RU2067866C1 - Способ получения ингибитора клеточной пролиферации - Google Patents
Способ получения ингибитора клеточной пролиферации Download PDFInfo
- Publication number
- RU2067866C1 RU2067866C1 RU93014666A RU93014666A RU2067866C1 RU 2067866 C1 RU2067866 C1 RU 2067866C1 RU 93014666 A RU93014666 A RU 93014666A RU 93014666 A RU93014666 A RU 93014666A RU 2067866 C1 RU2067866 C1 RU 2067866C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- filtrate
- hours
- ultrafiltration
- cells
- stabilizer
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Способ получения ингибитора клеточной пролиферации используется для получения высокоактивных лекарственных препаратов. Способ включает в себя гомогенизацию лимфоидных тканей животных, водную их экстракцию, очистку ультрафильтрацией на мембранах со средними размерами пор
Description
Изобретение относится к медицине, а именно к способам получения ингибиторов клеточной пролиферации.
В настоящее время в качестве клеточной пролиферации наибольшее применение получили цитостатики [1]
Недостатком препаратов является наличие многочисленных побочных эффектов, связанных с нарушением иммунного статуса.
Недостатком препаратов является наличие многочисленных побочных эффектов, связанных с нарушением иммунного статуса.
Известно получение ингибитора клеточной пролиферации путем обезвоживания и обезжиривания лимфоцидных тканей млекопитающих с последующей экстракцией водой и лиофилизацией. Препарат угнетает лейкозные клетки, при этом оказывает слабое стимулирующее действие на нормальные [2]
Прототипом заявляемого изобретения является усовершенствованный метод получения препаратов из лимфоидных тканей (селезенки), заключающийся в том, что перед извлечением селезенки в организм водят циклофосфат или иные препараты, разрушающие ткань [3]
Недостатками прототипа являются невозможность получения высокоселективного препарата, нетехнологичность процесса получения.
Прототипом заявляемого изобретения является усовершенствованный метод получения препаратов из лимфоидных тканей (селезенки), заключающийся в том, что перед извлечением селезенки в организм водят циклофосфат или иные препараты, разрушающие ткань [3]
Недостатками прототипа являются невозможность получения высокоселективного препарата, нетехнологичность процесса получения.
Проблема получения более эффективного препарата за счет более технологического способа решается путем, предложенным авторами.
Способ включает в себя гомогенизацию измельченных тканей, экстракцию их водой при 4-10o в течение 16-20 часов с последующим отделением нерастворимых частиц фильтрованием, после чего продукт подвергают ультрафильтрации на мембранах со средним размером пор , смешивают со стабилизатором конечной концентрации последнего в соотношении 0,05-1% и лиофилизуют, а затем готовят лекарственную форму. В качестве стабилизатора используют полиглюкин, реополиглюкин или желатиноль, которые обеспечивают образование защитного комплекса с активными центрами. В качестве лимфоидных тканей используют селезенку свиней, кролика.
Для получения лекарственной формы лиофилизат растворяют в воде, исходя из требуемой удельной активности, выдерживают не менее двух часов для созревания, затем стерилизуют и фасуют.
Отличиями заявляемого способа от прототипа являются: использование для очистки продукта ультрафильтрации на мембранах, введение соединений, стабилизирующих активные центры препаратов, а также введение новой технологии получения готовой лекарственной формы, включающей созревание препарата, и выдерживание его при пониженной температуре не менее двух часов.
Ранее в литературе данная совокупность операций не описана. В литературе известно применение в качестве источников сырья лимфоидных тканей с последующей экстракцией, отделением водной части центрифугированием, осаждением целевого продукта этанолом, растворением в воде и гельхроматографией на сефадексе G-75 [4] (а. с. 1506669, недоступное неограниченному кругу лиц, что исключает его выбор в качестве прототипа). Однако эта технология не позволяет получить конечный продукт высокой активности, а также непригодна для использования в производстве, кроме того получаемый препарат пирогенен.
Значительные отличия заявляемого способа от аналога, получение высокоактивного препарата, не достижимого при известных методах переработки, подтверждают соответствие изобретения критерию "изобретательский уровень".
Сущность изобретения и возможность практического использования иллюстрируются примерами.
Пример 1. 1,0 кг лимфоузлов свиньи помещали в гомогенизатор при 4000 об/мин на 4 минуты, после чего заливали шестикратным объемом стерильной дистиллированной воды и помещали в холодильник (при 4-10oC) по крайней мере на 16 часов (оптимально 18-20 часов), после чего фильтровали через марлю на воронке Бюхнера. В результате получали 5,5 л фильтрата.
Фильтрат помещают в половолоконную установку ультрафильтрации (размер пор ), где проводят очистку при скорости подачи 100-150 л/час при давлении 0,8- 1,0 атмосфер до полного расхода жидкости. После вводят полиглюкин из расчета образования до конечной концентрации в фильтрате до 0,1±0,05% и подвергают раствор сублимационной сушке. Получают 25 г препарата с активностью 3-166 ЕИА.
Полученный препарат стерилизуют, затем растворяют в воде до активности 3000 ЕИА/мл и помещают для созревания в холодильник при 4-6o на 14-18 часов, после чего подвергают повторной стерилизующей фильтрации через мембраны с размером пор не менее 0,22 мк, сублимационно высушивают и фасуют.
Пример 2. Испытание специфической активности ингибитора пролиферации, получившего наименование "лимфотилин".
Влияние лимфотилина на синтез ДНК в лимфоцитах периферической крови доноров изучали в тесте РБТ, стимулированных ФГА клеток. Лимфоциты из плазмы крови выделяли в градиенте плотности фиколлверографина. Количество клеток в культуре 2 • 106 кл/мл. Клетки культивировали в среде 199 с добавлением 15% активированной сыворотки человека группы АВ, стрептомицина (100 мкг/мл) и пенициллина (100 Е/мл). Концентрация ФГА в культуре составляла 4 мкг/мл. Клетки инкубировали в СО2-инкубаторе при 37o и 5% CO2 в воздухе в течение 72 часов. Лимфотилин вводили в культуру одновременно с ФГА в начале инкубации. Были испытаны концентрации препарата от 0,1 ЕИА/мл до 500 ЕИА/мл 3Н-тимидин в концентрации 1 мкк/мл вносили в культуру за 6 часов до снятия проб. После культивирования клетки переносили на фильтры, отмывали и высушивали. Фильтры переносили в виалы с сцинцилляционной жидкостью для подсчета радиоактивности на счетчике Рак-Бета.
В результате исследований с помощью данного метода было выявлено ингибирующее влияние препарата на указанную реакцию. Ингибирующий эффект проявился в широком диапазоне концентраций (указанных выше) и составил от 45 до 86%
Влияние лимфотилина на синтез ДНК в трансформированных клетках периферической крови и костного мозга крыс и людей, больных лейкозами, изучали в культурах с использованием той же среды, что и при культивировании лимфоцитов периферической крови доноров. Количество клеток в культуре было равно 2 • 106 в 1 мл.
Влияние лимфотилина на синтез ДНК в трансформированных клетках периферической крови и костного мозга крыс и людей, больных лейкозами, изучали в культурах с использованием той же среды, что и при культивировании лимфоцитов периферической крови доноров. Количество клеток в культуре было равно 2 • 106 в 1 мл.
Лимфотилин вносили в культуру клеток в начале инкубации и испытывали в концентрациях от 0,1 ЕИА/мл до 500 ЕИА/мл. Клетки костного мозга инкубировали в CO2 инкубаторе при 37o, 5% СO2 в воздухе в течение 2-х часов, клетки крови в течение 2 и 21 часа. 3Н-тимидин вводили в культуру при краткосрочной инкубации вместе с лимфотилином, при суточной инкубации за 6 часов до снятия проб. Обработка клеток после инкубации проводилась так же, как и при постановке РБТ с лимфоцитами доноров.
По окончании срока инкубации во всех опытах проверяли жизнеспособность клеток в тесте с трипановым синим. Жизнеспособными были 987-100% клеток, взятых после культивирования.
Влияние лимфотилина на синтез ДНК в костномозговых клетках крыс определяли в широком диапазоне концентраций препарата (от 0,1 до 500 ЕИА). Результаты приведены в таблице 1. Данные показывают, что ингибирующее действие на гемопоэтические клетки лимфотилин проявляет во всех использованных концентрациях.
Пример 3. 1,2 кг лимфоузлов свиньи помещают в гомогенизатор при 4000 об/мин на 4 мин, после чего гомогенизат заливают шестикратным объемом стерильной дистиллированной воды и помещают в холодильник (при 4-10oC) по крайней мере на 16 часов (оптимально 18-20 часов), после чего взвесь фильтруют на воронке Бюхнера через марлю. В результате получают 6-6,5 л фильтрата.
Берут 1,0 л фильтрата и помещают в ультрафильтрационную установку, в которой в качестве разделительных элементов используются плоские мембраны и мембраны в виде полых плоских волокон с различными средними размерами пор.
Процесс фильтрационной очистки ведут при тангенциальной скорости подачи раствора 0,25-0,35 м/сек, давлении 0,8-1,2 атм, комнатной температуре. После прохождения в фильтрат 0,9 л раствора опыт прекращают, отбирают 2 см3 интегрального фильтрата и определяют его биологическую активность по подавлению включения меченого тимидина в растущие клетки. Кроме того определяют пирогенность полученных образцов.
Результаты приведены в таблице 2.
Пример 4. 100 г селезенки кролика помещают в гомогенизатор при 4000 об/мин на 4 мин, после чего гомогенизат заливают 600 мл дистиллированной стерильной воды и помещают в холодильнике при 4oC на 20 часов, после чего взвесь фильтруют на воронке Бюхнера через марлю. В результате получают 0,55 л фильтрата, которые фильтруют на установке с полыми волокнами со средним размером пор при давлении 1±0,2 атм, тангенциальной скорости подачи раствора 0,3 м/сек. После прохождения в фильтрат 0,5 л раствора отбирают пробу, которую тестируют на биологическую активность и пирогенность. Полученный фильтрат апирогенен и имеет активность 120 ЕИА/мл.
Пример 5. 0,2 кг свиных лимфоузлов помещают в гомогенизатор при 4000 об/мин на 4 мин, после чего гомогенизат заливают дистиллированной водой в количестве 1,2 л помещают в холодильник на 20 часов, затем фильтруют через марлю, потом через полые волокна с размером пор в соответствии с условиями примера 1.
В 100 мл фильтрата растворяют навеску стабилизатора (в качестве которых используют полиглюкин, реополиглюкин, желатиноль и др.), полученный раствор лиофильно высушивают и перерастворяют в 20 мл апирогенной воды, выдерживают не менее 2 часов при пониженных температурах, стерильно разливают в ампулы по 1,0 мл и лиофильно высушивают.
Вскрывают одну ампулу, растворяют ее содержимое в 1 мл дистиллированной воды и испытывают на биологическую активность и проверяют присутствие механических включений.
В таблице 3 приведены результаты экспериментов.
Полученные результаты показали, что при осуществлении процесса в заявляемом интервале условий удается получить высокоактивный препарат, применяемый для медицинских целей.
В настоящее время по препарату "лимфотилин" оформлена документация в Ветфармкомитет. ТТТ1
Claims (3)
1. Способ получения ингибитора клеточной пролиферации из лимфоидных тканей животных, включающий в себя их гомогенизацию, водную экстракцию активного начала, очистку, лиофилизацию и получение готового продукта, отличающийся тем, что очистку водного экстракта гомогената осуществляют ультрафильтрацией, а перед лиофилизацией в фильтрат вводят стабилизатор, раствор выдерживают не менее 2 ч перед финишной стерильной фильтрацией и сушкой.
4. Способ по пп.1 и 3, отличающийся тем, что стабилизатор вводят в фильтрат до концентрации 0,05 1
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU93014666A RU2067866C1 (ru) | 1993-03-22 | 1993-03-22 | Способ получения ингибитора клеточной пролиферации |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU93014666A RU2067866C1 (ru) | 1993-03-22 | 1993-03-22 | Способ получения ингибитора клеточной пролиферации |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU93014666A RU93014666A (ru) | 1996-06-10 |
RU2067866C1 true RU2067866C1 (ru) | 1996-10-20 |
Family
ID=20138991
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU93014666A RU2067866C1 (ru) | 1993-03-22 | 1993-03-22 | Способ получения ингибитора клеточной пролиферации |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2067866C1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102397293A (zh) * | 2010-09-19 | 2012-04-04 | 曹吉祥 | 脾脏免疫因子及其制备方法 |
-
1993
- 1993-03-22 RU RU93014666A patent/RU2067866C1/ru active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
1. Ravazzolo R., Bianchi-Scarra J., Carpa V. et al. Synthesis of a 60 kd nuclear JWA binding protein induced by cytosine arabinoside in the HL60 leukemic cell line. Eur.I.Haematol., 1990, v.44, 3, p.150 - 153. 2. Федяхина P.Ф. и др. Влияние экстракта лимфатических узлов на гемопоэтические и лимфоидные клетки в норме и при различных формах лейкоза. Экспериментальная онкология, 1990, т. 12, 4, с.47 - 50. 3. Свирновский А.И. и др. Способ получения вещества, угнетающего лейкозные клетки, авторское свидетельство СССР N 8З9090, 1979. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102397293A (zh) * | 2010-09-19 | 2012-04-04 | 曹吉祥 | 脾脏免疫因子及其制备方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4390623A (en) | Serum-free and mitogen-free T-cell growth factor and process for making same | |
US4464355A (en) | Serum-free and mitogen-free T-cell growth factor and process for making same | |
KR870001149B1 (ko) | 인체 콜로니 자극인자의 제조방법 | |
DK153848B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af interferon | |
AU666465B2 (en) | Growth hormone crystals and a process for production of these GH-crystals | |
FR2461500A1 (fr) | Procede de production d'une substance capable de stimuler la proliferation et la differenciation des cellules souches granulopoietiques humaines | |
EP0049611B2 (en) | A T-cell growth factor, and a process of producing the same | |
US4100022A (en) | Process for preparing a curing agent for myelogenic leukemia | |
RU2067866C1 (ru) | Способ получения ингибитора клеточной пролиферации | |
US4001080A (en) | Production of immunological materials | |
Courreges et al. | In vitro antiphagocytic effect of Melia azedarach leaf extracts on mouse peritoneal exudate cells | |
CN101759765A (zh) | 一种体外制备抗鸡法氏囊病毒特异性转移因子的制备方法 | |
US4386066A (en) | Immunogenic complex from N. gonorrhoeae | |
CN111265550A (zh) | 一种修复损伤组织的干细胞因子脂质体及其制备方法 | |
CN106267409B (zh) | 艾滋病生物治疗反应器 | |
RO116045B1 (ro) | Peptida de vaccin impotriva mastitei si compozitie ce o contine | |
JPH03505200A (ja) | 治療活性のある、特に傷治療または老人医学に用いる作用物質およびかかる作用物質を含む製剤の製造方法 | |
RU2142816C1 (ru) | Способ получения антигерпетической вакцины и лекарственная форма на ее основе | |
EP0142109B1 (en) | Macromolecules extracted from cultured mesenchymal cells for the treatment of degenerative diseases | |
RU2128513C1 (ru) | Способ получения лечебного средства, регулирующего дифференциацию клетки | |
CN101759764A (zh) | 一种体外制备抗鸡新城疫病毒特异性转移因子的制备方法 | |
RU2180592C1 (ru) | Полипептидный препарат из бурсы кур, способ его получения и фармацевтическая композиция на его основе | |
RU2128514C1 (ru) | Способ получения противовоспалительного средства | |
SU1654333A1 (ru) | Способ обнаружени неклассического вируса | |
CN101686993A (zh) | 卡介菌多糖核酸提取物在制备治疗病毒性皮肤病的药物中的应用及其注射剂和制备方法 |