JPH04501663A - 黒色腫用免疫療法ワクチン - Google Patents
黒色腫用免疫療法ワクチンInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
黒色腫用免疫療法ワクチン
発明の背景
主型Φ分野
本発明は腫瘍ワクチンに関し、更に詳しくは温血動物の宿主又は患者における黒
色1m (+aelano+ia tumors)の治療を目的とした腫瘍結合
抗原(tumor−associatedantigen)およびアジュバント
からなるワクチンに関する。
従来技街Ωに載
悪性黒色腫の発生率は着実に増加しており、特に、アメリカ南西部のような「気
候の良い地帯(”5unbelt ” ) Jにおいて、およびオーストラリア
やハワイの白人(Caucasians)の間で増加しつつある。これは、少な
くとも一部分は、色の白い人間および室内の職業に従事している人間が周期的に
強烈な日光に身をさらすことに帰因する。カリフォルニアおよびオーストラリア
の白人におけるこの疾患の現在の発生率は、ioo、ooo人に対し約15人の
割合であり、ハワイにおける発生率の2倍である。エイチ・メンテおよびビー・
イー・ヘンダーソン(H,Menchand B、E、Henderson)、
「太平洋岸地域における癌の発生J 、Nat ’ I Cancer Tns
t。
匣匹肛並し、1985 ; 69 : 105−111を参照。
原発性黒色腫の初期の治療においては手術が効を奏してきたが、散在性タイプ(
disseminated form)の黒色腫は、化学療法や放射線療法のよ
うなすべての従来の治療方法に対して耐性を示してきた。散在性悪性黒色腫は現
在、化学療法、放射線、非特異的生物学的応答変更因子(non−specif
ic biological responsemodH1ers)またはこれ
らの併用によって治療されている。しかしながら、いったん転移が起きて癌が身
体中に広がるかまたは転移すると、この病に冒された宿主の長期にわたる生存は
ほとんど期待できない。化学療法は18−20%の患者に有効であるが、わずか
約5カ月の平均応答期間(median duration of respo
nse)を有するのみである。放射線は、大量に放射する場合を除き、たいてい
は効果がない。
化学療法、放射線又は非特異的生物学的応答変更因子は毒性があり、患者の「基
本条件(“quality of 1ife ” ) Jを強烈に低下させると
いう望ましくない副作用を有している。この病気に対する最近の免疫学的研究の
結果、インターフェロン−αあるいはインターロイキン−2が使用されるように
なったが、前位てシクロホスファミド単独またはエクス・ビボ(ex vivo
)で誘出されたリンフ才力イン活性化キラー細胞とともにシクロホスファミドを
投与する0診断時に黒色腫が深く浸潤していたり、あるいは局部リンパ節がかか
わっている場合には予後が悪い。
その際、補助的な(“adjuvant”)治療は、顕微鏡的に見た転移発生源
の部位を未然に防止する。即ち多分その部位を撲滅するという試みにおいては理
に適っているように考えられて来たが、これまで有効なものは何ひとつなかった
。
黒色腫全細胞又は溶菌液(Iysate)からなる種々の製剤を用いた黒色腫の
活性免疫治療法がこれまでに試みられており、患者に免疫性を与えるという点で
、時には望ましい臨床的回復をもたらすという点で、場合により変動があるもの
の、ある程度成功している。これらのことについては次の文献に記載されている
。J。
C,Bystrin et al、+ ’多価ヒト黒色腫抗原ワクチンの調製お
よび特徴」、ム且1゜如狂四胆」列、 1986 ; 5 : 211 224
HD、Berd et al、、 r低薬量シクロホスファミドによるヒト細
胞性およびヒト体液性免疫の増強J 、Cancer Res、 1984 ;
44 :5439 5443 ;D、Berd et al、、 ’進行した
癌患者に対するシクロホスファミド投与後のコンカナバリンAg発性サプレッサ
ー活性の損傷J 、Cancer Res、 1984 ; 441275−1
280 ; P、Livingston et al、+ r他見的培養黒色腫
細胞から得られたワクチンに対する黒色II!患者の血清学的反応J 、Int
、J、Cancer、 1983 ;31 : 567 575゜John L
、Cantrellが1987年9月30日に出願した米国特許出1!]1に1
02.909号(腫瘍抗原およびアジュバントを含有するワクチン)には、少な
くとも1種の腫瘍結合性抗原、精製解毒エンドトキシンからなるアジュバントお
よび他の免疫刺激剤(immunostimulants)を薬剤学的に許容さ
れる担体とともに用いた混合物として製造したワクチンが記載されている。 C
antrell博士によって使用された精製解毒エンドトキシンはモノホスフォ
リルリビッド^(MPL)であり、詳細は、同時係属の米国特許出願No、73
2,889号および米国特許NCL4.436.727号(発行日: 1984
年3月13日、特許権者: Edgar E、Ribi、発明の名称:精製解毒
エンドトキシン生成物)にも開示されている。また、E、Ribi et al
、、 rリピッドAおよび免疫療法」、Revt−ew of Infevti
ous Diseases、Vol、6. Na4.7−8月、1984.56
7−572頁を参照。
このアジュバントはまた、マイコバクテリア細胞壁部分(5ycobacter
i cellwall 5keleton )からなる群より選ばれた免疫刺激
剤を含む、この点の詳細は、米国特許出JjlNtx102.909号オヨヒ米
国特許No、4,579,945号(発行日: 19B6年4月。
1日、特許権者: 5teven M、SchwartzmnおよびEdgar
E、Rjbi、発明の名称二Fレハロースジマイコレーツの精製)に記載され
ている。また、E、Rjbi et al、、 ’11瘍抑制および退化におけ
るマイコバクテリア細胞壁成分J 、National CancerInst
j Lute Monograpj、Nn39.1972年10月、115−1
20頁参照。
このアジュバントは、更にトレハロースジマイコレート(trehalose
dimycolate)を含み、この点について米国特許出1i1Na102.
909号および米国特許NCL4.505.903号に詳細に記載されている。
アジュバントはまた、微生物から得た精製したピリジン可溶性エキスを含有して
もよく、これについては、米国特許Nα4.505,903号(発行日: 19
B5年3月19日、特許権者: John L、Cantrell+発明の名称
:微生物のピリジン可溶性エキス)に記載されている。
腫瘍結合性抗原を得る方法、J、L、Cantrellの米国特許出願k102
,909号およびJ、L、Cantrell et al、、 rネズミEL−
4白血病の免疫療法における腫瘍細胞エキスの効果」、Cancer Re5e
arch、39 : 1159−1167.1979年4月号に詳しく記載され
ている。腫瘍抗原の種々の例が、A、E、Re1fおよびM、50M1tche
11、「癌に対する免疫」、アカデミツク・プレス株式会社(Acade+wi
c Press Inc、、) 二s−ヨーク1985.413−427頁およ
び429−442頁に開示されている。
上記の特許、刊行物および論文はこの明細書においてこれによって援用される。
剪獅
本発明の主要な目的は、温血は乳動物宿主又は患者における黒色腫の予防的およ
び治療的処置のための改良されたワクチンを提供することである。
本発明の更に具体的な目的は、原発性腫瘍の除去後およびその疾、色そのものが
症状を引き起こしていない時点で主として有用性を発揮する、黒色腫の効果的な
非毒性治療法を提供することである。
本発明の別の目的は、宿主にほとんど又は全く副作用がなく、容易に投与できる
黒色腫用ワクチンを提供することである。
本発明の別の目的は、黒色腫の腫瘍の成長を抑制する方法を提供することである
。
更に別の本発明の目的は、メラノーマ腫瘍関連抗原に対する増強した免疫学的応
答を誘発することである。
更に本発明の目的は、患者又は宿主中のメラノーマ腫瘍の増殖を抑制することで
ある。
本発明の更に別の目的は、メラノーマ腫瘍の増殖を防止または抑制できる、改良
したアジュバント処理ワクチンを提供することである。
更に別の本発明の目的は、転移又は増殖の進行段階のII瘍の増殖を減じている
範囲までさえ、幾らかの治療利点を与える、前述の特性をもつワクチンを提供す
ることである。
本発明のその他の目的及び利点は、次の記載から明らかになるであろう。
本発明は、培養したメラノーマ細胞の溶解物とアジュバントとの混合物からなる
ワクチンで具体化される。メラノーマ細胞混合物の組成は、殆どの宿主からメラ
ノーマ癌中に存在すると予期されうる、範囲の腫瘍抗原(これらのうちの多(は
モノクローナル抗体により同定できる)を含むように選択される0組織培養物か
ら誘導される溶解物(粉砕細胞の均質物)の形体のメラノーマ細胞を、アジュバ
ント及び担体と混合し、岡原メラノーマの免疫治療に適した、標準化同種異系ワ
クチンを与える。
本発明に有用なアジュバントには、選択した騙内細菌群からの脱毒化精製エンド
トキシン抽出物がある。これらの細菌から得られたエンドトキシン抽出物を酸で
加水分解し、凍結乾燥させて脱毒化粗エンドトキシン成分を得る0次いで、脱毒
化粗エンドトキシンを精製して所望の脱毒化精製エンドトキシン〔モノホスホリ
ル・リビッドA (MPL)]を得る。このエンドトキシン(MPL)を、米国
特許第4.436,727号、4,436,728号、4,505,900号、
4,535,386号及び4,505,899号各明細書に記載されているよう
にして、細胞壁骨格(CWS)及びトレハロースシミコール酸(TDM)を合わ
せることができる。
脱毒化精製エンドトキシン及び細胞壁骨格アジュバントと混合状態のメラノーマ
細胞溶解物は、メラノーマ癌を減じる又は可能な限り撲滅するために、予防的に
又は治療的に利用できるワクチンを与える。ワクチンは、宿主の免疫系を刺激し
、腫瘍抗原に対して特異的に反応性である特異的キラー免疫細胞を合成すること
により仲働すると思われる。
ワクチンは、いずれの方法によっても、未変化の外部膜結合抗原、細胞内(内部
膜)抗原、及び細胞質抗原を与える。ワクチンを、一定の抗原のその内容分につ
いて標準化でき、従って、再現能力を有する。
ワクチンの有効性を例証するために、22人のメラノーマ患者(17人が顕著な
病変を有する)を新規なワクチンで処置した。メラノーマ関連抗原のワクチンの
含量を定量し、その毒性を決定し、メラノーマ抗原に対する抗体及び細胞性免疫
における影響を決定し、そして腫瘍におけるその影響を測定した0群当たり6又
はそれ以上の患者に、ワクチンの100.200又は400抗原単位を皮下注射
した。17、愚者のうち5人(29,4%)は寛解し、そのうち2人は完全に寛
解し、3人は部分的に寛解し、3人が追加のより少ない応答であって、1人の完
全な寛解は、5.5力月持続し、その患者は、おおよそ2年後も発病せず生存し
ている。リンパ節、皮下及び肺の結節は退縮したが、肝、副腎及び骨の病変は退
縮しなかった。メラノーマ細胞に対する細胞溶解リンパ細胞が12患者において
増加し、臨床的な応答のある8患者すべてを含んだが、増加のない7患者のうち
誰もH”J的な寛解はなかった。メラノーマ抗原に対する抗体が5患者で増加し
、その総てが同バッチのワクチンを受けており、臨床的な応答に関係なかった。
好通笠実施態様少起述
本発明は、選択した同種異系メラノーマ腫瘍抗原及び有効量の一種以上の選択し
たアジュバントの組み合わせからなる免疫治療用ワクチンで具体化される。この
ワクチンは悪性メラノーマ細胞の混合物で構成され、該細胞は均質化されており
、キラー胸腺誘導リンパ細胞、即ち“T−細胞”の生成物を刺激することにより
細胞免疫を増幅する免疫性物質を放出する。このような細胞は、次に、悪性メラ
ノーマLI瘍細胞の進行と戦う。
ワクチンは、治療と潜在的予防との双方をになう。即ち、確立した腫瘍を塊を処
置した患者の約20%の割合で顕著に収縮させることができ、一旦起こった広が
り又は再発から疾病を防ぐのにも有効でもありうる。ワクチンは、メラノーマの
前癌症状からの進展を防止しうる可能性がある。ワクチンの目的は、腫瘍の転移
の部分的又は完全な寛解をもたらすことにあり、悪性細胞の宿主の身体のその他
の部位への広がりを防止することにある。散型のT−細胞、及び、ワクチンによ
り授けられた、多分その他の免疫学的に活性な出血細胞は、悪性メラノーマ細胞
の進行と戦う、ワクチンとアジュバントは、温血動物宿主又は患者中の上記のよ
うな免疫学的に活性な血細胞の産生を刺激するのに有効である。
ワクチンを生成させるために、メラノーマ細胞のバイオプシー腫瘍フラグメント
を、数種のメラノーマ源から病変部のバイオプシーにより取り出す、これらのメ
ラノーマ細胞のインビトロでの培養を開始し、適当な組織培養フラスコ中の抗生
物質不添加培地中で増殖させる。牛胎児血清を、約10%の濃縮物中に、約2ミ
リモルの[縮物に17−グルタミンと共に加えることもできる0次に、こうして
得られたマスター・シード培養物を、液体窒素中で凍らせ、将来の使用のために
貯蔵した。
使用しようとする種培養物の選択された量を液体窒素中での保存からいったん取
り出したらすぐ、適当量の生育培地を含有する遠心管中に入れて200Gで5分
間遠心分離する。この上清を傾しゃし、細胞を染色して生育を調べ、計数し、生
育フラスコに接種した。−貫して無菌で滅菌された生育操作を行う、メラノーマ
(黒色腫)細胞株を含有する数個のフラスコに最初のフラスコから接種する。接
種後、37°C15%CO□/95%空気中でインキュベーター中で生育を続け
る。腫瘍細胞を血清を含まない生育培地中に2−4日保持してから回収してウシ
胎児蛋白質を除去した。細胞単層を洗ってから回収する。細胞懸濁液を遠心管中
で凍結させる。これらの細胞を、目的とする抗原に特異的な適当なマウスモノク
ローナル抗体によって抗原性について試験する。酵素イムノアッセイにもとづく
結合阻害アッセイによって抗原性単位を決定する。
ワクチンを製造するために、回収物からあるいは回収物から得られた70°Cで
保存された凍結細胞から新しく得られた細胞を高速組織ホモジナイザーで破壊し
、細胞株全体からの熔解物を集める。凍結と融解を2周期行うことにより同等活
性ある安定した腫瘍細胞が残らないようにする。メラノーマ溶解物の混合物を、
滅菌性、−i的な安全性と発熱性、肝炎うイルスの混入、マイコプラズマの混入
およびAlll5ウイルス(HIV)の混入について試験した0組織培養物およ
びヌードマウ゛ ス中の生きた腫瘍細胞の存在についても試験した。
メラノーマ溶解物とアジュバント(米国特許Nct4.436.727に詳述さ
れ、商標名“DETOX″で市販されているようなアジュバント)との適当量を
徹底的に混合する。このワクチンを希釈するのには適当な医薬として受容できる
溶液が利用できる。
メラノーマ細胞溶解物とアジュバントの混合物からなる上記ワクチンを徹底的に
混合後、ヒト宿主に皮下注射する。1回の投与量たり、約5百万−4千万個の細
胞から得られたメラノーマ細胞溶解物を約250μgのCWSと約25μgのM
PLを含むアジュバントのある量とともに、約1−4%のスクアレン中で乳化し
て使用する。 CWSとMPLの比は、一般に約8−12部のCWS対1部のM
PLの範囲である。
該ワクチンの注射は6−8週間の期間で投与され、必要なら、毎月補助薬としで
あるいは周期的に完全なコースとして繰り返し投与できる。
下記具体例により本発明はより詳細に説明されよう。
実施例 ■
12王ペヱ上Ω周裂
1、亨1 れ無 れたエンドトキシンの[至Z法スホリル1ピ7ドA (MOL
)粗エンドトキシンをザルモネラ・ミネソタ(Salmonella m1nn
esota) (菌株11595)の多糖類欠損へプトース不存在のRe変異株
から有機溶媒抽出により単離した。この菌株はNIH,NIAID 、ロッキー
・マウンティン・ラボラトリ−(Rocky MountajnLaborat
ory) 、 ハミルトン(Has+1lton)、モンタナ(Montana
)から得られた。このエンドトキシン(KDOとリビッドAからのみなる)は典
型的なエンドトキシンであるリポポリサッカライドというよりむルろ糖脂質であ
り、適当な極性の有機溶媒で分別沈澱して精製した。ついで、還流している0、
IN塩酸で処理して無毒性モノホスホリルリピッドA (MPL)の遊離脂肪酸
と構造同族体からなる複合体混合物を得た。これらの成分をシリカゲルクロマト
グラフィーで分離した。薄層クロマトグラフィによって同定されたMPLの構造
同族体に相当する溶出フラクシヨンを集め、毒性を試験した。静脈注射で接種さ
れたニワトリ胎児を50%死亡させる投与量(CELDs。)が10dgを越え
るとき動物実験に適合するものとした。(もとのエンドトキシンのCELDs。
は一般に0.01dg未満である。)精製され無毒化されたエンドトキシンは同
等検出し得る2−ケト−3−デオキシオクタノエート(KDO)(約500−約
800r++woles / mgのホスホラスおよび約1700−約2000
nmoles/■の脂肪酸)を有しない。
2、ミコバクテリア フn(C−3)の−NIH,NIArD 、ロッキー・マ
ウンティン・ラボラトリ−(Rocky Mountain Labora−t
ory) +ハミルトン(Hamilton)、モンタナ(Mo1tana)か
ら得られたミコバクテリウム°ボビス(Mycobacterium bovi
s)BCG株の細胞壁をソルバルーリビ・セル・アフラクシオネーター(Sor
vall−R3bi Ce1l Fractionator) (RF −1型
)によって調製した。 10−15°Cで35,000ps+の圧力でミコバク
テリア細胞壁を“砕き”、原形質を溶は出させた。細胞壁を遠心分離して回収し
、遠心と水中懸濁とを繰り返すことによって精製した。ついで、細胞壁をRN^
分解酵素とDNA分解酵素で処理して核酸を除去し、一連の蛋白分解酵素と洗浄
剤での処理によって各々蛋白質とペプチドを除去した。最後にこの調製物を徹底
的に有機溶媒で抽出して“遊離リビッド”を除去した。得られたCIは重合性ミ
コール酸−アラビノガラクタン−ムコペプチド複合体からなっていた。
3、トレハロース−シミコレート TDM)の とミコバクテリアの全細胞をま
ずエタノールで、ついでアセトンで、最後にクロロホルムとメタノールの2対1
混合物(CM2:I)で抽出した。このCM抽出物はTMDおよびTDIIより
は低いか高い極性を有する混入脂質を含有していた。これらの脂質を、それらは
溶かさないがTMDを溶解状態に保持する有機溶媒の組成物で沈澱させることに
よって選択的に分離した。得られた“粗TMD″をシリカゲルクロマトグラフィ
ーで精製した。TLCで同定された純粋なTM[lを含有する溶出フラクシヨン
を集めた。
コ1ネバクーiウム・パルブム(虹と■叩)VPI 0204 (バージニア・
ポリテクニック・インスチテウードのC,CuIIImings博士より入手)
の加熱死金細胞を37℃で2回ピリジンで抽出し、ピリジン可溶性抽出物をいっ
しょにしてフラッシュ蒸発させ、透析し、凍結乾燥した。コ!ネバクテリウム・
バルブム(C0aeνuI11)0204はタイプ■であるP、acnes 0
204であり、37.7%の炭水化物、4.5%の蛋白質、56.5%の脂肪酸
を有するPaPEを生じた。これらの成分の範囲はもっと広く、約10−約4%
の炭水化物、約3−約20%の蛋白質、約35−約70%の脂肪酸を含んでも良
い、 Berek、Cantrellら、Cancer Re5earch 4
4 : 1871−1875参照。好適範囲は3−6%のPaPE、 15 4
0%の炭水化物、および45−70%の脂肪酸である。
5.7ジエバント のためのMPLおよびC?ISの 人1つの例示的なアジュ
バントは、ミリリットルあたり約6.25から約250マイクログラム(μg/
l11)の間のMPL 、およびミリリットルあたり約125から750マイク
ログラム(μg/d)の間のCWS 、好ましくはそれぞれ1対10の割合で、
特に約25μg/d MPLと250μg/d CWSの割合で混合して作成さ
れる。
実施例 ■
メーノーマ r″ の
メラノーマ細胞のインビボでの培養は、2人の異なる女性の2種の皮下腺生検材
料から開始された。1つの細胞株は、MSM −M −1(M−1)と名付けら
れ、1人の女性の腓の2つの病巣からの生検材料で1980年から開始された。
この細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクシジン(Ameflcan
Type Cu1tureCollection(ATCC))に寄託番号CR
L 9822として寄託された。もう1つの、MSM −M −2(M−2)と
名付けられた細胞株は、他のもう1人の女性の背中の病巣からのもので、198
1年に開始された。この細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション(
American Type Cul ture Co11ection(AT
CC) )に寄託番号CRL9823として寄託された。これらの細胞は両方と
も現在は、南カリフォルニア大学ガンセンター、(2025ゾーナル通り、10
−422ジーエイチ、ロサンジェルス、カリフォルニア90033 : Uni
versity of 5outhern Ca1ifornia Cance
r Center、2O25
Zonal Avenue+ 10 442 GH,Los Angeles、
Ca1ifornja 90033)のマルコルム ニス ミツシェル博士(D
r、Malcolm S、Mitchell)の研究室から入手できる。
細胞株門−1およびM−2は、HLA−A、B、C抗原に対するモノクローナル
抗体W6/32およびHLA −DRに対するモノクローナル抗体Q5/13で
フェノタイプされた。
ト」はメラニン欠乏であり、成長が遅く、IILA−A、B、C(クラス1)抗
原を発現し、HLA−DRを適度に発現することが観察された。M−2は高度に
沈着しており、成長がより速(、HAL−A、B、Cを強く発現するがHLA−
DRを欠いていることが観察された。
メラノーマカルチャーの純度は、定期的にマイコプラズマの混入をチェックされ
た。それらは抗生物質を含まないカルチャー中で成長させたので、抗生物質感受
性に対する注意を払う事な(患者に与えることができた。
ト」および?I−2の双方ともPRM11640培地にウシ胎児血清(10%)
およびL−グルタミン(2cM)を加えてT−175およびT−75組織培養フ
ラスコ内でほぼ集合体に近くなるまで成長させた。それぞれ約20および25m
2の生育培地が各々のフラスコに使用された。
マスターシードカルチ+ (Master 5eed culture)は液体
窒素中で2111の凍結ビン内に凍結された。ビンあたりの平均細胞数は、5百
万であった。一度液体窒素を除去したら、ビンは、水浴中で完全に溶解するまで
37℃にあたためられた(約5分)、ビンの内容物は、30−の成長培地を含む
遠心管に移され、200 Xgで5分間遠心され、上澄み液を別に移した。細胞
は生存能力のため着色しており、数を数えられ、50dの成長培地を含むT−1
75フラスコにばあたり約lOSの数で植えられた。細胞は、37°C14−7
%CO,存在の雰囲気中で成長し集合体となった。無菌技術および滅菌、脱パイ
ロジエン処理したガラス容器をすべての成長過程に使用した。
4つのT−175集合体を0.02%EDTAを含む25dのダルベツコBSで
処理し、10分間インキュベートした。細胞と液体は、50dのファルコンチュ
ーブに移され、200xgで10分間遠心し、上澄みを別に移した。4つの試験
管の内容物を合わせて、8dのRPM11640培地に再懸濁した。500−の
RPM11640培地を吸引ビンに加えた。8dのRPM11640培地懸濁液
を撹拌しながらそれに加えた。8ミリリツターの懸濁液をその後採取し、17d
のRPM11640培地をT−75フラスコに加え、これは細胞の成長をモニタ
ーするための対照として使用した。さらに1500−のRPM11640培地を
500 dの吸引ビンに加えた。この2リツトルの細胞懸濁液は、滅菌チューブ
を取り付けた吸引ビンに含まれ、細胞工場(Cell Factory)と称せ
られる10段フラスコ(tentiered flask)の1つに植えるため
に使用された。各々の細胞工場には、約101の細胞が植えられた。
細胞工場は、CO□インキエベーター内で37°Cにて5日から9日管置かれた
。培地は別に移され、各々の細胞工場あたり2リツトルの血清を含まない培地に
交換された。成長は、インキュベーター内で24日間、37℃で続行した。ト1
およびM−1およびト2細胞系の成長は、フラスコまたは細胞工場の下部の不透
明の単層により特徴づけられた。
培地は、細胞工場から別に移され、細胞は2リツトルのPBSで洗浄されて残存
する培地、死んだ細胞および血清を除去した0次に0.02%EDTAを含む2
リツトルのPBSを加え、細胞は37°Cで45分間あるいは容器の表面から分
離するまでインキュベートされる。収穫に先立ち、残る細胞は、細胞工場の定期
的に穏やかな“スランプ(slaps)″でゆるめられた。
インキュページ町ン期間の終わりに、細胞工場の内容物は、250 Xgで1o
分間遠心された。上澄み液を別に移し、細胞を20IdのPBS中で再懸濁し、
250 Xgで10分間遠心した。上澄み液を再び別に移し、細胞を最終容量2
0dのPBS中で再懸濁した。細胞の数を数えた。約10”の細胞が各々の細胞
工場から収穫された。
細胞懸濁液は、−70°Cで20dのPBSを含む、50dの遠心管中(細胞工
場あたり1つの管)で凍結された。
M−1およびM−2細胞工場の内容物の抗原性は、その抗原に特異的なマウスモ
ノクローナル抗体(Mab) 9. 2.27を用いて、1つのメラノーマー関
連抗原(p250)の量を測定することにより試験した。この抗体は、ラジジー
ラ ヵリホオルニアのスクリップス クリニック アンド リサーチ ファンデ
ーション(Scripps C11nic and Re5earch Fou
ndation LaJolla、Ca1ifornia)のラルフ@ラ
イスフェルト博士(Dr、Ra1ph Re1sfeld)より得た。
酵素イムノアッセイに基づいた結合阻害アッセイが、抗原単位(a、 u 、)
を決定するのに用いられた。セイヨウワサビ・ペロキシダーゼでラベルされたマ
ウス・モノクローナル抗体Mab 9. 2.27.150μmを、37℃で約
1時間、PGS、 1%BSA (ウシ血清アルブミン)の媒質中において、メ
ラノーマ溶解産物30t!lでインキュベートした。この混合物50μmを、ポ
リビニル・フアシヨン・ミクロフィルター・ウェルに固定されたメラノーマ細胞
を目標とするために、3倍にして(tripltcate)加え、37℃で1時
間、インキュベートした。洗浄後、0−フェニレンジアミンを含むペロキシダー
ゼ基質溶液を加えた。 30分後、反応が止まり、IJAプレート・リーダーで
の吸光度は490n−を指し示した。
標準的な結合曲線は、腹腔腫瘍に由来するメラノーマ溶解産物で作成される。
この曲線から、試験試料の抗原内容が決定された。1抗原単位(a、u、)は、
Mab 9゜2.27に対して最大限に(少なくとも20%の阻害率で)結合す
る純粋標準メラノーマ抽出物10μlに存在する抗原の量として定義される。エ
プスタイン、ミッチェルおよびブラックフォード・コンピュータ・コンサルタン
ッ(コネチヵット州、二ニー・ヘブン)のシェフエリ−・S・ミッチェルによっ
て開発された「カーブ・フィツト」と呼ばれるコンピュータ・プログラムが標準
曲線によって表された方程式から直接メラノーマ溶解産物を新しいロフトごとに
おける抗原単位の数を計算するのに用いられた。さらに、相当する腫瘍細胞の数
が記録された。約107個の細胞が100 a、u、に相当する。
実施例 ■
21土2の調製
実施例Hの細胞を一70℃で冷凍し、氷上にて解凍した。この細胞をポリトロン
・ステンレススチール・高速組織ホモジェナイザー(チクマールCo、、シンシ
ナチ、オハイオ)で機械的に粉砕した。顕微鏡下で完全な細胞が認められなくな
るまで、繰り返し細胞を粉砕した。各セル・ファクトリの細胞は独立に粉砕され
た。
それから細胞ラインおよびセル・ファクトリ両方からの溶解産物がプールされた
。
プール後、細胞溶解産物にPBSを加えて、溶解産物濃度をdあたり20X10
’τ、C,E。
(腫瘍細胞等りに調整した。
その溶解産物を計量中、エタノール/水バスに保持した。50mのプラスチック
の管に細胞溶解産物25dが満たされ、1dのアリコートが2mの無菌で空のピ
ロゲンのないバイアルに、25ゲージ針を使った1dのシリンジを用いて、注入
された。管は、シリンジ注入の前に手でもってよく振った。各バイアルの上部は
アルコールのスポンジで拭った。バイアルは氷上に置かれ、それから−70’C
に冷凍した。これに適合する他の適当な方法が用いられてもよい。
メラノーマ・ワクチン溶解産物の、FDAガイドライン下での無菌性(ster
ility)と発熱性についての試験が、アメリカン・マグロウ・バイオロジカ
ル・テストセンター(アーヴイン、カリフォルニア州)によっておこなわれ、満
足すべき結果が得られた。
メラノーマ・ワクチン熔解産物の、I(IV(AIDSウィルス)汚染について
の試験が、南カリフォルニア大学のドクター・スライ・ラシード研究所において
行われ、満足すべき結果が得られた。
メラノーマ・ワクチン溶解産物の、一般的な安全性と発熱性についての試験が、
アメリカン・マグロウ・バイオロジカル・テストセンター(アーヴイン、カリフ
ォルニア州)によっておこなわれ、満足すべき結果が得られた。
メラノーマ・ワクチン溶解産物の、肝炎汚染についての試験が、南カリフォルニ
ア大学血清学研究所でおこなわれ、満足すべき結果が得られた。
メラノーマ・ワクチン熔解産物の、ミクロソーマ汚染についての試験が、コリエ
ール・インスティチェートのメヂカル・リサーチ(カムデン、ニューシャーシー
州)で行われ、満足すべき結果が得られた。
注射の直前に、メラノーマ・ワクチン溶解産物はCWS/MPLアジュバントと
lOO12割合で十分に混ぜ合わされた。200 a、u、/d濃度の溶解産物
のldバイアルが0.25mff1のCWS/MPLアジュバントと混合された
。
実施例 ■
ユ2チヱΩ使里上ヱΩ結果
患者はおよそ1O120および40百万II!!瘍細胞等量、すなわち、250
μgのc−sおよび25dgのMPLを含むアジュバントDETOXと混合した
ワクチン1OO1200および400抗原単位を投与された。1抗原単位はマウ
ス・モノクローナル抗体9.2゜27に最大限(阻害率80%以上で)結合する
純粋な標準メラノーマ抽出物10ul中に存在する抗原の量として定義される。
17名の患者のデルタ帯または殿部に播種性メラノーマを皮下注射し、5名の患
者にも同様にして再発性の危険性が非常に高いが、転移性の予見のないメラノー
マを皮下注射した。少なくとも6名の患者が各投与レベルのワクチン(100,
200または400抗原単位)を投与された。ワクチンに対する正の皮膚試験を
うける患者1名がわずか50抗原単位の投与を受けた。
身体的な試験、エックス線照射、 CTスキャンなどによって、センチネル(s
enti−nel)な病変として選ばれた腫瘍のマスの最長の直径を1週問おき
に測り、治療後は2週問おきに測った0反応の程度と持続期間の両方を含む厳し
い標準定義が、完全寛解、部分寛解、少反応、無反応として臨床反応を分類する
のに用いられた。
この結果、「完全寛解」は少なくとも4週間の間、いがなる病変部も再発・再現
しなかったことを示す、「部分寛解」はすべての病変部の最大直径の合計が50
%に減少したのが少なくとも4週間続いたことを示す。「少反応」は、すべての
病変部の最大直径の合計が25−50%に減少したか、または50%減少が4週
間未満続いたことを示す。そして「無反応」は、少反応より劣った反応しか示さ
なかったことを表す。
注射後1日たって、注射部位にわずかな痛みが残った以外は、なんの毒性もみら
れなかった。2名の患者の注射部位数箇所に粒子状のものができたが、それは皮
下ごく上層に注射をしたためであった。全身的な副作用は観察されず、1週間ご
との一般的な血液検査、化学血液検査でも、生体器官に毒性を与えた証拠が認め
られなかった。同様に、発疹やアナフィラキシ−などの逆の免疫的影響も認めら
れなかった。
ワクチンの免疫効果はいくつかの方法で観察した。最も劇的な方法は、幾人かの
患者における測定可能な病巣の収縮であった。表1の「フエーブIトライアルの
要約」に示されるように、活性な免疫治療薬により、測定可能な病巣を持つ17
人の患者のうちの5人(29,3%)についてメラノーマの完全又は部分的回復
をもたらした。2名の患者はその病気から完全に回復し、他の3名は部分的回復
を示した。別の3名についてば軽微な応答がみられた。このうちの1名は大結節
の50%以上の回復がみられた。しかしながら、4週間は続かなかった。9名の
患者については応答がなかった。即ち、治療にもかかわらず進行性の症状であっ
た。
最も興味があるのは2名の完全回復であった。患者り、A、 (30才の女性)
は毎週200 a、u、 (抗原性単位)のワクチンを投与され、最初の投与後
1週間以内に右大腿部及び臀部の多数の皮下結節の縮小が始まった。この消散の
速かな始まりは200 a、u、投与に対応する全ての患者に共通していた。一
方、50又は100 a、u、の投与では、治療開始から3〜5週後に回復が始
まった。L、A、の結節の多くは3週間以内に触知不可能になり、6週間内に全
て消滅した。その患者は4cmの壊死性結節をもっており、それはゆっくりと縮
小していたが、座る際に不快であるため第5週目に切除した。消滅が最初に始っ
た時、患者の皮膚は硬化していたが、数ケ月の間に、徐々に以前の組織に戻った
。患者はソ経部靭帯の直上の右下四分の−の皮膚に新たな5閤の病巣を1個を生
じた。これは消炎が始ってから5ケ月半後に直ちに切除した。同じサイズの別の
1個も10ケ月後に切除した。このこと以外、この患者は、肺、肝および脳の通
常OCTスキャンによって証明されたようにほぼ2年間この病気の再発はなかっ
た。
1:フェーズI−の 、
(a)+−認められた評価; n1=最初の認識口n2=最高の日;
(b)0−−十 陽性への転化;+−−+十最初の領域よりも25%以上の増加
(C):治療前に存在したが、その後有意には増加しなかった抗体略語:a、u
、抗原性単位、EIA、酵素免疫検定;CR完全消散;22部分消散;MR1微
小応答;NE評価不能(検知不能の症状)患者J、 B、はこのテスト開始前の
3ケ月前に右わきの下からメラノーマを含む大きいリンパ結節を切除していた。
これはそれ以前のわきの下の病気の明らかに過激な切除によるものであった。患
者は、唯一の病巣である2、5 cts径のリンパ結節が、最初の注射1週間後
に検知し得る縮小を示した。注射は物理的試験及びCTスキャンで完全に消失す
るまで6週間のあいだ毎週行われた。8週の試験の間及びその後5.5ケ月間、
リンパ節疾患は生じなかった。腹膜後のリンパ節疾患はその際CTスキャンで見
つからず、この患者の試験は終了と考えられた。
問題の患者等は嵩高又は多数の皮下又はリンパ節腫瘍塊を持っていたので、部分
消散では満足しなかった。患者C,C,は右下肢からソ径部の領域にわたって、
病巣が散らばっていた。この病巣は0.8〜2.2cm径であった。全ての病巣
は、4回目の注射の後、1週間の間隔をおいて縮小し、2回目のワクチン投与コ
ース(5〜6週後)の中間まで大部分は小さくなったままであった。2つの結節
は3週間以内に検出不可能になった。残っている結節の生体組織片検査では、腫
瘍細胞の相当の壊死を示し、若干の末梢リンパ球浸潤を伴っていた。この両コー
スの間、特に第2のコースでは、結節は、特異なしたがってとても説明できない
ような3〜4日のサイズの変動を示した。患者C,C,は試験において最も少い
50au/週の投与量を与えた。これは患者が、治療前にメラノーマ皮膚試験で
陽性であった唯一の者であったためである。
患者?1. R,は3個の大きい(4〜5c+++)皮下結節、左副腎および肺
に塊を持ち、予しめ低投与量のシクロホスファミドを投与された後、200au
7週のコースを受けた。1週間以内に患者は、全ての皮膚結節の速やかな軟化
が認めら娠8日間の測定では病巣は小さく、平らになっていた。全ての病巣は1
ケ月以内に最小に達しており、治療後までには1つの病巣は検知不能になってい
た。
第3番目の患者、G、G、は、シクロホスファミド投与後に、400a、u、7
週の投与を行い6週間で多くのほぼ1c11径の皮下結節が平らになった。7週
間後、5個の注目している病巣の全てが縮小し、元のサイズの50%以下の凝集
体になった。
患者T、 B、は、低投与シクロホスファミド及び週100a、u、のワクチン
での治療の開始後3週間で始まったが、わずか3週間続いた皮下及びリンパ結節
塊の50%以上の縮小を示した。しかし、この患者の皮下小結節の一つは、極微
となりそしてそのままでいる。彼は、次いでシクロホスファミド+rL−2を受
け、存続PRを有しており、そして今や免疫治療開始後18月維持治療を受けて
いる。患者T、W、は、四つの大きな皮下転移を有しており、その一つは1週間
以内に縮小を開始し、直径が1.8 ctsから0.75cmに減少し、そして
その後511I11の寸法のままであった。他の三つの皮下塊及び肝臓中の病巣
は縮小しなかったので、彼の相互的応答はPRより小さかった。患者G、G、は
、わずか3週間続いた彼の皮下小結節のほぼ30%の後退を有した。
ここに記載された発明は、1988年10月15日発行Cancer Res、
48巻第5883〜5893頁のM、S、ミッチェル(Mi tchel I
)等のrActive 5pecific Immunotherapy fo
r Mel=|
noma;Phase I Trial of AIlogeneic Lys
ates and Novel Adjuvant Jにさ轤■■
しく記載されており、その刊行物及び開示は参考のためここに導入される。
本発明のある例示的具体化が詳しく記載されてきたが、本発明をその開示された
特定の形態及び方法に限定する意図がないことは了解されるべきである。それど
ころか、添付された請求の範囲中に表現された発明の精神及び範囲内に入るすべ
ての変更、均等物及び使用を包含することが意図である。
手続補正書(方式)
平成 4年 1月 6日
Claims (38)
- 1.異質遺伝子型の黒色腫瘍細胞から産生する黒色腫細胞溶解産物;とマイコバ クテリア細胞壁骨格、二ミコール酸トレハロース、微生物のピリジン可溶性抽出 物およびこれらの混合物からなる群より選択される1以上の生物学的免疫刺激物 および精製し無毒化した内毒素からなる抗原性補強剤とからなる免疫治療用黒色 腫瘍ワクチン。
- 2.前記精製し無毒素化した内毒物には、約500〜約800nmol/mgの リンおよび約1700〜約2000nmol/mgの脂肪酸が含まれており、検 知しうる量の2−ケト−3−デオキシオクタノエートは含まれていない請求項1 のワクチン。
- 3.前記精製し無毒化した内毒物がモノホスホリル脂質Aである請求項1のワク チン。
- 4.前記免疫刺激物がマイコバクテリア細胞壁骨格である請求項1のワクチン。
- 5.前記免疫刺激物が二ミコール酸トレハロースである請求項1のワクチン。
- 6.前記免疫刺激物が微生物のピリジン可溶性抽出物である請求項1のワクチン 。
- 7.前記免疫刺激物がマイコバクテリア細胞壁骨格と二ミコール酸トレハロース との混合物である請求項1のワクチン。
- 8.前記免疫刺激物がマイコバクテリア細胞壁骨格と微生物のピリジン可溶性抽 出物との混合物である請求項1のワクチン。
- 9.前記免疫刺激物が二ミコール酸トレハロースと微生物のピリジン可溶性抽出 物との混合物である請求項1のワクチン。
- 10.前記免疫刺激物がマイコバクテリア細胞壁骨格、二ミコール酸トレハロー スおよび微生物のピリジン可溶性抽出物の混合物である請求項1のワクチン。
- 11.前記微生物のピリジン可溶性抽出物には、約3〜約20重量%の蛋白質、 約10〜約40重量%の炭水化物および約35〜約70重量%の脂肪酸が含まれ ている請求項1のワクチン。
- 12.前記微生物のピリジン可溶性抽出物には、約4.5%の蛋白質、約37. 7%の炭水化物および約56.5%の脂肪酸が含まれている請求項1のワクチン 。
- 13.異質遺伝子型の黒色腫瘍細胞から産生する黒色腫細胞溶解産物;とマイコ バクテリア細胞壁骨格、二ミコール酸トレハロース、微生物のピリジン可溶性抽 出物およびこれらの混合物からなる群より選択される1以上の生物学的免疫刺激 物および精製し無毒化した内毒素からなる抗原性補強剤とからなるワクチンを、 黒色腫患者に抗腫瘍効果を奏する量投与することからなる患者の黒色腫瘍治療法 。
- 14.前記精製し無毒素化した内毒物には、約500〜約800nmol/mg のリンおよび約1700〜約2000nmol/mgの脂肪酸が含まれており、 検知しうる量の2−ケト−3−デオキシオクタノエートは含まれていない請求項 13の治療法。
- 15.前記精製し無毒素化した内毒物がモノホスホリル脂質Aである請求項13 の治療法。
- 16.前記免疫刺激物が二ミコール酸トレハロースである請求項13の治療法。
- 17.前記免疫刺激物が二ミコール酸トレハロースである請求項13の治療法。
- 18.前記免疫刺激物が微生物のピリジン可溶性抽出物である請求項13の治療 法。
- 19.前記免疫刺激物がマイコバクテリア細胞壁骨格と二ミコール酸トレハロー スとの混合物である請求項13の治療法。
- 20.前記免疫刺激物がマイコバクテリア細胞壁骨格と微生物のピリジン可溶性 抽出物との混合物である請求項13の治療法。
- 21.前記免疫刺激物が二ミコール酸トレハロースと微生物のピリジン可溶性抽 出物との混合物である請求項13の治療法。
- 22.前記免疫刺激物がマイコバクテリア細胞壁骨格、二ミコール酸トレハロー スおよび微生物のピリジン可溶性抽出物の混合物である請求項13の治療法。
- 23.前記微生物のピリジン可溶性抽出物には、約3〜約20重量%の蛋白質、 約10〜約4重量%の炭水化物および約35〜約70重量%の脂肪酸が含まれて いる請求項13の治療法。
- 24.前記微生物のピリジン可溶性抽出物には、約4.5%の蛋白質、約37. 7%の炭水化物および約56.5%の脂肪酸が含まれている請求項13の治療法 。
- 25.異質遺伝子型の黒色腫瘍細胞から産生する黒色腫細胞溶解産物;とマイコ バクテリア細胞壁骨格、二ミコール酸トレハロース、微生物のピリジン可溶性抽 出物およびこれらの混合物からなる群より選択される1以上の生物学的免疫刺激 物および精製し無毒化した無毒素からなる抗原性補強剤とからなるワクチンをホ ストに抗腫瘍効果を奏する量投与することからなるホストの黒色腫治療法。
- 26.異質遺伝子型の黒色腫瘍細胞をインビトロ培養することによって産生する 黒色腫細胞溶解物;とマイコバクテリア細胞壁骨格、二ミコール酸トレハロース 、微生物のピリジン可溶性抽出物およびこれらの混合物からなる群より選択され る1以上の生物学的免疫刺激物および精製し無毒化した内毒素からなる抗原性補 強剤とからなる、ホストの黒色腫の治療および予防に有用なワクチン。
- 27.薬剤学的に許容される担体をさらに含有する請求項26のワクチン。
- 28.MSM−M−1およびMSM−M−2およびこれらの混合物からなる群よ り選択されるセルラインから産生する異質遺伝子型の黒色腫瘍細胞の黒色腫細胞 溶解産物;とマイコバクテリア細胞壁骨格、二ミコール酸トレハロース、微生物 のピリジン可溶性抽出物およびこれらの混合物からなる群より選択される1以上 の生物学的免疫刺激物および精製し無毒化した内毒素からなる抗原性補強剤とか らなる免疫治療用黒色腫瘍ワクチン。
- 29.MSM−M−1およびMSM−M−2およびこれらの混合物からなる群よ り選択されるセルラインから産生する異質遺伝子型の黒色腫瘍細胞の黒色腫細胞 溶解産物;とマイコバクテリア細胞壁骨格、二ミコール酸トレハロース、微生物 のピリジン可溶性抽出物およびこれらの混合物からなる群より選択される1以上 の生物学的免疫刺激物および精製し無毒化した内毒素からなる抗原性補強剤とか らなる免疫治療用黒色腫ワクチンを黒色腫患者に抗腫瘍効果を奏する量投与する ことからなる患者の黒色腫瘍治療法。
- 30.MSM−M−1およびMSM−M−2およびこれらの混合物からなる群よ り選択されるセルラインから産生する異質遺伝子型の黒色腫瘍細胞の黒色腫細胞 溶解産物;とマイコバクテリア細胞壁骨格、二ミコール酸トレハロース、微生物 のピリジン可溶性抽出物およびこれらの混合物からなる群より選択される1以上 の生物学的免疫刺激物および精製し無毒化した内毒素からなる抗原性補強剤とか らなる免疫治療用黒色腫ワクチンをホストに抗腫瘍効果を奏する量投与すること からなるホストの黒色腫瘍治療法。
- 31.セルラインMSM−M−1およびセルラインMSM−M−2およびこれら の混合物からなる群より選択される異質遺伝子型の黒色腫瘍細胞をインビトロ培 養することによって産生する黒色腫細胞溶解産物;とマイコバクテリア細胞壁骨 格、二ミコール酸トレハロース、微生物のピリジン可溶性抽出物およびこれらの 混合物からなる群より選択される1以上の生物学的免疫刺激物および精製し無毒 化した内毒素からなる抗原性補強剤とからなる、ホストの黒色腫瘍を治療および 予防するのに有効なワクチン。
- 32.薬剤学的に許容される担体をさらに含有する請求項31のワクチン。
- 33.MSM−M−1およびMSM−M−2およびこれらの混合物からなる群よ り選択されるセルラインから産生する異質遺伝子型の黒色腫瘍細胞の黒色腫細胞 溶解産物;とマイコバクテリア細胞壁骨格、二ミコール酸トレハロース、微生物 のピリジン可溶性抽出物およびこれらの混合物からなる群より選択される1以上 の生物学的免疫刺激物および精製し無毒化した内毒素からなる免疫的な効果を奏 する量の抗原性補強剤とからなることを特徴とする免疫治療用黒色腫ワクチン組 成物。
- 34.セルラインMSM−M−1。
- 35.セルラインMSM−M−2。
- 36.セルラインMSM−M−1から産生する黒色腫瘍細胞の黒色腫細胞溶解産 物。
- 37.セルラインMSM−M−2から産生する黒色腫瘍細胞の黒色腫細胞溶解産 物。
- 38.セルラインMSM−M−1およびMSM−M−2から産生する黒色腫傷細 胞の黒色腫細胞溶解産物。
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