TW202237158A - 赤紅球菌產品在治療放射病中的用途 - Google Patents

Abstract

本揭露關於赤紅球菌產品在治療放射病中的用途。具體而言，本揭露提供了一種包含赤紅球菌細胞壁或其成分的赤紅球菌產品，可有效治療或緩解放射病及其症狀。

Description

赤紅球菌產品在治療放射病中的用途

本揭露關於醫學領域、微生物領域、生物製藥領域。具體而言，關於赤紅球菌及其細胞壁成分、製劑、醫藥組成物、製備方法、以及赤紅球菌的細胞壁成分在製備治療放射病的藥物/醫療裝置中的用途。

赤紅球菌(Rhodococcus ruber)(也稱為紅色紅球菌)，革蘭氏陽性菌。通常而言，菌落呈桔黃色或呈桔紅色，圓形；菌落大小約1mm至2mm；細胞形態為球狀或短杆狀；可形成初級分枝菌絲體；無鞭毛。赤紅球菌好氧，化能異養。

目前，已有研究人員對赤紅球菌進行了全基因側學。例如，樊欣等人對赤紅球菌SD3株的全基因組進行測序，並進行生物信息學分析。SD3株的全基因組長度大約為5.37Mb，GC含量約為70.63%，GenBank登錄號為CP029146(樊欣，赤紅球菌SD3全基因組測序及其熱休克蛋白DnaK的表達分析，基因組學與應用生物學，2019年1月)。

紅球菌屬Rhodococcus，因其自身具有非常強的有機物耐受性，以及較寬的降解譜，能夠適應多種生存環境。因此，紅球菌屬被廣泛應用於污染修復、有機化合物降解、汙水處理等領域。目前，赤紅球菌的主要應用領域在於環境治理，參見CN108862590A、CN107151635A、CN102250796A、CN1519312A、CN103627653A、CN101033454A、CN108130288A、CN104830738A、CN101619299A、CN103509833A、CN106434466A、CN101580808A、CN102604875A、CN103160491A、CN106591168A、CN106591172A、CN105820982A。

CN109576180A中公開了一種從廣州市番禺區附近郊野紅土中篩選到的菌RDC-01，經16S rRNA基因序列分析和培養特性鑑定，該菌株鑑定為赤紅球菌。將該菌滅活後，作為免疫佐劑添加入動物用的滅活疫苗中，發現可以促進動物生產抗體。

放射病是機體在受到大劑量輻射時引起的全身性或局部性疾病(包括其症狀)。體內輻射和體外輻射都可能發生放射病。引起放射病的射線有γ線、中子和X射線等。

輻射後的初期，有噁心和食欲減退等症狀，照射劑量可能大於1Gy；有嘔吐的情況，可能大於2Gy。輻射後數小時內出現多次嘔吐，並很快發生嚴重腹瀉，但無神經系統症狀的情況，可考慮為腸型放射病。輻射後1小時內頻繁嘔吐、定向力障礙、共濟失調、肢體震顫、肌張力增強的情況，可診斷為腦型放射病。

在臨床治療中，放射療法是利用射線治療腫瘤或癌症的一種局部治療方法。射線包括α、β、γ和x射線治療機或加速器產生的射線、電子線、質子束、及其他粒子束。然而，放射療法常會伴有多種副作用或併發症：

-全身反應：表現為乏力、眩暈、頭痛、噁心、嘔吐等。

-血液變化：主要表現為白細胞和血小板減少。

-皮膚反應：照射部位可出現充血、色素沉著、乾性脫皮、濕性脫皮、皮膚萎縮、表皮毛細血管擴張、皮下脂肪纖維組織纖維化等。

-黏膜反應：可有潮紅、腫脹、發乾、表淺潰瘍及蒼白假膜形成；肺癌病人常可出現食管炎。

-其它組織的反應：中樞神經系統受到大量照射後會發生腦壞死、放射性脊髓炎等；盆腔大劑量照射可發生尿急、尿痛、尿頻、血尿、大便次多及裡急後重等膀胱及直腸刺激症狀。

然而，現有技術中尚未有報導赤紅球菌在放射病中的作用，也沒有報導其在改善或緩解放射療法所致的皮膚和黏膜副作用或併發症中的用途。

根據本揭露的一些實施方案，提供了一種分離的赤紅球菌(Rhodococcus ruber)。

根據本揭露的一些具體的實施方案，提供了一種赤紅球菌，其於2019年03月22日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏(北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所；郵政編碼：100101；China General Microbiological Culture Collection Center.Address：Institute of Microbiology,Chinese Academy of Sciences,No.1 West Beichen Road,Chaoyang District,Beijing China)，保藏編號為CGMCC No.17431。該保藏滿足《國際承認用於專利程序的微生物保存布達佩斯條約(Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure)》的規定。

根據本揭露的一些實施方案，提供了赤紅球菌及其衍生產品。該衍生產品源自赤紅球菌，包含赤紅球菌的組成成分(如蛋白、核酸、脂質、細胞壁及其組成成分、碳水化合物、代謝物)。

在具體的實施方案中，提供了一種分離的赤紅球菌細胞壁。

在具體的實施方案中，提供了一種分離的赤紅球菌細胞壁，該赤紅球菌是指保藏號為CGMCC No.17431的株。

在具體的實施方案中，提供了一種分離的赤紅球菌細胞壁骨架。

在具體的實施方案中，提供了一種分離的赤紅球菌細胞壁骨架，該赤紅球菌是指保藏號為CGMCC No.17431的株。

根據本揭露的一些實施方案，提供了醫藥組成物，其包含根據本揭露的赤紅球菌的細胞壁或赤紅球菌的細胞壁骨架。

根據本揭露的一些實施方案，提供了一種赤紅球菌產品，其包含赤紅球菌經粉碎後所得的產物。

根據本揭露的另一些實施方案，提供了一種赤紅球菌產品，其包含赤紅球菌經粉碎並經過純化(除脂、除核酸、除蛋白)所得的產物。

根據本揭露的另一些實施方案，提供了一種赤紅球菌產品，其包含赤紅球菌的細胞壁。

根據本揭露的另一些實施方案，提供了一種赤紅球菌產品，其包含赤紅球菌的細胞壁骨架。

根據本揭露的一些實施方案，提供了一種醫藥組成物或醫療裝置，其包含赤紅球菌經粉碎後所得的產物。

根據本揭露的另一些實施方案，提供了一種醫藥組成物或醫療裝置，其包含赤紅球菌經粉碎和經過純化(除脂、和/或除核酸、和/或除蛋白質)後所得的產物。

根據本揭露的另一些實施方案，提供了一種醫藥組成物或醫療裝置，其包含赤紅球菌的細胞壁。

根據本揭露的另一些實施方案，提供了一種醫藥組成物或醫療裝置，其包含赤紅球菌的細胞壁骨架。

根據本揭露的另一些實施方案，提供了一種醫藥組成物或醫療裝置，其包含上述赤紅球菌產品。

在具體的實施方案中，醫藥組成物還包含藥學上可接受的賦形劑。

在一些實施方案中，醫藥組成物中該赤紅球菌產品為1個重量份，藥學上可接受的賦形劑為100至1000個重量份(100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000)，較佳200個至500個重量份，更佳200至300個重量份(例如，200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300以及任意兩個數值範圍內的任意點值)。

在另一些實施方案中，醫藥組成物中赤紅球菌細胞壁為1個重量份，該藥學上可接受的賦形劑為100至1000個重量份(100、200、300、400、 500、600、700、800、900、1000)，較佳200個至500個重量份，更佳200至300個重量份(例如，200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300以及任意兩個數值範圍內的任意點值)。

在又一些實施方案中，醫藥組成物中赤紅球菌細胞壁骨架為1個重量份，該藥學上可接受的賦形劑為100至1000個重量份(100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000)，較佳200個至500個重量份，更佳200至300個重量份(例如，200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300以及任意兩個數值範圍內的任意點值)。

在一些實施方案中，醫藥組成物可以製備成液態的(液體製劑)。

在另一些實施方案中，醫藥組成物可以製備成固體的(乾粉製劑或凍乾粉製劑)。

所屬技術領域具有通常知識者理解，對於本揭露的醫藥組成物而言，液體製劑和乾粉製劑(或凍乾粉製劑)，二者可以相互轉化，差別僅在於含水量。除去液體製劑中的絕大部分或全部水，得到乾粉製劑(或凍乾粉製劑)。乾粉製劑(或凍乾粉製劑)溶解(或複溶)後得到液體製劑。

在一些實施方案中，藥物或醫藥組成物被製備成選自以下的劑型：膏劑、霜劑、乳液、混懸劑、糊劑、凝膠劑、洗劑、酊劑、油劑、片劑、氣霧劑、噴霧劑、搽劑、粉劑、栓劑；其中，該膏劑選自：軟膏劑、硬膏劑、乳膏劑。

在一些實施方案中，劑型是適合應用至病灶上的形式。例如，噴霧、軟膏、洗劑、敷料、貼片、膠囊、片劑、含片。

在一些實施方案中，該藥學上可接受的賦形劑涉及但不限於：填充劑、穩定劑、矯味劑、崩解劑、黏合劑、潤滑劑。

在一些實施方案中，該藥學上可接受的賦形劑，例如但不限於：右旋糖酐、乳糖、微晶纖維素、海藻糖、甘胺酸、木糖醇、羧甲基纖維素鈉、赤蘚糖醇、明膠、硬脂酸鎂、拋射劑、保濕劑、溶劑、增溶劑、乳化劑、抗氧化劑、pH調節劑、防腐劑。

在一些實施方案中，該藥學上可接受的賦形劑的非限制示例還包括：白凡士林、卡波姆、羥丙甲纖維素、甲基纖維素、羥甲基纖維素鈉、殼聚糖、硫糖鋁殼聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、玻璃酸鈉、二甲醚、四氟乙烷、氫氟烷烴、甘油、丙二醇、去離子水、注射用水、蒸餾水、乙醇、十六醇、十八醇、對胺基苯甲酸、乙醯胺、異丙醇、吐溫、聚氧乙基氫化蓖麻油、硬脂酸、單硬脂酸甘油酯、三聚甘油單硬脂酸酯、脂肪酸蔗糖酯、蔗糖酯、乙酸異丁酸蔗糖糖酯、山梨醇酐三硬脂酸酯、肉豆蔻酸異丙酯、膽固醇、角鯊烯、角鯊烷、正丁醇、乙二醇、乙醇、丙二醇、聚甘油酯、亞硫酸鹽、半胱胺酸、二叔丁基羥基甲苯、山梨酸鉀、磷酸緩衝溶液、三乙醇胺、氫氧化鈉、乙二胺、月桂胺、碳酸氫鈉、鹽酸、尼泊金類、硫柳汞、氯甲酚、三氯叔丁醇、苯甲酸及其鈉鹽。

根據本揭露的一些實施方案，提供一種赤紅球菌產品的製備方法，其包括以下步驟或由以下步驟組成：

1)提供赤紅球菌；

2)視需要，培養該赤紅球菌；

3)視需要，收集經培養的赤紅球菌；

4)粉碎該經培養的赤紅球菌，得到粉碎產物；

5.1)視需要，對該粉碎產物進行去除脂質的操作；

5.2)視需要，對該粉碎產物進行去除核酸的操作；

5.3)視需要，對該粉碎產物進行去除蛋白質的操作；

5.4)得到純化產物；

6)視需要地，除去該純化產物中的水，較佳藉由冷凍乾燥除去該純化產物中的水；

7)視需要地，進行分裝；

8)收穫該赤紅球菌產品；

其中，步驟5.1)、5.2)、5.3)可互換順序或可並行；步驟6)和步驟7)可互換順序。

視需要地，根據需要，步驟5)中還可以包含(例如用非離子型表面活性劑)去除細胞膜的步驟。

赤紅球菌的培養不限於具體的培養介質和培養參數，所屬技術領域具有通常知識者可以採用公知的適當方式進行培養，可以根據製備規模採用培養皿、培養瓶、發酵罐。

對於赤紅球菌的粉碎，其目的在於去除細胞內的物質，因此可以採用超聲破碎、溶菌酶等技術。所屬技術領域具有通常知識者理解，任何適用於破碎革蘭氏陽性菌的已知或未來方法，均適用於本揭露技術方案。

所屬技術領域具有通常知識者有能力根據活性成分(細胞壁及其組成成分)的後續應用(例如外敷等)，來調整培養、破碎、分離、收集、除雜質、分裝的具體參數和設備，以免製備步驟中引入影響後續應用的因素。

在一些實施方案中，利用例如有機溶劑去除破碎產物中的脂質。在一些實施方案中，利用例如核酸酶去除破碎產物中的DNA和RNA。在一些實施方案中，利用例如水解酶降解破碎產物中的蛋白質。在一些實施方案中，利用例如表面活性劑去除破碎產物中的細胞膜。

在一些實施方案中，粉碎的平均粒度為10nm至1000nm；可以提及10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190nm±10nm，以及上述任意兩個數值之間的範圍。粒度的測試方法有很多(胡松青等人，現代顆粒粒度測量技術，現代化工，2002年22：1)。

在一些具體的實施方案中，粉碎的平均粒度為10nm至800nm。

在另一些具體的實施方案中，粉碎的平均粒度為10nm至500nm。

在一些實施方案中，該分裝是指分裝至容器或置於固體支持物上。該容器選自：瓶、管、包、袋、板、安瓿、注射裝置、鋁膜包裝、敷料、膠囊。

例如，在具體的實施方案中，該分裝是指分裝至瓶/安瓿中。臨用前，向瓶/安瓿中添加溶劑。

根據本揭露的一些實施方案，提供了一種赤紅球菌產品，其是藉由根據本揭露的方法製備所得。

根據本揭露的一些實施方案，提供了一種醫藥組成物或醫療裝置，其包含根據本揭露的方法製備所得的赤紅球菌產品。

根據本揭露的一些實施方案，提供了一種分離的赤紅球菌細胞壁，其用於治療放射病。

根據本揭露的一些實施方案，提供了一種赤紅球菌產品，其用於治療放射病。

根據本揭露的一些實施方案，提供了一種醫藥組成物或醫療裝置，其用於治療放射病。

根據本揭露的一些實施方案，提供根據本揭露的赤紅球菌細胞壁在治療放射病中的用途。

還提供了本揭露的赤紅球菌細胞壁在製備用於治療放射病的藥物/醫療裝置中的用途。

根據本揭露的一些實施方案，提供根據本揭露的赤紅球菌產品在治療放射病中的用途；還提供了本揭露的赤紅球菌產品在製備用於治療放射病的藥物/醫療裝置中的用途。

根據本揭露的一些實施方案，提供根據本揭露的醫藥組成物在治療放射病中的用途。

在一些實施方案中，放射病是輻射所致的放射病。

在一些實施方案中，該輻射是電離輻射或非電離輻射。

在一些實施方案中，該放射病是由選自以下的任一項或其組合所致：α射線、β射線、x射線、γ射線、中子輻射。

在一些實施方案中，該放射病是放射療法所致副作用和/或放射療法所致併發症。

在一些實施方案中，放射療法所致副作用和/或放射療法所致併發症尤其是指涉及表皮、真皮和/或黏膜相關的副作用和/或併發症。

在一些實施方案中，放射病可以累及以下組織：表皮層、真皮層、黏膜(如消化道黏膜)、皮下組織。

在一些具體的實施方案中，該醫療裝置(如敷料、貼片、繃帶、膜、貼片等)用於治療放射病。

根據本揭露的一些實施方案，還提供了一種治療放射病的方法，包括使受試者(病灶)接觸治療有效量的選自以下的任一項：

-根據本揭露的分離的赤紅球菌細胞壁、

-根據本揭露的赤紅球菌產品、

-根據本揭露的醫藥組成物、

-根據本揭露的醫療裝置。

在一些具體的實施方案中，針對病灶的面積或嚴重程度的不同，採用藥物(或醫療裝置)施用至病灶。例如，但不限於用包含赤紅球菌細胞壁骨架的藥物塗抹、或者用浸有赤紅球菌細胞壁骨架的貼片覆蓋在病變處、或包含赤紅球菌細胞壁骨架的凍乾粉在病灶直接施用、在病灶上施用包含赤紅球菌細胞壁骨架的膏體、洗劑等。當病灶位於消化道時，可以口服施用包含赤紅球菌細胞壁骨架的膠囊、片劑、溶液等。

每次的施用量，視患者病灶的面積大小及嚴重程度不同採用不同的劑量，通常為5μg至800μg/單位劑量/每次，較佳為10μg至600μg/單位劑量/每次。

在一些具體的實施方案中，接觸的週期為：持續2天至4個月或更長。具體而言，例如2、4、6、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60天；再比如，可以提及1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、 10週、11週、12週、13週、14週、15週、16週、17週、18週或更長。在具體的實施方案中，向受試者施用3-5週活性成分。

在一些實施方案中，按照以下頻率進行施用：一天施用1至3次、兩天施用1至6次、三天施用1至9次、一週施用1至14次、一月施用1至60次。在一些實施方案中，一天施用兩次，或一天施用一次，或二天施用一次。

每次施用量視受試者具體情況的不同採用不同的劑量，通常為1μg至1000μg/單位劑量/每次施用；具體而言，例如1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200μg/單位劑量/每次、以及前述任意兩個數值之間的範圍。

在一些具體的實施方案中，本揭露的赤紅球菌產品、醫藥組成物或醫療裝置與病灶部位接觸：數分鐘至數小時，如30分鐘至24小時。

在一些具體的實施方案中，本揭露的赤紅球菌產品、醫藥組成物或醫療裝置與病灶部位接觸的週期為：一天一次，或者一天兩次，或者兩天一次。

在一些實施方案中，前述治療方法適用於任何具有皮膚/黏膜結構的動物，包括但不限於：人、非人靈長動物、豬、牛、馬、羊、犬、貓、鼠、兔。

在一些具體的實施方案中，受試者是人以外的動物，例如用於農場動物、寵物、工作動物、觀賞動物、生產動物。

在具體的實施方案中，受試者是人；尤其是經輻射的受試者。作為一個示例，受試者是經放射療法處理過的患者；尤其是，經放射療法處理後，出現了皮膚、真皮和/或黏膜症狀的患者。

在一些具體的實施方案中，藥物或醫療裝置中的唯一治療性(或預防性)活性成分是源自赤紅球菌的產品，尤其是包含赤紅球菌組成成分(如蛋白、核酸、脂質、細胞壁及其組成成分、碳水化合物、代謝物)的產品，具體而言包含赤紅球菌細胞壁(更佳赤紅球菌細胞壁骨架或其組成)的產品。

圖1A至圖1C：本申請的醫藥組成物改善化療所致的傷口癒合。

圖2A至圖2D：本申請的醫藥組成物改善化療所致的傷口癒合。

圖3A至圖3G：本申請的醫藥組成物在大鼠輻射模型中對皮膚損傷創面的癒合促進作用。45Gy輻射後1週(圖3A和圖3E)、2週(圖3B和圖3F)、3週(圖3C和圖3G)、4週(圖3D和圖3H)；圖3A至圖3D為對照組(照射後僅施用對照組成物，即和本申請的組成物相比不含細胞壁骨架)；圖3E至圖3H為治療組，施用有本申請的組成物。

“分離”是指本揭露的赤紅球菌脫離其原始生長環境。

所屬技術領域具有通常知識者知曉，革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的細胞壁結構不同。具體而言，革蘭氏陽性菌的細胞壁較厚(通常20nm至80nm)，含有約90%的肽聚糖和約10%的磷壁酸(一種由醇和磷酸分子形成的聚合物，通常以糖酯或胺基酸酯的形式存在)。肽聚糖層緻密，甚至多達20層。然而，革蘭氏陰性菌的細胞壁比革蘭氏陽性菌的細胞壁要薄很多，結構較複雜，分為外膜(outer membrane)和肽聚糖層(通常2nm至3nm)。

肽聚糖層是細菌細胞壁中特有成分，是一種雜多糖的衍生物。每一個肽聚糖的單體包括3部分：糖單元(例如，至少兩種糖分子藉由糖苷鍵連接起來，構成肽聚糖的框架性結構)、肽尾(由若干胺基酸連接成的短肽鏈，其連接在N-乙醯胞壁酸分子上)、和肽橋(將相鄰“肽尾”交聯形成高強度的網狀結構)。不同細菌的肽橋、肽尾、交聯方式是不同的。

分離的赤紅球菌細胞壁

在本揭露中，“分離的赤紅球菌細胞壁”既可以理解為完整的細胞壁，也可以理解為不完整的細胞壁(例如，破碎的、或部分降解的)。在本揭露的教導下，所屬技術領域具有通常知識者將理解，顯示出所需活性的成分來自赤紅球菌的細胞壁(例如，是細胞壁本身或其組成)。因此，在臨床應用中允許採用完整的細胞壁、經破碎的細胞壁、細胞壁的不完全降解產物、細胞壁的組成成分、細胞壁的提取物等各種形式，這些都包含在本揭露範疇之內。

細胞壁骨架

構成細胞壁主體結構的組成成分；但不能理解為僅僅表示細胞壁當中的交聯網狀實體，所屬技術領域具有通常知識者理解不排除交聯網狀實體上所吸附、結合、攜帶的其他細胞壁成分。

赤紅球菌

本揭露實施方案中所用的赤紅球菌是指紅球菌屬(Rhodococcus)的赤紅球菌種(Rhodococcus ruber)，不限於特定的細胞株。

非限制性示例包括TOY7株(南京農業大學農業環境微生物菌種保藏中心)、CGMCCNo.4795、DSM43338、CCTCC No.2012035、CGMCC No.16640、CGMCC No.17431。

赤紅球菌的鑑定

根據已知的或未來的微生物鑑定技術，所屬技術領域具有通常知識者可以對一株細菌進行分類學鑑定，例如可用的鑑定技術包括形態學、生理生化特徵、16S rRNA等。所屬技術領域具有通常知識者理解，隨著科技的發展，鑑定技術涉及不同的手段，在較早的時期主要採用形態學和生化鑑定方式，但是這種方法的可靠程度不高。測序技術出現後，所屬技術領域具有通常知識者可以利用更為可信的方式鑑定菌株。例如，當16S rRNA的DNA序列被鑑定為具有97%(含)以上相似性時，判定兩個菌屬於相同的種(華苟根等人，紅球菌屬的分類及應用研究進展，微生物學通報，2003：30(4))。就赤紅球菌而言，將保藏在國際(或國家級)菌種保藏單位中的已知菌株作為模式菌株，並與其進行比對。

劑型

本揭露的藥物或醫藥組成物或活性成分或產品，可以體現為但不限於以下形式：軟膏劑、乳膏劑、硬膏劑、凝膠劑、片劑、洗劑、酊劑、搽劑、油劑、糊劑、散劑、粉劑、噴霧劑、氣霧劑、栓劑、貼片、懸液、漱口液、口含片、輔料、貼片、繃帶、貼膜、紗布。

製劑單元

本揭露的藥物或醫藥組成物或活性成分或產品，可以製備成單位製劑(單元製劑)的形式。

在一些實施方案中，該藥物(或製劑、或治療劑、或醫療裝置)中的單位劑量含有：

-1μg至1000μg該赤紅球菌產品；或

-1μg至1000μg該赤紅球菌細胞壁；或

-1μg至1000μg該赤紅球菌細胞壁骨架。

單位劑量的具體示例是1、2、5、10、15、20、25、30、40、50、55、56、57、58、59、60、61、62、63、65、66、67、68、69、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500μg±10%、以及上述任意兩個數值之間的範圍。

“施用”、“給予”、“提供給”、“處理”當應用於動物、人、細胞、組織、器官或生物樣品時，是指藥物或醫療裝置與動物、人、細胞、組織、器官或生物樣品接觸。

“治療”意指給予受試者內用或外用藥物(治療劑、活性成分或組成物)(如，根據本揭露的赤紅球菌細胞壁或其醫藥組成物)或醫療裝置，在被治療的受試者(或群體)中緩解(減輕、延遲、改善、治癒)一種或多種疾病症狀，以至於達到臨床可測量的程度，其中該受試者已經患有、疑似患有或易感於一種或多種疾病或其症狀。

有效緩解任何疾病症狀的藥物(治療劑、活性成分或組成物)的量稱為治療有效量。可根據多種因素變化，例如受試者的疾病狀態、年齡和體重。應當理解，在緩解單個受試者的目標疾病或其症狀時，藥物(治療劑、活性成分或組成物)可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法(如Student T檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗)確定，藥物(治療劑、活性成分或組成物)在統計學意義上對目標疾病或其症狀是有效的。

“視需要”意味著其隨後所描述的事項可以發生，但不必須發生；需要視情況而定。例如，“視需要地，進行分裝”意味著允許對產品進行分裝，但是不是必須進行分裝；分裝與否不影響技術效果的實現。

“一個”、“一”、“單個”、“該”，如果沒有明確說明，也包括複數形式。

以下結合實施例、製備例和測試例，進一步描述本揭露。但這些實施例、製備例和測試例並非限制著本揭露的範圍。當未註明具體條件時，按照常規條件、按照原料供應商所建議的條件操作。未註明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。

所屬技術領域具有通常知識者尤其理解，雖然以下具體示例採用了特定的細胞株，但是技術效果的實現不限於該特定的細胞株，任何屬於紅球菌屬赤紅球菌種的(Rhodococcus ruber)物種均適用。

[實施例]

實施例1.菌株保藏

發明人將實驗室保存的主代菌株於2019年03月22日保藏在北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.17431。經檢測表明，所寄存的菌株存活。

實施例2.菌株鑑定

1.菌落形態特徵的裸眼觀測

在甘油瓊脂培養介質上，30-37℃(具體為32-35℃)培養12至72(具體為36至60，例如40-50)小時：

-菌落隆起；

-呈桔紅色(受光線、培養介質顏色等影響，則略有差別)；

-表面乾燥皺起、稍顯光澤(隨培養條件差別，則略有差別)；

-輕觸易碎；

-菌落大小約1mm至2mm(隨培養條件差別，則略有差別)。

2.顯微鏡觀察

-菌體呈分枝狀，有橫隔膜，形成菌絲體(隨培養條件差別，則略有差別)；

-菌絲分裂形成規則的短粗細胞(隨培養條件差別，則略有差別)；

-培養4至5天時，菌體成短杆狀或球形(隨培養條件差別，則略有差別)。

3.染色性

革蘭氏染色陽性。

4.生化反應

取甘油瓊脂斜面培養介質上，30-37℃(具體為32-35℃)培養12至72(具體為36至60，例如40-50)小時培養。然後，對培養物進行以下各項測試。

4.1碳水化合物產酸：

呈陽性：甘油、甘露醇、山梨醇、D-阿拉伯糖醇、D-果糖、D-葡萄糖；

呈陰性：肌醇、菊糖、乳糖、蔗糖、澱粉、麥芽糖、糖原、木糖醇、葡萄糖酸鹽、海藻糖、赤蘚醇、松三糖、蜜二糖、棉子糖、纖維二糖、苦杏仁甙、龍膽二糖、阿東醇、熊果甙、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、α-甲基-D-葡萄糖甙、α-甲基-D-甘露糖甙、D-核糖、D-木糖、L-木糖、N-乙醯-葡糖胺、D-松二糖、D-來蘇糖、β-甲基-D-木糖甙、D-半乳糖、D-塔格糖、D-岩藻糖、L-岩藻糖、D-甘露糖、L-山梨糖、L-阿拉伯糖醇、L-鼠李糖、2-酮基-葡萄糖酸鹽。

4.2酶活性測定(API ZYM)：

呈陽性：鹼性磷酸酶、類脂酯酶(C8)、類脂酶(C14)、白胺酸芳胺酶、纈胺酸芳胺酶、胱胺酸芳胺酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、酸性磷酸酶、萘酚-AS-B1-磷酸水解酶、α-葡萄糖苷酶；

呈陰性：N-乙醯-葡萄糖胺酶、酯酶(C4)、β-半乳糖苷酶、β-糖醛酸苷酶、β-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶、α-甘露糖苷酶、β-岩藻糖苷酶。

4.3硝酸鹽還原反應陽性、接觸酶陽性、酪胺基酸酶陽性、澱粉酶陰性、氧化酶陰性、明膠液化陰性。

4.4唯一碳源：

Biolog Gen II 葡糖醛醯胺、β-羥基-DL丁酸、D-果糖-6-磷酸、α-D-葡萄

生長實驗：糖、D-果糖、D-甘露醇、D-阿糖醇、D-山梨醇、奎寧酸、γ-胺基丁酸、檸檬酸、L-蘋果酸、溴丁二酸、吐溫40、丙酸、乙酸呈陽性；

Biolog Gen III 對二甲胺四環素、十四烷硫酸鈉、利福黴素SV、pH5.0、8%

化學敏感實驗：氯化鈉、林可黴素、夫西地酸、D-絲胺酸、萬古黴素、四唑紫、四唑藍敏感；

對溴酸鈉、1%乳酸鈉、pH6.0、1%-4%氯化鈉、萘啶酸、氯化鋰、亞碲酸鉀、胺曲南、丁酸鈉不敏感。

4.5.16S rRNA鑑定

對工作種子管中分離的15株菌和原始種子管中分離的10株不同菌株，進行基因組提取、16Sr RNA擴增、並測序。總計25個菌株的16Sr RNA基因同一性為100%。這表示25個菌株為相同種屬。

同時，基於Kimura2-參數算法構建的neighbor-joining菌株進化樹，結果顯示菌株歸屬為Rhodococcus ruber。

[製備例]

製備例1.培養方法

1.可以藉由常規的微生物生產方法，培養赤紅球菌。

2.培養方式既可為固體培養，也可為液體培養(比如搖瓶、發酵罐)。

3.對培養介質中的營養源並無特殊的限制，培養介質中含有培養革蘭氏陽性菌常用的碳源、氮源及其它營養源。

-碳源是赤紅球菌可以利用的任何碳源。例如，果糖、葡萄糖等。

-氮源：肉膏、蛋白腖、銨鹽、硝酸鹽以及其它有機或無機含氮化合物。

-其它營養源：可適當添加無機鹽。例如NaCl、磷酸鹽等。

4.對培養條件(溫度、時間等)並無嚴格的限制，所屬技術領域具有通常知識者可以根據初步的小規模的中試數據，自行選擇使其產量最高的條件。

5.作為一個示例，採用以下培養條件發酵赤紅球菌：

(1)培養介質組成包含：

蛋白腖、牛肉膏、氯化鈉、磷酸鹽、甘油(以及，視需要瓊脂，當固體培養時)。

(2)培養的方法參數：

工作菌種復蘇後，轉移至固體培養介質上維持3-5天，再轉移至液體培養(30-37℃，維持3-5天)，可以採用補料分批的半連續模式，也可以採用分批模式。培養期間監控pH、細菌密度、溶解氧、碳源消耗。

製備例2.菌體破碎

收集製備例1所得到的菌，對細胞進行粉碎(例如但不限於藉由超聲波破碎)。也允許採用本領域任何適當的公知方法對菌體進行破碎，例如CN101250490A或CN101323865A。

顯微鏡下檢查粉碎的情況，每個視野有形菌不得超過5個，檢查若干(10至30個)視野均達到此標準為合格。

製備例3.去除非細胞壁成分

1.除核酸：

將破碎產物進行離心，獲得的沉澱物中加入DNA酶和RNA酶，按照酶的供應商建議的操作去除核酸。

2.除蛋白質：

沉澱物加入常見的蛋白酶(例如胰蛋白酶)，按照酶的供應商建議的操作去除蛋白質。

3.除脂質：

沉澱物中加入有機試劑(如但不限於丙酮、乙醚、乙醇中的一種或組合)，按照本領域常規操作去除脂質。

4.除細胞膜：

沉澱物中加入TritonX-100，按照本領域常規操作，離心收集沉澱物，用PBS漂洗。

應當理解，上述除去雜質的步驟之間，所屬技術領域具有通常知識者可以調整先後順序，使得步驟之間兼容。去除非細胞壁成分後，將沉澱物複溶於注射用水，待用。視需要地，可以在115℃下滅菌20-30分鐘，作為細胞壁骨架的原液(包含細胞壁骨架及其組成成分)。

除了上述方法，所屬技術領域具有通常知識者還可以使用本領域已知的或未來的方法以去除非細胞壁成分，例如CN105779326A中公開的萃取細胞壁成分的方法。

5.產量

從159個克氏瓶中共收集菌液653ml(破碎後)；濕重產量為138g；細胞壁骨架產量為約0.87g/克氏瓶。

製備例4.醫藥組成物(醫療裝置)的製備方法

1.液體組成物

向製備例3所得產物中加入賦形劑(如右旋糖酐40、甘露醇或海藻糖)。分裝後，即為醫藥組成物。

2.凍乾粉組成物

將第1項的醫藥組成物凍乾，製得凍乾粉(分別編號為凍乾粉組成物1至7)。

3.製劑的製備方法

(1)敷料

將第1項的醫藥組成物(活性成分60μg至120μg，例如60μg、70μg、80μg、90μg、100μg、110μg、120μg)塗覆在敷料(例如無菌紗布)上，製備成外用醫療裝置。

(2)貼片或貼膜

採用本領域公知的方法，製備貼膜(例如中國申請號201610605617.5、201510614414.8、200610200450.0、201610511974.5、201610471977.0等公開的方法)。

例如：將成膜材料聚乙烯醇、卡波姆、羥丙基纖維素加如水中，溶脹，形成均質黏稠液；向其中加入第1項的醫藥組成物(分別地，組成物1至7)，並混勻；靜置消泡；將形成的無氣泡的混合黏稠液；澆鑄在塗抹少量石蠟的模具上，乾燥5-20min，取出起膜，切割成所需面積。

(3)凝膠劑

也可以製成凝膠的形式。例如參照中國申請號200510028076.6公開的方法，將組成物3和酯化劑攪拌溶解在溶媒中，加入羥烷基纖維素，使之溶脹，繼續攪拌形成凝膠狀；然後加入交聯劑繼續攪拌至完全均勻。

(4)膏劑

用於皮膚外用軟膏的製備方法，還見於但不限於中國申請號201610856428.5、01133296.4、1133297.2、《藥物劑型與製劑設計》(化學工業出版社2009)公開的方法。

(5)將第1項的醫藥組成物(活性成分60μg至120μg，例如60μg、70μg、80μg、90μg、100μg、110μg、120μg)製備成腸溶膠囊。

4.質量檢驗(以凍乾粉組成物3為例)

測試例.放射病的治療效果

藥物及主要試劑

測試藥物：本申請的組成物3。

測試例1

患者乳腺癌術後三個月，傷口始終不癒合，無法進行化療。使用本申請的醫藥組成物治療後5天、10天創面明顯收縮變小(圖1A至圖1C)。

測試例2

患者，宮頸癌IB1期，於2020年2月3日行宮頸癌根治術。半個月後進行同步放化療，盆腔外照射25次，化療兩個週期。宮頸癌IB1期術後兩月餘，發現切口癒合不良。患者於2020年04月20日再次入院。入院查體：T 36.7℃ P 98次/分R 18次/分BP 135/83mmHg。腹平軟，下腹部可見一長約20cm縱行手術疤痕，瘢痕上段近臍部皮膚及脂肪層裂開長約2.5cm，深達腹直肌前鞘，少許滲液流出，無明顯滲血。

於2020年04月21日對裂開傷口行手術治療，手術順利，創面置矽膠管負壓氣球一根，表皮生長因子噴塗敷料覆蓋切口。術後予每日傷口換藥、引流、紅光治療，並施用頭孢他啶。

2020年5月1日拆線後傷口在臍旁再次裂開，長約2.5cm，深約3cm(圖2A至圖2B)。

2020年05月18日就診後開始使用本申請的醫藥組成物，用藥後創面明顯收縮變小(圖2C至圖2D)。

測試例3.赤紅球菌細胞壁骨架對大鼠輻射模型的作用

大鼠後背部單次45Gy X射線照射，照射後1、2、3、4週大鼠受照部位創面變化情況。創面上施用本申請的組成物，肉眼可見地促進放射性皮膚損傷創面的癒合(圖3A至圖3G)。

Claims (9)

1. 一種赤紅球菌細胞壁或赤紅球菌細胞壁骨架在製備藥物中的用途，其中該藥物用於治療放射病。
2. 如請求項1所述的用途，其中，

   該放射病是輻射所致的放射病；

   較佳地，該輻射是電離輻射或非電離輻射；

   較佳地，該放射病是由選自以下的任一項或其組合所致：α射線、β射線、x射線、γ射線、中子輻射；

   較佳地，該放射病是放射療法所致副作用和/或放射療法所致併發症；

   較佳地，該放射病涉及選自以下任一項的綜合症：骨髓型綜合症、腸型綜合症、腦型綜合症；

   較佳地，該放射病是選自以下的任一項：輕度、中度、重度、極重度；

   較佳地，該放射病累及選自以下任一組織或其組合：表皮層、真皮層、黏膜、皮下組織。
3. 如請求項1所述的用途，其中該藥物製備成選自以下任一項的劑型：膏劑、霜劑、乳液、混懸劑、糊劑、凝膠劑、洗劑、酊劑、油劑、片劑、氣霧劑、噴霧劑、搽劑、粉劑、輔料、繃帶、膜、貼片、栓劑。
4. 如請求項1所述的用途，其中，

   該藥物包含1μg至1000μg單位劑量的赤紅球菌細胞壁或赤紅球菌細胞壁骨架；

   較佳地，包含5μg至800μg單位劑量的赤紅球菌細胞壁或赤紅球菌細胞壁骨架；

   更佳地，包含10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、100μg、150μg、200μg、250μg、300μg、350μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg每單位劑量。
5. 如請求項1所述的用途，其中該赤紅球菌是2019年03月22日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的赤紅球菌Rhodococcus ruber，保藏編號為CGMCC No.17431。
6. 如請求項1所述的用途，其中，

   該藥物還包含藥學上可接受的賦形劑；

   該赤紅球菌細胞壁或赤紅球菌細胞壁骨架為1個重量份，該藥學上可接受的賦形劑為100個至1000個重量份，較佳200個至500個重量份，更佳200個至300個重量份；

   較佳地，該赤紅球菌細胞壁或赤紅球菌細胞壁骨架為1個重量份，該藥學上可接受的賦形劑為250個重量份；

   該藥物是液態、乾粉製劑、或凍乾粉製劑。
7. 如請求項1至6中任一項所述的用途，該赤紅球菌細胞壁或赤紅球菌細胞壁骨架能夠藉由以下方法獲得，該方法包括以下步驟或由以下步驟組成：

   1)提供赤紅球菌；

   2)粉碎該赤紅球菌，得到粉碎產物；

   3.1)視需要地，對該粉碎產物進行去除脂質的操作；

   3.2)視需要地，對該粉碎產物進行去除核酸的操作；

   3.3)視需要地，對該粉碎產物進行去除蛋白質的操作；

   3.4)得到源自赤紅球菌細胞壁的產物；

   4)視需要地，除去該源自赤紅球菌細胞壁的產物中的水，較佳對該源自赤紅球菌細胞壁的產物進行冷凍乾燥；

   5)視需要地，分裝；

   其中，步驟3.1)、3.2)、3.3)能夠互換順序或並行；

   步驟4)和步驟5)能夠互換順序；

   較佳地，該粉碎的平均粒度為10nm至1000nm，更佳10nm至800nm，更佳10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm、200nm、250nm、270nm、300nm、320nm、350nm、370nm、400nm、420nm、450nm、470nm、500nm；

   較佳地，該分裝是指分裝至容器中或固體支撐物上；

   該容器選自：瓶、管、包、袋、板、安瓿、注射裝置、鋁膜包裝、敷料、膠囊。
8. 一種治療放射病的方法，包括：

   使受試者接觸治療有效量的赤紅球菌細胞壁或赤紅球菌細胞壁骨架；

   該赤紅球菌細胞壁或赤紅球菌細胞壁骨架製備成選自以下任一項的形式：膏劑、霜劑、乳液、混懸劑、糊劑、凝膠劑、洗劑、酊劑、油劑、片劑、氣霧劑、噴霧劑、搽劑、粉劑、輔料、繃帶、膜、貼片、栓劑；

   該接觸為一天兩次、或一天一次、或二天一次、或二天三次、或三天一次、或一週一次；

   所述接觸為每次30分鐘至每次24小時；

   所述接觸持續2天、3天、4天、5天、6天、1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週、13週、14週、15週、16週、17週、18週或更長；

   該放射病是輻射所致的放射病；

   較佳地，該輻射是電離輻射或非電離輻射；

   較佳地，該放射病是由選自以下的任一項或其組合所致：α射線、β射線、x射線、γ射線、中子輻射；

   較佳地，該放射病是放射療法所致副作用和/或放射療法所致併發症；

   較佳地，該放射病涉及選自以下任一項的綜合症：骨髓型綜合症、腸型綜合症、腦型綜合症；

   較佳地，該放射病是選自以下的任一項：輕度、中度、重度、極重度；

   較佳地，該放射病累及選自以下任一組織或其組合：表皮層、真皮層、黏膜、皮下組織。
9. 如請求項8所述的方法，該赤紅球菌細胞壁或赤紅球菌細胞壁骨架能夠藉由以下方法獲得，該方法包括以下步驟或由以下步驟組成：

   1)提供赤紅球菌；

   2)粉碎該赤紅球菌，得到粉碎產物；

   3.1)視需要地，對該粉碎產物進行去除脂質的操作；

   3.2)視需要地，對該粉碎產物進行去除核酸的操作；

   3.3)視需要地，對該粉碎產物進行去除蛋白質的操作；

   3.4)得到源自赤紅球菌細胞壁的產物；

   4)視需要地，除去該源自赤紅球菌細胞壁的產物中的水，較佳對該源自赤紅球菌細胞壁的產物進行冷凍乾燥；

   5)視需要地，分裝；

   其中，步驟3.1)、3.2)、3.3)能夠互換順序或並行；步驟4)和步驟5)能夠互換順序；

   該粉碎的平均粒度為10nm至1000nm，較佳10nm至800nm，更佳10nm至500nm；

   較佳地，該分裝是指分裝至容器中或固體支撐物上；

   該容器選自：瓶、管、包、袋、板、安瓿、注射裝置、鋁膜包裝、敷料、膠囊。

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