태아 송아지의 신장세포]

태아 송아지의 신장(FCK)의 상피세포를 ″최소 필수 배지″[Science 130, 432(1959)] 및 7% 태아 송아지의 혈청이 들어있는 850ml 로울러 플라스크에서 배양하였다. 연속 세포 로온(lawn)이 형성되자마자 인산염으로 완충시킨 염화 나트륨용액(pH7.2)으로 세척한후 에틸렌디아민 테트라아세테이트와 물을 넣고 고무 스크레이퍼(Scraper)를 사용하여 로울러 플라스크로부터 세포 로온을 제거한후 발열물질이 없는 2차 증류수 4ℓ를 가했다. 100ml 의 FCK 세포(4×10⁸/ml)를 1분간 초음파(Soniprep 150: 진폭 4, 중파)로 붕괴 분쇄하였다. FCK 세포 슬러리에 4ℓ의 물을 가한후 병류 가열기에서 80℃로 가열하고 10분후 10℃로 냉각하였다. 변성된 단백질과 다른 불용성 세포 단편들을 TZ-28병류 회전자(20,000rpm, 잔류시간10분)가 있는 소르발 원심분리기에서 원심분리하여 제거했다. 상층액에 발열물질이 없는 2차 증류수 8ℓ를 가하면서 계속하여 한외여과(제한 한계 분자량〉10,000)하였다. 한외여과액을 500ml 로 농축한후 전기투석하였다. 펩티드를 함유하는 생성물은 CO₂에 의해 손상된 섬유아세포의 성장-증진 작용을 나타냈다.

Claims (8)

10,000달톤보다 적은 분자량을 갖는 생물학적 활성물질의 혼합물로서 발열물질 및 항원이 없으며 생물학적 활성이 있는 무균의 저염 완전 추출물을 포유동물의 기관 및 세포 배양액으로부터 제조하는 방법에 있어서, 저균 또는 무균상태로 처리저장한 출발물질을 분쇄하여 세포를 붕괴시키고 붕괴 분쇄된 물질을 재빨리 열교환기에서 70-90℃의 온도로 가열하고 다시 재빨리 저온으로 냉각한후 원심분리하여 용액으로부터 침전 생성물을 분리시키고 한외여과하여 용액으로부터 분자량이 10,000달톤보다 큰 물질을 제거시킨후 전기투석하여 잔류용액으로부터 염이온을 제거시켜 추출물을 제조하되, 전 과정에 걸쳐 물 이외의 이물질은 함유시키지 않으며 분리과정에서도 담체물질을 사용하지 않음을 특징으로 하는 제조방법.

제1항에 있어서, 사용한 출발물질이 포유동물의 흉선, 지라, 간, 심장, 태반, 골수 또는 혈액임을 특징으로하는 제조방법.

제2항에 있어서, 출발물질이 흉선임을 특징으로 하는 제조방법.

제1항에 있어서, 출발물질이 흉선세포, 태아 송아지의 신장세포, 백혈구, 잡종 세포 또는 섬유아세포의 배양액이거나 그에 대응하는 배양액으로부터 얻은 세포군임을 특징으로 하는 제조방법.

제1항에 있어서, 세포 배양액을 초음파의 작용에 의해 분쇄하고 붕괴시킴을 특징으로 하는 제조방법.

제1항에 있어서, 30-40℃의 온도에서 전기투석함을 특징으로 하는 제조방법.

제1항에 있어서, 열처리, 침전 생성물의 제거 및 한외여과 단계를 연속공정으로 행함을 특징으로 하는 제조방법.

제1항에 있어서, 수득된 완전 추출물에 부가적으로 멸균처리함을 특징으로하는 제조방법.

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