CN101686993A

CN101686993A - 卡介菌多糖核酸提取物在制备治疗病毒性皮肤病的药物中的应用及其注射剂和制备方法

Info

Publication number: CN101686993A
Application number: CN200880023204A
Authority: CN
Inventors: 宁云山; 关继峰
Original assignee: Hunan Jiuzhitang Siqi Biopharmaceutical Co ltd
Current assignee: Hunan Jiuzhitang Siqi Biopharmaceutical Co ltd
Priority date: 2008-01-07
Filing date: 2008-01-07
Publication date: 2010-03-31
Anticipated expiration: 2028-01-07
Also published as: WO2009086694A1; CN101686993B

Abstract

一种卡介菌多糖核酸提取物在制备治疗病毒性皮肤病的药物中的应用。一种含有多糖0.32mg/ml－0.38mg/ml，核酸50μg/ml－100μg/ml，卡介菌菌体蛋白0μg/ml－2.5μg/ml，苯酚残留量和杂菌数为零的卡介菌多糖核酸注射剂。以及一种由卡介菌多糖核酸提取物制备卡介菌多糖核酸注射剂的方法。

Description

卡介菌多糖核酸提取物在制备治疗病毒性皮肤病的药物中的应用及其注射剂和制备方法技术领域本发明涉及生物制药领域。具体说，本发明涉及一种卡介菌多糖核酸提取物在制备治疗病毒性皮肤病的药物中的应用，以及由该卡介菌多糖核酸提取物制备的卡介菌多糖核酸注射剂及其制备方法。背景技术

卡介苗（Bacilli Calmette Guerin, BCG) 是一种弱化的牛型分枝杆菌，是目前预防结核病最有效的疫苗。自 1948年以来，全球已有 30亿人接种，其安全性已被证实。 BCG除了用于预防结核病以外，还可以用于多种疾病的治疗，如变态反应性疾病及肿瘤。但是由于其成分复杂，副作用如皮疹、瘙痒等发生率较高。因此，对 BCG进行纯化、提取其中的有效成分有助于减少其副作用的发生率。卡介菌多糖核酸注射剂是卡介菌多糖核酸提取物配以灭菌生理盐水制成的免疫调节剂。临床及实验资料均显示，具有广泛的免疫调节及抗炎作用，在改善免疫功能、抗过敏、抗感染方面具有良好的疗效，临床用于多种免疫失调或免疫水平下降及过敏性疾病，如难治性肺结核、支气管哮喘、支气管炎、病毒感染性疾病及皮肤变态反应疾病等。自从卡介菌多糖核酸注射剂上市后，其作用机制一直是医学研究的热点，目前研究的成果表明：

卡介菌的主要成分包括脂类、多糖、蛋白和核酸，其中多糖（包括脂类）和核酸组分发挥着重要的生理功能。在卡介菌中，多糖（主要包括肽聚糖、阿拉伯半乳糖聚糖和分支菌酸）和脂类常结合在一起，构成细胞壁的主要成分。目前的研究还表明： BCG细胞壁和其他细胞器上存在可结合人和动物 Toll受体（TLR)的配体，这些配体至少可结合 5种 Toll受体 (TLR1、 TLR2、 TLR4、 TLR6、 TLR9), 当它们同 TLR结合促进树突状细胞（DC)的成熟，并且诱导 IL-12的分泌， IL-12对促进 ThO细胞向 Thl 细胞亚群转化和 IFN-γ分泌，从而产生 Thl占优势的非特异性免疫反应。

同样，在卡介菌的核酸中含有丰富的 CpG基序， CpG基列在体内外均能激活多种免疫活性细胞，包括树突状细胞（DC)、单核 /巨噬细胞、自然杀伤细胞 (NK：)、 B细胞和 T细胞,剌激免疫活性细胞分泌多种细胞因子并能上调某些表面分子、趋化因子、粘附分子和共剌激分子等,诱导机体天然免疫系统活化,并产生抗原特异性的获得性免疫应答。

综上所述， BCG及卡介菌多糖核酸注射剂主要是其核酸和多糖通过识别和结合人体的 Toll受体（TLR1、 TLR2、 TLR4、 TLR6、 TLR9), 激活 DC、 T细胞、 Β细胞及巨噬细胞等多种免疫活性细胞，刺激多种免疫活性细胞分泌免疫活性分子（细胞因子、趋化因子、粘附分子和共刺激分子）而发挥抗微生物感染、抗肿瘤及调节 Thl/Th2平衡的作用。

近十年来的体内、体外研究表明：卡介菌多糖核酸注射剂可以特异性增强机体的 Thl 型细胞免疫反应，抑制 Th2细胞免疫反应，进而调节 TM/Th2平衡的作用。

研究表明，卡介菌多糖核酸注射剂可增加 T细胞及脾细胞膜上 IL-2 的表达，促进 T细胞克隆增殖及 T细胞集落形成，此外卡介菌多糖核酸注射剂还能增加活化 T细胞 IFN-γ的分泌，增强巨噬细胞功能。卡介菌多糖核酸注射剂还能抑制多种过敏反应，稳定嗜碱性和肥大性细胞的功能，减少 IgE的产生。因而，卡介菌多糖核酸注射剂在预防和治疗微生物感染（细菌、病毒等）、肿瘤的免疫治疗或辅助治疗及纠正 Thl/Th2细胞失衡的变态反应疾病中将具有非常广阔的应用前景。

目前已上市的卡介菌多糖核酸注射剂是通过从卡介菌培养经热酚法提取的卡介菌多糖核酸提取物配制而成，现行的卡介菌多糖核酸提取物、卡介菌多糖核酸注射剂的质量标准和工艺按 2000版《中国生物制品规程》执行。 2000版《中国生物制品规程》规定的卡介菌多糖核酸提取物质量标准为：该制剂为多糖、核酸及蛋白混合物，其中多糖为 70%〜80%左右，核酸为 10%〜20%，卡介菌菌体蛋白含量小于 1%, 杂菌数不超过为 100 个 /克。 2000版《中国生物制品规程》规定的卡介菌多糖核酸注射剂质量标准为： 1ml/支，含卡介菌多糖 0.28-0.42mg/ml，核酸不低于 30μ_§。

现行的卡介菌多糖核酸提取物、卡介菌多糖核酸注射剂的质量标准存在一些问题，主要表现为：（1 )卡介菌多糖核酸提取物的多糖和核酸的范围较宽，造成卡介菌多糖核酸注射剂批次间多糖和核酸的含量不一致，从而使卡介菌多糖核酸注射剂批次间疗效不稳定；（2)卡介菌多糖核酸提取物中杂质的含量比较高，特别是卡介菌菌体蛋白、杂菌数和苯酚的残留量。例如由于原卡介菌多糖核酸提取物中含有较高比例的卡介菌菌体蛋白和杂菌，造成卡介菌多糖核酸注射剂中卡介菌菌体蛋白和杂菌较高，按 2000 版《中国生物制品规程》规定生产的每支卡介菌多糖核酸注射剂中含有 5μ_§ 的卡介菌菌体蛋白，同时可能数量不等的杂菌物质。相对人体而言，卡介菌菌体蛋白和杂菌是异源抗原或毒性物质，可引起较强的免疫排斥反应和毒性反应（因为要连续使用 3个月），表现为临床上使用该制剂时常出现病人注射部位发生严重溃烂，同时约有 5-10%的病人出现发烧现象，少数病人出现严重的过敏反应；（3)现有的卡介菌多糖核酸注射剂中只规定了核酸含量的下限，但在长期的临床应用中却发现，当每只注射剂中核酸的含量大于 llO g时，约有 90%的患者表现为注^ "部位红肿、疼痛、甚至严重肿胀影响日常生活。

扁平疣等病毒性皮肤病可能是由人类乳头瘤病毒 (HPV)等病毒引起，其发生、发展与患者细胞免疫功能异常有关。研究发现，卡介菌多糖核酸注射剂可以特异性增强机体的 Thl型细胞免疫反应，诱导释放 ΕΡΝ-γ、 IL-2 等细胞因子、破坏溶解病毒靶细胞，增强单核-巨噬细胞系统的免疫功能，恢复 ΝΚ等免疫细胞的活性，因此可能在由 HPV等病毒引起的病毒性皮肤病的治疗中发挥作用。发明内容本发明一方面提供一种卡介菌多糖核酸提取物在制备治疗病毒性皮肤病的药物中的应用，其中该卡介菌多糖核酸提取物含有多糖、核酸、残留的卡介菌菌体蛋白和质量百分含量小于 10%的水分，其中多糖质量百分含量为 70-78%，核酸质量百分含量为 12-20%，残留的卡介菌菌体蛋白质量百分含量为 0-0.5%，苯酚的残留量为零，杂菌数为 0-20个 /克。

其中，所述卡介菌多糖核酸提取物通过以下步骤制备：

(a) .对卡介菌进行培养，并收获卡介菌培养物；

(b) .采用物理方法对上述卡介菌培养物进行破碎，得到卡介菌多糖核酸混悬液；

(c) . 利用加入 30-100°C苯酚结合高速离心法对上述卡介菌多糖核酸混悬液进行处理，得到卡介菌多糖核酸混合物；

(d) .通过凝胶柱层析法对上述卡介菌多糖核酸混合物进行分离，得到卡介菌多糖核酸提取液，从该卡介菌多糖核酸提取液中进一步分离得到卡介菌多糖核酸提取物。

上述病毒性皮肤病可以与患者的免疫功能失衡有关，或者与机体被病毒感染有关。该病毒性皮肤病可以由人乳头瘤病毒引起，包括扁平疣、尖锐湿疣等。

上述用于治疗病毒性皮肤病的药物包括卡介菌多糖核酸注射剂。该注射剂优选含有多糖、核酸、残留的卡介菌菌体蛋白和药学上可接受的辅料，其中多糖含量为 0.32mg/ml〜0.38mg/ml，核酸含量为 5(^g/ml〜10(^g/ml，卡介菌菌体蛋白含量为 0 g/ml〜2.5 _g/ml，苯酚的残留量和杂菌数为零。上述卡介菌多糖核酸注射剂中的药学上可接受的辅料可以包括氯化钠，其含量优选为 9mg/ml。

另一方面，为了克服原卡介菌多糖核酸注射剂批间疗效差异大，副反应大等问题，本发明提供一种由卡介菌多糖核酸提取物制备的卡介菌多糖核酸注射剂，该卡介菌多糖核酸注射剂中含有卡介菌多糖、核酸、残留的卡介菌菌体蛋白和药学上可接受的辅料，其中多糖含量为 0.32mg/ml〜 0.38mg/ml、核酸含量为 5(^g/ml〜 100 g/ml、卡介菌菌体蛋白含量为 (^g/ml〜2.5 g/ml，苯酚的残留量为零。该卡介菌多糖核酸注射剂中的杂菌数优选为零。上述药学上可接受的辅料可以包括氯化钠，其含量优选为 9mg/ml。

本发明还提供制备上述用于治疗病毒性皮肤病的卡介菌多糖核酸注射剂的方法，其包括以下步骤：

(a) .培养卡介菌，并收获卡介菌培养物；

(b) .采用物理方法破碎所述卡介菌培养物，得到卡介菌多糖核酸混悬液；

(c) . 利用加入 30-100°C苯酚结合高速离心法处理所述卡介菌多糖核酸混悬液，得到卡介菌多糖核酸混合物；

(d) .通过凝胶柱层析法分离所述卡介菌多糖核酸混合物，得到卡介菌多糖核酸提取液，并对所述卡介菌多糖提取液进行醇沉，收集沉淀物，沉淀物洗涤后干燥，干燥物即为卡介菌多糖核酸提取物；

(e) . 将卡介菌多糖核酸提取物稀释于含药学上可接受的辅料的注射用水中，混勾，使最终溶液中的多糖含量为 0.32 mg/ml〜0.38mg/ml，核酸含量为 50 g/ml〜： LOO g/ml,卡介菌菌体蛋白含量为（^g/ml〜2.5 g/ml，将该溶液过滤后湿热灭菌分装，即得卡介菌多糖核酸注射剂。

其中，上述步骤（e) 中所述的药学上可接受的辅料可以包括氯化钠，其在所得卡介菌多糖核酸注射剂中的含量优选为 9mg/ml。

另外，上述步骤（e)还可以包括在过滤前用 pH值调节剂将 pH值调节至 6.0〜7.2。其中所述 pH值调节剂优选为氢氧化钠和盐酸。

上述卡介菌多糖核酸注射剂可通过激活机体的树状突细胞（DC)，促使 ThO细胞向 Thl细胞亚群转化和 IFN-γ分泌，从而产生 Thl占优势的非特异性细胞免疫反应。同时，可诱导机体释放 IFN-Y、 IL-2等细胞因子、破坏溶解病毒靶细胞，增强单核-巨噬细胞系统的免疫功能，恢复 NK等免疫细胞的活性。

本发明提供的卡介菌多糖核酸注射剂的主要药效学研究表明：在氢化可的松所致免疫功能低下小鼠间日肌内注射卡介菌多糖核酸注射剂 (0.15、 0.3、 0.60 mg/kg) 3周，可增强单核巨噬细胞系统对碳粒的廓清能力，升高空斑形成数以及总 T细胞、 Th细胞、 Ts细胞数、 IFN-γ水平。在豚鼠生殖器疱疹模型，间日肌内注射卡介菌多糖核酸注射剂（0.1、 0.2、 0.4 mg/kg) 3周，可明显减少皮损的复发天数，升高血漿 IFN-γ水平。这些结果提示，卡介菌多糖核酸注射剂可以提高机体细胞免疫功能，激活单核-巨噬细胞并诱生白介素、干扰素等，从而调节细胞和体液免疫，最终达到抗病毒、排斥疣病变组织的目的，因此可应用于治疗扁平疣等病毒性皮肤病。

本发明提供的卡介菌多糖核酸注射剂的主要药效学研究也表明：卡介菌多糖核酸注射剂做为一个免疫调节剂，单独或同其它药物（或方法）联合作用可以在治疗扁平疣等病毒性皮肤病发挥作用。具体实施方式以下通过具体实施例和试验结果详细介绍本发明的创新和应用意义所在，以帮助阅读者更好地理解利用的精神和实质，但不构成对本发明实施范围的限定。实施例一卡介菌的培养和收获

1. 菌体培养：将液体低温保藏的菌种（中国卡介苗制备用卡介菌株 D2PB302, 中国药品生物制品检定所）室温下溶解，接种于马铃薯苏通培养基， 37°C连续培养 14-20天；或在 37°C连续培养 15天后转种于改良的液体苏通培养基， 37°C连续培养 14-20天。

其中，马铃薯苏通培养基的制备方法可以是：

( 1 )取洗净新鲜土豆 (1个)，用穿刺器穿成圆柱，再用刀切成 4公分长斜面；用流动饮用水冲洗土豆斜面 1小时，再用纯化水冲洗土豆斜面块; 用苏通培养基冲洗斜面块，取苏通培养基 20ml，加入 100ml灭菌大管中；

(2) 将冲洗后的土豆斜面放入装有苏通培养基的灭菌大管中；

(3) O.l lMPa的大气压 121 °C，灭菌 20分钟。放冷至室温待接种。苏通培养基配制比例：

每 1000ml : 硫酸镁 0.5g 磷酸氢二钾 1.04g

味精 8.0g 枸橼酸 2.0g

甘油 60ml 10%柠檬酸铁铵 0.5ml 加纯化水至 1000ml 氨水调至 pH8.0左右

2.菌体收集：待菌体生长至对数期时，对培养瓶逐瓶检査后，收集菌

实施例二卡介菌多糖核酸混合物的制备

1.菌体破碎和热酚处理：将收集的菌体按 10： 1的比例加入纯化水，以组织捣碎勾浆机 (12000rpm/min)破碎菌体， 3 min><3次，将菌体捣碎，然后再加入破碎菌悬液 0.5-2.0倍体积量的热苯酚（30〜100°C )，在低速搅拌中保温 30分钟〜 1小时。

2.卡介菌多糖核酸混合物的提取：将热酚好的混合液自然沉淀 1〜10 天，吸取上清液，管式离心机高速离心后，上清经 0.45um无菌滤器过滤, 即为卡介菌多糖核酸混合物。实施例三精制卡介菌多糖核酸提取物的制备

采用美国密里博（ LLIPORE)公司制造的 K- PRIME 40 II凝胶层析过滤系统和 GH-25凝胶介质进行卡介菌多糖核酸、苯酚及卡介菌蛋白的分离。具体的制备过程如下-

1.平衡：用 0.9%生理盐水以 lOOOmL/分钟经柱正向流动，直至柱前柱后电导、 PH—致时结束平衡过程。

2.上样：将卡介菌多糖核酸混合物经上样系统进行上样，上样速度为 600mL/分钟。

3.洗脱：上样结束后，用 0.9%生理盐水以 800mL/分钟速度进行洗脱，采用紫外分光仪（波长采用 260 nm或 280nm)检测流出液，收集目的峰，将收集的目的峰通过 0.45μηι无菌滤器过滤，即为精制卡介菌多糖核酸提取液。 4.精制：将所收集的精制卡介菌多糖核酸提取液进行醇沉，在精制卡介菌多糖核酸提取液中加入药用乙醇进行醇沉，含醇量为 70-75%。自然沉淀 4天后，收集沉淀物。沉淀物通过无水乙醇充分搅拌均匀、离心洗涤 3次，然后用乙醚洗涤离心 3次后，放至干燥器干燥，干燥物即为卡介菌多糖核酸提取物。

实施例四卡介菌多糖核酸提取物的检测

通过本方法制备的九批精制卡介菌多糖核酸提取物按照 2000版《中国生物制品规程》和 2005版《中国药典》进行检测，结果如下表 1、表 2、表 3所示。

表 1 三批卡介菌多糖核酸提取物检测结果

注 *表示按 2005版《中国药典》检测结果为阴性

表 2 三批卡介菌多糖核酸提取物检测结果

注 *表示按 2005版《中国药典》检测结果为阴性

注 *表示按 2005版《中国药典》检测结果为阴性实施例五卡介菌多糖核酸注射剂的制备和检测

1.溶解：

准确称取处方量的卡介菌多糖核酸提取物，加入适量注射用水用磁力搅拌器溶解，未溶解的部分继续加注射用水用磁力搅拌器溶解，直至完全溶解为止，再离心，取上清液。

2. 配液：

先加入注射用水至接近批量刻度线，再将上清液和每批量所需的氯化钠加入稀配罐，加入注射用水至刻度线后搅拌均匀，取样检验多糖、核酸含量，并用 NaOH或 HC1调 pH值于 6.0〜7.2之间，通过过滤器滤过，打入贮液罐，运至灌封间灌封。

应该理解，虽然上述步骤中只加入了氯化钠和 NaOH及 HC1作为辅料，但是所属技术领域的技术人员应该能够认识到，所属技术领域的其它公知注射剂用药用辅料也可以根据需要加入其中，例如抗氧化剂、稳定剂、等渗调节剂等等。

3.灌封：在万级保护的局部百级层流罩下进行。

( 1 )洗瓶：操作人员在十万级区使用安瓿超声波清洗机洗瓶，依次经循环水，喷淋水，新鲜水三次用压缩空气加压淋洗，新鲜水为注射用水，洗涤后的安瓿用杀菌干燥机干燥灭菌。 ' (2)灌封：使用洗灌封联动线灌装封口，灌装前检查设备是否正常，管道是否淋洗干净，调节装量至规定范围。检査熔封质量是否封口完整光

4.灭菌：使用安瓿检漏灭菌柜，将安瓿放在安瓿推车上，于检漏灭菌柜内高压 ,灭菌 (121°C、 0.11MPa、 F0: 20)。

按照 2000版《中国生物制品规程》和 2005版《中国药典》对卡介菌核酸注射剂进行检测，结果如下表 4、表 5、表 6所示。表 4 三批卡介菌多糖核酸注射剂检测结果

注 *表示按 2005版《中国药典》检测结果为阴性表 5三批卡介菌多糖核酸注射剂检测结果

注 *表示按 2005版《中国药典》检测结果为阴性表 6三批卡介菌多糖核酸注射剂检测结果

注 *表示按 2005版《中国药典》检测结果为阴性

实施例六卡介菌多糖核酸注射剂抗病毒的主要药效学试验研究

1.对免疫功能的影响

以下试验均在免疫功能低下小鼠模型（氢化可的松， 100 mg/kg， ic，每日 1次，共 7天， 0.1 ml/10 g体重）进行。

1.1影响非特异性免疫功能的试验一 -小鼠碳粒廓清法

1.1.1 药物与材料

药物：卡介菌多糖核酸注射剂（以 0.5 mg精制卡介菌多糖核酸提取物溶于 l ml生理盐水），临用时用生理盐水配制成相应浓度的溶液。 5%盐酸左旋咪唑注射剂由江苏省东台市动物药厂生产，规格： 10 ml/支，临用时用生理盐水稀释成所需浓度。注射用氢化可的松琥珀酸钠由天津市生物化学制药厂生产，规格： 50 mg/支，临用时用生理盐水配制成相应浓度的溶液。

1.1.2方法试验分为六组：正常动物对照组、免疫功能低下模型组、盐酸左旋咪唑阳性对照组（2.5 mg/kg)、三个剂量（0.15， 0.30， 0.60 mg/kg) 的卡介菌多糖核酸注射剂组（n=10)。

印度墨水用生理盐水稀释 1倍，超声处理，离心，弃沉淀物，上清备用。取小鼠尾静脉注射印度墨水生理盐水溶液（0.1 ml/10 g体重），于 1 (tj )和 5 (t₅) min后分别从眼哐静脉釆血 20 μ1，加入 0.1% Na₂CO₃溶液 2 ml,摇匀， 680 nm波长下测定光密度值（OD)。按下式计算廓清指数（K) 和吞噬指数（α)。

廓清指数 = logOD logODs = logOD! /ODs 吞噬指数 ₌ « _χ

ti - ts 4 肝脾重

卡介菌多糖核酸注射剂组小鼠在造模前 2周至造模期间，后肢股部肌内注射卡介菌多糖核酸（0.1 ml/10 g体重），间日一次，末次给药后 24小时进行碳粒廓清试验。盐酸左旋咪唑对照组碳粒廓清试验前皮下注射盐酸左旋咪唑，每日 1次，连续用药 7日，给药体积为 0.1 ml/10 g。

1.1.3 结果

小鼠连续皮下注射氢化可的松（lOO mg kg, 1次 /日） 7天，可显著降低廓清指数和吞噬指数；高剂量（0.60 mg/kg)卡介菌多糖核酸可明显升高廓清指数和吞噬指数，中、低剂量对其无明显影响；盐酸左旋咪唑也可明显升高廓清指数和吞噬指数（表 7)。

卡介菌多糖核酸注射剂对小鼠碳粒廓清的影响（；ds n=10 ) 廓清指数吞噬指数正常动物对照组 0.041 ± 0.016 6.52 ± 0.56 免疫功能低下组 0.013 0.007** 3.93 ± 0.70**

+盐酸左旋咪唑阳性对照组 2.5 mg kg 0.029 ± 0.010+ 5.54 0.63+

+卡介菌多糖核酸注射剂组 0.15 mg/kg 0.017 ± 0.009 4.36 ± 0.83

0.30 mg kg 0.018 ± 0.010 4.70 ± 1.07

0.60 mg/kg 0.030 0.010++ 5.39 0.62+

'Ρ < 0. 01 Ρ¾·正常动物对照组； X 0. 05, ⁺⁺Ρ < 0. 01 免疫功能低下组。

1. 2影响特异性体液免疫功能的试验一 -小鼠抗体形成细胞测定法 1.2.1药物与动物药物：卡介菌多糖核酸注射剂（1.0 ml/支，以 0.5 mg精制卡介菌多糖核酸提取物溶于 1 ml生理盐水），临用时用生理盐水配制成相应浓度的溶液。 5%盐酸左旋咪唑注射剂由江苏省东台市动物药厂生产，规^: 10 ml/ 支，临用时用生理盐水稀释成所需浓度。注射用氢化可的松琥珀酸钠由天津市生物化学制药厂生产，规格： 50 mg/支，临用时用生理盐水配制成相应浓度的溶液。

1.2.2方法

试验分为六组：正常动物对照组、免疫功能低下模型组、盐酸左旋咪唑阳性对照组（2.5 mg/kg)、三个剂量（0.15， 0.30, 0.60 mg/kg) 的卡介菌多糖核酸注射剂组（n=10)。

①免疫：用 20%SRBC 0.2 ml腹腔注射免疫小鼠。免疫后第 4天处死供实验。

②制备脾细胞混悬液：脱颈处死经 SRBC免疫的小鼠，立即剖腹取脾脏，在冰浴中将脾置于 100目尼龙网纱布上，加少许 Hank's液，轻轻挤压出脾细胞。细胞计数时用 0.4%台盼蓝染色观察活细胞应在 90%以上。将脾细胞悬液配成 10⁷个 /ml浓度。

③制备琼脂底层：平皿中加入用 Hank's液配成的溶化的 1.4%琼脂 3 ml, 制备琼脂底层。

④加样：取脾细胞悬液和 5%SRBC各 0.1 ml及原补体 0.05 ml混合加入保温于 45°C水浴的、含 0.4%琼脂糖 0.8 ml的试管中，摇匀后倒入平皿，旋转平皿使混合物均匀平铺于底层琼脂上，凝固后将平皿装入湿盒并置于 37°C温箱中孵育 4小时后计数空斑形成数（PFC)。

⑤计数：以每 10⁶个脾细胞所含空斑数表示结果。卡介菌多糖核酸注射剂组小鼠在造模前 2周至造模期间，后肢股部肌内注射卡介菌多糖核酸（0.1 ml/10 g体重），间日一次，末次给药后 24小时进行空斑试验。盐酸左旋咪唑对照组空斑试验前皮下注射盐酸左旋咪唑，每日 1次，连续用药 7日，给药体积为 0.1 ml/10 g。

1.2.3结果小鼠连续皮下注射氢化可的松（100 mg/kg, 1次 /日） 7天，可显著降低空斑形成数；在此基础上使用卡介菌多糖核酸注射剂和盐酸左旋咪唑，均可明显升高空斑形成数（表 8)。卡介菌多糖核酸注射剂对小鼠空斑形成数的影响（ X—土 n = 10) 空斑形成数（/10⁶个脾细胞) 正常动物对照组 26.0士 9.7

免疫功能低下组 18.0 ± 6.3*

+盐酸左旋咪唑阳性对照组 2.5 mg/kg 36.0 ± ΙΟ.δ ""^

+卡介菌多糖核酸注射剂组 0.15 mg/kg 34.0 ± 17.8"¹"¹"

0.30 mg/kg 41.0土 ^

0.60 mg/kg 34.0 ± 15.8 +

<0.05 w正常动物对照组； ^ΡΟ.ΟΙ, +PO.OOl vs免疫功能低下组。

1.3影响特异性细胞免疫功能的试验一检测小鼠 T淋巴细胞亚群 1.3.1药物与动物

药物：卡介菌多糖核酸注射剂（规格： 1.0 ml/支，以 0.5 mg精制卡介菌多糖核酸提取物溶于 1 ml生理盐水），临用时用生理盐水配制成相应浓度的溶液。 5%盐酸左旋咪唑注射剂由江苏省东台市动物药厂生产，规格： 10 ml/支，临用时用生理盐水稀释成所需浓度。注射用氢化可的松琥珀酸钠由天津市生物化学制药厂生产，规格： 50 mg/支，临用时用生理盐水配制成相应浓度的溶液。

1.3.2方法

试验分为六组：正常动物对照组、免疫功能低下模型组、盐酸左旋咪唑阳性对照组 (2.5 mg/kg), 三个剂量（0.15， 0.30, 0.60 mg/kg) 的卡介菌多糖核酸注射剂组（n=10)。

①总 T细胞％: 常规制备淋巴细胞悬液，并用 RPMI1640完全培养液调细胞浓度至 4 X 10⁹个/ L。用生理盐水将 SRBC洗 3次，并用培养液调至 1%浓度。在 1 ml塑料离心管中，每管加入淋巴细胞悬液和培养液各 50 μ1， 37°C水浴中保温 1小时。再加入 SRBC悬液 100 μΐ混匀， 37°C水浴保温 10分钟。离心（800 rpm, 5分钟）水浴 2小时。将细胞轻轻悬起，加 ΙΟΟμΙ 4%戊二醛固定液（用锌酸缓冲液配制）混匀。计数前将上清液全部移除，加生理盐水 100 μΐ和 20倍稀释的 1%美蓝染色液 100 μΐ染色， 20分钟后计数，即得总 Τ细胞％。

②茶碱抵抗细胞花环％: 在 50 μΐ淋巴细胞悬液中加入含 100 mmol/L 茶碱的培养液 50 μΐ混匀，其余歩骤同上。

③ Th、 Ts细胞％: 按下式计算。

总翁 ^阳性细胞数 _Th细胞％ ₌ ^ ϋ^ _χ100%

淋巴细胞总数总 T细胞％

7¾细胞％ = 100% - 7¾细胞％

④ IFN-γ: 用 ELISA方法，按试剂盒说明书进行。

卡介菌多糖核酸注射剂组小鼠在造模前 2周至造模期间，后肢股部肌内注射卡介菌多糖核酸（0.1 ml/10 g体重），间日一次，末次给药后 24小时进行试验。盐酸左旋咪唑对照组试验前皮下注射盐酸左旋咪唑，每日 1 次，连续用药 7日，给药体积为 0.1 ml/10 g。

1.3.3结果

小鼠连续皮下注射氢化可的松（100 m_g/kg， 1次 /日） 7天，可显著降低总 T细胞、 Th细胞、 Ts细胞数以及血浆 IFN-γ水平；卡介菌多糖核酸注射剂和盐酸左旋咪唑，均可明显升高总 T细胞、 Th细胞、 Ts细胞数以及血浆 IFN-γ水平（表 9)。表 9卡介菌多糖核酸注射剂对小鼠细胞免疫功能的影响（ ± ， n = 9-10) 总 T (%) Th (%) Ts (%) IFN-y (pg/mI) 正常动物对照组 44.6土 4.5 33.4 ± 4.1 11.1 ± 4.1 209.1土 113.0 免疫功能低下组 38.0 + 3.6** 29.2 ± 2.8' 8.8 + 2.1* 137.0 + 88*

+盐酸左旋咪唑阳性对照组

47.1 ± 4·2⁺⁺⁺ 33·5 ± 2.6⁺⁺ 13.7 ± 4.4 234.6土 70.2+

2.5 mg/kg

+卡介菌多糖核酸注射剂组

0.15 mg/kg 49.8士 32.5 ± 1.5⁺⁺ 17.3 + 2.8^ 230.6 ± 211.5+

0.30 mg/kg 50.1 ± 3·4⁺⁺⁺ 12.9土 5.6^ 272.6土 120.5+

0.60 mg/kg 51.0 β^⁴""" 14.4 193.6士 126.2+ <0.05, "PO.Ol w正常动物对照组； + <0.05， ^Ο.ΟΙ , ⁺⁺⁺P<0.001 w免疫功能低下组。

2.对豚鼠生殖器单纯疱疹病毒（HSV-2)感染的影响 2.1药物与材料

药物：卡介菌多糖核酸注射剂 (规格： 1.0 ml/支，以 0.5 mg精制卡介菌多糖核酸提取物溶于 1 ml生 ®盐水），临用时用生理盐水配制成相应浓度的溶液。 5%盐酸左旋咪唑注射剂由江苏省东台市动物药厂生产，批号： 020418，规格： 10 ml/支，临用时用生理盐水稀释成所需浓度。

2.2方法

造模方法：生理盐水清洗外阴，干棉签磨擦阴道数次，造成阴道粘膜损伤，然后用接有灌胃针头的注射器吸取 HSV-2 (效价为 10_⁴~— ⁶TCID₅₀，由中国科学院武汉病毒研究所提供） 0.1 ml,将针头插入豚鼠阴道内约 3〜 4 cm将病毒注入阴道穹窿后缓慢退出，用明胶海绵塞入阴道以维持毒液，针头上少许毒液滴在外阴，用玻璃棒轻轻涂抹均匀，使病毒渗入皮肤。

注入病毒 14天后根据皮损程度分层随机分为五组：模型组、盐酸左旋咪唑阳性对照药 (2.5 mg/kg) 组、三个剂量 (0.1， 0.2， 0.4 mg/kg) 的卡介菌多糖核酸注射剂组（11=45-16)。第 15天开始，卡介菌多糖核酸注射剂组和模型组分别后肢股部肌内注射卡介菌多糖核酸和生理盐水（给药容积均为 0.1 ml/100 g体重），间日 1次，共 3周；阳性对照组皮下注射盐酸左旋咪唑，间日 1次，共 3周，给药容积为 0.1 ml/100 g体重。观察给药期间复发率（出现皮损的次数和天数）和皮损情况，末次给药后 24 采血测定血清 γ-IFN水平。皮损程度参考文献方法进行评分：

0，无症状； 0.5，微红； 1.0，红肿无水疱； 1.5，单个小水疱（≤2 mm); 2.0，单个大水疱（>2 mm); 2.5, 多个小水疱和（或）阴道溃疡（出血）； 3.0，多个大水疱； 3.5，严重外阴肿胀； 4.0，多个小（大）水疱融合； 4.5，后肢瘫痪； 5.0，外阴溃疡。 2.3结果

接种 HSV-2后，豚鼠均出现类似于人类外阴生殖器疱疹的症状，主要表现为外阴红肿、水疱、溃疡，部分动物甚至后肢瘫痪。皮损症状多在按种后 2〜3天开始出现，首先表现为分散的红肿性小水疱，第 4-10天发展为水疱-溃疡性皮损，第 8-12天开始结痂，第 13-15天痂皮脱落。第 7-12 天有 8只动物出现后肢瘫痪，该症状第 12-14天消失。

HSV-2接种 14天后，根据皮损程度把豚鼠分层随机分为五组，给予卡介菌多糖核酸注射剂和盐酸左旋咪唑治疗 3周。结果发现，高剂量（0.4 mg/kg) 卡介菌多糖核酸注射剂和盐酸左旋咪唑均可明显减少皮损的复发天数，并可显著升高血浆 IFN-γ水平（表 10)。

卡介菌多糖核酸注射剂对豚鼠生殖器疱疹复发天数和血浆 IFN-γ水平的影响

( x ± s, n = 15-16) 复发天数 IFN-γ (pg/ml) 模型组 4.2 ± 2.3 100.3 ± 37.6

+盐酸左旋咪唑阳性对照组 2.5 mg/kg 1.9 ± 1.6** 208.0 ± 151.6*

+卡介菌多糖核酸注射剂组 0.1 mg/kg 3.1 ± 1.3 112.8 ± 68.1

0.2 mg/kg 2.9 ± 1.8 161.5 ± 113.7

0.4 mg/kg 2.1土 1.6** 224.4 ± 141.0* <0.05, * <0.01 w模型组通过已完成的卡介菌多糖核酸注射剂对小鼠免疫功能、豚鼠生殖器单纯疱疹病毒（HSV-2) 感染的影响等主要药效学试验的研究表明：卡介菌多糖核酸注射剂可增强单核巨噬细胞系统对碳粒的廓清能力，升高空斑形成数以及总 T细胞、 Th细胞、 Ts细胞数和血清 IFN-γ的水平，减少由于生殖器单纯疱疹病毒引发的动物皮损的复发天数。这些结果提示，卡介菌多糖核酸注射剂可以提高机体细胞免疫功能，激活单核 -巨噬细胞并诱生干扰素等免疫活性物质，从而提高机体的整体免疫功能，达到抗病毒、排斥疣病变组织的目的。

Claims

权利要求书

1. 一种卡介菌多糖核酸提取物在制备治疗病毒性皮肤病的药物中的应用，其中该卡介菌多糖核酸提取物含有多糖、核酸、残留的卡介菌菌体蛋白和质量百分含量小于 10%的水分，其中多糖质量百分含量为 70-78%，核酸质量百分含量为 12-20%，残留的卡介菌菌体蛋白质量百分含量为 0-0.5%，苯酚的残留量为零，杂菌数为 0-20个 /克。
2.根据权利要求 1 所述的卡介菌多糖核酸提取物在制备治疗病毒性皮肤病的药物中的应用，其特征在于所述卡介菌多糖核酸提取物通过以下步骤制备：

(a) .对卡介菌进行培养，并收获卡介菌培养物；

(b) .采用物理方法对上述卡介菌培养物进行破碎，得到卡介菌多糖核酸混悬液；

(c) .利用加入 30-100°C苯酚结合高速离心法对上述卡介菌多糖核酸混悬液进行处理，得到卡介菌多糖核酸混合物；

(d) .通过凝胶柱层析法对上述卡介菌多糖核酸混合物进行分离，得到卡介菌多糖核酸提取液，从该卡介菌多糖核酸提取液中进一步分离得到卡介菌多糖核酸提取物。
3.根据权利要求 1 所述的卡介菌多糖核酸提取物在制备治疗病毒性皮肤病的药物中的应用，其特征在于所述的病毒性皮肤病与患者的免疫功能失衡有关。
4. 根据权利要求 1 所述的卡介菌多糖核酸提取物在制备治疗病毒性皮肤病的药物中的应用，其特征在于所述的病毒性皮肤病与机体被病毒感染有关。
5. 根据权利要求 3或 4所述的卡介菌多糖核酸提取物在制备治疗病毒性皮肤病的药物中的应用，其特征在于所述的病毒性皮肤病由人乳头瘤病毒引起。
6.根据权利要求 5所述的卡介菌多糖核酸提取物在制备治疗病毒性皮肤病的药物中的应用，其特征在于所述的病毒性皮肤病包括扁平疣和尖锐湿疣等。
7.根据权利要求 1 所述的卡介菌多糖核酸提取物在制备治疗病毒性皮肤病的药物中的应用，其特征在于所述的治疗病毒性皮肤病的药物包括卡介菌多糖核酸注射剂。
8.根据权利要求 7所述的卡介菌多糖核酸提取物在制备治疗病毒性皮肤病的药物中的应用，其特征在于所述的卡介菌多糖核酸注射剂含有多糖、核酸、残留的卡介菌菌体蛋白和药学上可接受的辅料，其中多糖含量为 0.32 mg/ml〜0.38mg/ml，核酸含量为 5(^g/ml〜10(^g/ml，卡介菌菌体蛋白含量为 0 g/ml〜2.5 g/ml，苯酚的残留量和杂菌数为零。
9.根据权利要求 8所述的卡介菌多糖核酸提取物在制备治疗病毒性皮肤病的药物中的应用，其特征在于所述卡介菌多糖核酸注射剂中的药学上可接受的辅料包括氯化钠，其中氯化钠含量为 9mg/ml。
10.一种用于治疗病毒性皮肤病的卡介菌多糖核酸注射剂，含有卡介菌多糖、核酸、残留的卡介菌菌体蛋白和药学上可接受的辅料，其特征在于其中多糖含量为 0.32mg/ml〜0.38mg/ml、核酸含量为 5(^g/ml〜 100μ<sub>§</sub>/ηι 卡介菌菌体蛋白含量为 0μ<sub>§</sub>/ηι1〜2.5μ /ηι1，苯酚的残留量为零。
11. 根据权利要求 10所述的用于治疗病毒性皮肤病的卡介菌多糖核酸注射剂，其特征在于其中的杂菌数为零。
12.根据权利要求 11 所述的用于治疗病毒性皮肤病的卡介菌多糖核酸注射剂，其特征在于所述药学上可接受的辅料包括氯化钠，其中氯化钠含量为 9mg/ml。
13.一种制备如权利要求 10所述的用于治疗病毒性皮肤病的卡介菌多糖核酸注射剂的方法，其特征在于包括以下步骤-

(a) . 培养卡介菌，并收获卡介菌培养物；

(b) .采用物理方法破碎所述卡介菌培养物，得到卡介菌多糖核酸混悬液；

(c) .利用加入 30-100°C苯酚结合高速离心法处理所述卡介菌多糖核酸混悬液，得到卡介菌多糖核酸混合物；

(d) .通过凝胶柱层析法分离所述卡介菌多糖核酸混合物，得到卡介菌多糖核酸提取液，并对所述卡介菌多糖提取液进行醇沉，收集沉淀物，沉淀物洗涤后干燥，干燥物即为卡介菌多糖核酸提取物；

(e) . 将卡介菌多糖核酸提取物稀释于含药学上可接受的辅料的注射用水中，混勾，使最终溶液中的多糖含量为 0.32 mg/ml〜0.38mg/ml，核酸含量为 5(^g/ml〜100 g/ml,卡介菌菌体蛋白含量为 0 g/ml〜2.5 g/ml，将该溶液过滤后湿热灭菌分装，即得卡介菌多糖核酸注射剂。
14.根据权利要求 13 所述的制备用于治疗病毒性皮肤病的卡介菌多糖核酸注射剂的方法，其特征在于步骤（e) 中所述的药学上可接受的辅料包括氯化钠，其中氯化钠在所得卡介菌多糖核酸注射剂中的含量为 9mg/ml。
15.根据权利要求 13 所述的制备用于治疗病毒性皮肤病的卡介菌多糖核酸注射剂的方法，其特征在于步骤（e)还包括在过滤前用 pH值调节剂将 pH值调节至 6.0〜7.2。
16.根据权利要求 15 所述的制备用于治疗病毒性皮肤病的卡介菌多糖核酸注射剂的方法，其特征在于所述 pH值调节剂包括氢氧化钠和盐酸。