JPH03505200A - 治療活性のある、特に傷治療または老人医学に用いる作用物質およびかかる作用物質を含む製剤の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 治療活性のある、特に傷治療または老人医学に用いる作用物質およびかかる作用 物質を含む製剤の製造方法本発明は治療活性のある、特に傷治療または老人医学 に使用される、作用物質の製造方法に関し、温血哺乳動物、特に若生または子牛 線維素を除去した血液を、パパインにより酵素加水分解して濾過し、透過物を濃 縮し、アルコール、好ましくはエタノールで処理する方法である。

哺乳動物または人の血液、もしくは血液構成分または臓器均質分から、傷治療、 細胞呼吸活性、もしくは物質代謝および成長進行特性を持つ製剤を抽出すること は、何年も前から多くの方法が知られている。これら製剤の正確な構成は、多く の場合、はっきりとは分からないが、しかし、その効果は、火傷、クルリス潰傷 などのような治療しにくい傷、あるいは大脳血行の改善などに有効であることが 証明されてきた。

この製剤の製造方法に共通した特徴は、しばしば一般に若い哺乳動物、特に若生 、子牛または馬の線維素を除去した溶血性血液から、通常の方法で、細胞物質、 ミネラル質、およびまたは、蛋白質を除去し、その全部または部分的抽出物を濃 縮し、有効製剤として処方することにある。

その蛋白除去または蛋白質の低減には、既知の方法すなわち加熱、遠心分離、濾 過により行われ、あるいは酸またはアルコールによる処理と、それに続く沈降蛋 白の遠心分離と濾過により行われる。

加熱とそれに続く濾過による蛋白除去は、ＥＰ−Ａ９５１７０に膜分離方法と共 に記されているが、そこでは膜分離方法として、約８０００ダルトン以上の分子 隔壁を持つ膜を使用して、連続多段式限外濾過が使用される。無機塩の部分的分 離には、約３００ダルトンまでの透過性を持つ膜で電気透析が実施される。

ＥＰ−Ａ　　１４０１３４には哺乳動物の内臓および細胞培養からの生物活性抽 出物を製造する同様の方法が記されているが、そこでは出発物質を細胞溶解によ り粉砕し、直ちに７０〜９０℃の温度で加熱し、冷却、遠心分離し、その溶液の 限外濾過により１０．Ｏｏｏダルトン以上の分子量を持つ物質を除去し、更にそ の溶液を電気透析により塩イオンを除去する。この方法による出発物質としては 、哺乳動物の胸腺、膵臓、肝臓、その他の内臓、また６掌血液が挙げられている 。

ＡＴ−ＰＳ　　２７４２４０では、若イ補乳動物の血液から溶血性血球、必要な 場合には、高度の乾燥体含有物への完全乾燥または部分的濃縮の後で、溜分がイ オン交換方法、吸収クロマトグラフィ、高圧泳動、高圧透析、ゲル濾過、薄膜ク ロマトグラフィ、向流分配により分離され、それにより２４５〜２４６ｍμの最 大紫外部を持つ作用物質の遊離がもたらされる。溜分分離の前に行われる濃縮ま たは乾燥の選択方法は、例えば限外濾過またはスプレー乾燥により行われること が知られている。

最後にＥＰ−Ａ　　３８５１１では、哺乳動物の内臓または体液から得られる、 生物活性により傷治療に使用される物質は、次式のグルコ−スフィンゴリピド（ 塘セラミド）に関するもので： Ｒは５個の糖グループを持つオリゴサツカライドである。ここではこの活性成分 は、０．２％ＮａＣ！水溶液を持つ哺乳類の体組織または体液の均質化、これら の均質物の遠心分離または濾過、その濾過物の限外濾過、透過物の濃縮、濃縮さ れた透過物から有機物の活性炭結合、吸着、これらの有機物の何回ものクロマト グラフィと溶解分離による精製により得られることが知られている。

これらの開発と平行して、生物活性作用物質の製造には多くの方法がある。これ らの方法では、該物質の製造に先たち、線維素除去、場合によっては、瀉血性血 液などのため、酵素加水分解、即ち蛋白分解酵素による消化が行われる。蛋白を 除去された生成物はそれから最終製剤中に組み込まれ、製品の効果を増進し改善 する。

ＵＳ−ＰＳ　　２９１２３５９では、線維素除去された溶血性血液は、蛋白分解 酵素により、加熱下で前消化され、冷却後に塩類除去の為に透析され、酸性化さ れ、それによる含有沈殿物をアルカリで中和すると作用物質が得られる。

ＤＥ−ＰＳ　　１０７６８８８では、線維素除去された若い哺乳動物の血液は酵 素分解され、およびまたは、分溜による蛋白除去の後で、脂肪族アルコールまた は酸で、高い分子量構成要素の分離に、水またはアルコールによる透析が行われ る。必要な場合には透析物は有機溶剤で分離され慎重に濃縮される。

ＤＥ−ＯＳ　　２３４９１８６では、製剤の作用を向上させるために、前述のＤ Ｅ−ＰＳ　　１０７６８８８で得られた生成物に、生理的に使用出来るヘプタミ ノール−（６−アミノ−２−メチルへブタン−２−オール）の酸付加塩を混合す ることが提案されている。

最初に記述した既知の製造方法（ＤＥ−ＯＳ　　１９４９１９５）では酵素消化 がｐＨ５〜５５で行われ、加熱により約８０℃にされ、続いて濾過により、蛋白 除去が行われる。この方法による蛋白除去は完全でなく、加熱下にババ、インの 存在で行われる。第二の蛋白除去工程が行われるが、この方法は複雑で長く、実 施が困難である。最終生成物には、液状で保存される場合に比較的高度の濁りが あり、原料血液に対する収率も十分でなく、作用物質の効果自体も望まれた使用 方法では完全ではない。

本発明は、これらの既知の方法の欠点を避けて、濁り傾向をなくし、作用物質収 率および効果を改善して、経済効果を上昇させることを課題とするものである。

本発明によれば、非溶血性血液をｐＨ６，５〜７．４で、活性パパインでパパイ ン分解させるもので、続いて反応物を冷却して反応を止め、蛋白質除去とパパイ ン除去の為に、１０，０００ダルトンまで限外濾過し、それから本質的にパパイ ンを含まない透過物を原料血液に対して１／２５〜１／３５量まで濃縮し、アル コールを混合して少なくとも２４時間冷却放置し、最後に透明濾過される。

最後に記述した既知の方法とは反対に、非溶血性血液を酵素加水分解し、溶液中 に蛋白質が存在する限りは熱処理をしない。

むしろ本発明によれば、濃縮中に加熱し、必要な場合には最終生成物の殺菌にも 加熱するが、しかし両者の場合には生成物は変化しない。

既知の方法では、費用の掛かる方法で連結されたカラム分離により、望ましくな い物質の一層の除去が行われるが、本発明ではこのことが種々の作用効果の理由 であると考える必要はない、また、既知の方法では、最終生成物の分子量分布の 最大値は約３５０〜４００の領域にあるが、本発明の方法では、本質的に３００ 以下にある。

本発明の方法による最終生成物の分子量分布は、したがって既知の各方法による ものとは本質的に異なる。このことは本発明の種々の作用効果の理由にもなる。

しかし、別の理由は、本発明による方法は出発点として本質的に非溶血性血液を 使用することであり、したがって赤血球は壊されずに保持される。血液の深冷凍 で起こる微々たる溶血は、本発明の方法では重要ではなく、最終生成物にも影響 しないことが調査により証明された。本発明による限外濾過では蛋白除去が行わ れ、分子量２０，０００以上のパパインと、ヘモグロビン（分子量５０，０００ 以上）も除去される。

蛋白質の分子量は一般には１２，０００以上であるので、アルコール添加時点で 、溶液中に蛋白質は最早存在しない。

したがって、本発明の方法では、アルコール沈殿を使用してペプチドが高度に除 去されるが、既知の方法では濁りが起きることも容易に推定される。これと反対 に、本発明による方法では、含有生成物に全く濁りを生ぜず、簡単な製造工程で あるので、溶血工程が省かれる利点がある。これはパパインによる酵素加水分解 の工程で溶血が起こり、加水分解と溶血の両方の工程が同時に起こるためと理解 される。限外濾過などを容易にさせ、反応を熱的に停止させるための水の後添加 では、本質的に多くの溶血を起こさない。

さらに、最終生成物は既知の製剤と比較して、向上した傷治療効果を示し、その 他、相対的に改善された酸素利用を達成した。特に大脳の傷治療および末梢動脈 の傷治療で、既知製剤と比較して向上した０本発明の方法によると、原料血液量 に対して驚くべき高い収率となり、最高に経済的な製造技術となる。

本発明の方法のより本質的な利点は、透明濾過された混合物が望ましい濃度で、 有利には希釈して、標準化される可能性があることである。

本発明による方法では、有利には哺乳動物の線維素を含まない血液、特に出発物 質として若生または子牛（最高３歳まで）の血液が使用される。この血液は活性 パパイン溶液で消化される。そこでは通常使用されるパパインの前処理に、蒸留 水中に懸濁され、遠心分離により万−含まれるかもしれない固形物を除去する。

通常使用されるパパインは２５．０００の分子量を持つが、分子量１０．○ＯＯ 以下の低分子量物質も含まれる。パパイン中のこれらの低分子量物質が許容濃度 に達するのを防ぐため、水懸濁液は限外濾過される。ついで濃縮液はシスティン 溶液と混合する。それによりパパインは活性化され培養溶液として使用される。

血液は場合によって冷凍して保存されるが、この場合には予め解凍され、３５〜 ４２℃の培養容器で暖められ、ＩＮのＨＯ２を加えてｐＨ６，５〜７．４にして 、培養溶液は有利には約１４〜１８時間保温される。こうして用意された培養血 液に０〜１０℃の温度の注射用蒸留水を加えて冷却され、それにより酵素分解ま たは前消化は中断され、限外濾過のために希釈される。限外濾過の前に、フィル ター保護のため、２５０μｍの六ｉさの粒子を何度も前濾過して分離する。最後 に限外濾過されるが、その間、規則的間隔をもって、トリクロル酢酸沈殿の方法 で濾過密度の調査試験が行われる。限外濾過により、実質的にすべての蛋白質は 溶液から除去される。これは５ＤＳ−ゲル電気泳動で分子量測定することにより 確認される。合目的には、限外濾過後は無菌状態で加工処理される。

得られた透過物は出来るだけ素早＜６０〜８０℃の真空蒸発機に入れられ、元の 血液容量の１／２５〜１／３３量まで濃縮される。それにより再び沈殿するので 、濾過される。しかしこの激しい濃縮により、更に後沈殿が必然的に起こる。濾 過された濃縮物に約２．５倍容量の予め冷却した９６％エタノールを混合し、有 利には冷却室を温度４〜６℃に冷却し冷却放置される。エタノールの代わりにメ タノール、プロパツール、ブタノールも使用出来る。少なくとも２４時間放置後 、望ましくは約４８時間放置の後、シュバルツバントフィルターを用いて透明濾 過される。沈殿物のあるアルコールは回転蒸発機で蒸留される。更に何度も沈殿 をシュバルツバンドフィルターおよびガラス繊維予備フィルターで透明濾過され る。

アルコール沈殿の前の強度の濃縮により、相当量の注射用の新鮮な水で希釈する ことにより、約２ｏ○ｍ　ｇ　／　ｍρの乾燥重量調節が可能になる。

生成された作用濃縮物は、殺菌濾過され、さらに限外濾過され、最後に滅菌瓶に 詰められる。一般にアルコールが除去されたとき病原菌除去を考慮して殺菌濾過 が常に行われる。透明濾過は沈殿物除去のために行われる。

アルコール沈殿前の限外濾過により、多量のアルコール導入による不経済性が避 けられる。操作は常に簡単であるから経済的である。

アルコール沈殿により、最終生成物中に凝集沈殿または濁りを生じる原因となる ペプチドが溶液から高度に分離される。そのため液状製品は非常に安定で、医薬 最終製品中でいかなる後沈殿も起こさず、高温例えば１２０℃でオートクレーブ 処理されても沈殿を起こさない。

元の血液容量の少なくとも１／２５〜１／３３量までの濃縮は、アルコール沈殿 の後、製品をそれ以上濃縮しないために行われる。従ってアルコール沈殿の後は 、単にアルコールを蒸発させ、塊は相当する乾燥重量について希釈される。

１０．０００以上の分子量を持つ分子を沈殿させないため、ＳＤＳゲル電気泳動 を使用しての分子量測定にも拘わらず、信頼性のある清潔な殺菌と、発熱源のな い最終生成物を保つために、結論として更に２度目の限外濾過を実施することが 有利である。この際、収率の低下は見られない。

作用物質または希釈されたアンプル溶液を長期に貯蔵する際、アルコール沈殿の 中間処理がないと、ペプチド凝集物による濁りと沈殿が起きるが、その時期は５ ０℃で溶液を揺り動かすかまたは５℃の冷蔵庫で数日間溶液を貯蔵冷却すること によって短縮されることがわかった。もしも限外濾過がアルコール沈殿の後でな されるなら、上述の濃縮に拘らず、作用物質の濁りない安定した積極的効果は最 早確認されない。

沈殿傾向を確認する可能性は、生成した製品を１２１℃でオートクレーブ処理す ることにある。アルコール沈殿の実施をしないと、２．３日から１週間後に濁り が生じる。

本方法の一層の有利性は、パパインによる前処理と限外濾過による蛋白除去によ り製品を非常に安定に保持し、市販製品と比較して本質的に高度の収率で、同量 の血液から活性物質を得られることにある。

既に述べたように本発明の方法により製造された製品では、分子量分布が、本質 的に既知の方法で製造された製品と区別される。これは比較試験で確認されたが 、そこでは比較製品として次の製品が使用された； 比較製品工：層殺に適した雌牛の血から得られた市販の蛋白および発熱源のない 製品 比較製品■；本質的にＤＥ−ＰＳ　１０７６８８８の方法により製造された市販 の製品 比較製品ｍ、ＤＥ−○５１９４９１９５による方法で製造された製品 友迭二 カラム：　ＴＳＫ２０００ＳＷ、　０．７５　ｘ６０　Ｃｍ前カラム；　Ｍｅｒ ｃｋ　Ｈｉｂｅｒ　＋００　Ｄｉａｌ、　０．４　Ｘ　２５　ｃｍ試験容ｊｉ； 　２０μ氾 ポンプ、ＬＫＢ２１５０　　ＨＰＬＣポンプ、レオダインインジェクター付き 流　　　量；０．５ｍρ／ｍｉｎ、　　　　。

光度計；　ＬＫＢ２１３８　Ｕｖｊｃｏｒｄ　Ｓ、　２８０ｎｍ記録計；Ｓｅｒ ｖｏｇｏｒ　　Ｓ、３０ｃｍ／ｈ分子量標準　； チロシン　　　　　　　１８１．１９　　４９．６結果は図１に本発明による製 品（ＩＶ）の測定結果を比較して示す。この図では、保持時間ＲＴの関連で完全 な吸収Ａ　Ｆ　Ｓ　（ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｆｕｌｌ　５ｃａｌｅ）が示され る。

比較製品工および■は、それぞれ４７．８または４８．２分の保持時間で、少数 の主最大値のみが示される。これは３５０〜４００の大体の分子量に相当する。

比較製品工は４９．３分および５６．１分（ＭＧ２００またはＭＧ＜１００に相 当）の保持時間での肩部を示す。これに反して比較製品■はＲＴ５６．２　＜＝ ＭＧ＜１００）でのｆ部のみである。実験で全ての検知出来る物質は、ＭＧ＜１ ００からＭＧ　〜２．５００の領域で現れる。これに反して比較製品■は二つの 主最大値、一つはＲＴ＝４８．４分（ＭＧ〜３００）にあり、もう一つはＲＴ＝ ５２．４分（ＭＧ＜１５０）にあり、更により低いＭＧ領領域＜１００）に第三 の肩部がある。

本発明による製剤（ｒＶ）は、本質的に既存の物質と区別され、三つの明らかな 最大値を示す、そこで最初の最大値は、前に述べた製剤より低い分子量領域、す なわち約ＭＧ２００にある。これは選択的に追加のアルコール沈殿に至る。別の 二つの最大値はＭＧ＜１５０およびＭＧ＜１００に見出だされる。それ以外は、 本発明による製剤では低分子量領域では肩部がないが、これに反してより高分子 量領域ではＭＧ５００およびＭＧ３００に二つ見られる。

比較製品工およびＨの曲線中で、最大値の左に現れる隣の最大値は、保存剤によ り起こるもので、従って、その時々の製剤には依存しない。

正確な測定結果は次の表１に集約される；表１ 保持時間（分）　大体の分子量 比較製品Ｉ　　　　　４７．８　　　　　　３５０〜４００比較製品ＩＩ　　　 　　４８．２　　　　　　３５０比較製品ＩＩＩ　　　　　４８．４　５２．４ 　　　３００１５０本発明による製剤ＩＶ　　４９．６５２．０５６．２　２０ ０１５０　＋００ヱーヨｌ脛− 保持時間（分）　大体の分子量 比較製品Ｉ　　　　　４９．３５６．１　　　　１００〜２００２００比較製　 　　　　５６．２　　　　　　１００１こよ　　知できる　　　の 保持時間（分）　大体の分子量 比較製品Ｉ　　　　　　４３．０〜５８．５　　２５００〜＜　］００比較製品 ＩＴ　　　　　　４０．４〜５９．２　　２７００〜＜１００比較製品ｍ　　　 　　　３９．８〜６７．２　　３０００〜＜１００本発明による製剤■３９．５ 〜６３．５　　３０００〜＜１００本発明により製造された製品は、その後に治 療効果の観点から、種々の試験および検査列で試験される。

正確な検査条件は後に記載される。

製剤の作用効果の検査では、人の腺維芽細胞のＤＮＡ中の３Ｈチミジンおよび肝 細胞との関連で示され、本製剤は既知製品と比較して、腺維芽細胞および肝細胞 に拘らず、本質的に強い（５〜１０倍）成長効果を持つ。

このため、本発明により製造された製剤を用いて、雌牛胎児血清の養分摂取によ り損なわれやすい、人の包皮腺維芽細胞の再生作用を試験した。

結果として、本発明による製剤は、傷ついた人の腺維芽細胞において、ＤＮＡ合 成の増加に明らかに再生的に作用し、その際、既知製品の場合と同様に、阻止領 域と濃度領域があることが判明した。

この検査の為に、種々の量を持つ８〜１ｏパツセージ中の人の包皮腺維芽細胞を 、本発明による製剤および既知の比較製品工に混合し、ＤＮＡ中の３Ｈチミジン 組込みについて測定した。

細胞にストレスを与える為に、プロットした後、先ず、１／２から２／３の交会 をして増殖放置された。

それから、一つの本質的培地成分である、雌牛胎児血清を添加しない人の培地中 で６〜９時間培養した。

それから、ごく少量の雌牛胎児血清を含む培地、本発明の製剤での増量ならびに 比較製品工での！Ｈ表示チミジンについて、培地交換させた。

これらは１２〜２４時間培養され、細胞の相応処理の後で、ＤＮＡ部の放射活性 が測定された。

図２の添付線図は結果をグラフの形で示すものである。実線は本発明による製品 での測定曲線を示し、細線は既知製品での結果を示す。

横軸は製剤添加量がマイクロリッターで示され、縦軸には放射性表示量が与えら れる。

同様に雌牛胎児血清の脱離により損なわれる、人の肝細胞での再生作用の測定に より、ＤＮＡ合成の増加と共に、既述の有効作用が示された。

検査方法は先に述べた腺維芽細胞の場合と相応するが、未処理のコントロールに 対しては完全な上昇が測定された０図３に本発明による製剤についての測定結果 を示す。

肝細胞の細胞呼吸の上昇検査では、均質化の後で比較的少量または比較的高度の 自己呼吸が示され、新しい製剤が既知の比較製品より強力な活性を引き出す能力 があることを示している。

最大呼吸上昇の領域では、両製品が比較できる範囲で作用している。ここでの測 定は既知のワールブルグ方法（ＧＢ−ＰＳ　　８２４３７５に記される）に従っ た。

次の表では、種々の肝臓均質化物の３項目についての測定結果が示されるが、そ こでは既知の比較製品工との比較が、製剤添加なしての測定と対照して実施さ酸 素消費、μβ　　　　　酸素消費の増加若牛血液抽出物には、細胞活性を高める 因子を含む、（例えば部分的に活性化され、損傷した腺維芽細胞または細胞増加 、ミトコンドリアの酸素消費）。これらの細胞活性効果は、例えば傷治療の範囲 で望まれたものと見なされる。

これに反して、望ましくないものは、新生物細胞の活性化であるが、検査では、 既知の比較製品工と比較して、本発明による製剤が、潰瘍細胞（マウスの腹水症 潰瘍細胞）の酸素消費を活性化しなかった。これは次の実験で追試される。そこ ではマウスの腹水症潰瘍細胞の酸素活性が、本発明による製剤ならびに比較製品 工を投与した後で検査された。

酸素消費量の測定： 方法；クラーク電極懸濁緩衝液 Ｎａｚ　ＨＰＯ，０，０４ｍｏ１２／Ｊ２ＮａＣＪ２　　　　０．０８　　ｍｏ ｆｌ／ＡＭｇＣｊ２ｚ　　　　ｏ、００５ｍｏｆｆ／Ｊ２ｐＨ７，４（３ｍｊ２ ／にａｍｍａｒ）腹水症潰瘍細胞、　）ＩＯＲＮＹＫＩＥＷＩＣＳおよびＳＡＴ ＫＥＥＩＣＨＬＥＲ（Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ　６．１９ ５６）０．１または０　、０５　ｍ　１２　／　Ｋａｍｍｅｒ本発明による製剤 ；注射用溶液、４０ｍｇ乾燥重量／ｍｆ２（０，２ｍｎ／Ｋａｍｍｅｒ） 比較製品工　　　；アンプル、市販製剤（０、２ｍ　Ｊ２／　Ｋａｍｍａｒ） 図４では、本発明による製剤（ＩＶ）ならびに比較製品（Ｉ）の結果をグラフで 示す０本発明による製剤（ＴＶ）では６個の測定点から中間値を取り出し、比較 製品（Ｉ）では４個の測定点から中間値を取り出している。

比較製品（Ｉ）に対して本発明による製剤（ＩＶ）ではマウスの腹水潰瘍細胞の 酸素活性（細胞呼吸）が上昇しないのみでなく、酸素活性の低下さえ生じる。

特に驚くべきことは、本発明による製剤を、末梢血管不全患者の老人に投与した 場合、４週間の治療で、微光振動数解析による明らかな改善が見られ、さらに評 価点から得られた医者の印象と老人症評価経過からは、ただ神の保護のみと考え られた。

新しい患者での末梢血管不全の精神病理学的随伴現象の症候治療でも特記すべき 効果を示した。

さらに、本発明により製造された製剤の実際上酸素代謝の増加がどの程度あるか を知るため、ワールブルグ方法で検査をした。その際本発明による製剤と２個の 通常市販製品（比較製品工および■）とを比較した。

全ての３個の製剤で、ラット肝細胞均質化物において明らかな呼吸増加が確認さ れ、そこで活性細胞構成要素の量およびまたは状態に関して、１種の既知製剤と 本発明による製剤の比較試験の結果は、本発明による製剤が明らかに優れ、他の 公知製剤では２０％まで低下した。

これは最初の既知製剤と比較して、本発明による製剤は４倍、第二の既知製剤と は１．４倍の作用物質収率が、等量のもとの血液から得られることがわかる。

最後に、人為的な酸素欠乏は除外して、ひひの脳血管流量または末梢動脈血流（ 大腿部動脈）の測定がなされた。この測定では、脳血管流量または動脈流（特に 脚部）への薬の評価が認められたモデルを置いて影響が表現された。（Ｍｅｙｅ ｒ　Ｊ、　Ｓ、、　Ｉｓｈｉｋａｗａ　Ｓ、、　ＬｅｅＴ、に、、　　Ｊ、Ｎｅ ｕｒｏｓｕｒｇ、　　２１．　５２４．Ｃ１９６４））本発明による製剤（■） （注射溶液として静脈注射、体重ｋｇ当たり４ｍΩ）は、既知製剤工　（注射溶 液として静脈注射、体重ｋｇ当たり４ｍβ）に対して、ひひの末梢血流としての 脳に、明らかにより強く　・促進することが比較試験で示される。

測定結果は、図５に脳血流として示され、末梢動脈血流については図６に示され る。

もう一つの心臓循環パラメータ（血圧、心拍、脈管抵抗）は変わらないか、ある いは微々たるものにすぎないので、本発明による製剤は既述の血流領域で特殊な 薬理作用をする。

本発明による製剤は既知の方法で注射溶液、錠剤、糖衣錠、傷軟膏、シェリーと しての治療用に加工できる。本発明による製剤、特に傷治療または老人治療製剤 には、この濃縮物を含み、必要な場合はその乾燥物として既述の方法で製造され る。

次に本発明による製剤の正確な製造と検査方法およびその結果ついて述べる。

パパイン前処理とその活性：パパインの前処理は、不溶物質を除去することと、 低分子量物質（ＭＧｌｏ、０００以下）を作用物質濃縮物から到達するのを避け ることに有用である。

２００ｇババイオチン（エクストラクトヘミ−社製／活性；８０Ｅ／ｍｇ）を１ ２の蒸留水に懸濁させ、続いて遠心分離する。（遠心分離機；　５ｏｒｖｅ　１ １ＲＣ−３，ｏ−ター、ＨＧ−４Ｌ、３０００ｒｐｍ。

２０ｍ１ｎ、） 限外濾過（溶液中に１０ミクロン以上の粒子があってはならない）のための前濾 過：シュバルッバンドフィルター、または円形フィルター５９５、ガラス繊維製 前フィルター（ザルトリウス社製）、８μｍ膜フィルタ−（ザルトリウス社製） 限外濾過；装置、ベリコーンカセットシステム、ミリボール社製ＮＭＧＧ　：　 １０，０００゜遠心分離後で、前濾過への試験用容量、０．７７ｔ２゜濃縮物容 量；ｏ、　３ｓｆ２゜ 液流量　　；６０ｍβ／分 濃縮物はシスティン溶液（０，６２℃の蒸留水中に３ｇシスティン）でＩ！２に 希釈＝活性パパイン溶液（＝培養溶液） 本発明による新しい作用物の製造は次の工程で行わ回転により線維素除去した、 若生（３年齢までの）または子牛の血液１００℃。

活性パパイン溶液工β。

ＨＯ２ＩＮ エタノール９６％ 注射用蒸留水。

培養： 解凍された血液は培養機で３７℃に暖められ、ＩＮＨＣΩでｐＨ７，０に調整す る。それから培養液を添加し、１４〜１８時間培養される。こうして出来た培養 血液は蒸留水で１：１に希釈し、前濾過してから限外濾過される。

前濾過： 粒子の大きさ二４５０μｍ 装置ニア個の濾過層のある円盤型濾過装置５ｅｉｔｚ　　５ｕｐｒａ　　３００ ゜限外濾過； 装置；ミリボール　ウルトラフィルター。

濾過面積：　４．６ｍ”、ＮＭＧ　　１０，０００出発容量：〜２００β、液流 量；〜０．７で７分濃縮物は３Ｑβの蒸留水で６０４まで希釈し、さらに〜２０ 〜２５ｆ２滞留（Ｒｅｔｅｎｔａｌ）まで濾過される。

全濾過容量；２０５〜２１０β。

３０．１００．２００℃毎に、透過物はＴＣＡ沈殿試験（ネガティブでなければ ならない）により、濾過密度の検査をそのつど行う。

蒸発機による濃縮： 限外濾過されたものは可及的速やかに６ｏ〜８０”Ｃの蒸発器に入れ、３〜４℃ まで真空濃縮する（原料血液当たり１／２５〜１／３３に濃縮）、そこで激しく 沈殿するので、それをシュバルッバンドフィルターで濾過する。後沈殿する確率 を減らすために高度に濃縮する。

エタノール沈殿； 濾過された濃縮物は２．５倍量（１０β）の冷却９６容量％エタノール中でかく はんし冷却放置する（冷却室温度；４〜６℃）、４８時間の放置後に透明濾過す る。

使用フィルター；シュバルッバンドフィルター、ガラス繊維、前フィルター（ザ ルト リウス製）。

沈殿に使用したエタノールは回転蒸発機で蒸留される。さらに沈殿が生じるので 、この場合シュバルッバンドフィルター、ガラス繊維前フィルターで透明濾過を 繰り返す。

エタノール沈殿前の激しい濃縮を経て、相当型の注射用に必要な清水で希釈する ことにより２００ｍｇ／ｍｆ２にもう一度乾燥重量調整をする。

出来上がった作用濃縮物は殺菌フィルターを通しく０．２ミクロン膜フィルタ− 、ザルトリウス製）、もう一度限外濾過しくＮＭＧＧＩｏ、０００）、最後に滅 菌瓶に充填される。この作用濃縮物はアンプル、浸剤、錠剤、糖衣錠、カプセル 、軟膏、シェリーなどの出発原料となる。有利な剤形は粉末または顆粒で、ハー トまたはソフトカプセルに充填される。

実施例１ １０Ωの牛血を層殺場で回転により線維素除去をする。線維素片は篩で濾過され た。血液は小分量で（４〜５ｆ２）凍結され、再加工の前に短時間で解凍される 。培養にはＨＣΩでｐＨ７，０に調整され、２０ｇの前処置した活性パパインを 混合し、３７℃で１５時間回転放置する。パパインの前処理には通常市販のパパ イン（例えばババイオチン、エキストラクトヘミ−製、８０．○○○Ｅ／ｇ）を 使用する。２０ｇの通常市販のパパインを２００ｍ１２の蒸留水中に懸濁させ、 続いて遠心分離する。その溶液には〉１０μｍの粒子があってはならない。限外 濾過により５０ｍ℃濃縮物まで濾過され、最後に活性化パパインはシスティン溶 液（１５０ｒｒ＋Ｊ２蒸留水中に３００ｍｇシスティン）で２００ｍ℃まで希釈 する。これはそのまま限外濾過は受入れられない。希釈された血液は１０ｆ２の 冷却された蒸留水中で攪拌される。希釈された血液は限外濾過する為に、７個の 濾過層のある円盤型濾過装置で前濾過され、最後に１．Ｏ，ＯＯ○ダルトンの分 子量境界のある限外濾過され、３６０ｍｆ２に濃縮される。濃縮により沈殿した 物質はシュバルツバンドフィルターで濾過され分離される。蛋白質を除去した濾 過物は９００ｍ℃の冷却された９６％エタノール中で攪拌され、７℃の冷蔵庫に 貯蔵される。蛋白質の除去されたことの追試はトリクロル酢酸を用いて迅速試験 される。少なくとも４８時間の放置後、沈殿物は濾過され、回転蒸発機でアルコ ールを除去する。

この含有製品は殺菌した、発熱源のない水で、２００ｍｇ／ｍ℃の乾燥物質含有 量に希釈され、無菌の滅菌された瓶に充填される。

分析データ； ｐＨ値　：６．１ 密度（ｇ／ｍｌ）；　　　　１．０７６０塩化物　；　　　　　２．５６ｇ／ｋ ｇ血ナトリウム、　　　　　　　　１．９４ｇ／ｋｇ血カリウム　＋　　　　　 　　０．１６ｇ／ｋｇ血収　　　率　　；　　　　　　　　　１０．９　　　ｇ ／ｋｇ血浸透圧（ｍｏ　ｓｍ／ｋ　ｇ）：３．　１１０活性（ワールブルグ）： ＋３２．１％ （標準物質との差） ＳＤＳ電気泳動；ＭＧ＞１０．ｏｏ○の物質を含まない。

実施例２ ５０リツトルの牛血を層殺場で回転により線維素除去をする。線維素片は篩で濾 過された。血液は直ちに実施例１のように処理された。

分析データ； ｐＨ値：６．Ｑ 密度（ｇ／ｍ！２）；　　　　１．０８４０塩化物　、　　　　　２．２８ｇ／ ｋｇ血ナトリウム、　　　　　　　　１．６０ｇ／ｋｇ血カリウム　；　　　　 　　　０．１４ｇ／ｋｇ血収　　　率　　、　　　　　　　　　　８．３ｇ／ｋ ｇ血浸透圧（ｍｏｓｍ／ｋｇ）＋３．７２５活性（ワールブルグ）　　　；＋３ ５．８％（標準物質との差） ＳＤＳ電気泳動、ＭＧ＞１０，０００の物質を含まない。

実施例３ １０℃の牛血を層殺場で回転により線維素除去をする。線維素片は篩で濾過され た。続いてＨＣβでｐＨ７，１に調整され、実施例１のように２０ｇの前処理し た活性パパインと共に３７℃で１４時間培養し、培養液は蒸留水で１＝１に希釈 された。全ての１０ミクロン以上の粒子の除去は、白金フィルターで前濾過し、 続いて１０．０００ダルトンの分離境界のある限外濾過される。蛋白質を除去し た限外濾過物は（追試は、トリクロル酢酸を用いてされる）回転蒸発機で約３５ ０ｍ℃に濃縮され、９００ｍ℃のエタノールを混合し、４８時間冷蔵庫に貯蔵さ れる。沈殿物は濾過して除去し、アルコールは回転蒸発器で蒸留する。この濃縮 物を４００ｍ℃に希釈し、殺菌濾過し、無菌の滅菌された瓶に充填する。

分析データ； ｐＨ値；　　　　６・１ 密度（ｇ／ｍρ）；　　　　１．０９１２塩化物　；　　　　　１．６８ｇ／ｋ ｇ血ナトリウム、　　　　　　　　１．１９ｇ／ｋｇ血カリウム　、　　　　　 　　０．１１ｇ／ｋｇ血収　　　率　　、　　　　　　　　　　６．０　　　ｇ ／ｋｇ血浸透圧（ｍｏｓｍ／ｋｇ）；３．６３５活性（ワールブルグ）　　　； ＋２８．３％（標準物質との差） ＳＯＳ電気泳動：ＭＧ＞１０．０００（７）物質を含まない。

実施例４ １０βの線維素除去した生血をＨＣｌ２でｐＨ６，５に調整し、実施例１のよう に２０ｇの前処理した活性パパインと共に室温で１８時間培養し、続いて希釈せ ずに限外濾過した。蛋白質を除去した限外濾過物は回転蒸発機で３０ｏｍｆ２に 濃縮し、ｏ、７５βのエタノ澱物は遠心分離または濾過して分離し、アルコール は回転蒸発機で蒸発した。この濃縮物は殺菌された発熱源のない水で２００ｍｇ 乾燥物／　ｍ　ｆ２に希釈し、滅菌された瓶に充填した。

実施例５ 実施例１から４に応じて製造された濃縮物は注射用蒸留水で４０ｍ　ｇ　／　ｍ βに希釈し、さらにｐＨ値を６．９に追試調整し、ＭＣｌ０．０００の分離境界 のある限外濾過で発熱源を含まないように濾過した。

この注射溶液は無菌条件で、２ｍ℃、５ｍ℃または１０ｍ℃アンプルに充填した 。

実施例６ 実施例１から４に従って製造された濃縮物は注射用蒸留水で５０〜７０　ｍ　ｇ 　／　ｍ　１２の乾燥物含有量に調整し、冷凍乾燥された錠剤を製造した。その 中には：５００、Ｏｇ　　凍結乾燥された濃縮物１．９８７．５ｇ　　メチルセ ルロース１２．５ｇ　　ステアリン酸マグネシウムを混合し、２５０ｍｇ錠に打 錠した。凍結乾燥した濃縮物は極度に吸湿性なので、打錠は乾燥された室内空気 （関係湿度２０％以下）のもとで実施しなければならない。核は唾液抵抗性のあ る白いフィルムで覆われ、その中の７５０ｇの核のために次の構成から成る３０ ０ｇのスプレー溶液でスプレーする；１２．０ｇ　　オイドラギッドＥＩＯ○１ ．５ｇ　ポリエチレングリコールｓ、ｏｏ。

９１．８ｇ　　オハスプレイ白、Ｋ　　１−７０００（５０％固形物含有、カラ コン社製） ９７．５ｇ　　イソプロパツール ９７．５ｇ　　メチレンクロライド 実施例７ 実施例１から４に従って製造された濃縮物は、９８％メチルセルロースと２％ゼ ラチンから成る１ｋｇの顆粒に、非常にゆっくりとスプレーされた。

そうして得られた顆粒は乾燥機中で６０℃の循環空気で少なくとも１８時間乾燥 された。残留水分が最大０．５％に到達した後で、顆粒に０．５％のステアリン 酸マグネシウムを混合し、２５０ｍｇ錠剤に打錠された。錠剤は実施例６と同様 に被覆された。

実施例８ 実施例１から４に従って製造された作用物質濃縮物の乾燥物含有量を持つ、ｓ　 ｍ　ｇ　／　ｇのゲルからの傷用シェリーの製造には： １、　　７５．０ｇ　メチルセ／Ｌ１０−ス４０００　ｃｐｓ２、　　２１０． ０ｇ　　プロピレングリコール３、　　　９０．０ｇ　　ポリエチレングリコー ル４、　　１２０．０ｍ１２作用物質濃縮物５、　　　　４．５ｇ　　パラヒド ロキシ安思香酸メチルエステル ６、　　　０．９ｇ　パラヒドロキシ安息香酸プロピルエステル ７、　　２，４９６ｇ　　蒸留水 以上のようにゲルが調整され、そこでは１．２．３から分散液が製造される。こ れを１，８００ｍβの熱水相（その中に５．６が溶解される）中に混合する。

残りの水で作用物質濃縮物を希釈し、殺菌濾過し、そのゲルを５０℃の冷却温度 で攪拌する。

補正書の駐訳文提出書（特許法第１８４条の８）。

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．温血哺乳動物、特に若生または子牛の線維素除去血液を、パパインにより酵 素加水分解してろ過し、透過液を濃縮し、アルコール好ましくは、エタノールで 処理する方法であって、非溶血性血液を活性パパインによりｐＨ６．５〜７．４ にて加水分解し、ついで冷却により反応を中止し、脱蛋白とパパインを除去する ため１０，０００Ｄまで限外ろ過し、さらに実質的に蛋白を含まない透過液を、 当初の血液に対して１／２５から１／３５に濃縮し、アルコールと混合し、少な くとも２４時間放置し、最後に透明にろ過することを特徴とする治療活性のある 、特に傷治療または老人医学に用いられる作用物質の製造方法。
2. ２．透明にろ過した混合液を蒸留水で所定濃度例えば２００ｍｇ／ｍｌに希釈す る請求項１に記載の方法。
3. ３．透明にろ過した混合液から、好ましくは蒸発によってアルコールを除去する 請求項１または２に記載の方法。
4. ４．好ましくは０〜５℃の冷蒸留水で希釈して反応を中止する請求項１ないし３ のいずれかに記載の方法。
5. ５．希釈が約１：１の範囲で行われる請求項４に記載の方法。
6. ６．限外ろ過の前に、５０μｍ以上の粒子を分離するための前ろ過を行う請求項 １ないし５のいずれかの項に記載の方法。
7. ７．透過液の濃縮が真空蒸発器内で６０〜８０℃の温度で行われる請求項１ない し６のいずれかの項に記載の方法。
8. ８．アルコール添加前に、再度ろ過が行われる請求項１ないし７のいずれかの項 に記載の方法。
9. ９．アルコール添加が添加により生じる混合物の約６５〜８０容量％、特には約 ７０容量％添加される請求項１ないし８のいずれかの項に記載の方法。
10. １０．混合液が４〜６℃で放置される請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
11. １１．パパイン加水分解のため、パパインが分子量１０，０００以下の物質の限 外ろ過によって開放され、システインによって活性化される請求項１ないし１０ のいずれかに記載の方法。
12. １２．パパイン加水分解が、１４〜１８時間、約ｐＨ７、温度約３７℃で行われ る請求項１ないし１１のいずれかの項に記載の方法。
13. １３．アルコール沈殿後２４〜５５時間特には、約４８時間放置される請求項１ 〜１２のいずれかの項に記載の方法。
14. １４．透明にろ過された混合液が希釈後再度滅菌ろ過または限外ろ過される請求 項１ないし１３のいずれかの項に記載の方法。
15. １５．請求項１ないし１４の方法によって製造される、特に創傷治療または老人 医学に用いる作用物質。
16. １６．請求項１ないし１４に記載の方法によって製造された濃縮物が注射液、錠 剤、糖衣錠または傷軟膏または傷ゲルに加工されることを特徴とする特に創傷治 療または老人医学用、治療薬剤の製造方法。
17. １７．請求項１ないし１４いずれかに記載の方法によって作られた濃縮物を含む 治療製剤特に創傷治療剤または老人医学製剤。